Nghiên cứu sự đa hình di truyền của các dòng hoa cúc được tạo ra bằng phương pháp chiếu xạ gây đột biến giống đoá trắng

Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA: SINH - KTNN

-------***------

KIỀU THỊ MAI HƢƠNG

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA
CÁC DÒNG HOA CÚC ĐƢỢC TẠO RA BẰNG
PHƢƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GÂY ĐỘT BIẾN
GIỐNG ĐÓA TRẮNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Di truyền học

Hƣớng dẫn khoa học
TS.Khuất Hữu Trung

Hà Nội – 2012

1
Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN


Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành bản khoá luận này, tôi đã nhận đƣợc nhiều sự giúp đỡ
của các thầy cô.
Đầu tiên tôi muốn gửi lời cảm ơn tới TS. Khuất Hữu Trung, ThS. Kiều
Thị Dung và tập thể cán bộ bộ môn Kỹ thuật Di truyền viện Di truyền Nông
nghiệp đã chỉ bảo, hƣớng dẫn tận tình, tạo điều kiện tốt nhất giúp đỡ tôi hoàn
thành khoá luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong Khoa SinhKTNN Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ để tôi hoàn thành bản
khoá luận này.
Trong quá trình hoàn thành bản khoá luận này, tôi không tránh khỏi
những thiếu sót, rất mong đƣợc sự góp ý kiến của các thầy cô để bản khoá
luận đƣợc đầy đủ hơn.
Tôi xin chân trọng cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2012

Sinh viên

Kiều Thị Mai Hƣơng

2
Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN


Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan khoá luận đƣợc hoàn thành là kết quả nghiên cứu của
riêng tôi, những số liệu trong luận văn là trung thực, không sao chép, không
trùng lặp với các kết quả nghiên cứu trƣớc.
Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Sinh viên

Kiều Thị Mai Hƣơng

3
Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN


Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT

STT

Ký hiệu

Tên đầy đủ

1

bp

Base pair (cặp bazơ nitơ)

2

CTAB

Cetyl trimethylammonium

3

dNTP

Deoxynucleotide Triphosphate

4

EDTA

Ethylen Diamine Tetr Acetic acid

5

Gy

Gray

6

Kb

kilobase

7

DNA

Deoxyribonucleic acid

8

EDTA

Ethylen Diamine Tetra Acetic acid

9

EtBr

Ethidium Bromide

10

mRNA

Messenger Ribonucleic acid

12

PCR

Polymerase Chain Reaction

12

PVP

Polyvinyl pyrrolidone

13

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

14

TBE

Tris – boric acid – EDTA

15

TE

Tris – EDTA

4

Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN


Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

MỤC LỤC
Phần 1: MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài……………………………………………………….......1
2. Mục đích yêu cầu của đề tài………………………………………………..2
3. Nội dung nghiên cứu……………………………………………………….2
Phần 2: Nội dung
Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………3
1.1. Giới thiệu chung về cây hoa cúc…………………………………………3
1.1.1. Nguồn gốc, vị trí, phân loại và đặc điểm của cây hoa cúc……………..3
1.1.2. Giá trị sử dụng của cây hoa cúc…………………………….…………5
1.1.3. Tình hình sản xuất hoa cúc trên thế giới………………………….........6
1.1.4. Tình hình sản xuất hoa cúc ở Việt Nam…….………………………….6
1.2. Khái quát về nghiên cứu sử dụng đột biến trong chọn tạo giống cây
trồng……………………………………….………………………………….8
1.2.1. Ý nghĩa của đột biến trong công tác chọn tạo giống cây trồng……..….8
1.2.2. Cơ sở di truyền của đột biến………………………….………………...8
1.2.3. Các tác nhân gây đột biến…………………………..………………… 9
1.2.4. Phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền dựa vào chỉ thị hình thái…. 12
1.2.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng………………..13
1.2.3.1. Khái quát về các loại chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng…..13
1.2.3.2. Các chỉ thị dựa trên PCR...................................................................14

1.2.3.3. Kỹ thuật RAPD..................................................................................17
1.2.3.4. Một số nghiên cứu ứng dụng của PCR – RAPD...............................18
5
Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN


Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

Chƣơng II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................20
2.1. Vật liệu nghiên cứu.................................................................................20
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu…………………………………………………20
2.1.2. Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm............................................................20
2.1.2.1. Dụng cụ dùng trong mô tả hình thái ..................................................20
2.1.2.2. Các hoá chất sinh học phân tử cần thiết.............................................20
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu.............................................................................22
2.1.4. Thời gian nghiên cứu.............................................................................22
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu..........................................................................23
2.2.1. Phƣơng pháp mô tả hình thái………………………………………….23
2.2.2. Phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền bằng kỹ thuật
PCR- RAPD…………………………………………………………………23
2.2.2.1. Tách chiết và tinh sạch ADN theo phƣơng pháp CTAB…………...23
2.2.2.2. Phƣơng pháp nhân gen bằng kỹ thuật PCR........................................24
2.2.2.3. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose……………………………...25
2.2.2.4. Tính hệ số đồng dạng di truyền theo công thức của Nei và Li……..26
2.2.2.5. Phân tích và xử lý số liệu..................................................................26
Chƣơng III: KẾT QUẢ VẢ THẢO LUẬN....................................................27

3.1. Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền ở mức hình thái...........................27
3.2. Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền các dòng cúc đột biến ƣu tú ở
mức phân tử bằng kĩ thuật PCR-RADP.........................................................33
3.2.1. Kết quả tách chiết ADN .......................................................................33
3.2.2. Kết quả phản ứng PCR – RAPD..........................................................34
3.2.3. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các giống đóa trắng...........................39
6
Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN


Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

Phần 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ................................................................41
1. Kết luận.......................................................................................................41
2. Đề nghị........................................................................................................41
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................42

7
Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN


Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Hoa là sản phẩm đặc biệt mà tạo hóa ban tặng để làm đẹp thêm cuộc
sống và tâm hồn con ngƣời. Thế giới của các loài hoa là vô cùng phong phú
và đa dạng, chúng giúp cho cuộc sống của chúng ta đẹp hơn, sinh động hơn,
vì vậy hoa mang lại những giá trị kinh tế và tinh thần mà thiên nhiên ƣu ái
cho loài ngƣời. Theo báo cáo MNS (market New Sevice) của trung tâm
thƣơng mại quốc tế, tính đến tháng 9 năm 2008 tổng kim ngạch sản xuất hoa
cây cảnh trên thế giới đạt 411,5 triệu EUR, tăng 5% so với năm trƣớc. Châu
Á có 134.000 ha trồng hoa chiếm 60% diện tích trồng hoa thế giới nhƣng diện
tích trồng hoa thƣơng mại nhỏ (chiếm 20% thị trƣờng hoa thế giới). Phong
trào trồng hoa ở Việt Nam trong những năm gần đây đã đƣợc chú ý phát triển,
diện tích hoa tăng nhanh. Hơn nữa điều kiện khí hậu và đất đai đa dạng đã tạo
điều kiện để trồng nhiều loại hoa, trong đó có hoa cúc Chrysanthemum. sp
(họ Asteraceae) là một trong những loài hoa cắt cành phổ biến nhất và đƣợc
thƣơng mại hoá nhiều thứ hai trên thị trƣờng chỉ sau hoa hồng.
Hoa cúc đã đƣợc trồng phổ biến ở Việt Nam từ rất lâu. Trải qua nhiều
năm, cùng với các kỹ thuật lai ghép, các phƣơng pháp trồng hoa mới, chất
lƣợng và chủng loại hoa cúc ở Việt Nam đã đƣợc cải thiện rất nhiều. Cho đến
nay có khoảng trên 70 giống hoa cúc đƣợc trồng với mục đích cắt cành tại
Việt nam [13]. Ngƣời Việt cũng trồng hoa cúc và coi nhƣ nó là một trong
những cây “tứ quý” (tùng, trúc, cúc, mai) tƣợng trƣng cho bốn mùa. Hoa cúc
xuất hiện ở khắp các nơi nhƣ vƣờn hoa, công viên, trong phòng khách, bàn
làm việc, trong các cuộc thăm viếng,… Hoa cúc cũng mang lại giá trị trong y
dƣợc học. Không những thế hoa cúc còn đem lại những lợi nhuận kinh tế
đáng kể cho ngƣời nông dân. Hiện nay diện tích trồng hoa cây cảnh của nƣớc
ta là trên 15.000 ha và diện tích trồng hoa cúc chiếm 30% tổng diện tích trồng
8
Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN


Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

hoa cây cảnh trên cả nƣớc. Tuy nhiên, ở nƣớc ta việc sản xuất hoa cúc còn
gặp rất nhiều hạn chế. Các giống hoa cúc có giá trị thƣơng mại ở Việt Nam
chủ yếu là các giống đƣợc nhập nội.
Để nâng cao chất lƣợng của các giống cây trồng và phát triển các giống
cúc mới, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sự đa hình di truyền của
các dòng hoa cúc đƣợc tạo ra bằng phƣơng pháp chiếu xạ gây đột biến
giống đóa trắng”.
2. Mục đích yêu cầu của đề tài
Đánh giá đa hình di truyền ở mức hình thái và mức phân tử của các
dòng cúc đƣợc tạo ra bằng phƣơng pháp chiếu xạ gây đột biến.
Xác định đƣợc một số chỉ thị đặc trƣng, để nhận dạng một số dòng cúc
có triển vọng, để phục vụ công tác chọn, tạo, nhân giống và đăng kí bản
quyền.
3. Nội dung nghiên cứu
Phân tích và đánh giá đa dạng các đặc điểm hình thái, đa dạng di truyền
ở mức phân tử của các dòng cúc bằng kỹ thuật PCR-RAPD.
Chọn lọc các dòng cúc đột biến ƣu tú.
Phân tích và đánh giá đa dạng di truyền ở mức hình thái của các dòng
cúc sau chiếu xạ.
* Ý nghĩa của đề tài
Dựa vào sự đa dạng di truyền ở mức hình thái và mức phân tử của các
dòng cúc đƣợc tạo ra bằng phƣơng pháp chiếu xạ gây đột biến làm cơ sở để

chọn tạo ra các dòng cúc ƣu tú phục vụ cho công tác chọn tạo giống mới.
Kết quả của đề tài có ý nghĩa lớn trong việc xây dựng quy
trình chọn tạo giống mới.
9
Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN


Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

Chƣơng I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây hoa cúc
1.1.1. Nguồn gốc, vị trí, phân loại và đặc điểm của cây hoa cúc
Nguồn gốc: Cây hoa cúc có tên khoa học là Chrysanthemum, đƣợc
định nghĩa từ Chrysos (vàng) và themum (hoa) bởi Linne năm 1973. Hoa cúc
có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản và một số nƣớc Châu Âu. Theo
Zenhua, Shouhe, hoa cúc đƣợc trồng ở Trung Quốc cách đây 3.000 năm, có
nguồn gốc từ một số loài hoang dại, trải qua quá trình trồng trọt, lai tạo và
chọn lọc từ những biến dị để trở thành những giống cúc ngày nay [15].
Ở Nhật Bản, cây hoa cúc đƣợc du nhập từ Trung Quốc sang, nó đƣợc
đánh giá rất cao và đƣợc mệnh danh là “ Hoàng thất quốc hoa”. Năm 1889
Edsmit đã bắt đầu lai tạo thành công nhiều loại cúc và ông đặt tên cho hơn
100 giống cúc của các thế hệ sau đó, một số khác ngày nay vẫn còn duy trì và
đƣợc trồng đến ngày nay [15].
Theo hệ thống phân loại thực vật cây hoa cúc thuộc lớp hai lá mầm
(Diccotyledoneae), phân lớp hoa cúc (Asterydae), bộ cúc (Asterales), họ cúc

(Asteraceace),

phân

họ

hoa

cúc

(Asteroidea)

và

chi

hoa

cúc

(Chrysanthenmum) [5].
Theo nghiên cứu của Langton (1987) [10] cho biết trên thế giới có hơn
7.000 giống cúc đã đƣợc đƣa vào sử dụng với chủng loại và màu sắc đa dạng.
Họ cúc trên thế giới đƣợc xếp trong 2 phân họ, 13 tông. Ở Việt Nam có
2 phân họ và 12 tông nhƣng hiện tại chia làm 17 tông. Họ cúc (Asteraceae) có
khoảng 1.550 chi với 23.000 loài, phân bố rộng khắp thế giới, nhƣng phổ biến
nhất tại các khu vực ôn đới và miền núi nhiệt đới, chủ yếu sử dụng để làm hoa
và cây cảnh [2].
10
Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN


Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

Ở Việt Nam: việc phân loại cúc chƣa thống nhất, nhƣng hiện nay cách
phân loại phổ biến:
Dựa vào hình dạng hoa để phân biệt cúc đơn hay cúc kép.
Cúc đơn: thƣờng là dạng hoa nhỏ đƣờng kính hoa từ 2-5 cm, chỉ có
hàng cánh ở vòng ngoài cùng, còn vòng trong là cánh hoa rất nhỏ thƣờng
đƣợc gọi là cồi hoa.
Cúc kép: hoa có đƣờng kính từ 5-15 cm, có nhiều cánh xếp từng vòng
sít nhau, có loại cánh dài cong, có loại cánh ngắn [6].
Dựa theo cấu tạo của cánh hoa:
Cúc đơn: chỉ để lại 1 bông hoa chính. Thƣờng hoa to nhƣ giống CN93,
CN98, …
Cúc cành (chùm): Cây hoa có nhiều cành, nhiều hoa nhỏ trên 1 gốc,
nhƣ các giống cúc chi và cúc cành Hà Lan.
Đặc điểm thực vật học của cây hoa cúc: cây hoa cúc thuộc dạng thân
thảo, có nhiều đốt, giòn, có khả năng phân cành mạnh, cây dạng đứng hoặc
dạng bò.
Rễ: rễ cây hoa cúc thuộc loại rễ chùm, phát triển theo chiều ngang.
Khối lƣợng bộ rễ lớn do sinh nhiều rễ phụ và lông hút, nên khả năng hút nƣớc
và dinh dƣỡng mạnh. Có 2 loại rễ: rễ mầm và rễ thứ sinh, những rễ thứ sinh
mọc ra từ các mắt đốt thân.
Thân: thân cây hoa cúc thuộc loại thân thảo, có phân đốt, phân nhánh
mạnh, thân có thể đứng hay bò, đốt giòn dễ gãy, càng lớn càng cứng. Những

giống nhập nội thân thƣờng to mập và thẳng, những giống cổ truyền thân nhỏ
hơn, mảnh và cong. Cây cao hay thấp, đốt dài hay ngắn, sự phân cành mạnh
hay yếu tùy thuộc vào từng giống. Chiều cao cây hoa cúc ở Việt Nam biến
động từ 30 – 80 cm, ở điều kiện ngày dài cây cúc có thể cao đến 1,5 – 2m.
11
Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN


Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

Lá: lá cúc xẻ thùy có răng cƣa to, sâu, thƣờng là lá đơn mọc so le nhau,
mặt dƣới lá bao phủ một lớp lông tơ, mặt trên nhẵn, gân hình mạng lƣới. Từ
mỗi nách lá thƣờng phát sinh một mầm nhánh. Phiến lá có thể to hay nhỏ, dày
hay mỏng, màu sắc xanh đậm, xanh vàng hay xanh nhạt còn phụ thuộc vào
từng giống.
Hoa: hoa lƣỡng tính hoặc đơn tính có nhiều màu sắc khác nhau (trắng
đỏ, tím vàng, xanh). Đƣờng kính hoa từ 1,5 – 12cm. Hoa cúc chính là gồm
nhiều hoa nhỏ hợp lại trên một cuống hoa hình thành hoa đầu trạng, mỗi cánh
hoa là một bông hoa. Tràng hoa dính vào bầu nhƣ hình cái ống, trên ống đó
phát sinh cánh hoa. Cánh hoa nằm ở phía ngoài thƣờng có màu đậm hơn cánh
phía trong hoa và xếp thành nhiều tầng. Độ xếp sít của cánh hoa lỏng hay chặt
tùy thuộc vào từng giống. Hình dạng của cánh hoa: cong, thẳng, dài, ngắn,
cuộn lại. Hoa cúc có từ 4 – 5 nhị đực dính vào nhau bao quanh vòi nhụy. Vòi
nhụy mảnh hình chẻ đôi.
Quả: quả cây hoa cúc là loại quả bế khô, hình trụ hơi dẹt, chỉ chứa 1
hạt mỏng và lép, trong hạt có phôi thẳng và không có nội nhũ. Các giống cúc

thông thƣờng có bộ nhiễm sắc thể là phức hợp lục bội với số lƣợng nhiễm sắc
thể trung bình là 54 [14].
1.1.2. Giá trị sử dụng của cây hoa cúc
Cúc (Chrysanthemum. sp) là một trong những loại hoa đƣợc trồng từ
lâu đời và quan trọng nhất trên thế giới. Hiện nay, hoa cúc đƣợc trồng phổ
biến khắp nơi, cúc có mặt ở các vƣờn hoa công viên, trong phòng khách,
trong các lễ hội,… Ngoài giá trị làm cảnh, cây hoa cúc có nhiều giá trị sử
dụng khác nhƣ: làm thuốc, làm các loại thức uống, làm thực phẩm, con ngƣời
đã và đang từng bƣớc nghiên cứu nhằm khai thác tốt nhất các giá trị của cây
hoa cúc để phục vụ cho các nhu cầu của cuộc sống.

12
Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN


Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

1.1.3. Tình hình sản xuất hoa cúc trên thế giới
Ở Bắc Mỹ, Tây Âu và Nhật Bản hoa cúc đang đứng ở vị trí thƣơng mại
thứ hai sau cây hoa hồng. Quốc gia sản xuất hoa cúc dẫn đầu là Hà Lan với
diện tích trồng hoa cúc chiếm 30% tổng diện tích trồng hoa tƣơi. Columbia là
nơi sản xuất hoa của Mỹ chiếm ƣu thế nhất với hoa hồng, cẩm chƣớng trong
đó hoa cúc đứng đầu về sản lƣợng. Ecuardor là nƣớc chiếm vị trí thứ nhì. Cả
2 nƣớc đều là nơi có khí hậu đặc biệt tốt cho sự phát triển của hoa và cả 2
cũng đều tạo ra cho mình những phân đoạn sản phẩm phổ biến nhất. Những
loại hoa có sản lƣợng đứng đầu của Ecuardor bao gồm hoa hồng, cúc tây, cây

phi yến và các loại hoa hỗn hơp khác [14].
Ở Châu Á, Nhật Bản cũng đang là nƣớc dẫn đầu về xuất khẩu hoa cúc,
mỗi năm Nhật Bản sản xuất đƣợc khoảng 200 triệu cành phục vụ cho tiêu
dùng nội địa và xuất khẩu. Ngoài ra cũng phải kể đến Thái Lan, hoa cúc đƣợc
trồng quanh năm với sản lƣợng là 50.841.500 cành/ năm. Ở Trung Quốc, theo
hiệp hội sản xuất hoa sản lƣợng hoa cúc năm 2007 đạt hơn 35 triệu bông.
Diện tích trồng hoa cúc phát triển ở Quảng Đông, Thƣợng Hải, và Bắc Kinh
bao gồm các giống ra hoa vào mùa hè, mùa thu, đông sớm và xuân muộn,
màu đƣợc ƣa chuộng nhất là màu vàng, kế đến là màu trắng, đỏ [14].
1.1.4. Tình hình sản xuất hoa cúc ở Việt Nam
Từ xa xƣa, chơi cúc đã là một thú chơi tao nhã của các bậc học sỹ và
các gia đình giàu có của Việt Nam. Trải qua nhiều năm, cùng với các kỹ thuật
lai ghép, các phƣơng pháp trồng hoa mới, chất lƣợng và chủng loại hoa cúc ở
Việt Nam đã đƣợc cải thiện rất nhiều. Cho đến nay có khoảng trên 70 giống
hoa cúc đƣợc trồng với mục đích cắt cành tại Việt nam diện tích hoa cúc
chiếm 30% tổng diện tích trồng hoa và cây cảnh ở nƣớc ta. Hoa cúc đƣợc
trồng quanh năm và xuất hiện khắp nơi trên đất nƣớc ta, tập trung chủ yếu ở
Đà Lạt, Hải Phòng , Sa Pa, thành phố Hồ Chí Minh trong đó Đà Lạt là lý
13
Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN


Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

tƣởng với khí hậu ôn hòa thuận lợi cho cây hoa cúc phát triển. Tại các tỉnh
trung du và miền núi phía Bắc diện tích trồng hoa cúc đã có 14,5 ha với sản

lƣợng 5 triệu cành/ năm [14].
Hiện nay vấn đề quan tâm không chỉ là đảm bảo mục tiêu về diện tích
trồng hoa, mà còn là chất lƣợng và hiệu quả bền vững, cần phải đa dạng hóa
các loại hoa phục vụ nhu cầu trong nƣớc, mặt khác phải chú trọng các loại
hoa chất lƣợng cao phục vụ xuất khẩu.
Các nhà khoa học đã xác định cần chú trọng công tác nhập nội, chọn
tạo và nhân nhanh các giống hoa chất lƣợng cao, nhất là hoa cúc, hoa hồng,
hoa lay ơn, hoa đồng tiền, hoa hồng môn, hoa phăng, hoa phong lan và hoa ly;
đồng thời tăng cƣờng tiếp nhận, chuyển giao các công nghệ, tiến bộ kỹ thuật
trong trồng, chăm sóc, thu hoạch và phân phối hoa để tăng hiệu quả, giá trị
sản phẩm, trong đó vấn đề giống, kỹ thuật canh tác là yếu tố quan trọng cần
đƣợc quan tâm, đầu tƣ thích đáng.
Công tác xây dựng cơ sở hạ tầng phục vụ sản xuất hoa, trong đó có việc
thiết kế đồng ruộng theo quy hoạch, hoàn chỉnh hệ thống tƣới - tiêu, hệ thống
nhà lƣới, nhà kính và các kỹ thuật đóng gói, bảo quản, vận chuyển, nhất là
vận chuyển từ nơi sản xuất đến các sân bay đối với hoa xuất khẩu,...
Cần phải rà soát các hoạt động thị trƣờng hoa trong hệ thống quốc gia
về tiếp thị và phân phối sản phẩm hoa. Xây dựng kế hoạch hành động về quản
lý sản phẩm nhằm đảm bảo dòng lƣu chuyển sản phẩm nhanh từ nhà sản xuất
đến ngƣời tiêu thụ. Đặc biệt, các cơ chế chính sách khuyến khích các cơ sở
trồng hoa quy mô lớn, chất lƣợng cao theo quy hoạch và với hệ thống lƣu
thông sản phẩm hoa, sự phối hợp chặt chẽ giữa các cấp, ngành chức năng
cũng đƣợc đề cập nhƣ những yếu tố không thể thiếu trong giải pháp phát triển
hoa trong giai đoạn tới.

14
Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN

Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

1.2. Khái quát về nghiên cứu sử dụng đột biến trong chọn tạo giống cây
trồng
1.2.2. Ý nghĩa của đột biến trong công tác chọn tạo giống cây trồng
Chọn tạo giống cây trồng là một ngành khoa học cải tiến di truyền của
thực vật nhằm phục vụ nhu cầu và lợi ích của con ngƣời, có nhiều phƣơng
pháp chọn tạo giống cây trồng nhƣ: chọn lọc, lai giống, tạo đột biến, gây đa
bộ thể, áp dụng thành tựu của công nghệ sinh học.
Trong tiến hóa: tính chất có lợi hay có hại của một đột biến gen chỉ là
tƣơng đối (có trƣờng hợp này thì có lợi, có trƣờng hợp khác có hại). Có
trƣờng hợp ở trạng thái dị hợp lại làm tăng sức sống, sức chống chịu của cơ
thể đối với một số bệnh. Ví dụ: ngƣời mang gen đột biến gây huyết cầu đỏ
hình lƣỡi liềm ở trạng thái dị hợp, có khả năng đề kháng với bệnh sốt rét. Tuy
tính chất ngẫu nhiên, cá biệt, không xác định và thƣờng ở trạng thái lặn nhƣng
đột biến gen vẫn đƣợc xem là nguồn nguyên liệu sơ cấp chủ yếu cho quá trình
chọn lọc tự nhiên, vì vậy chúng có vai trò trong tiến hóa. Đột biến là cơ sở
hình thành các giống vật nuôi và cây trồng mới [15].
Trong chọn giống: một vài đột biến có lợi dùng làm cơ sở là nguồn
nguyên liệu quan trọng cho tạo giống vật nuôi và cây trồng. Đột biến tự phát
là những đột biến xảy ra một cách ngẫu nhiên trong tự nhiên, thƣờng xảy ra
với tần số thấp và không phải lúc nào đột biến tự nhiên cũng có ý nghĩa cho
con ngƣời, vậy chúng ít có ý nghĩa trong tiến hóa và chọn giống [15].
1.2.2. Cơ sở di truyền của đột biến
Đột biến là những biến đổi bất thƣờng trong vật chất di truyền ở cấp độ
phân tử (ADN, gen) hoặc cấp độ tế bào (nhiễm sắc thể), dẫn đến sự biến đổi
đột ngột của một hoặc một số tính trạng, những biến đổi này có tính chất bền

vững và có thể di truyền cho các đời sau.
15
Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN


Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

Đột biến là quá trình xảy ra đột ngột, riêng rẽ, ngẫu nhiên, không định
hƣớng ở cơ thể sống trong điều kiện tự nhiên. Đa số là đột biến gen lặn và có
hại, một số ít có lợi và có ý nghĩa rất lớn đối với quá trình tiến hóa và chọn
giống.
Những cá thể mang đột biến đã biểu hiện trên kiểu hình của cơ thể gọi
là thể đột biến.
Căn cứ vào tính chất xuất hiện đột biến, có thể phân chia thành các
dạng nhƣ sau:
Đột biến gen là những biến đổi về số lƣợng, thành phần, trật tự các cặp
nucleotit xảy ra tại một điểm nào đó trên phân tử ADN. Sự biến đổi về cấu
trúc phân tử của gen có thể dần đến biến đổi cấu trúc của protein sẽ dẫn đến
biến đổi kiểu hình.
Đột biến nhiễm sắc thể là sự biến đổi về cấu trúc hoặc số lƣợng nhiễm
sắc thể (đột biến về cấu trúc nhiễm sắc thể nhƣ: mất đoạn, thêm đoạn, đảo
đoạn hay chuyển đoạn). Đột biến số lƣợng nhiễm sắc thể (thể dị bội, đa bội)
[15].
1.2.3. Các tác nhân gây đột biến
Các tác nhân gây đột biến đột biến có thể xảy ra ở mọi cơ quan, mọi
thời kỳ sinh trƣởng của cây trồng, theo nhiều hƣớng khác nhau và mức độ tần

số cũng khác nhau, đột biến có thể xảy ra bất cứ lúc nào do những thay đổi
nội tại trong cấu trúc vật chất di truyền, do môi trƣờng thay đổi đột ngột cũng
nhƣ những tác động vật lý, hóa học của con ngƣời.
Đột biến thƣờng có hại: gây dị dạng, gây chết,…, nhƣng cũng xuất hiện
dạng có lợi nhƣ: năng suất cao, chống chịu tốt với điều kiện môi trƣờng , xuất
hiện các tính trạng mới, khắc phục các nhƣợc điểm của giống vật liệu khởi
đầu.
16
Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN


Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

Các tác nhân đƣợc sử dụng trong tạo đột biến nhân tạo: tác nhân vật lý
và tác nhân hóa học.
+ Tác nhân hóa học:
Số lƣợng các chất hóa học gây đột biến là rất nhiều và số lƣợng các
chất nhƣ vậy đƣợc phát hiệ n ngày càng nhiều. Tuy nhiên trong thƣ̣c tiễn công
tác chọn tạo giống đột biến ở cây trồng chỉ một số í

t đƣợc sử dụng và tỏ ra

hữu ích; hầu hết trong số đó thuộc về nhóm alkyl hóa, nhƣ là: ethyl methane
sulhonate (EMS), diethyl sulfate (DES), ethyleimine (EI), ethyl nitroso
urethane (ENU), dimethyl sunfat (DMS), ethyl nitroso urea (ENH), methyl
nitroso urea (MNH). Đây là nhóm quan trọng nhất của các tác nhân hóa học

đƣợc sử dụng cho quá trình gây đột biến các chủng nông nghiệp

. Chúng có

một hoặc nhiều nhóm alkyl linh động vốn có thể đƣợc chuyển sang cho các
phân tử khác. Chúng phản ứng với ADN bằng cách alkyl hóa

nhóm

phosphate cũng nhƣ các base puri ne và pyrimidine , do vậy nên cực kỳ cẩn
thận trong việc sử dụng chúng vì hầu hết là chất gây ung thƣ tiềm năng, chẳng
hạn nhƣ: EI, EMS, MNH.
Nhóm chất oxy hóa khử nhƣ: HNO3, H2O2, aldehyde và một số muối
kim loại nặng xâm nhập vào làm thay đổi nhóm NH2 trong nucleotide, trong
protein và tế bào.
Nhóm chất kháng sinh (antibiotics) nhƣ là azaserine, mitomycin C,
streptonigrin và actinomycin D đã đƣợc nhận thấy là có tính chất làm đứt gẫy
nhiễm sắc thể.
Azide: Azide là một tác nhân gây đột biến hiệ u quả trong nhƣ̃ng điều
kiện xƣ̉ lý nào đó . Nó cho phép nhận đƣợc các thể đột biến với tần suất cao .
Phần lớn các đột biến ghi nhậ n đƣợc là các đột biến gen , bên cạnh đó còn có
các hiệu ứng làm thay đổi cầu trúc nhiễm sắc thể.
17
Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN


Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

Trƣớc đây và ngay cả đến nay , ngƣời ta còn dùng Conchicine để gây ra
hiện tƣợng đa bội là vì khi thấm vào mô đang phân bào, Conchicine cản trở
sự hình thành thoi vô sắc, làm cho nhiễm sắc thể không phân li.
+ Tác nhân vật lý:
Các tác nhân vật lý có thể tác độ ng làm thay đổi cấu trúc ADN, nhiễm
sắc thể một cách hiệu quả so với các nhân tố hóa học là điều đã đƣợc chƣ́ng
minh thông qua lị ch s ử chọn tao giống đột biến . Các tác nhân vật lý ấy bao
gồm:
Việc gây sốc nhiệt : sự tăng hoặc giảm nhiệt độ môi trƣờng một cách
đột ngột có khả năng gây đột biến là vì nó làm cho tế bào không khởi động
kịp các cơ chế đáp ƣ́ng, gây chấn thƣơng trong bộ máy di truyền hoặc làm tổn
thƣơng thoi vô sắc, gây rối loạn sự phân bào. Sốc nhiệt thƣờng gây đột biến
số lƣợng nhiễm sắc thể.
Các tác động gây bức xạ ion hóa các cặ

p base nitrogen trong chuỗi

ADN xảy ra trong quá trình sinh tổng hợp ADN có khả năng gây ra các đột
biến. Trong trƣờng hợp này , chúng làm nảy sinh sƣ̣ tồn tại của các cặp base
nitrogen bất thƣờng và hì nh thành nên các thay đỗi hỗn biến trong cấu trúc
các cặp base. Hệ quả của việc này là trì n h tƣ̣ các base trong chuỗi ADN đƣợc
sinh tổng hợp mới bị sai lệch, một thay đổi rời rạc có khả năng duy trì

, di

truyền đƣợc có thể đƣợc hì nh thành.
Có một số các loại bức xạ và nguồn bức xạ đã đƣợc các nhà chọn giống
sử dụng. Ngoài tia cực tím (ultraviolet), một vài kiểu bƣ́c xạ ion hóa nhƣ tia

X, tia Gamma , các tiểu phần beta và alpha , proton và neutron thông thƣờng
có khả năng hình thành nên sƣ̣ phát năng lƣợng rời rạc đƣợc gọi là sƣ̣ ion hóa
khi chúng xuyên qua vật chất . Tia X cũng nhƣ tia Gamma hay ánh sáng cực
tím là các bức xạ điện từ phát ra lƣợng tử

(với bƣớc sóng 10

0.001

nm đối với

Tia X và tia Gamma , khác với ánh sáng cực tím khoảng 2.000 – 3.000nm).
18
Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN


Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

Trong việc sản sinh ra các đột biến , máy phát tia X với bƣớc só ng ngắn có
khả năng xuyên thấu cao là thích hợp hơn bƣớc sóng dài.
Tia Gamma: có bƣớc sóng ngắn hơn và do vậy có mức năng lƣợng
photon cao hơn tia X . Khác với tia X , tia Gamma thƣờng đƣợc tạo ra tƣ̀ các
đồng vị phóng xạ.
Tia cực tím (UV) có khả năng xuyên thấu vật chất rất giới hạn , vì thế
chúng chỉ đƣợc sử dụng một cách hạn chế để xử lý các vật liệu có kích thƣớc
nhỏ nhƣ bào từ, hạt phấn, các tế bào hạt và mô nuôi cấy.

Các tiểu phần be ta: Các tiểu phần beta hình thành từ nguồn đồng vị
Phosphorus 32 (32P) hoặc Sulfur 35 (35S) gây hiệu ƣ́ng lên các mô tƣơng tƣ̣
nhƣ tia X và tia Gamma , tuy nhiên khả năng xuyên thấu của các tiểu phần
beta là thấp hơn.
Tia Neutron: chùm tia neutron chậm và chùm neutron nhanh từ việc
phân hủy hạt nhân nguyên tử Uranium trong các lò phản ứng hạt nhân cũng
có thể đƣợc sử dụng để chiếu xạ gây đột biến vật liệu thực vật.
Tia điện tƣ̉ (electron beam ): hình thành từ máy gi a tốc hạt điện tƣ̉ ,
phƣơng pháp này bị hạn chế và cấm sử dụng trong việc chiếu xạ tạo đột biến
để đảm bảo tính an toàn cho nhà chọn giống.
Chùm tia ion (Ion beam): có thể gây ra sự thay đổi lớn về cấu trúc
nhiễm sắc thể và AND [8], [15].
1.2.4. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền dựa vào chỉ thị hình thái
Phƣơng pháp đánh giá đa dạng ở mức hình thái là phƣơng pháp truyền
thống đƣợc nhà phân loại học đầu tiên là Larmark sử dụng. Phƣơng pháp này
bao gồm việc miêu tả những đặc điểm, cấu tạo hình thái bên ngoài, cụ thể là:
Đặc điểm của hoa: màu sắc, số lƣợng hoa trên bông, số lƣợng bông trên
thân, cách sắp xếp của cánh hoa, kích thƣớc, mùi hƣơng của hoa, thời gian ra
hoa, thời gian hoa tồn tại.
19
Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN


Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

Đặc điểm của lá: màu sắc, số lƣợng của lá trung bình của một cây,

chiều dài và chiều rộng của lá, hình dáng của lá, cấu tạo lá.
Đặc điểm của bộ rễ: màu sắc, cấu tạo, hình dáng, kích thƣớc (chiều dài
và đƣờng kính).
Đặc điểm của thân: màu sắc, cấu tạo, hình dáng, kích thƣớc (chiều dài
và đƣờng kính) [3].
1.2.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng
1.2.3.1. Khái quát về các loại chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng
Chỉ thị phân tử đƣợc coi là những đoạn ADN đã đƣợc tìm thấy ở các
vùng đặc hiệu trên bộ gen và đƣợc di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác.
Ứng dụng chỉ thị phân tử để xác định nguồn gốc cũng nhƣ phân loại giống
cây trồng đƣợc thực hiện từ những năm 1990 do William & cs. Chỉ thị phân
tử đƣợc coi là những đoạn DNA đã đƣợc tìm thấy ở các vùng đặc hiệu trên bộ
gen và đƣợc di truyền theo các quy luật từ thế hệ này sang thế hệ khác. Sự
phát triển và sử dụng các loại chỉ thị phân tử để phát hiện và khám phá sự đa
hình của ADN, lập bản đồ di truyền và nghiên cứu sự liên kết của các tính
trạng là một trong những tiến bộ nhất trong lĩnh vực di truyền phân tử. Có rất
nhiều loại chỉ thị phân tử nhƣ: đa hình các đoạn độ dài giới hạn (RFLP), đa
hình khuếch đại ngẫu nhiên ADN (RAPD), đa hình khuyếch đại đoạn dài
(AFLP), lặp trình tự đơn giản giữa các phân tử (SSRs), vùng đặc trƣng trính
tự (SCARs), điểm trình tự đầu (STSs), các trình tự đa hình khuếch đại đã
phân cắt (CAPs), phƣơng pháp vi vệ tinh hay lặp trình tự đơn giản (SSRs),
đầu trình tự đã biểu hiện (ETSs), đa hình nucleotide đơn (SNPs) và công nghệ
mảng đa dạng (DArT) đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu phát hiện và đánh
giá sự đa hình ở mức độ phân tử của ADN... Tuy nhiên tùy thuộc vào mục
đích của từng nghiên cứu để có thể lựa chọn một trong số các chỉ thị phân tử
này [7].
20
Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN

Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

1.2.3.2. Các chỉ thị dựa trên PCR
PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử cho phép khuyếch đại, tạo một số
lƣợng rất lớn bản sao của gen (hay một đoạn ADN) trong một thời gian ngắn
mà không cần đến cơ thể sống.
Nguyên tắc PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính của ADN và
nguyên lý tổng hợp ADN. Trên cơ sở của đoạn ADN khuôn, đoạn mồi tự do
(primer), các nucleotid tự do (dNTP) và enzym ADN polymerase có thể tổng
hợp đƣợc đoạn ADN giới hạn bởi các đoạn mồi. Lặp lại nhiều lần chu trình
nhân gen, trong một thời gian ngắn số lƣợng bản sao ADN tạo thành tăng theo
cấp số nhân [7].
* Nguyên lý chung của phương pháp
PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ kế tiếp nhau,
mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn biến tính: ở nhiệt độ cao 90 - 95°C, cao hơn nhiệt độ biến
tính (Tm) của khuôn, làm đứt các liên kết hydro của phân tử ADN, hai mạch
phân tử ADN tách rời nhau. Đoạn khuôn ADN có các đoạn dài gồm nhiều
nucleotid giống nhau, hoặc tỉ lệ G - C càng cao, có nhiệt độ biến tính cao hơn.
Do vậy cần căn cứ đặc điểm của ADN khuôn để lựa nhiệt độ biến tính phù
hợp. Giai đoạn này kéo dài 1 - 2 phút.
Giai đoạn gắn mồi: ở nhiệt độ khoảng 55 - 56°C để các mồi bắt cặp với
các mạch đơn ADN khuôn ở các đầu 3’ theo nguyên lý Chargaff. Giai đoạn
này khoảng 30 - 60 giây.
Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ 70 - 72°C thích hợp với điều kiện hoạt
động của enzym ADN polymerase. Enzym ADN polymerase xúc tác hoạt

động tổng hợp gắn thêm các nucleotid vào cuối đoạn mồi, các mồi đƣợc kéo
dài trên cơ sở bắt cặp với mạch khuôn, tạo nên các mạch đơn ADN mới, giai
21
Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN


Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

đoạn này gọi là giai đoạn polymer hoá. Thời gian giai đoạn này từ 30 giây
đến vài chục phút, tuỳ thuộc vào kích thƣớc của đoạn ADN. Thông thƣờng
với thời gian 2 phút, tổng hợp đƣợc những đoạn ADN kích thƣớc dƣới 2 kb.
Một phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ liên tục, sản phẩm tạo ra ở chu
kỳ trƣớc lại đƣợc làm khuôn ở chu kỳ kế tiếp, nên số lƣợng bản sao tạo thành
tăng theo cấp số nhân. Một phản ứng PCR thƣờng thực hiện 20 - 40 chu kỳ,
từ mỗi đoạn ADN khuôn có thể tạo nên 220- 240 bản sao ADN. Trong quá
trình thực hiện phản ứng PCR, cần lƣu ý ở những chu kỳ sau lƣợng khuôn
tăng, lƣợng mồi và dNTP tự do giảm, enzym ADN polymerase hoạt động yếu
dần. Do đó, cần tính toán hàm lƣợng mồi dNTP, enzym để bảo đảm phản ứng
PCR có kết quả tốt nhất [7].
* Các yếu tố cần thiết cho phản ứng PCR
ADN khuôn: đoạn khuôn ADN tinh sạch là một yếu tố quan trọng, đảm
bảo kết quả phản ứng PCR tạo đƣợc các sản phẩm PCR chính xác. Kích thƣớc
đoạn khuôn nhỏ hơn 3kb cho kết quả nhân gen tốt nhất. PCR có thể khuyếch
đại đƣợc ADN từ những mẫu sinh học đang bị phân huỷ nhƣ: vết máu, vết
tinh dịch để lâu ngày, tóc và xƣơng của ngƣời chết,...
Các nucleotid tự do (dNTP): cần thiết cho phản ứng PCR bao gồm:

dATP, dTTP, dGTP và dCTP. Trong mỗi phản ứng PCR cần chú ý tỉ lệ G - C
trong đoạn khuôn để xác định hàm lƣợng mỗi đoạn ADN phù hợp. Nồng độ
dNTP mỗi loại, thƣờng sử dụng trong các phản ứng PCR khoảng 50 – 200
M. Khi hàm lƣợng các loại dNTP tự do quá ít, tạo sản phẩm PCR không đủ
để phát hiện, ngƣợc lại nồng độ dNTP tự do quá cao thì phản ứng PCR khó
thực hiện. Do đó, tuỳ theo kích thƣớc đoạn gen và số chu kỳ PCR thực hiện
để tính toán nồng độ dNTP thích hợp.
Mồi: là các đoạn oligonucleotid ngắn khoảng 14 - 35 nucleotid, có vai
trò quan trọng quyết định thành công của phản ứng PCR. Để thực hiện nhân
22
Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN


Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

một đoạn ADN bằng phản ứng PCR, cần có một cặp mồi thích hợp. Một cặp
mồi trong PCR gồm mồi xuôi F (Foward) và mồi ngƣợc R (Revert). Mồi có
vai trò tạo các nhóm 3’ OH tự do, cần thiết cho phản ứng polymer hoá. Mồi
xuôi phải có trình tự tƣơng đồng với trình tự của mạch ADN mang mã di
truyền, mồi ngƣợc bắt cặp với mạch ADN mang mã di truyền ở đầu 3’ của
mạch.
Emzym ADN polymerase: là yếu tố quan trọng, có vai trò quyết định
hiệu quả của phản ứng PCR. Mỗi loại enzym ADN polymerase có đặc tính và
vai trò khác nhau trong phản ứng PCR, sử dụng các loại enzym ADN
polymerase khác nhau thu đƣợc sản phẩm PCR có tính đặc hiệu khác nhau.
Hàm lƣợng enzym ADN polymerase cũng ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu quả

PCR. Do đó, trong các phản ứng PCR, tuỳ theo mục đích cụ thể của các nghiên
cứu để lựa chọn loại enzym với hàm lƣợng thích hợp.
Dung dịch đệm cho PCR: là một trong những yếu tố quan trọng ảnh
hƣởng đến chất lƣợng và hiệu quả của phản ứng PCR. Dung dịch đệm của
phản ứng PCR cần đảm bảo thành phần các chất cần thiết cho hoạt động của
enzym ADN polymerase nhƣ: MgCl2, KCl, Tris,... Trong dung dịch đệm, ion
Mg2+ là thành phần có ảnh hƣởng rõ rệt đến hiệu quả của phản ứng PCR, do
Mg2+ ảnh hƣởng đến khả năng bắt cặp và gắn các mồi với mạch khuôn.
Thiết bị thực hiện phản ứng PCR: Phản ứng PCR là một chuỗi các chu
kỳ tuần hoàn nhiệt, do vậy có thể thực hiện phản ứng PCR trong các thiết bị
chuyên dụng là các máy PCR. Ngoài ra, phản ứng PCR có thể thực hiện trong
các bể ổn nhiệt, có bộ đếm giờ với dụng cụ thông dụng trong phòng thí
nghiệm [7].
* Các ứng dụng chủ yếu của PCR
Sử dụng PCR trong tách dòng gen, xây dựng ngân hàng gen, lập các
loại bản đồ gen và giải trình tự gen, bộ gen.
23
Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN


Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

PCR đƣợc ứng dụng trong các nghiên cứu chuẩn đoán sớm các bệnh
nhiễm virus, vi khuẩn và các đột biến gây rối loại di truyền.
PCR đƣợc sử dụng trong tạo đột biến in vitro, và trong một số kỹ thuật
chuyển gen nhằm tạo ra các giống vật nuôi, cây trồng và vi sinh vật mới.

PCR có vai trò quan trọng trong nghiên cứu nguồn gốc các loài sinh vật
và trong phân loại phân tử.
Ƣu điểm của phƣơng pháp này là: chỉ cần một lƣợng nhỏ ADN và có
thể không cần đến mẫu dò gắn phóng xạ, có khả năng khuyếch đại trình tự
ADN từ các mô đã đƣợc bảo quản, có thể ứng dụng cho nhiều loại chỉ thị di
truyền, có khả năng chọn lọc nhiều gen trong cùng một thời điểm và trong
thời gian ngắn. Phƣơng pháp này có thể áp dụng đƣợc ở tất cả các phòng thí
nghiệm quy mô nhỏ và có thể tiết kiệm đƣợc chi phí [7].
1.2.3.3. Kỹ thuật RAPD
RADP hay còn gọi là đa hình khuyếch đại ngẫu nhiên ADN là kỹ thuật
sử dụng cùng một số cặp mồi ngẫu nhiên nhất định (thƣờng sử dụng từ 10 - 40
cặp mồi) để thực hiện phản ứng PCR, nhằm nhân các đoạn ADN đặc trƣng của
các mẫu nghiên cứu. Nếu các mẫu nghiên cứu có bộ gen giống nhau hoàn toàn,
sản phẩm PCR thu đƣợc gồm các đoạn ADN hoàn toàn giống nhau về kích
thƣớc và cấu trúc. Khi bộ gen của các mẫu nghiên cứu có sự khác biệt nhau, kết
quả PCR nhân đƣợc các đoạn khác biệt nhau. Mồi ngẫu nhiên là các đoạn
oligonucleotid gồm khoảng 8 - 20 nucleotid đặc trƣng với mỗi loài sinh vật [7].
* Các bước thực hiện
Tách chiết và tinh sạch ADN bộ gen của các mẫu nghiên cứu, và thực
hiện phản ứng PCR nhân các đoạn ADN với các cặp mồi đã lựa chọn (trong
cùng điều kiện giống nhau).

24
Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN


Luận văn tốt nghiệp

Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2

Xác định tính hệ số đồng dạng di truyền hoặc mức độ khác nhau giữa
các mẫu nghiên cứu bằng các phần mềm phân tích sinh học thông dụng, hoặc
tính theo các biểu thức khác nhau bởi các nghiên cứu của các nhà khoa học.
Có thể tính hệ số đồng dạng di truyền theo biểu thức của Nei & Li (1979) [7].
1.2.3.4. Một số nghiên cứu ứng dụng của PCR - RAPD
RAPD đƣợc ứng dụng cho nhiều nghiên cứu về hệ gen thực vật nhƣ
đƣợc dùng để định vị các gen kháng bệnh và kháng côn trùng, phối hợp với
kỹ thuật RFLP lập bảng đồ gen lúa, định vị gen kháng bệnh ruồi gall midge
trên nhiễm sắc thể số 4 ở lúa. RAPD còn đƣợc dùng phổ biến để nghiên cứu
tính đa dạng di truyền ở các loại thực vật. RAPD đƣợc ứng dụng khảo sát mối
quan hệ di truyền và tiến hóa của các giống cà phê đƣợc lai tạo từ các loại bố
mẹ ở các vùng sinh thái khác nhau. Kết quả cho phép chọn lọc đƣợc các dòng
lai gần và lai xa có đặc tính quý để làm nguyên liệu cho việc lai tạo giống cà
phê mới, nhƣ trong công trình nghiên cứu của Orozco - Castillo và cộng sự,
năm 1994. Năm 1995, Schell và cộng sự đã sử dụng RAPD để nghiên cứu 25
giống xoài khác nhau với 80 mồi 10 bp. Kết quả cho phép phát hiện ra các
đoạn ADN đặc trƣng cho mỗi loài, phân loại và xác định di truyền của các
loài này. RAPD đánh giá mối quan hệ di truyền của 10 giống đu đủ, phản ứng
PCR với một đoạn 10 bp có trật tự ngẫu nhiên. RAPD cũng đƣợc nghiên cứu
ứng dụng tính đa dạng ở các loài thực vật khác nhau nhƣ ở cần tây, ở hành, cỏ
linh lăng, bạch dƣơng và táo,… RAPD cũng đƣợc sử dụng để nghiên cứu đa
hình di truyền ở một số giống lan công nghiệp ở Nhật Bản, Đài Loan, Thái
Lan.
Ƣu điểm của kỹ thuật này là: không cần biết trình tự nucleotit của đoạn
DNA khuôn, quy trình tiến hành tƣơng đối nhanh, dễ thực hiện ở quy mô
phòng thí nghiệm nhỏ. Các chỉ thị RADP thƣờng đƣợc sử dụng để phân tích

25

Kiều Thị Mai Hương

Khoa Sinh - KTNN