Nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc m4v có khả năng phân giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp để thu cellulase phục vụ chăn nuôi

Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2
LỜI CẢM ƠN

Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Phương Phú Công,
người đã trực tiếp, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt quá
trình thực hiện đề tài này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong tổ Vi sinh vật học và
toàn thể các thầy cô khoa Sinh – KTNN trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2 đã
tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại đây.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên
giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2013
Sinh viên
Nguyễn Thị Dung

SVTH: Nguyễn Thị Dung

1

K35B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, các kết quả thu được trong khoá luận là trung thực, chưa từng được công
bố trong bất kì công trình khoa học nào.
Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Hà Nội, tháng 05 năm 2013
Sinh viên
Nguyễn Thị Dung

SVTH: Nguyễn Thị Dung

2

K35B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1.

Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ phẩm
nông nghiệp phổ biến ................................................................. 7

Bảng 3.1.

Khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M4V trên các
nguồn cơ chất khác nhau........................................................... 26

Bảng 3.2.

Ảnh hưởng của sự phối trộn các phế phụ phẩm nông
nghiệp đến khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc
M4V ......................................................................................... 29

Bảng 3.3.

Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh
cellulase .................................................................................... 30

Bảng 3.4.

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase ................ 31

Bảng 3.5.

Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase ............ 33

Bảng 3.6.

Hàm lượng đường tổng số của các mẫu cơ chất trước và
sau khi lên men ......................................................................... 35

Bảng 3.7.

Hàm lượng protein của các mẫu cơ chất trước và sau khi
lên men ..................................................................................... 37

Bảng 3.8.

Kết quả phân tích hoạt tính cellulase từ các mẫu sau khi
lên men (UI/g) .......................................................................... 38

SVTH: Nguyễn Thị Dung

3

K35B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Công thức hoá học của cellulose ................................................... 4
Hình 1.2. Quá trình phân giải cellulose của enzyme cellulase ..................... 8
Hình 3.1. Hoạt tính của chủng M4V trên nguồn cơ chất vỏ trấu, vỏ lạc
và lõi ngô .................................................................................... 27
Hình 3.2. Hoạt tính của chủng M4V ở tỉ lệ phối trộn 4:4:2 và 4:3:3 ........... 29
Hình 3.3. Hoạt tính của chủng M4V ở thời gian lần lượt là 36 giờ và
48 giờ ......................................................................................... 31
Hình 3.4. Hoạt tính của chủng M4V ở 320C và 440C.................................. 32
Hình 3.5. Hoạt tính của chủng M4V ở nguồn nitơ pepton và NaNO 3 ......... 33

SVTH: Nguyễn Thị Dung

4

K35B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

Cs

: Cộng sự

CMC

: Cacboxyl methyl cellulose

CMC – ase

SVTH: Nguyễn Thị Dung

: Cacboxylmethylcellulase

5

K35B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................ 2
2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 2
3. Nội dung của đề tài..................................................................................... 2
4. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 4
1.1. Cellulose và sự phân bố cellulose trong thực vật .................................... 4
1.1.1. Cellulose .............................................................................................. 4
1.1.2. Sự phân bố cellulose trong thực vật ...................................................... 6
1.2. Cơ chế phân giải cellulose của enzyme cellulase .................................... 8
1.2.1. Hệ thống cellulase ................................................................................ 8
1.2.2. Cơ chế phân giải cellulose của enzyme cellulase .................................. 8
1.3. Ứng dụng của cellulase .......................................................................... 9
1.3.1. Cellulase với công nghiệp thực phẩm ................................................... 9
1.3.2. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy ...................................... 10
1.3.3. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm .............................................. 10
1.3.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ .................................... 11
1.3.5. Trong công nghệ xử lí rác thải và sản xuất phân bón vi sinh ............... 12
1.3.6. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi ................................... 12
1.4. Các nhóm vi sinh vật tham gia phân giải cellulose ................................ 13
1.4.1. Vi khuẩn ............................................................................................. 13
1.4.2. Xạ khuẩn loài Actimomyces (Streptomyces) ...................................... 14
1.4.3. Nấm sợi .............................................................................................. 14
1.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật ........ 14
1.5.1. Giống vi sinh vật ................................................................................ 14

SVTH: Nguyễn Thị Dung

6

K35B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

1.5.2. Nguồn dinh dưỡng .............................................................................. 15
1.5.2.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon.......................................................... 15
1.5.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ ............................................................... 15
1.5.3. Điều kiện nuôi cấy .............................................................................. 16
1.5.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................... 16
1.5.3.2. Ảnh hưởng của độ ẩm ...................................................................... 16
1.5.3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ................................................... 17
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... 18
2.1. Nguyên liệu và vi sinh vật ..................................................................... 18
2.1.1.Chủng vi sinh vật ................................................................................. 18
2.1.2. Nguyên liệu ........................................................................................ 18
2.1.3. Hóa chất – thiết bị .............................................................................. 18
2.1.4. Môi trường ......................................................................................... 18
2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 20
2.2.1. Phương pháp vi sinh ........................................................................... 20
2.2.1.1. Thu thập mẫu ................................................................................... 20
2.2.1.2. Chuẩn bị môi trường phân lập và bảo quản..................................... 20
2.2.1.3. Hoạt hoá vi sinh vật ......................................................................... 20
2.2.2. Phương pháp hoá sinh ........................................................................ 21

2.2.2.1. Nuôi cấy chủng nấm mốc để thử hoạt tính ....................................... 21
2.2.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính carboxymethylcellulase ................ 22
2.2.2.3. Phương pháp xác định protein tổng số ............................................ 24
2.2.2.4. Phương pháp xác định lượng đường tổng số ................................... 25
2.2.3. Phương pháp xử lí số liệu ................................................................... 26
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN .................................................... 27
3.1. Khảo sát khả năng sinh cellulase của chủng M4V trên các phế phụ
phẩm nông nghiệp ........................................................................................ 27

SVTH: Nguyễn Thị Dung

7

K35B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

3.2. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh
cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp của chủng M4V ..................... 29
3.2.1. Ảnh hưởng của sự phối trộn các phế phụ phẩm nông nghiệp đến
khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M4V ....................................... 29
3.2.2. Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng sinh
cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp của chủng M4V ..................... 31
3.2.2.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase ....... 31
3.2.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase ........ 32
3.2.2.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase .................. 33
3.3. Nâng cao chất lượng phế phụ phẩm nông nghiệp thông qua sử

dụng chủng nấm mốc M4V để ứng dụng trong chăn nuôi ............................ 35
3.3.1. Kiểm tra hàm lượng đường tổng số của môi trường trước và sau
khi lên men bằng chủng nấm mốc M4V ....................................................... 35
3.3.2. Kiểm tra hàm lượng protein của môi trường trước và sau khi lên
men bằng chủng nấm mốc M4V ................................................................... 37
3.3.3. Phân tích hoạt tính cellulase của các mẫu nghiên cứu ......................... 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 40

SVTH: Nguyễn Thị Dung

8

K35B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Trong thời gian gần đây chăn nuôi đang gặp phải những khó khăn với
hàng loạt các vấn đề nổi lên như: nhiều dịch bệnh như cúm gia cầm tái phát
và giá thức ăn chăn nuôi cao,… Chính vì vậy, ngành chăn nuôi nước ta đang
đứng trước một thách thức mới là làm thế nào để có một nền nông nghiệp bền
vững và ổn định trong thời kì kinh tế hội nhập, phát triển nhanh, luôn đổi mới
và nhiều cạnh tranh này.
Mặt khác, một nền nông nghiệp phát triển như ở Việt Nam thì vấn đề
được đặt ra là đầu ra cho các phế phụ phẩm trong nông nghiệp sau thu hoạch

như rơm rạ, vỏ trấu, vỏ lạc…Nguồn phế phụ phẩm trong nông nghiệp thải ra
trong quá trình sản xuất và chế biến nông sản của nước ta ước tính khoảng
trên 50 triệu tấn mỗi năm. Lượng phế thải lớn này là những hợp chất hữu cơ
giàu cacbon và các chất khoáng đa vi lượng. Đây là nguồn nguyên liệu có giá
trị cao cho sản xuất các dạng chế phẩm sinh học cũng như phân hữu cơ sinh
học phục vụ sản xuất nông nghiệp đặc biệt là trong lĩnh vực chăn nuôi. Do
vậy, cần phải có những phương pháp, những nghiên cứu khả thi và hiệu quả
để tận dụng nguồn phế phẩm nông nghiệp dồi dào này [26]
Enzyme cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân
cellulose, chúng được tổng hợp chủ yếu nhờ vi sinh vật trong đó nấm mốc có
hoạt tính phân giải cellulose cao hơn cả như Aspegillus, Mucor,
Tricoderma…Cellulase là một phức hệ enzyme rất quan trọng và được ứng
dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Cellulase được sử dụng với 2 mục đích
chính : Dùng cellulase trực tiếp trong phân giải các phế thải của công nghiệp
thực phẩm, phế thải nông nghiệp bổ sung vào thức ăn gia súc và vào trong
công nghệ môi trường ; Thủy phân cellulase tạo cơ chất lên men để thu sản

SVTH: Nguyễn Thị Dung

9

K35B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

phẩm cuối cùng khác nhau. Cellulase đã, đang và sẽ ngày càng được sử dụng
nhiều hơn để bổ sung vào thức ăn cho vật nuôi [12].

Từ rất lâu trước, con người cũng đã biết đến sự tồn tại của các chủng
nấm mốc và đã biết ứng dụng chúng vào nhiều lĩnh vực như công nghiệp chế
biến thực phẩm, công nghiệp dược phẩm, công nghệ môi trường, nông
nghiệp…Trên thế giới cũng như trong nước đã có nhiều nghiên cứu về
cellulase ứng dụng trong chăn nuôi như : Chu Thanh Bình và Cs (2012) đã
ứng dụng các chủng nấm men trong chế biến bãi thải hoa quả giàu cellulose
làm thức ăn gia súc ; Nguyễn Lân Dũng (1991) đã lên men xốp sắn bằng cách
sử dụng Aspergillus hennebergi niger sản phẩm dùng làm thức ăn cho bò;
Phương Phú Công (2008) Tuyển chọn và ứng dụng một số chủng vi sinh vật
có khả năng lên men xylan trên phế phụ phẩm nông nghiệp để thu xylanase
phục vụ cho chăn nuôi… và đã thu được kết quả cho nhiều triển vọng.
Xuất phát từ những yều cầu cấp thiết như trên tôi chọn đề tài “ Nghiên
cứu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V có khả năng phân giải
cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp để thu cellulase phục vụ chăn nuôi”
2. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V trong việc
phân giải cellulose trên các phế phụ phẩm nông nghiệp để thu cellulase phục
vụ chăn nuôi.
3. Nội dung của đề tài
3.1. Tuyển chọn và nghiên cứu chủng nấm mốc M4V có khả năng sinh
cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp.
3.2. Bước đầu đánh giá sản phẩm lên men từ chủng nấm mốc M4V để bổ
sung vào thức ăn làm tăng năng suất vật nuôi.

SVTH: Nguyễn Thị Dung

10

K35B – SP Sinh

Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

4. Ý nghĩa của đề tài
4.1. Ý nghĩa lý luận
Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm
mốc M4V có khả năng phân giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Bước đầu nghiên cứu nâng cao chất lượng phế phụ phẩm trong ngành
nông nghiệp Việt Nam để phục vụ chăn nuôi.

SVTH: Nguyễn Thị Dung

11

K35B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cellulose và sự phân bố cellulose trong thực vật
1.1.1. Cellulose
Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức cấu tạo (C 6H10O5)n, và là
thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật, gồm nhiều cellobiose liên kết

với nhau, 4-O- (β-D-Glucopyranosyl)-D-glucopyranose (Hình 1.1). Cellulose
cũng là hợp chất hữu cơ nhiều nhất trong sinh quyển, hàng năm thực vật tổng
hợp được khoảng 1011 tấn cellulose (trong gỗ,cellulose chiếm khoảng 50% và
trong bông chiếm khoảng 90%) [27].

Hình 1.1. Công thức hoá học của cellulose
Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên
kết Waals Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô
định hình. Trong vùng tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với
nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hoá chất. Ngược lại,
trong vùng vô định hình, cellulose không liên kết chặt với nhau nên dễ bị tấn
công [27].
Trong mô hình Fringed Fibrillar: phân tử cellulose được kéo dài và
định hướng theo chiều sợi. Vùng tinh thể có chiều dài 500 Ao và xếp xen kẽ
với vùng vô định hình [27].

SVTH: Nguyễn Thị Dung

12

K35B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Trong mô hình chuỗi gập: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi.
Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng khớp khoảng 1000. Các đơn vị đó được sắp xếp
thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thuỷ phân.

Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa tính
chất kết tinh càng cao. Trong vùng vô định hình, các liên kết β – glycoside
giữa các monomer bị thay đổi góc liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân
tử monomer sắp xếp tạo ra sự thay đổi 180o cho toàn mạch. Vùng vô định
hình dễ bị tấn công bởi các tác nhân thuỷ phân hơn vùng tinh thể vì sự thay
đổi góc liên kết của các liên kết cộng hoá trị (β – glycoside) sẽ làm giảm độ
bền của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro[27].
Cellulose có cấu tạo tương tự carbohydrate phức tạp như tinh bột và
glycogen. Các polysaccharide này đều được cấu tạo từ các đơn phân là
glucose. Cellulose là glucan không phân nhánh, trong đó các gốc glucose kết
hợp với nhau qua liên kết β-1→4- glycoside, đó chính là sự khác biệt giữa
cellulose và các phân tử carbohydrate phức tạp khác. Giống như tinh bột,
cellulose được cấu tạo thành chuỗi dài gồm ít nhất 500 phân tử glucose. Các
chuỗi cellulose này xếp đối song song tạo thành các vi sợi cellulose có đường
kính khoảng 3,5 nm. Mỗi chuỗi có nhiều nhóm - OH tự do, vì vậy giữa các
sợi ở cạnh nhau kết hợp với nhau nhờ các liên kết hydro được tạo thành giữa
các nhóm - OH của chúng. Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớn
hơn hay còn gọi đó là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi trong
mixen có những khoảng trống lớn. Khi tế bào còn non, những khoảng này
chứa đầy nước, ở tế bào già thì chứa đầy lignin và hemicellulose [27].
Cellulose có cấu trúc rất bền và khó bị thuỷ phân. Người và động vật
không có enzyme phân giải cellulose (cellulase) nên không tiêu hoá được
cellulose, vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng. Tuy nhiên, một số
nghiên cứu cho thấy cellulose có thể có vai trò điều hoà hoạt động của hệ

SVTH: Nguyễn Thị Dung

13

K35B – SP Sinh

Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

thống tiêu hoá. Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và
động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose.
Nấm cũng có thể phân huỷ cellulose, vì vậy chúng có thể sử dụng cellulose
làm thức ăn [24].
1.1.2. Sự phân bố cellulose trong thực vật
Cellulose được tổng hợp hàng năm với khối lượng lớn. Sinh khối thực
vật của trái đất là 1800 tỷ tấn, thì cellulose chiếm tới 720 tỷ tấn. Khối lượng
cellulose khổng lồ này ngoài việc chứa trong quần thể thực vật chủ yếu còn có
trong động vật và vi sinh vật nhưng với số lượng nhỏ. Cùng với cellulose,
hemicellulose và lignin phối hợp với nhau tạo nên cấu trúc và quyết định tính
chất hoá học và cơ lí của nguyên liệu có nguồn gốc thực vật. Các hợp chất
này thường đi cùng với nhau, do đó người ta thường gọi là ligno – cellulose
(Bảng 1.1) [27].

SVTH: Nguyễn Thị Dung

14

K35B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Bảng 1.1. Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ phẩm
nông nghiệp phổ biến
Nguồn lignocellulose

Cellulose

Hemicellulose

Lignin

(%)

(%)

(%)

Thân gỗ cứng

40-55

24-40

18-25

Thân gỗ mềm

45-50

25-35

25-35

Vỏ lạc

25-30

25-30

30-40

Lõi ngô

45

35

15

Giấy

85-99

0

0-15

Vỏ trấu

32.1

24

18

Vỏ trấu của lúa mì

30

50

15

Rác đã phân loại

60

20

20

Lá cây

15-20

80-85

0

Hạt bông

80-95

5-20

0

Giấy báo

40-55

25-40

18-30

Giấy thải từ bột giấy hoá học

60-70

10-20

5-10

Chất rắn nước thải ban đầu

8-15

-

24-29

Chất thải của lợn

6

28

-

Phân bón gia súc

1.6-4.7

1.4-3.3

2.7-5.7

Cỏ ở bờ biển Bermuda

25

35.7

6.4

Cỏ mềm

45

31.4

12

25-40

25-50

10-30

33.4

30

18.9

Các loại cỏ (trị số trung bình
cho các loại)
Bã thô

SVTH: Nguyễn Thị Dung

15

K35B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

1.2. Cơ chế phân giải cellulose của enzyme cellulase
1.2.1. Hệ thống cellulase

Cellulase là enzyme đa cấu tử gồm: endo-β-1,4-glucanase, exoglucanase
và β-glucosidase.
 Endo-β-1,4-glucanase được gọi là endoglucanase hoặc 1,4-β-D-glucan4-glucanohydrolase hay CMCase (EC 3.2.1.4).
 Exoglucanase, gồm 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase (giống như
cello dextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase
(cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91).
 β – glucosidase hoặc β – glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) [28].
1.2.2. Cơ chế phân giải cellulose của enzyme cellulase

Hình 1.2. Quá trình phân giải cellulose của enzyme cellulase

SVTH: Nguyễn Thị Dung

16

K35B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

 Endocellulase: xúc tác quá trình cắt liên kết α-1,4- glucoside trong
cellulose, lignin và α- D glucan một cách ngẫu nhiên. Sản phẩm của quá trình
phân giải là các cellulose phân tử nhỏ, cellobiose và glucose.
 Exocellulase: cắt 2 hoặc 4 đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi
cellulose tạo thành các cellobiose (disaccharide) và một số cellotetrose.

 Cellobiase: tham gia phân giải cellobiose (disaccharide) và cellotetrose
thành glucose [28].
1.3. Ứng dụng của cellulase
1.3.1. Cellulase với công nghiệp thực phẩm
Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật, vì vậy nó có mặt
trong mọi loại rau quả cũng như trong các nguyên liệu, phế liệu của ngành
trồng trọt và nông nghiệp. Nhưng người và động vật không có khả năng phân
giải cellulose. Nó chỉ có giá trị làm tăng tiêu hoá, nhưng với lượng lớn nó trở
nên vô ích hay cản trở tiêu hoá. Chế phẩm cellulase thường dùng để: Tăng
chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc, tăng hiệu suất trích ly các chất từ
nguyên liệu thực vật [31].
Ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là dùng
nó để tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực
phẩm thực vật. Đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ em và nói chung chất lượng
thực phẩm được tăng lên. Một số nước đã dùng cellulase để xử lí các loại rau
quả cải bắp, hành, cà rốt, khoai tây, táo và lương thực như gạo. Người ta còn
xử lí cả chè và các loại tảo biển,… [25].
Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase thành tế bào của hạt
đại mạch bị phá huỷ tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và đường hoá.
Trong sản xuất agar-agar, tác dụng của chế phẩm cellulase đã làm tăng chất
lượng agar-agar hơn so với phương pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào.
Đặc biệt là việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực vật

SVTH: Nguyễn Thị Dung

17

K35B – SP Sinh

Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

đem thuỷ phân, dùng làm thức ăn gia súc và công nghệ lên men. Những ứng
dụng của cellulase trong công nghiệp thực phẩm đã có kết quả rất tốt. Tuy
nhiên hạn chế lớn nhất là khó thu được chế phẩm có cellulase hoạt độ cao
[25].
1.3.2. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy
Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, bổ sung các loại enzyme
trong khâu nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy có vai trò rất quan trọng. Nguyên
liệu ban đầu chứa hàm lượng cao các chất khó tan là lignin và một phần
hemicellulose, nên trong quá trình nghiền để tách riêng các sợi gỗ thành bột
mịn gặp nhiều khó khăn. Trong công đoạn nghiền bột giấy, bổ sung
endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng
nghiền và tiết kiệm 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học. Trước khi
nghiền hoá học, gỗ được xử lí với endoglucanase và hỗn hợp các enzyme
hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hoá chất vào phía
trong gỗ và hiệu quả khử lignin [32].
Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần được tẩy mực trước
khi sản xuất các loại giấy in, giấy viết. Endoglucanase và hemicellulase đã
được dùng để tẩy trắng mực in trên giấy [12].
1.3.3. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm
Trong quá trình sản xuất các loại nước quả và nước uống không cồn
dựa trên việc trích li dịch quả từ thịt nghiền. Các loại quả sau khi tách vỏ, bỏ
hạt được dịch nhuyễn. Từ thịt quả nghiền đã ép bã thu được dịch quả. Dịch
này thường chứa các thành phần tế bào thịt quả và các thành phần của
polysaccharide làm cho dịch quả có độ nhớt cao. Để tăng hiệu suất trích li
dịch quả, giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm quan nước quả và giảm bớt một số
công đoạn thì việc bổ sung endoglucanase là rất quan trọng. Enzyme này là

mấu chốt cải thiện hiệu suất dịch hoá. Sự kết hợp của glucanase và pectinase

SVTH: Nguyễn Thị Dung

18

K35B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

sẽ phá huỷ hoàn toàn màng tế bào. Trong quá trình sản xuất, ở giai đoạn dịch
hoá bổ sung hỗn hợp các enzyme cellulase, hemicellulase sẽ đem lại hiệu quả
của chế phẩm, làm cho độ đồng thể của nước quả có thịt sẽ tốt hơn. Trong
công nghệ sản xuất bia, các chế phẩm enzyme amylase, protease và glucanase
đã được sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các diacetyl, do đó giảm lượng
diacetyl được tạo thành, rút ngắn thời gian cần thiết để ủ bia [15].
Trong dịch lên men có chứa một lượng β-glucan, chất này ảnh hưởng
tới khả năng lọc và gây đục cho bia [15].
Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, cà phê chủ yếu được sản
xuất bằng phương pháp khô, phương pháp này cho chất lượng cà phê không
cao. Để tiến hành nâng cao chất lượng cà phê, phương pháp lên men đã được
áp dụng. Đó là quá trình sử dụng phức hệ enzyme cellulase và pectinase để xử
lí bóc vỏ cà phê và làm tăng khả năng trích li dịch quả. Trong khâu bóc vỏ,
cellulase gây hiện tượng thẫm màu, làm giảm chất lượng sau khi sấy, đồng
thời cản trở cho việc bóc vỏ. Khi sử dụng chế phẩm A. niger có tên thương
mại là Biovina-09 có hoạt tính pectinase và cellulase cho thấy số lượng cà phê
được bóc vỏ tăng, hạt cà phê được bóc vỏ bằng chế phẩm không còn nhớt như

hạt không sử dụng chế phẩm enzyme và hiệu suất bóc vỏ khá cao. Trong quá
trình trích li dịch quả, cellulose và pectin cản trở sự thoát các chất hoà tan
trong tế bào ra ngoài tế bào. Khi sử dụng chế phẩm Biotin-09 hiệu suất trích li
cao hơn mẫu không sử dụng là 46% [9].
1.3.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ
Trong giai đoạn đường hoá của quá trình sản xuất ethanol, amylase là
thành phần chính trong quá trình thuỷ phân tinh bột. Tuy nhiên, bổ sung một
số enzyme phá huỷ thành tế bào như cellulase, hemicellulase có vai trò quan
trọng, giúp tăng lượng đường tạo ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột
với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rượu tăng lên 1,5% [27].

SVTH: Nguyễn Thị Dung

19

K35B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

1.3.5. Trong công nghệ xử lí rác thải và sản xuất phân bón vi sinh
Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử dụng
công nghệ vi sinh trong xử lí rác thải cải thiện môi trường rất có hiệu quả.
Enzyme này có khả năng thuỷ phân chất thải chứa cellulose, chuyển hoá các
hợp chất kiểu lignocellulose và cellulose trong rác thải tạo nên nguồn năng
lượng thông qua các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các sản phẩm
giàu năng lượng khác [27].
Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để chứ rác thải thì việc

tạo ra các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đã được
nghiên cứu và sản xuất.
Phức hệ cellulase được sử dụng để xử lí nguồn nước thải do các nhà
máy giấy tạo ra. Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao).
Sinh khối này chứa rất nhiều loại polysaccharide, trong đó các polysaccharide
quan trọng quyết định tới chất lượng, số lượng giấy là cellulose. Vì vậy nước
thải của các nhà máy giấy, các cơ sở chế biến gỗ, các xưởng mộc khi bổ sung
các chế phẩm chứa phức hệ cellulase đem lại hiệu quả cao [33].
1.3.6. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi
Trong chăn nuôi, một trong những biện pháp nâng cao năng suất vật
nuôi là nâng cao hiệu suất sử dụng các chất dinh dưỡng ở thức ăn ở mức cao
nhất. Để giải quyết nhiệm vụ này, người ta có thể dùng chế phẩm enzyme bổ
sung khẩu phần thức ăn của vật nuôi. Các enzyme này cùng với các enzyme
có sẵn trong đường tiêu hoá sẽ phân giải các chất dinh dưỡng của thức ăn,
giúp cho con vật tiêu hoá được tốt hơn [3].
Cellulase là một trong số các enzyme thường được bổ sung vào thức ăn
chăn nuôi cho gia súc. Tuy nhiên, người ta không bổ sung riêng chế phẩm
enzyme này mà thường bổ sung cùng với các enzyme khác như: amylase,
protease, xylanase,…tạo ra một dạng chế phẩm chứa nhiều loại enzyme. Việc

SVTH: Nguyễn Thị Dung

20

K35B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

bổ sung nhiều loại enzyme giúp vật nuôi phân giải được nhiều loại cơ chất,
vật nuôi sẽ hấp thu tốt hơn các nguồn thức ăn khác nhau [3].
Khi động vật ở giai đoạn còn non, hệ enzyme tiêu hoá của chúng chưa
hoàn chỉnh, chủ yếu ở động vật ăn bột và ăn cỏ. Sử dụng enzyme trong chăn
nuôi, người ta thấy lợn con theo ổ tăng trọng 20% và giảm thức ăn 6÷14%.
Thí nghiệm trên lợn 1-3 tuần tuổi thì lợn tăng trọng 8÷40%, tăng khả năng sử
dụng thức ăn từ 10÷18% [3].
Người ta cũng đã dùng enzyme bổ sung vào thức ăn của trâu, bò. Quá
trình tiêu hoá thức ăn trong dạ cỏ của trâu, bò được gắn liền với hoạt động của
enzyme của các vi sinh vật sống nhờ ở đấy. Vì vậy bổ sung vào thức ăn
những chế phẩm enzyme để nâng cao khả năng tiêu hoá là điều rất cần thiết.
Dùng các chế phẩm có hoạt tính amylase, protease, cellulase,… đều thu được
kết quả tốt, kết quả tăng trọng của trâu, bò có thể đạt đến 12÷17% và thậm chí
còn có thể cao hơn. Trên thế giới, người ta đã sử dụng thức ăn gia súc có chứa
các enzyme tiêu hoá từ đầu những năm 1990. Hiện nay, hàng năm người ta
sản xuất khoảng 30 triệu tấn thức ăn gia súc có bổ sung chế phẩm enzyme,
chiếm khoảng 5% trong tổng số 600 triệu tấn thức ăn gia súc được sản xuất
[14], [15].
Như vậy, hiệu quả của việc bổ sung enzyme vào thức ăn chăn nuôi là rõ
ràng làm tăng tỉ lệ tiêu hoá cho vật nuôi và giảm chi phí. Tuy nhiên, hiện nay
ở Việt Nam chế phẩm enzyme thường phải được nhập khẩu với giá thành cao
nên nghiên cứu và sản xuất chế phẩm enzyme là vấn đề vô cùng cần thiết.
1.4. Các nhóm vi sinh vật tham gia phân giải cellulose
1.4.1. Vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens var cellulose – Acetobacter xylinum
Cellulomonos phân giải mạnh cellulose bã mía
Cytophaga Sporocytophaga myxococcoides.

SVTH: Nguyễn Thị Dung

21

K35B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Cellvibrio gilvus, cellvibrio fulvus [7].
1.4.2. Xạ khuẩn loài Actimomyces (Streptomyces)
Actimimyces coelicolor; Act. sulfureus.
Act. cellulosae; Act. diastaticus.
Act. hydroscopicus; Act. themofuscus.
Act. bovis; Act. flavochromogenes, Thermonosporacurvala [7].
1.4.3. Nấm sợi
Đối tượng chủ yếu trong các nghiên cứu về cellulase hiện nay thường là
nấm (nấm mốc và nấm quả thể). Rất nhiều loài nấm đã tổng hợp cellulase có
hoạt tính khá cao trong đó đáng kể là một số chủng loại sau:
Asp. flavus; Asp. niger; Asp. oryzae; Asp. terreus;
Asp. amstelodamy; Asp. fumigates.
Chaetomium globosu …
Mucor pusillus.
Penicillium notatum, Pen. variabite; Pen. pusillum…
Tricoderma koningi; Trlignorum Tr. viride.
Sporotrichum pruinosum.
Myro thecium verrucaris.
Chrysosporium lignorum [7].
1.5. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật

1.5.1. Giống vi sinh vật
Có rất nhiều nhân tố ảnh hưởng đến sự tạo thành enzyme và hoạt tính
của nó trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật. Đặc tính sinh lí, sinh hoá của nó
trong quá trình nuôi cấy của các chủng vi sinh vật có ý nghĩa quan trọng hơn
cả [8].
Không phải tất cả các vi sinh vật đều có khả năng sinh enzyme như
nhau, ngay cả những chủng cùng giống, cùng loài cũng có thể rất khác nhau

SVTH: Nguyễn Thị Dung

22

K35B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

về lượng enzyme do chúng sản sinh ra. Vì vậy, trong công tác nghiên cứu cần
phải tiến hành tìm kiếm các chủng, giống có hoạt lực enzyme cao bằng cách
phân lập từ các điều kiện và lựa chọn các điều kiện nuôi cấy tối thích với các
cơ chất cảm ứng cũng như cần nâng cao hoạt lực bằng cách đột biến [8].
1.5.2. Nguồn dinh dưỡng
Các yếu tố trong thành phần môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt
động sống và sự tạo thành enzyme của vi sinh vật. Trong môi trường nuôi cấy
vi sinh vật cần phải đảm bảo có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng và tỉ lệ các
thành phần dinh dưỡng hợp lí, phù hợp với từng nhu cầu vi sinh vật cụ thể
[10].
1.5.2.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Thành phần và hàm lượng cacbon có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp
enzyme. Đối với nấm sợi A. fumigatus và các loại nấm mốc ưa nhiệt, nguồn
cacbon thích hợp nhất là rơm nghiền và bột giấy lọc. Môi trường cám bã và
củ cải đường là môi trường thích hợp nhất với T. reesei [10].
Bã mía là nguồn cellulose tự nhiên tốt cho quá trình sinh tổng hợp
cellulase của A. niger, A. elipticus và A. fumigatus, T. reesi kết hợp với
A. phoenicis, Penicilium sp, A. terreus…còn lõi ngô, vỏ cà phê, xơ cọ dừa lại
là nguồn cellulose thích hợp cho các chủng vi sinh vật khác [10].
1.5.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Nitơ cần cho sự hình thành các axit amin để cấu tạo nên các protein cấu
trúc cũng như enzyme. Nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh
vật có thể là nitơ vô cơ hoặc hữu cơ. Việc chọn nguồn nitơ là rất cần thiết để
đảm bảo được hiệu suất tổng hợp cao và có lợi về mặt kinh tế [13].
Các nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với các vi sinh vật sinh
cellulase là muối nitrat. Đối với các giống của bộ nấm bông
(Hyphomycetales) nguồn nitơ tốt nhất lại là (NH4)2HPO4. Nói chung các muối

SVTH: Nguyễn Thị Dung

23

K35B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

amon ít có tác dụng nâng cao hoạt lực enzyme này, thậm chí còn ức chế quá
trình tổng hợp, vì môi trường các muối này làm cho môi trường axit hoá. Điều

này không những ức chế quá trình tổng hợp enzyme mà còn làm mất hoạt tính
sau khi tạo thành [13].
Natri nitrat làm cho môi trường kiềm hoá, tạo điều kiện thuận lợi cho sự
tạo thành cellulase. Các hợp chất nitơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng
hợp cellulase. Cao ngô và cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực
cellulase của vi sinh vật. Tác dụng kích thích của hợp chất này do sự có mặt
của các axit amin, các nhân tố khoáng và những nhân tố sinh trưởng khác
[13].
Ngoài nitơ và cacbon thì những nguyên tố khoáng như Fe, Mn, Bo, Mo,
Cu,… cũng có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của vi sinh
vật. Các nguyên tố khoáng Zn, Mn, Fe có tác dụng kích thích tạo thành
enzyme ở nhiều chủng [13].
1.5.3. Điều kiện nuôi cấy
1.5.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng tới sinh tổng hợp enzyme của các loài nấm khác
nhau. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của đa số nấm mốc trên môi trường
rắn là 25÷400C. Nhiệt độ dưới 250C hoặc trên 400C nấm mốc phát triển chậm,
thời gian nuôi kéo dài giảm khả năng sinh tổng hợp enzyme [11], [12].
1.5.3.2. Ảnh hưởng của độ ẩm
Trong quá trình lên men bề mặt, độ ẩm 60-70% là độ ẩm tương đối thích
hợp với các chủng nấm mốc khi nuôi cấy trên các khay. Nếu để độ ẩm quá
thấp 50% môi trường sẽ khô nhanh, sinh bào tử mạnh đồng thời giảm sinh
enzyme. Hơn nữa, độ ẩm môi trường ảnh hưởng đến độ thoáng khí khi lên
men bề mặt không có đảo trộn [10].

SVTH: Nguyễn Thị Dung

24

K35B – SP Sinh

Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

1.5.3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến sự tạo thành enzyme. Theo
Lương Đức Phẩm khi lên men bề mặt chủng mốc Asp. awamori để sản xuất
enzyme nhiều nhất vào thời điểm khoảng 36-40 giờ [13]. Đối với nấm mốc
Aspergillus tạo thành enzyme cao nhất lúc bắt đầu sinh bào tử, sau khi sinh
bào tử lượng enzyme tiết ra ít thậm chí giảm đi rất nhiều [7].

SVTH: Nguyễn Thị Dung

25

K35B – SP Sinh