Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường tới quá trình lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn acetobacter

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
........................

PHẠM VĂN HOẠT

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG ĐIỀU KIỆN
MÔI TRƯỜNG TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN
TẠO MÀNG BC CỦA CHỦNG VI KHUẨN
ACETOBACTER

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành : Vi sinh vật học

HÀ NỘI, 2011


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC

LỜI CẢM ƠN
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn
PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung và các thầy cô trong phòng Vi Sinh
khoa Sinh - KTNN đã tận tình giúp đỡ em trong thời gian qua. Em xin
chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh – KTNN đã
tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài. Cảm ơn tất cả các bạn sinh viên đã
giúp đỡ tôi để hoàn thành khóa luận một cách tốt đẹp.
Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2011
Sinh viên

Phạm Văn Hoạt

Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh

ii

ĐHSP HÀ NỘI


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài : “Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường
tới quá trình lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn Acetobacter ” là do
tôi thực hiện, không có sự trùng lặp với các tác giả khác.
Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2011
Sinh viên

Phạm Văn Hoạt

Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh

iii

ĐHSP HÀ NỘI

Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC

MỤC LỤC
Lời cảm ơn
Bản cam đoan
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt, bảng, hình vẽ
TÓM TẮT CÔNG TRÌNH

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài ................................................................................ 1
2. Mục tiêu của đề tài.............................................................................. 2
3. Nội dung của đề tài............................................................................. 2
4. Ý nghĩa của đề tài ............................................................................... 2

NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Lược sử nghiên cứu ................................................................................ 3
1.2. Phân loại Acetobacter ............................................................................. 4
1.2.1. Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter ............................................4
1.2.2. Phân loại vi khuẩn Acetobacter...................................................... 5
1.3. Đặc điểm của vi khuẩn Acetobacter ....................................................... 7
1.3.1. Đặc điểm hình thái ......................................................................... 7
1.3.2. Đặc điểm khuẩn lạc ........................................................................ 8
1.3.3. Đặc điểm màng của vi khuẩn Acetobacter trên môi trường lỏng .... 9
1.3.4. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Acetobacte................................ 9
1.3.5. Con đường chuyển hoá cacbon ...................................................... 9

1.4. Vị trí phân loại và đặc điểm của Acetobacter xylinum ........................ 10
1.4.1. Vị trí phân loại Acetobacter xylinum ............................................ 10

Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh

iv

ĐHSP HÀ NỘI


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC

1.4.2. Đặc điểm của Acetobacter xylinum .............................................. 10
1.4.3. Màng BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum................................ 11
1.4.4. Cơ chế tổng hợp màng BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum ..... 12
1.5. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum ........................................ 13
1.5.1. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới.............. 13
1.5.2. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum ở Việt Nam............... 14

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu và thiết bị ................................................................................ 16
2.1.1. Vi sinh vật.................................................................................... 16
2.1.2. Hoá chất và thiết bị ...................................................................... 16
2.1.2.1. Hoá chất.................................................................................... 16
2.1.2.2. Thiết bị .............................................................. ……………...16
2.1.3. Môi trường................................................................................... 17
2.1.3.1. Môi trường phân lập giống (MT1) ............................................ 17
2.1.3.2. Môi trường nhân giống cơ bản (MT2)....................................... 17

2.1.3.3. Môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng ............................... 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 18
2.2.1. Phương pháp vi sinh..................................................................... 18
2.2.1.1. Phân lập chủng Acetobacter theo phương pháp truyền thống
(Phương pháp Vinogradski và Beijerinck .............................................. 18
2.2.1.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp
tế bào trên tiêu bản nhuộm kép .............................................................. 19
2.2.1.3. Tuyển chọn các chủng Acetobacter cho màng theo phương pháp
Graxinop................................................................................................ 19
2.2.1.4. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter cho
màng mỏng............................................................................................20
2.2.1.5. Phương pháp bảo quản chủng giống trên môi trường

Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh

v

ĐHSP HÀ NỘI


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC

thạch nghiêng ........................................................................................20
2.2.1.6. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường lỏng ............................... 21

2.2.3. Các phương pháp hoá sinh ........................................................... 21
2.2.3.1. Phát hiện hoạt tính catalase ....................................................... 21
2.2.3.2. Phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic ....................................21

2.2.3.3. Phương pháp phát hiện khả năng tổng hợp cellulose ................. 21
2.2.3.4. Phương pháp xác định khả năng tổng hợp acid acetic bằng chuẩn
độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1% làm chỉ thị màu.................. 22
2.2.4. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả........................................ 22

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng Acetobacter ............... 24
3.1.1. Hình thái và tế bào học của chủng vi khuẩn Acetobacter ............... 24
3.1.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa ........................................... 25
3.1.3. Sinh trưởng trên môi trường lỏng................................................... 25
3.1.4. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Acetobacter.................................. 26
3.1.4.1. Hoạt tính catalase........................................................................ 26
3.1.4.2. Khả năng chuyển hóa glucose thành acid gluconic ...................... 26
3.1.4.3. Kiểm tra khả năng tổng hợp cellulose...................................................... 27
3.2. Sự thay đổi của màng BC qua thời gian nuôi cấy ............................................. 28
3.3. Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành màng BC................................. 29
3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành màng BC ........................ 31
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .........................................................................34
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................35
PHỤ LỤC.....................................................................................................37

Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh

vi

ĐHSP HÀ NỘI


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT, BẢNG VÀ HÌNH VẼ
1. Danh mục chữ viết tắt
BC : Bacterial cellulose
PC : Plant cellulose
CFU : Colony Forming Unit
CS : Cộng sự
Nxb : Nhà xuất bản
A.xylinum : Acetobacter xylinum
MT : Môi trường
CNSH : Công nghệ sinh học
2. Danh mục các bảng
Bảng 1.1. Phân loại các nhóm vi khuẩn acetic theo Frateur (1950)
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành màng BC
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hình thành màng BC
3. Danh mục hình
Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum
Hình 1.2. Con đường chuyển hoá cacbon trong Acetobacter xylinum
Hình 2.3. Acetobacter trên môi trường thạch nghiêng
Hình 3.4. Kết quả nhuộm Gram của Actobacter
Hình 3.5. Acetobacter trên môi trường thạch đĩa
Hình 3.6. Acetobacter trên môi trường lỏng
Hình 3.7. Hoạt tính catalase của chủng Acetobacter
Hình 3.8. Khả năng oxy hóa acetat của vi khuẩn Acetobacter
Hình 3.9. Kết quả nhuộm màng BC
Hình 3.10. Màng BC sau 4 ngày nuôi cấy
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi khối lượng màng BC qua thời
gian nuôi cấy
Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh

vii

ĐHSP HÀ NỘI


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC

Hình 3.12. Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành màng BC
Hình 3.13. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến sự hình thành
màng BC
Hình 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành màng BC
Hình 3.15. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành
màng BC
Hình 3.16a. Kết quả thí nghiệm lần 1 ảnh hưởng của pH đến sự hình
thành màng BC (môi trường nước máy)
Hình 3.16b. Kết quả thí nghiệm lần 2 ảnh hưởng của pH đến sự hình
thành màng BC (môi trường nước máy)
Hình 3.16c. Kết quả thí nghiệm lần 3 ảnh hưởng của pH đến sự hình
thành màng BC (môi trường nước máy)
Hình 3.17. Kết quả thí nghiệm lần 4 ảnh hưởng của pH đến sự hình thành
màng BC (môi trường nước dừa)
Hình 3.18a. Kết quả thí nghiệm lần 1 ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình
thành màng BC trong môi trường nước máy
Hình 3.18b. Kết quả thí nghiệm lần 3 ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự
hình thành màng BC trong môi trường nước máy
Hình 3.19. Kết quả thí nghiệm lần 2 ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình
thành màng BC môi trường nước dừa

Hình 3. 20. Màng BC do chủng Acetobacter xylinum tạo ra
ở pH =5 và t0C = 300C

Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh

viii

ĐHSP HÀ NỘI


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC

TÓM TẮT CÔNG TRÌNH
Vi khuẩn Acetobacter là chủng có khả năng tạo màng BC trên môi
trường dịch thể trong điều kiện nuôi cấy tĩnh. Màng BC được cấu tạo bởi
những chuỗi polymer 1,4 glucopyranose mạch thẳng, có cấu trúc hóa học và
đặc tính cơ học giống với cellulose của thực vật nhưng có thêm một số tính
chất hóa lý đặc biệt như: độ bền học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao,
tính đàn hồi lớn, khả năng thấm hút nước nhanh, khả năng polymer hóa rất
lớn. Vì vậy màng BC được ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong rất nhiều lĩnh
vực công nghệ. Trong công nghệ thực phẩm sử dụng vi khuẩn Acetobacter tạo
màng BC dày để sản xuất thạch dừa, màng để bảo quản thực phẩm. Trong
công nghiệp giấy, màng BC được dùng để sản xuất giấy chất lượng cao, dùng
để làm màng lọc nước trong công nghệ môi trường, làm chất mang đặc biệt
cho các pin và tế bào năng lượng. Trong lĩnh vực mỹ phẩm màng BC được
dùng làm mặt nạ dưỡng da. Trong lĩnh vực y học, màng BC bước đầu được
nghiên cứu làm màng trị bỏng, da nhân tạo thay thế da tạm thời, mạch máu
nhân tạo. Đặc biệt, hiện nay nhu cầu về màng trị bỏng rất cao nhưng đều phải

nhập ngoại với giá thành rất lớn.
Công trình của chúng tôi tập trung nghiên cứu: Ảnh hưởng của điều kiện
môi trường nuôi cấy (nhiệt độ, độ pH) đến khả năng tạo màng BC của chủng
vi khuẩn A.xylinum với mục đích tìm ra nhiệt độ, độ pH thích hợp cho sự tạo
màng. Nội dung của chúng tôi gồm:
Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng A.xylinum; nghiên cứu
ảnh hưởng của nhiệt độ, độ pH ban đầu tới sự tạo màng BC của chủng
A.xylinum. Công trình cho phép lựa chọn điều kiện môi trường nuôi cấy thích
hợp cho chủng vi khuẩn A.xylinum tạo màng BC có chất lượng tốt nhất.
Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh

ix

ĐHSP HÀ NỘI


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Như chúng ta đã biết thế kỷ XX là thế kỷ của ngành công nghệ thông
tin thì thế kỷ XXI là thế kỷ của ngành công nghệ sinh học. Ngày nay công
nghệ sinh học đang dần trở thành một ngành kĩ thuật chủ đạo và chiếm giữ
một vị chí cao của nhiều quốc gia trên thế giới. Là một bộ phận của ngành
CNSH, công nghệ Vi sinh đã và đang phát triển mạnh mẽ với những thành
tựu lớn có ý nghĩa trong đời sống, trong các ngành: công nghiệp, nông
nghiệp, y học... Khó có thể tìm ra một lĩnh vực nào của công nghệ sinh học
mà lại không liên quan tới vi sinh vật.

Cho đến nay Acetobacter được đánh giá là loại vi khuẩn có khả năng
sinh màng BC hiệu quả nhất trong tự nhiên. Vi khuẩn Acetobacter thuộc
nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí bắt buộc, hoá dưỡng thuộc họ
Acetobacteriaceae. Vi khuẩn Acetobacter tìm thấy trong giấm, dịch rượu,
nước ép hoa quả. Khi nuôi cấy vi khuẩn này trên môi trường dịch lỏng, chúng
sẽ hình thành trên bề mặt một lớp màng BC, đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn
liên kết với phân tử cellulose. Màng BC cấu tạo bởi những chuỗi polymer-1,4 glucopyranose không phân nhánh được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn
khi nuôi cấy chúng trên môi trường dịch lỏng.
Màng BC do Acetobacter tạo ra có cấu trúc hóa học và đặc tính cơ học
giống với cellulose của thực vật nhưng có thêm một số tính chất hóa lý đặc
biệt như: độ bền học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi lớn,
khả năng thấm hút nước nhanh, khả năng polymer hóa rất lớn. Vì vậy màng
BC được ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong rất nhiều lĩnh vực công nghệ.
Một trong các ứng dụng đã và đang được quan tâm hiện nay là sản xuất màng
BC điều trị bỏng và tổn thương da [7].

Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh

1

ĐHSP HÀ NỘI


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC

Nhằm bổ sung hiểu biết về Acetobacter và màng BC tạo cơ sở cho sản
xuất màng trị bỏng, chúng tôi quyết định chọn đề tài:
“Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường tới quá trình lên men

tạo màng BC của chủng vi khuẩn Acetobacter ”
2. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến khả năng
tạo màng BC của chủng vi khuẩn A.xylinum.
3. Nội dung của đề tài
3.1. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn A. xylinum
3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự tạo màng BC của chủng
A.xylinum.
3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH ban đầu tới sự tạo màng BC của
chủng vi khuẩn A.xylinum.
4. Ý nghĩa của đề tài
Tìm ra một số đặc điểm của chủng vi khuẩn A.xylinum. Từ đó chọn điều
kiện môi trường (pH, nhiệt độ) nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn
A.xylinum tạo màng BC có chất lượng tốt nhất.

Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh

2

ĐHSP HÀ NỘI


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC

NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Lược sử nghiên cứu
Giấm là sản phẩm rất quen thuộc đối với mỗi chúng ta, nó xuất hiện

khoảng từ những năm 1000 trước công nguyên, người xưa dùng nó làm nước
uống jessus, và được biết đến nhờ hiện tượng lên men hỏng của rượu vang.
Chính vì vậy giấm có tên là “Vinegar”, bắt nguồn từ tiếng Pháp: “Vine” là
rượu vang và “aigre” là chua. Khi đó, người ta chưa biết vi khuẩn Acetobacter
chính là tác nhân của quá trình lên men này.
Giấm mới chỉ bắt đầu được nghiên cứu từ những năm đầu của thế kỉ XIX.
Person là người đầu tiên nghiên cứu về giấm và vi khuẩn Acetobacter. 1822,
ông đã quan sát lớp màng mỏng phát triển trên bề mặt giấm và chứng minh sự
có mặt của một loại vi sinh vật, ông gọi chúng là Mycoderma aceti.
Năm 1837, Kiitzing từ những thí nghiệm của mình đã đưa ra kết luận: quá
trình lên men giấm được thực hiện khi có sự tham gia của vi khuẩn. Cùng năm
đó, nhà bác học nổi tiếng người Đan Mạch là Hansen đã tách được từ màng
giấm 2 loại vi khuẩn thuần khiết ông gọi đó là: Mycoderma aceti và
Mycoderma pasteurianum.
Nhờ có sự xuất hiện của kính hiển vi, 1862 đến 1868, Pasteur nhờ sự trợ
giúp của kính hiển vi đã chứng minh nhận của Kiitzing và Pasteur là hoàn toàn
đúng đắn. Ông nghiên cứu lớp màng xuất hiện trên bia và rượu vang, ông kết
luận: Màng đó được tạo thành do một loại trực khuẩn và ông cũng gọi nó là
Mycoderma aceti.
Từ đó đến nay, nhiều nhà khoa học vẫn tiếp tục nghiên cứu về
Acetobacter. Các nghiên cứu chủ yếu nhằm mục đích cải tiến và hoàn thiện
hơn quá trình lên men giấm, phân loại Acetobacter thành các nhóm, các loài
dựa trên những đặc tính sinh lý, sinh hoá và các ứng dụng của chúng.
Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh

3

ĐHSP HÀ NỘI

Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC

1.2. Phân loại Acetobacter
1.2.1. Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter
Để phân loại Acetobacter, các nhà nghiên cứu dựa vào một số tiêu chuẩn:
- Địa điểm phân lập: có liên quan đến điều kiện sống.
- Đặc điểm nuôi cấy: đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường thạch (hình thái,
tính chất, màu sắc…); khi nuôi cấy trên môi trường lỏng chú ý sự biến đổi
của môi trường sau thời gian nuôi cấy (môi trường đục hay trong, mùi thơm
dễ chịu hay không mùi, màu sắc môi trường…)
- Đặc điểm hình thái: hình dạng tế bào, cách sắp xếp tế bào, khả năng di
động, có hay không có tiên mao, vỏ nhầy, màu sắc khi nhuộm Gram.
- Đặc điểm sinh lý: mối quan hệ với các yếu tố: nhiệt độ, độ pH của môi
trường, khả năng hình thành sắc tố, mối quan hệ với oxy, khả năng lên men
acetic, khả năng sử dụng chất vô cơ và hữu cơ,…
- Đặc điểm sinh hoá (theo Frateur, 1950):
+ Khả năng tạo catalase.
+ Khả năng tổng hợp các xeto từ các rượu bậc cao như : glixerol,
manitol, sorbitol.
+ Khả năng oxy hoá acetat thành CO2 và H2O.
+ Khả năng oxy hoá glucose thành acid gluconic.
+ Khả năng sử dụng muối amôn làm nguồn nitơ duy nhất, khả năng sử
dụng rượu etylic làm nguồn cacbon.
+ Khả năng sinh sắc tố nâu.
+ Khả năng tổng hợp cellulose.
- Ngoài ra, ngày nay khi định loại Acetobacter, người ta còn sử dụng sinh
học phân tử để giải trình tự rARN16S.

Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh

4

ĐHSP HÀ NỘI


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC

1.2.2. Phân loại vi khuẩn Acetobacter
Việc tiến hành phân loại vi khuẩn Acetobacter được tiến hành ngay từ
thế kỷ XIX. Trong đó có một số khoá phân loại đáng chú ý như sau: khoá
phân loại của Beijerinck năm 1899, ông đã tiến hành phân lập vi khuẩn acetic
thuần khiết và chia chúng thành 4 nhóm cơ bản. Năm 1916, Janke đã tiếp theo
công trình nghiên cứu của Beijerinck. Ông đã phân loại dựa trên 2 dấu hiệu:
Một là: Sử dụng muối amoni làm nguồn cung cấp nitơ trong quá trình sinh
trưởng và phát triển.
Hai là: Không có hoặc có khả năng di động trong quá trình phát triển.
Năm 1926, Henneberg dựa vào nơi sống mà chia vi khuẩn acetic làm
4 nhóm sau:
+ Nhóm 1: Vi khuẩn không phát triển trên bia vì hoa hublon độc với
chúng.
+ Nhóm 2: Vi khuẩn có khả năng phát triển trên bia.
+ Nhóm 3: Vi khuẩn phát triển trong dung dịch rượu vang, oxy hoá rượu
thành giấm, thường dùng trong sản xuất giấm theo phương pháp chậm.
+ Nhóm 4: Vi khuẩn dùng để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh.
Năm 1934, các nhà vi khuẩn học Hoa Kỳ dựa vào khả năng sử dụng các
hợp chất tương đối đơn giản của cacbon và nitơ, đã xếp vi khuẩn acetic vào

họ Nitrobacteriaceae. Từ đó, vi khuẩn acetic có tên là Acetobacter.
Năm 1936, Kenyver, Wanneil và Staniel nghiên cứu khả năng di động
của chúng thấy có hiện tượng ghép cực xoắn ở phần di động nên xếp chúng
vào họ Pseudomonadaceae.
Năm 1948, Vanghn đã nghiên cứu khả năng di động của một số loài
Acetobacter: Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianum, Acetobacter
zancens, Acetobacter melanogenus, Acetobacter oxydans và thấy chúng đều
có đơn mao ở cực và đã xác nhận vị trí của vi khuẩn acetic trong họ

Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh

5

ĐHSP HÀ NỘI


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC

Pseudomonadaceae. Cùng năm 1948, Krassilnicov cùng một số tác giả người
Mỹ đã thống nhất xếp vi khuẩn Acetobacter vào họ vi khuẩn
Pseudomonadaceae.
Năm 1914, Bergey đã phân các loài trong giống Acetobacter thành 2
nhóm:
- Nhóm 1: Có khả năng oxy hoá acetic thành CO2 và H2O, gồm các nhóm:
+ Sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất (sinh trưởng trên môi
trường Hoyer) như: Acetobacter aceti.
+ Không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất:
* Trên môi trường dịch thể tạo thành màng nhầy chứa cellulose như:

Acetobacter xylinum.
* Trên bề mặt môi trường dịch thể không tạo thành màng nhầy có chứa
cellulose như: Acetobacter rancens, Acetobacter pasteurianus,
Acetobacter kneizigianus.
- Nhóm 2: Không có khả năng oxy hoá acid acetic.
+ Tạo thành sắc tố trên môi trường glucose.
* Sắc tố nâu tối tới đen nhạt như: Acetobacter melanogenus.
* Sắc tố hồng như: Acetobacter resens.
+ Không tạo thành sắc tố:
* Nhiệt độ thích hợp nhất từ 300C đến 350C : Acetobacter suboxydans.
* Nhiệt độ thích hợp nhất từ 180C đến 210C : Acetobacter oxydans.
Năm 1950, Frateur chính thức đưa ra một khoá phân loại mới dựa trên
các tiêu chuẩn cụ thể như:
- Khả năng tạo catalase.
- Khả năng tổng họp các chất xeto từ rượu bậc cao như: glycerol, manitol,
sorbitol.
- Khả năng oxy hoá acid acetic thành CO2 và H2O

Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh

6

ĐHSP HÀ NỘI


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC

- Khả năng oxy hoá glucose thành gluconic.

- Khả năng sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ và rượu làm nguồn
cacbon (Sinh trưởng trên môi trường Hoyer)
- Tạo sắc tố nâu.
- Tổng hợp cellulose.
Trên cơ sở đó, Frateur chia vi khuẩn acetic thành các nhóm theo bảng sau:
Bảng 1.1. Phân loại các nhóm vi khuẩn acetic theo Frateur (1950)
STT
1

2

Tên nhóm

Vi khuẩn đại diện

Suboxydans

Acetobacter suboxydans

Không có khẳ năng oxy hoá acid

Acetobacter melanogennum

acetic thành CO2 và H2O

Acetobacter aceti

Có đầy đủ các đặc điểm trên

Meroxydans

Đặc điểm cơ bản

Acetobacter xylinum
Acetobacter meroxydan
3

Oxydans

Acetobacter ascendans

Không có khả năng tạo ra các hợp

Acetobacter ransens

chất xeto từ rượu bậc cao.

Acetobacter lovaniens
4

Peroxydans

Acetobacter peroxydans

Không có hoạt tính catalase,

Actebacter paradonum

không oxy hoá glucose thành acid
gluconic

1.3. Đặc điểm của vi khuẩn Acetobacter
1.3.1. Đặc điểm hình thái
Vi khuẩn Acetobacter là tác nhân chính của quá trình lên men acid acetic.
Đối chiếu với các tiêu chuẩn phân loại học có thể xếp chúng vào 2 giống:
vi khuẩn Acetobacter có chu mao hoặc không có chu mao và Gluconobacter
đơn bào.
Theo Bergey, 1989 và Larpent et al, 1990, Acetobacter và Gluconobacter
là hai giống vi khuẩn quan trọng nhất trong họ Acetobacteriaceae. Hai giống
này gặp thấy nhiều trong tự nhiên, trên bề mặt lá cây, hoa quả và đều có khả
Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh

7

ĐHSP HÀ NỘI


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC

năng tạo acid từ rượu. Nhưng Gluconobacter không có chu trình tricacboxylic
(ATC) nên không có quá trình oxy hoá acetat thay vào đó có một số chu trình
khác như: chu trình Glyoxylat, quá trình photphoril hoá, còn Acetobacter lại
không xảy ra các quá trình trên.
Đem so sánh 2 vi khuẩn trên với những vi khuẩn thuộc giống
Pseudomonas thấy có nhiều nét tương đồng. Tuy nhiên chúng khác
Pseudomonas ở những điểm sau: khả năng chịu độ acid cao hơn, khả năng
chuyển hoá pepton yếu hơn, không sinh sắc tố, ít di động hơn. Một số loài vi
khuẩn acetic khi sống trên môi trường nghèo chất dinh dưỡng hoặc thời

gian nuôi cấy lâu thì tế bào dễ bị biến đổi hình thái( kéo dài hoặc phình to
hay phân nhánh)
Tế bào vi khuẩn acetic có hình que hoặc hình elip, đứng độc lập hay xếp
thành chuỗi, kích thước 0,6 – 0,8 µm, có thể có tiên mao và có khả năng di
động, sống hiếu khí bắt buộc, hóa dưỡng hữu cơ, nhuộm màu Gram âm, không
sinh bào tử.
Vi khuẩn Acetobacter thích hợp pH = 4,5 – 6,2 và nhiệt độ 25 – 35oC, có
khả năng oxy hoá rượu etylic thành acid acetic và có quá trình oxy hoá hoàn
toàn các chất hữu cơ tạo các hợp chất xeton hay acid hữu cơ tương ứng.
1.3.2. Đặc điểm khuẩn lạc
Trên môi trường đặc (thạch đĩa), Acetobacter phát triển thành các khuẩn
lạc tròn, đều, đường kính trung bình là 3mm. Thường có 3 dạng:
Một số loài như Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti có khuẩn lạc nhỏ
(đường kính ≈ 1mm), bề mặt trơn bóng, ở giữa khuẩn lạc dày và đậm màu hơn
các phần xung quanh.
Một số khác lớn hơn (đường kính khoảng 4 – 5 mm), bề mặt trơn nhẵn,
không màu, mỏng như những hạt sương nhỏ, có thể tách ra khỏi môi trường dễ
dàng. Một loại khác ăn sâu vào môi trường, khó tách ra bằng que cấy.

Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh

8

ĐHSP HÀ NỘI


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC

1.3.3. Đặc điểm màng của vi khuẩn Acetobacter trên môi trường lỏng
Trên môi trường lỏng, vi khuẩn Acetobacter tạo thành các loại màng BC
có độ dày mỏng, và đặc tính khác nhau.
Một số loài tạo thành màng dày như sứa, nhẵn, khi lắc chìm xuống đáy
bình và hình thành lớp màng mới.
Một số loài tạo thành màng mỏng như tờ giấy cellofan, dai, nhẵn, khi lắc
cũng chìm xuống đáy bình, dịch nuôi cấy trong, có mùi thơm dễ chịu. Khi
nghiên cứu màng này thấy có nhiều sợi cellulose đan kết với nhau tạo nên độ
dẻo dai, đàn hồi và độ chắc khỏe, màng có chứa nhiều vi khuẩn Acetobacter.
Một số khác tạo thành những loại màng mỏng, dễ vỡ, nhăn nheo, bám
theo thành bình, dịch nuôi cấy đục có màu vàng nâu, không trong, có mùi
không dễ chịu.
1.3.4. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Acetobacter
Vi khuẩn acetic có nhu cầu đối với nguồn cacbon, nguồn nitơ và các chất
sinh trưởng hết sức đa dạng. Chúng có thể đồng hoá nhiều loại thức ăn cacbon
khác

nhau

như:

các

loại

đường

(monosaccharide,

disaccharide,

polysaccharitde), rượu etylic, acid hữu cơ nhưng không sử dụng được tinh bột.
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển vi khuẩn acetic cần cung cấp
một số acid amin như: valin, alanin, prolin, ioslysine. Một số chất kích thích
sinh trưởng như: acid nicotic, acid folic, biotin.
Một số vi khuẩn acetic có khả năng tổng hợp polysaccharide phân tử lớn
như: cellulose, tinh bột, dextran,…Người ta ứng dụng đặc tính này trong sản
xuất công nghiệp. Một số loài tổng hợp được những sợi cellulose như bông:
Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti, Acetobacter kiitzingianum.
1.3.5. Con đường chuyển hoá cacbon
Qua sự nghiên cứu về khả năng chuyển hoá cacbon các tác giả đã đi đến
kết luận: Vi khuẩn acetic có khả năng oxy hoá gluxit theo các hướng sau:

Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh

9

ĐHSP HÀ NỘI


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC

Hướng 1: Chuyển hoá gluxit theo con đường hexosemono phosphate
(HMP) hoặc pentose nhờ sự oxy hoá các cơ chất đã được photphoril hoá.
Hướng 2: Theo con đường Entner – Doudoroff (ED) - chỉ gặp trong loài
có khả năng tổng hợp cellulose.
Hướng 3: Theo chu trình Kreps (ATC) hoặc glyoxylat
Hướng 4: Sinh trưởng trên môi trường chứa glycerol.

Hướng 5: Không có sự photphoril hoá cơ chất do thiếu enzym
phosphofructokinase do đó không tồn tại con đường glycolysis.
1.4. Vị trí phân loại và đặc điểm của Acetobacter xylinum
1.4.1. Vị trí phân loại Acetobacter xylinum
Theo hệ thống phân loại của Bergey,(1992) Acetobacter xylinum thuộc
giống Acetobacter,họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales,
lớp Schizommycetes. Việc phân loại vi khuẩn này còn nhiều tranh cãi, một số
tác giả coi Acetobacter xylinum như một loài phụ của Acetobacter acetic [11]
1.4.2. Đặc điểm của Acetobacter xylinum
Vi khuẩn Acetobacter xylinum là trực khuẩn hình que, kích thước khoảng
2m, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi, có khả năng di động. Các tế bào
được bao bọc bởi màng nhầy có bản chất là cellulose. Chúng tích luỹ khoảng
4,5% acid trong môi trường, khi nồng độ acid acetic vượt quá giới hạn cho
phép, nó sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn.

Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum
Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh

10

ĐHSP HÀ NỘI


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC

Vi khuẩn Acetobacter xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí
bắt buộc, không sinh bào tử. Thường sống trong giấm, rượu nhạt, nước ép hoa
quả, bề mặt hoa quả, và có cả ở trong đất. Theo Bergey, 1992, nhiệt độ thích

hợp cho vi khuẩn Acetobacter xylinum là 250C – 350C, pH tối ưu là 4,5 – 6,2 [11].
Đặc điểm khuẩn lạc: Trên môi trường đặc, vi khuẩn Acetobacter xylinum
hình thành khuẩn lạc nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hoặc gợn
sóng, màu trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên, dễ tách
khỏi môi trường [5].
1.4.3. Màng BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum
Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn
Acetobacter xylinum hình thành nên một lớp màng có bản chất là cellulose,
được tập hợp bởi những bó sợi cellulose liên kết với nhau được gọi là màng
Bacterial cellulose hay màng BC.
* Cấu trúc của màng Bacterial cellulose:
Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mạch
thẳng. Có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu
trúc và đặc tính lại khác xa nhau.
Chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo
thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi
lớn hơn- sợi vĩ mô ( microfibril) ( Jonas and Farad, 1998), những sợi này kết
hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon. Dải ribbon có chiều
dài trong khoảng từ 1-9nm. Những dải ribbon được kéo ra từ tế bào này sẽ
liên kết với những dải ribbon của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc lực
vandesvan tạo thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt
môi trường nuôi cấy [14].

Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh

11

ĐHSP HÀ NỘI

Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC

Do dải ribbon của màng BC có đường kính nhỏ hơn của PC, chỉ số kết
tinh cao (khoảng 60%), độ polymer hoá lớn nên màng BC có độ bền cơ học
cao, khả năng hấp thụ nước lớn.
Bacterial cellulose sản xuất bởi vi khuẩn Acetobacter xylinum được
nghiên cứu đầu tiên bởi Brown năm 1886. Nó đã thu hút sự chú ý từ nửa sau
của thế kỷ XX, những nghiên cứu tập trung sâu vào cơ chế tổng hợp, cũng
như cấu trúc và đặc tính của cellulose.
1.4.4. Cơ chế tổng hợp màng BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum
Bacterial cellulose là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa
cacbon trong vi khuẩn Acetobacter xylinum.
Saxena và cs đã chứng minh vị trí tổng hợp cellulose ở tế bào
Acetobacter xylinum nằm giữa lớp màng lipopolysaccharide và lớp màng sinh
chất. Vì enzym CS nằm trên màng sinh chất nên cellulose là sản phẩm ngoại bào.
Alina Krystynowicz và cs đã chứng minh vai trò của 4 enzym (GK,
PGM, UGP, CS) tham gia xúc tác tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Acetobacter
xylinum (hình 1.2), trong đó UGP là enzyme có vai trò quan trọng nhất.
Quan sát dưới kính hiển vi điện tử khi nhuộm âm bản và đông lạnh cho
thấy mỗi tế bào có 46 điểm tổng hợp cellulose. Khoảng cách giữa mỗi điểm là
12-15 nm, kích thước của mỗi điểm là 3,5nm. Khi tế bào phân chia, các vị trí
tổng hợp cellulose được phân bố về 2 tế bào con. Các chuỗi polyme β -1,4
glucopynanose từ mỗi vị trí sẽ liên kết với các chuỗi ở vị trí khác tạo dải
ribbon, tốc độ kéo dài sợi là 2 μm/ phút [2].

Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh

12

ĐHSP HÀ NỘI


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC

Hình 1.2. Con đường chuyển hoá cacbon trong Acetobacter xylinum
Quá trình sinh trưởng của vi khuẩn Acetobacter xylinum diễn ra đồng
thời với quá trình hình thành màng trên bề mặt môi trường dịch. Lớp màng
này chính là hàng rào ngăn cản oxy và chỉ những tế bào tiếp xúc trực tiếp với
oxy mới có khả năng tổng hợp cellulose.
1.5. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum
1.5.1. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới
Vi khuẩn Acetobacter xylinum và màng BC của chúng đã thu hút được sự
chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới và được ứng dụng trong nhiều lĩnh
vực: trong công nghệ môi trường, các nhà khoa học dã dùng màng BC làm
màng phân tách để xử lý nước, làm chất mang đặc biệt cho pin và tế bào năng
lượng (Brown 1989) [12], Jonas và Farad (1998) [14] đã dùng màng như một
chất đặc biệt để biến đổi độ nhớt, làm các sợi truyền quang, làm môi trường cơ

Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh

13

ĐHSP HÀ NỘI


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC

chất trong sinh học. Đặc biệt trong công nghiệp dệt, Brown (1989) đã sử dụng
chúng để sản xuất vải đặc biệt có giá trị kình tế cao [12]. Trong công nghiệp
giấy, màng BC được sử dụng để sản xuất giấy điện tử có chất lượng cao.
Trong công nghiệp thực phẩm, nó được ứng dụng để sản xuất thạch dừa, một
món ăn được ưa chuộng ở Đông Nam Á.
Ứng dụng nổi bật nhất của màng BC là trong lĩnh vực y học. Nó được sử
dụng để chế tạo vật liệu composite đắp lên vết thương hở, điều trị bỏng, thay
thế da tạm thời, làm mặt nạ dưỡng da [10], làm mạch máu điều trị các bệnh
tim mạch. Các sản phẩm chế tạo từ microbial cellulose cũng được ứng dụng
trong phẫu thuật và nha khoa implants. Năm 2005, Henrik Backdahl và cs đã
ghép thành công sợi cellulose trên động mạch cảnh của lợn thấy chúng sinh
sản và kéo dài khoảng 40m chỉ sau 2 tuần cấy ghép. Họ đã đi đến kết luận có
sự tương đồng về cấu trúc giữa màng BC với collagen.
1.5.2. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum ở Việt Nam
Trong điều trị bỏng, để giảm đau cho bệnh nhân, hạn chế mất dịch, máu
qua vết thương, hạn chế nhiễm khuẩn vết bỏng, kích thích biểu mô hoá ở
bỏng nông hay kích thích tạo mô hạt ở bỏng sâu người ta thường sử dụng các
loại vật liệu che phủ tạm thời. Việc sử dụng các vật liệu che phủ tạm thời có
nguồn gốc từ da dị loại để che phủ vết thương phần mềm, vết bỏng đã được
sử dụng từ rất lâu. Tuy nhiên, việc sử dụng những loại da này cũng mới chỉ
dừng lại ở cách sử dụng đơn giản, đó là da tươi. Mặc dù da dị loại tươi có
những ưu điểm, đặc biệt là khả năng bám dính tốt, nhưng nó cũng có những
nhược điểm nhất định. Hơn nữa, việc sử dụng lại ở thế bị động, bảo quản và
xử lý phức tạp, khó có thể sử dụng rộng rãi trên lâm sàng. Vật liệu từ da đồng
loại là lý tưởng nhất cho việc che phủ vết thương, vết bỏng nhưng trong nhiều
trường hợp rất khan hiếm, không đủ đáp ứng được. Chính vì vậy vật liệu che
phủ tạm thời từ các loại màng sinh học là lựa chọn số một, có vai trò rất quan

Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh

14

ĐHSP HÀ NỘI


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC

trọng trong điều trị bỏng. Một trong các loại màng sinh học đã và đang được
quan tâm ngày nay là màng cellulose vi khuẩn.
Tại Việt Nam việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ vi khuẩn
A.xylinum ngày càng được quan tâm . Có một số các nghiên cứu, công bố liên
quan đến A.xylinum sự hình thành BC và ứng dụng màng BC. Các công trình
mới chỉ bước đầu nghiên cứu quá trình tạo màng, đặc tính cấu trúc màng làm
cơ sở chế tạo màng trị bỏng [7], sản xuất thạch dừa. Gần đây nhất là nghiên
cứu ứng dụng màng BC làm chất nền và giá đỡ để cố định tế bào vi khuẩn của
Nguyễn Thúy Hương và Phạm Thạch Hổ.
Theo tác giả Nguyễn Văn Thanh, Trưởng bộ Vi sinh – Ký sinh, Đại học
Y Dược, Thành phố Hồ Chí Minh cho biết nhóm nghiên cứu của ông chế tạo
thành công màng trị bỏng sinh học có tẩm dầu mù u bằng phương pháp lên
men. Nó có khả năng thấm nước cao, kết dính chặt và trơ về mặt hóa học nên
nó có vai trò như màng sinh học có thể thay thế da tạm thời.
Nghiên cứu về màng trị bỏng của tác giả như Huỳnh Thị Ngọc Lan,
nghiên cứu chế tạo màng trị bỏng từ Bacterial cellulose của A.xylinum và hoạt
chất tái sinh mô của dầu mù u. Ngoài ra, có nghiên cứu về hiệu ứng làm lành
vết thương của hỗn hợp Chistosan tan trong nước – Bacterial cellulose – Nano

bạc của nhóm tác giả Nguyễn Thị Mỹ Lan, Huỳnh Thị Phương Linh, Lê Thị
Mỹ Phước và Nguyễn Quốc Hiển.
Và tại phòng Vi sinh, khoa Sinh – KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2, nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cs đang tiến
hành nghiên cứu quy trình sản xuất màng BC với chất lượng tốt và ứng dụng
vào trị bỏng bước đầu đã đạt được thành công.

Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh

15

ĐHSP HÀ NỘI


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC

CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu và thiết bị
2.1.1. Vi sinh vật
Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng hình thành
màng BC của các chủng vi khuẩn acetic từ các nguồn sau: mẫu màng giấm từ
kết quả nghiên cứu của thạc sỹ Đặng Thị Hồng 2007, giấm làm theo phương
pháp thủ công, nước uống lên men (Kombucha) [5]
Đối tượng nghiên cứu: chủng vi khuẩn phân lập Acetobacter xylinum có
khả năng hình thành màng BC.
2.1.2. Hoá chất và thiết bị
2.1.2.1. Hoá chất

Các loại hóa chất được cung cấp từ phòng thí nghiệm Vi sinh khoa
Sinh – KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2 gồm:
Nguồn cacbon: glucose (công ty dược trung ương MEDI PTANTEX).
Nguồn nitơ: cao nấm men, pepton, (NH4)2SO4 (Trung Quốc)
Các muối khoáng: KH2PO4, CaCO3, MgSO4.7H2O, NaOH, CuSO4
(Trung Quốc)
Thuốc thử: dung dịch fehling, dung dịch blue bromophenol.
Thuốc nhuộm: tím gentian, fucshin, lugol (Việt Nam)
Ngoài ra còn sử dụng : acid acetic, NaOH 0,1N, nước dừa (Việt Nam).
2.1.2.2. Thiết bị
Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức).
Nồi hấp Tommy (Nhật).
Máy so màu UV – vis ( Nhật).
Máy đo pH (MP 200R - Thụy Sỹ).
Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh).
Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh

16

ĐHSP HÀ NỘI