Nghiên cứu khả năng ngăn cản vi sinh vật của màng BC tạo ra từ chủng acetobacter xylinum BHN2

Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài ........................................................................... 1
2. Lịch sử vấn đề............................................................................... 2
3. Mục đích chọn đề tài .................................................................... 4
4. Nhiệm vụ nghiên cứu.................................................................... 4
5. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu ............................................................. 5
6.Phương pháp nghiên cứu .............................................................. 5
7 Đóng góp của khóa luận................................................................ 5
8. Bố cục của khóa luận.................................................................... 5
NỘI DUNG ....................................................................................... 7
Chương 1: Tố Hữu và khuynh hướng chủ đạo thơ Tố Hữu trước
1975 ............................................................................................................. 7
1.1Tố Hữu-nhà cách mạng, nhà thơ………………......................... 7
1.1.1 Cuộc đời Tố Hữu………………………………………………7
1.1.2. Các chặng đường thơ Tố Hữu…………………………………8
1.2

Từ phong cách nghệ thuật đến khuynh hướng chủ đạo thơ Tố

Hữu trước 1975 .......................................................................................... 14
1.2.1 Khái quát phong cách nghệ thuật thơ Tố Hữu ...................... 15
1.2.2 Khuynh hướng chủ đạo trong thơ Tố Hữu trước 1975 ........ 18
Chương 2: Khuynh hướng vận động thơ Tố Hữu sau 1975 qua tập
thơ Một tiếng đờn....................................................................................... 30
2.1 Lịch sử xã hội-thời đại và sự ra đời của tập thơ ....................... 30

2.1.1 Đổi mới xã hội và công cuộc đổi mới văn học sau 1975 ......... 30
2.1.2 Tố Hữu- một chặng đường thơ mới........................................ 31
2.1.3 Tập thơ Một tiếng đờn ............................................................ 32

K33B Khoa sinh – KTNN

i

Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

2.2 Khuynh hướng vận động thơ Tố Hữu sau 1975 qua tập thơ
Một tiếng đờn ................................................................................... 32
2.2.1 Từ khuynh hướng sử thi chuyển sang cảm hứng thế sự........ 32
2.2.2 Từ giọng điệu tráng ca,hào hùng chuyển sang giọng chiêm
nghiệm triết lý............................................................................................ 45
2.2.2 Từ ngôn ngữ sử thi trang trọng, khoa trương chuyển sang ngôn
ngữ đời thường .......................................................................................... 54

KẾT LUẬN...................................................................................... 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................ 60

K33B Khoa sinh – KTNN

ii

Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

CÁC TỪ VIẾT TẮT

A. xylinum

: Acetobacter xylinum

BC

: Bacterial cellulose

PMG

: Phosphoglucomutase

UGP

: Glucose-1-phosphate uridylytransferase

1PFK

: Fructose-1-phosphate kinase

Fru-6-P

: Fructose-6-phosphate

Glc-1-P

: Glucose-1-Phosphate

UDPGlc

: Uridine diphosphoglucose

GK

: Glucokinase

FBP

: Fructose-1,6-biphosphate phophatase

G6PDH

: Glucose-6-phosphate dehydrogenase

PGI

: Phosphoglucoisomerase

PTS

: Hệ thống phosphotransferase

Fru-bi-P

: Fructose-1,6-bi-Phosphate

Glc-6-P

: Glucose-6-Phosphate

PGA

: Phosphogluconic acid

FK

: Fructokinase

CS

: Cellulose synthase

CFU

: Colony Forming Unit

UV

: Ultra Violet

VSV

: Vi sinh vật

cs

: Cộng sự

K33B Khoa sinh – KTNN

iii

Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Kết quả nhuộm Gram của Actobacter xylinum BHN2 ............................ 5
Hình 1.2. Vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 ..................................................... 5
Hình 1.3. Khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter xylium ................................................. 6
Hình 1.4. Sợi cellulose của màng BC .................................................................... 10
Hình 1.5. Sợi cellulose của thực vật ....................................................................... 10
Hình 1.6. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở A.xylinum .................................... 11
Hình 1.7. Màng sinh học dễ bong, không gây đau rát trong
điều trị bỏng ........................................................................................................... 15
Hình 3.8 a. Tạo màng BC trong điều kiện nuôi cấy tĩnh sau 2 ngày..........................24
Hình 3.8.b. Tạo màng BC trong điều kiện nuôi cấy tĩnh sau 4 ngày..........................24
Hình 3.8. Màng BC thu được trong điều kiện nuôi cấy tĩnh sau 4 ngày ....................25

Hình 3.9 a. Màng BC trước khi xử lí..................................................................... 26
Hình 3.9. b. Màng BC sau khi xử lí....................................................................... 26
Hình 3.9 c. Dịch nghệ tươi...................................................................................... 26
Hình 3.9 d. Màng BC tẩm nghệ .............................................................................. 26
Hình 3.10 a. Bản thạch được che phủ bởi màng BC tẩm nghệ sau 6 ngày............. 27
Hình 3.10 b. Bản thạch được che phủ bởi màng BC tẩm dầu mù uư
sau 6 ngày .............................................................................................................. 28
Hình 3.10 c. Bản thạch được che phủ bởi màng BC không tẩm sau 6 ngày .......... 28
Hình 3.10 d. Bản thạch được che phủ bởi gạc vô trùng
sau 6 ngày (đối chứng)........................................................................................... 28
Hình 3.10 e. Bản thạch không được che phủ, mở nắp
sau 6 ngày (đối chứng)........................................................................................... 28
Hình 3.11 a. Màng BC được đánh nhiễm vi khuẩn Acetobacter xylinum trên bề mặt
màng sau 5 ngày ................................................................................................................. 30
Hình 3.11 b. Bản thạch không che phủ, mở nắp được đánh nhiễm vi khuẩn
Acetobacter xylinum sau 5 ngày (đối chứng)...................................................................... 31
Hình 3.11 c. Bản thạch được che phủ bởi gạc vô trùng được đánh nhiễm vi........
khuẩn Acetobacter xylinum sau 5 ngày (đối chứng)........................................................... 31

K33B Khoa sinh – KTNN

iv

Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

Hình 3.12 a. Màng BC được đánh nhiễm xạ khuẩn Streptomyces trên bề mặt màng
sau 8 ngày ........................................................................................................................... 32
Hình 3.12 b. Bản thạch được che phủ bởi gạc vô trùng được đánh nhiễm xạ khuẩn
Streptomyces sau 8 ngày (đối chứng) ................................................................................. 33
Hình 3.12 c. Bản thạch không che phủ, mở nắp được đánh nhiễm xạ khuẩn
Streptomyces sau 8 ngày (đối chứng) ................................................................................. 33
Hình 3.13 a. Bản thạch được che phủ bởi màng BC đã được đánh nhiễm nấm mốc
Aspergillus trên bề mặt sau 6 ngày ..................................................................................... 34
Hình 3.13 b. Bản thạch được che phủ bởi gạc vô trùng đã được đánh nhiễm nấm
mốc Aspergillus sau 6 ngày (đối chứng)............................................................................. 34
Hình 3.13 c. Bản thạch không che phủ, mở nắp được đánh nhiễm nấm mốc
Aspergillus sau 6 ngày (đối chứng) .................................................................................... 34
DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. 7
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn A.xylinum................................ 7
Bảng 2.1. Các bước xử lý màng BC ....................................................................... 21

K33B Khoa sinh – KTNN

v

Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Ngày nay công nghệ sinh học đang dần trở thành một ngành kĩ thuật

chủ đạo của nhiều quốc gia trên thế giới. Gắn liền với nó là công nghệ vi sinh
với những thành tựu lớn có ý nghĩa trong đời sống, trong các ngành công
nghiệp, y học... Khó có thể tìm ra một lĩnh vực nào của công nghệ sinh học
mà lại không liên quan tới vi sinh vật.
Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí bắt buộc,
hoá dưỡng thuộc chi Acetobacter, họ Acetobacteraceae. Vi khuẩn A.xylinum
tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả. Khi nuôi cấy vi khuẩn này
trên môi trường dịch lỏng, chúng sẽ hình thành trên bề mặt một lớp màng BC,
đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với phân tử cellulose. Màng BC cấu
tạo bởi những chuỗi polimer--1,4 glucopyranose không phân nhánh được
tổng hợp từ một số loài vi khuẩn khi nuôi cấy chúng trên môi trường dịch
lỏng. Hầu hết các nghiên cứu đều chỉ ra rằng A.xylinum là loài vi khuẩn tổng
hợp màng BC có hiệu quả cao [10].
Màng BC do A.xylinum tạo ra có cấu trúc hóa học và đặc tính cơ học
giống với cellulose của thực vật nhưng có thêm một số tính chất hóa lý đặc
biệt như: độ bền cơ học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi
lớn, khả năng thấm hút nước nhanh, khả năng polymer hóa rất lớn. Vì vậy
màng BC được ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong rất nhiều lĩnh vực công
nghệ. Một trong các ứng dụng đã và đang được quan tâm hiện nay là sản xuất
màng BC điều trị bỏng và tổn thương da [6].
Nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của con người với nhiều mục
đích trị bỏng một cách hiệu quả, tạo ra màng trị bỏng chất lượng tốt tôi quyết
định chọn đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu khả năng ngăn cản vi sinh vật của

K33B Khoa sinh – KTNN

1

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

màng BC tạo ra từ chủng Acetobacter xylinum BHN2”
2. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu khả năng ngăn cản vi sinh vật của màng BC được tạo
ra từ chủng Acetobacter xylinum BHN2.
3. Nội dung của đề tài
3.1. Nghiên cứu quá trình lên men tạo màng BC tạo ra từ chủng
A.xylinum BHN2.
3.2. Xử lí màng.
3.3. Nghiên cứu khả năng ngăn cản vi sinh vật của màng BC tạo
ra từ chủng Acetobacter xylinum BHN2.
3.4. Nghiên cứu khả năng ngăn cản vi khuẩn của màng BC tạo ra
từ chủng Acetobacter xylinum BHN2.
3.5. Nghiên cứu khả năng ngăn cản xạ khuẩn của màng BC tạo ra
từ chủng Acetobacter xylinum BHN2.
3.6. Nghiên cứu khả năng ngăn cản nấm mốc của màng BC tạo ra
từ chủng Acetobacter xylinum BHN2.
4. Ý nghĩa của đề tài
4.1. Lựa chọn phương pháp phù hợp để loại bỏ vi sinh vật trên màng
BC tạo ra từ chủng Acetobacter xylinum BHN2.
4.2. Nghiên cứu khả năng ngăn cản vi sinh vật của màng BC tạo ra từ
chủng Acetobacter xylinum.

K33B Khoa sinh – KTNN

2

Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

NỘI DUNG
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại của Acetobacter xylinum trong sinh giới
1.1.1 Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum trong sinh giới
Acetobacter xylinum là tên gọi chính thức theo hệ thống danh pháp
quốc tế 1990.
Acetorbacter xylinum thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonasdaceae,
bộ Pseudomonasdales, lớp Schizomycetes [21].
Ngày nay, việc phân loại vi khuẩn acetic nói chung và vi khuẩn
A.xylinum nói riêng còn tồn tại nhiều quan điểm khác nhau. Vì vậy, đòi hỏi
cần nhiều nghiên cứu hơn nữa về loại vi khuẩn này.
1.1.2. Đặc điểm phân loại của Acetobacter xylinum trong sinh giới
* Đặc điểm hình thái - tế bào học
Acetobacter xylinum là loại trực khuẩn hình que, kích thước khoảng 2
µm, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di động.
Các tế bào dược bao bởi màng nhầy có bản chất là hemicellulolose, màng này
bắt màu xanh khi nhuộm axit H2SO4, bắt màu hồng khi nhuộm fucshin.
Acetobacter xylinum có khả năng tích lũy 4,5 % acid acetic trong môi trường,
khi nồng độ acid trong môi trường quá cao sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn
[9]. Chúng có thể sống chung với nấm men trong một loại nước giải khát dân
gian làm bằng nước chè và đường loãng, pH thích hợp là 5,4 – 6,2, nhiệt độ

thích hợp từ 25 – 300C, còn gọi là “Thủy hoài sâm”, ở Nga người ta gọi là
“nấm chè”, ở Trung Quốc có tên “hải bảo”, “vị hảo”, người Pháp gọi là
“Champiognon De Longue Vie – nấm trường sinh”. Vi khuẩn Acetobacter
xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, hóa dị dưỡng, tế bào của

K33B Khoa sinh – KTNN

3

Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

chúng thường tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả, trong đất.
Theo tác giả Nguyễn Lân Dũng [2] vi khuẩn Acetobacter xylinum có
bao nhầy cấu tạo bởi cellulose. Thành phần cấu tạo chủ yếu của bao nhầy là
các polysaccarit (chủ yếu là glucose), ngoài ra còn có các polypeptit, protein.
Bao nhầy có tác dụng bảo vệ, cung cấp dinh dưỡng, giúp vi khuẩn bám vào
giá thể.
Theo tác giả Sokolnicki và cs [19] độ dai chắc của màng cellulose do vi
khuẩn sinh ra có liên quan đến hình dạng của tế bào vi khuẩn. Nếu độ dài
(chiều dài của tế bào) càng cao thì tính bền vững của màng cellulose do vi
khuẩn đó tổng hợp càng lớn. Kết quả này cùng phù hợp với nghiên cứu của
tác giả Nguyễn Thúy Hương (2006) khi nghiên cứu về mối liên hệ giữa hình
dáng kích thước tế bào vi khuẩn và độ chịu lực của màng BC cũng cho rằng
những dòng có tế bào dài thì màng BC mà chúng tạo ra có khả năng giữ nước
tốt hơn và có độ dai chắc hơn, còn những dòng Acetobacter xylinum có hình

dạng tròn dài thì màng BC của chúng khả năng chịu lực thấp hơn [6].

K33B Khoa sinh – KTNN

4

Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

Hình 1.1. là kết quả nhuộm Gram của vi khuẩn Acetobacter xylinum
BHN2

Hình 1.1. Kết quả nhuộm Gram của Actobacter xylinum BHN2

Hình 1.2. là hình dạng của vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 có
màng nhầy bao bọc:

Hình 1.2. Vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2

K33B Khoa sinh – KTNN

5

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

* Đặc điểm nuôi cấy
Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn Acetobacter xylinum hình thành
khuẩn lạc nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu
trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc lồi lên dễ tách khỏi môi trường [21]. Hình
1.3 là khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter xylinum trên môi trường dinh
dưỡng:

Hình 1.3. Khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter xylium

Ở điều kiện nuôi cấy tĩnh, trong môi trường dịch thể chúng sẽ hình
thành trên bề mặt môi trường một lớp màng cellulose – đó là tập hợp các tế
bào vi khuẩn liên kết với các phân tử cellulose, trong tế bào xảy ra quá trình
trao đổi chất nói chung còn ở màng cellulose xảy ra quá trình trao đổi oxy và
các chất dinh dưỡng [22].
Ngược lại, khi nuôi cấy trong điều kiện lắc, cellulose hình thành dạng
hạt nhỏ với kích thước không đều nhau và phân tán trong môi trường dinh
dưỡng tạo ra những đặc tính hình thái khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi
cấy tĩnh [12].
* Đặc điểm sinh lý – sinh hóa
+ Đặc điểm sinh lý
Vi khuẩn A.xylinum phát triển ở nhiệt độ 25 - 350C, pH = 4 - 6. Nhiệt độ
và pH tối ưu tuỳ thuộc vào giống. Ở 370C, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay
K33B Khoa sinh – KTNN

6

Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

cả trong môi trường tối ưu. Tuy nhiên vẫn còn những ý kiến khác nhau và
nhiều tranh cãi về điều kiện nhiệt độ, pH tối thích cho chủng vi khuẩn
A.xylinum sinh trưởng và tạo màng.
A.xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm
acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ.
+ Đặc điểm sinh hoá
Năm 1950, Frateur [26] đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn
cứ vào các tiêu chuẩn: Khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt
tính catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer [19]…Theo quan
điểm này A.xylinum là chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ
Pseudomonadales, lớp Schizomycetes. Đặc điểm phân biệt với các chủng khác
trong cùng một chi được trình bày ở bảng 1.1 dưới đây:
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn A.xylinum
theo Frateur (1950) [26]

TT

Đặc điểm
Oxy hoá ethanol thành

1

2

acid acetic

Hoạt tính catalase
Sinh trưởng trên môi

3

4

5

trường Hoyer

Hiện tượng
Chuyển hoá môi trường chứa
Bromphenol Blue

+

0,04% từ màu xanh sang màu vàng
Hiện tượng sủi bọt khí

+

Sinh khối không phát triển

_

Chuyển hoág lycerol

Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch

thành dihydroxyaceton

sau lên men

Chuyển hoá glucose

Vòng sáng xuất hiện xung quanh

thành acid

khuẩn lạc trên môi trường chứa CaCO3

K33B Khoa sinh – KTNN

Kết quả

7

+

+

Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

Kiểm tra khả năng sinh
6

Kiểm tra khả năng tổng
7

Không hình thành sắc tố nâu

_

Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam

+

sắc tố nâu

hợp cellulose

1.2. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Acetobacter xylinum
1.2.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tốt hơn cần cung cấp nguồn
cacbon phù hợp. Tuỳ nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp là vô
cơ hay hữu cơ. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào
hai yếu tố: thành phần hoá học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn, đặc
điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật.
Người ta sử dụng đường làm thức ăn nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật
dị dưỡng. Đường đơn ở nhiệt độ cao có thể bị chuyển hoá thành loại hợp chất
có màu tối khó hấp thụ. Trong môi trường kiềm sau khử trùng, đường còn dễ

bị chuyển hoá làm biến đổi pH môi trường. Để tránh hiện tượng này khi khử
trùng môi trường có chứa đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5atm ở
1100C trong 30 phút. Từ các loại đường đơn tốt nhất nên sử dụng phương
pháp hấp gián đoạn (phương pháp Tyndal). Để nuôi cấy các loại vi sinh vật
khác người ta sử dụng các nồng độ đường không giống nhau, với vi khuẩn
thường dùng 0,5-0,2% đường. Hầu hết các vi sinh vật chỉ đồng hoá được các
loại đường ở dạng đồng phân D [2].
Các hợp chất hữu cơ chứa cả cacbon cả nitơ (pepton, nước thịt, nước
chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch,...) có thể vừa sử dụng
làm nguồn cacbon, vừa sử dụng làm nguồn nitơ đối với vi sinh vật [2].
1.2.2. Nhu cầu nitơ của vi sinh vật
Nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thu nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+.
Tuy nhiên, khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường có sử dụng NH4+ thì sau

K33B Khoa sinh – KTNN

8

Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

khi chúng đồng hóa NH4+ trong môi trường sẽ tích lũy anion vô cơ (SO42-, Cl…) làm hạ thấp rất nhiều trị số pH của môi trường. Muối anion của các axit
hữu cơ ít làm chua môi trường hơn do đó có lúc được sử dụng nhiều hơn (mặc
dù đắt hơn).
Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp với nhiều loại tảo, nấm sợi,
xạ khuẩn nhưng lại ít thích hợp với vi khuẩn, vì sau khi vi khuẩn sử dụng hết

NO3- các ion kim loại còn lại sẽ kiềm hóa môi trường [2]. Vi sinh vật có khả
năng đồng hóa tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ. Các thức ăn này vừa là
nguồn cacbon vừa là nguồn cung cấp nitơ cho vi sinh vật. Vi sinh vật không
có khả năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân tử, chỉ có các polypeptid
không chứa quá 5 gốc axit amin mới có thể di chuyển trực tiếp qua màng tế
bào chất của vi sinh vật [2].
1.2.3. Hàm lượng ethanol trong dung dịch lên men
Ethanol được sử dụng như một cơ chất. Hàm lượng ethanol có thể thay
đổi từ 2-10% V. Hàm lượng cao hơn sẽ làm giảm năng suất lên men. Theo
Hong-Joo Son lại công bố hàm lượng ethanol có thể thay đổi từ 0,2-1% tốt
nhất ở 0,6% [22]. Theo Nodes, lượng ethanol duy trì trong môi trường luôn
giữ ở 3-3,5% . Các tác giả Ebner và Heirich, cho lượng ethanol dùng từ 710% V [19]. Để tránh hiện tượng oxy hoá hoàn toàn acid acetic cần có một
lượng ethanol sót trong sản phẩm từ 0,2-0,5% để ức chế sự tổng hợp enzyme
oxy hoá acid acetic và muối acetate. Ngoài việc oxy hoá ethanol, vi khuẩn
acetic còn có khả năng oxy hoá các rượu khác thành các acid tương ứng.
1.3. Đặc điểm và tính chất hình thành màng bacterrial cellulose
1.3.1. Đặc điểm cấu trúc của màng bacterrial cellulose
Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β – 1,4 glucopyranose mạch
thẳng . Nó có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng
cấu trúc và đặc tính của nó khác xa nhau.
K33B Khoa sinh – KTNN

9

Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

Chuỗi polyme β – 1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau
tạo thành sợi nhỏ có kích thước 1,5 nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi lớn
hơn – sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng
tạo thành dải lớn. Những dải lớn từ tế bào này đẩy ra ngoài liên kết với những
dải lớn của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc Van Der Waals tạo thành
dạng sệt (gel) hay một lớp màng mỏng. Kích thước bên của màng tăng lên khi
quần thể vi khuẩn sinh trưởng. Những điểm tạo màng BC mới có thể xuất
hiện, chính vì thế mà màng BC được mở rộng [23]. Hình 1.4 và hình 1.5 là
hình ảnh so sánh sợi cellulose của màng BC và sợi cellulose của thực vật.

Hình 1.4. Sợi cellulose của màng BC

Hình 1.5. Sợi cellulose của thực vật

1.3.2. Cơ chế tổng hợp bacterial cellulose
Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được
điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều
loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà [19].
Theo tác giả Alina Krystynowics và cộng sự cho rằng có 4 enzyme
tham gia xúc tác tổng hợp cellulose ở vi khuẩn A.xylinum đó là: Glucokinase
(GK),

Phosphoglucomutase

(PGM),

Glucose

-

1

-

phosphate

uridylyltransferase (UDPG pyrophosphorylase hay UGP), Cellulose synthase
(CS). Trong đó UGP là enzyme có vai trò quan trọng nhất [24].
Hình ảnh 1.6 là con đường sinh tổng hợp cellulose ở A. xylinum:

K33B Khoa sinh – KTNN

10

Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

Hình 1.6. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở A.xylinum
Một số ý kiến khác lại cho rằng:
A.xylinum hấp thu đường glucose từ môi trường nuôi cấy. Trong tế bào
vi khuẩn, glucose này sẽ kết hợp với acid béo tạo thành một tiền chất nằm
trên màng tế bào. Tiếp đó nó được thoát ra cùng với một enzyme. Enzyme
này có thể polime hóa glucose thành cellulose.
A.xylium tạo nên lớp cellulose dày là do môi trường nuôi cấy nước dừa
có bổ sung chất dinh dưỡng cần thiết. Cellulose là do những polisaccharide

không tan trong nước mà tan trong môi trường kiềm. Đó cũng là thành phần
chính của màng tế bào thực vật. Polisaccharide của vi sinh vật thường được
tích tụ đáng kể trong các môi trường lỏng. Vi sinh vật có khả năng tổng hợp
các oligo và polisaccharide. Lượng các oligo và các polisaccharide nội bào có
thể đạt tới 60% trọng lượng khô của tế bào. Tất cả các oligo và polisacharide
được tổng hợp bằng cách kéo dài chuỗi saccharide có trước nhờ vào việc

K33B Khoa sinh – KTNN

11

Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

thêm vào đơn vị monosaccharide. Đơn vị monosaccharide được thêm vào
phản ứng ở dạng nucleotide, monosaccharide được hoạt hóa thường là dẫn
xuất của các uridin diphotphat (UDP-X) nhưng đôi khi cũng dẫn xuất với các
nucleotide, purin và các primidin khác.
Sự tổng hợp diễn ra theo các phản ứng sau:
...X-X-X-X- +

UDP-X = ...X-X-X-X-X + UDP

n nhánh

(n + 1) nhánh

Cơ chế quá trình sinh tổng hợp diễn ra theo sự tổng hợp các loại
polisaccharide phân nhánh hiện nay chưa rõ. Người ta cho rằng thứ tự các gốc
đường và tính đặc trưng tham gia của chúng vào chuỗi polysaccharide phụ
thuộc vào enzyme transferase.
1.3.3. Tính chất của màng Bacteria cellulose.
Theo nghiên cứu của tác giả Huỳnh Thị Ngọc Lan – Nguyễn Văn
Thanh, bộ môn Vi sinh- khoa Dược, Trường đại học Y Dược Thành phố Hồ
Chí Minh đã nghiên cứu và chứng minh một số tính chất ưu việt của màng
BC như có khả năng thấm hút tốt thí nghiệm thử khả năng hút nước tối đa của
màng BC có độ ẩm từ 90% - 0%. Màng được ngâm trong nước sau các
khoảng thời gian xác định là 2, 4, 6, 12 giờ. Sau đó cân lại để kiểm tra lượng
nước hút được. Độ ẩm của màng BC ban đầu là 90% kết quả sau 12 giờ còn
lại là 19,84 %, màng BC có khả năng thấm nước cao, khả năng kết dính chặt
chẽ và trơ về mặt hóa học nên nó có vai trò như màng sinh học, có thể thay
thế da tạm thời [12].
Không những thế, màng BC còn có độ thông thoáng tốt khi đắp lên vết
thương sẽ không bị ứa nhiều dịch, độ thoáng ít phụ thuộc vào độ ẩm của
màng ban đầu. Khi chọn ngẫu nhiên 5 mẫu màng để thử độ bền cơ học bằng
cách kéo theo chiều dọc và chiều ngang thep phương pháp ASTMD 882 – 02
tại trung tâm kỹ thuật Tổng cục đo lường chất lượng.

K33B Khoa sinh – KTNN

12

Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

Điều kiện phòng thử nghiệm nhiệt độ từ 25 ± 30C, độ ẩm 55 ± 5% ổn
định mẫu trước khi thử ở 40C trong 24 giờ.
1.4. Tình hình nghiên cứu ứng dụng màng bacterrial cellulose trong điều
trị bỏng
1.4.1. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới
Hiện nay, vi khuẩn Acetobacter xylinum và ứng dụng của nó đang được
sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới tập trung theo hai hướng cơ
bản:
* Hướng 1: Chủ yếu là phân lập tuyển chọn, nghiên cứu các đặc tính
sinh học của Acetobacter xylinum từ đó xác định vị trí phân loại của chúng
trong sinh giới.
* Hướng 2: Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp, đặc điểm và ứng dụng
của vi khuẩn Acetobacter xylinum. Đó là các nghiên cứu về khả năng sinh
tổng hợp cellulose của các chủng Acetobacter xylinum, ảnh hưởng của môi
trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp
cellulose.
Mở đầu là nghiên cứu của R.M.Brown và cs, K.Zaa. Gần đây cơ chế
sinh tổng hợp cellulose, các hệ enzyme tham gia vào con đường chuyển hóa
cacbon trong vi khuẩn Acetobacter xylinum mới dần được sáng tỏ [23].
Từ sau nửa thế kỉ XIX đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về
ứng dụng của màng BC trong lĩnh vực khác nhau. Đặc biệt làm màng trị
bỏng, sử dụng màng BC đắp lên vết thương hở, vết bỏng và đã thu được kết
quả tốt như Wan và Millon đã được đăng kí bản quyền về làm màng BC từ
Acetobacter xylinum dùng trị bỏng. Về sau cũng có nhiều tác giả cũng nghiên
cứu về hướng này [25].

K33B Khoa sinh – KTNN

13

Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

1.4.2. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum ở Việt Nam
Tại Việt Nam tình hình điều trị bỏng trong nước ngày càng được cải
tiến. Có một số các nghiên cứu, công bố liên quan đến Acetobacter xylinum,
sự hình thành BC và ứng dụng màng BC. Các công trình mới chỉ bước đầu
nghiên cứu quá trình tạo màng, đặc tính cấu trúc màng làm cơ sở chế tạo
màng trị bỏng, sản xuất thạch dừa. Gần đây nhất là nghiên cứu ứng dụng
màng BC làm chất nền và giá đỡ để cố định tế bào vi khuẩn của Nguyễn Thúy
Hương và Phạm Thành Hổ [6], [16].
Năm 2006, tác giả Nguyễn Văn Thanh, Trưởng bộ môn Vi Sinh – Ký
Sinh, Trường đại học Y Dược học Tp.HCM đã chế tạo thành công màng trị
bỏng sinh học dầu mù u bằng phương pháp lên men. Màng BC có khả năng
thấm nước cao, kết dính chặt và trơ về mặt hóa học nên nó có vai trò như
màng sinh học, có thể thay thế da tạm thời. Với các hoạt chất tái sinh mô và
các chất sát khuẩn đều có nguồn gốc thiên nhiên không gây đau rát và không
chứa các yếu tố gây kích ứng da [17], chính vì vậy dùng màng sinh học để
ngăn ngừa biến chứng nhiễm trùng vết thương bỏng, tạo điều kiện che phủ
sớm vết thương, qua đó, rút ngắn thời gian điều trị và giảm thiểu sẹo xấu trên
vùng bỏng sâu.
Mới đây, nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung cũng đang
bước đầu ứng dụng màng BC trong điều trị bỏng trên thỏ. Công tác điều trị

bỏng hiện đang sử dụng phương pháp cấy ghép, phẫu thuật, hoặc dùng một số
màng trị bỏng như màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màng chitossan, sử dụng
các chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng [10]. Theo tác giả
Huỳnh Thị Ngọc Lan, màng trị bỏng sinh học BC với các hoạt chất tái sinh
mô và các chất sát khuẩn đều có nguồn gốc thiên nhiên.Vì thế, nó không chứa
các yếu tố nguy cơ như không có độc tố trực tiếp, không gây dị ứng, không có
yếu tố lây lan mầm bệnh, không giải phóng chất lạ vào vết thương. Màng có
K33B Khoa sinh – KTNN

14

Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

khả năng diệt 100% vi khuẩn thường gây ra các nhiễm trùng vết thương hở da
như vết bỏng... Chỉ cần áp sát màng vào vết thương và không cần sử dụng bất
cứ thứ gì khác, màng đã có khả năng cản khuẩn, đồng thời, làm vết thương
mau lành do thúc đẩy quá trình tái tạo mô hạt [12].
Hình 1.7 là hình ảnh mô tả đặc tính sinh học của màng BC trong
việc thay thế da tạm thời ứng dụng vào trị bỏng:

Hình 1.7. Màng sinh học dễ bong, không gây đau rát trong điều trị bỏng.
(Ảnh: Viện Bỏng Quốc gia)

Đặc biệt, tuy sản phẩm này là loại màng thay hàng ngày, nhưng do
khả năng làm mát trên bề mặt của da và ít dính chặt trên vết thương nên màng

rất dễ bong. Đồng thời, màng có ưu điểm là không gây đau như các loại màng
hiện đang sử dụng trong việc điều trị bỏng như gạc vô trùng hay băng bán
thấm.
Không chỉ ở Việt Nam mà hầu hết các quốc gia trên thế giới, việc
điều trị bỏng bằng các thuốc trị bỏng có nguồn gốc từ tự nhiên đã được áp
dụng rất lâu và phổ biến. Các thuốc này có sẵn trong thiên nhiên và có nhiều
đặc tính tốt cho điều trị bỏng cũng như chữa các vết thương, côn trùng đốt…

K33B Khoa sinh – KTNN

15

Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

CHƯƠNG 2
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu và hóa chất
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là chủng Acetobacter xylinum BHN2 được nhận
từ phòng thí nghiệm Vi Sinh - Khoa sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm
Hà Nội 2 cung cấp.
2.1.2. Hoá chất
Trong quá trình tiến hành nghiên cứu, chúng tôi có sử dụng đến nhiều
loại hóa chất, những hóa chất chúng tôi sử dụng được cung cấp bởi phòng thí
nghiệm Vi Sinh- Khoa sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.

- Nguồn đường: glucose do Công ty dược T.W MEDIPLANTEX HNVN sản xuất.
- Nguồn nitơ:
+ Nguồn nitơ vô cơ: (NH4)2SO4 do Trung Quốc sản xuất.
+ Nguồn nitơ hữu cơ: pepton, cao thịt do Trung Quốc sản xuất.
Một số hóa chất vô cơ: KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaOH do Trung Quốc
sản xuất.
- Một số loại thuốc nhuộm: tím gentian, dung dịch fushsin, dung dịch
lugol.
-

Agar do công ty TNHH Hải Long – Hải Phòng sản xuất.

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ
Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức).
Nồi hấp Tommy (Nhật).
Máy so màu UV – vis ( Nhật).
Máy đo pH (MP 200R - Thụy Sỹ).

K33B Khoa sinh – KTNN

16

Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh).

Máy li tâm Sorvall (Mỹ).
Micropipet Jinson (Pháp), các loại từ 20ml – 100ml.
Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức): Axioskop 40.
Cân (Precisa XT 320M - Thụy sỹ).
Hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, đèn cồn… và nhiều
dụng cụ hóa sinh quan trọng khác.
2.1.4. Môi trường nghiên cứu
2.1.4.1. Môi trường phân lập giống (MT1)
Glucose: 20 g

(NH4)2SO4: 3 g

KH2PO4: 2 g

MgSO4.7H2O: 2 g

CaCO3 : 10g

Agar: 20g

Pepton: Pepton 4g
Axit acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Nước máy: 1000ml.
2.1.4.2. Môi trường nhân giống cơ bản (MT2)
Glucose: 20 g

(NH4)2SO4: 3 g

KH2PO4: 2 g

MgSO4.7H2O: 2 g

Pepton: 4g
Axit acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Nước máy: 1000ml.
2.1.4.3. Môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng
Glucose: 20 g

(NH4)2SO4: 3 g

KH2PO4: 2 g

MgSO4.7H2O: 2 g

Pepton: 4g

K33B Khoa sinh – KTNN

17

Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

Axit acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).

Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Nước dừa: 500ml.
Nước máy: 500ml
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc [21]
Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa vi khuẩn 24 giờ nuôi cấy, pha loãng
theo phương pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha
loãng rồi trang đều trên môi trường thạch đĩa. Nuôi ở 30oC trong 5 ngày đếm
khuẩn lạc (CFU) trong môi trường đĩa petri, từ đó xác định số lượng tế bào vi
khuẩn trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức.

N  Ai .

1000 1
.
Vi 10n

Trong đó N : Tổng số CFU trong 1ml mẫu ban đầu.
Ai: Số khuẩn lạc trung bình tạo vòng phân giải
CaCO3 trên đĩa phân lập có độ pha loãng 10-n.
Vi : Thể tích dịch mẫu trên mỗi đĩa phân lập.
10-n : Là độ pha loãng của mẫu phân lập.
2.2.2. Phân biệt tế bào vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram
Vi khuẩn Acetobacter xylinum là các vi khuẩn Gram âm, do đó có thể
phân biệt với vi khuẩn Gram dương nhờ phương pháp nhuộm Gram (kép).
Vai trò: Nhuộm gram là phương pháp nhuộm sử dụng hai hay nhiều
loại thuốc nhuộm trên một tiêu bản nhằm quan sát và định loại tế bào vi
khuẩn dựa vào khả năng tạo thành trong tế bào hợp chất bền vững của protit
đặc biệt với thuốc nhuộm kiềm và Iốt.
Tiến hành: Lấy chủng Acetobacter xylinum đem nhuộm tiêu bản theo

K33B Khoa sinh – KTNN

18

Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

phương pháp nhuộm Gram. Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu của
kính hiển vi quang học Olympus với độ phóng đại 1000 lần [3], [4], [5].
2.2.3. Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng
Các chủng giống sau khi phân lập được xác lập là vi khuẩn Acetobacter
xylinum được cấy vào ống thạch nghiêng, nuôi 4 – 5 ngày trong tủ ấm ở 300C.
Sau đó giữ trong tủ lạnh ở 40C dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Cấy truyền
giữ giống trên thạch nghiêng khoảng 1 tháng một lần [4], [5].
2.2.4. Phương pháp hoạt hóa giống
Giống trong ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử
dụng phải hoạt hóa giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật
cho quá trình lên men. Phương pháp hoạt hóa sử dụng môi trường tiêu chuẩn
không có thạch aga, đem hấp thanh trùng. Sau đó đem xử lý trong đèn tím 15
phút, cấy truyền giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút
trong 24 giờ [4], [5].
2.2.5. Phương pháp lên men tạo màng
Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng . Sau đó
khử khuẩn ở đèn tím trong 15 phút. Bổ sung vào môi trường 5% giống hoạt
hóa.

Nuôi ở điều kiện tĩnh trong 4 – 5 ngày.
2.2.6. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả
Xử lý thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số phương pháp
trong cuốn “Ứng dụng tin học trong sinh học”, và “Thống kê và ứng
dụng” [14] như:
* Số trung bình cộng: Dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại
thí nghiệm.

X

1 n
 Xi
n i 1

K33B Khoa sinh – KTNN

19

Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Hoài Nam

n

(X
* Trung bình bình phương các sai lệch  
* Sai số đại diện của trung bình cộng

m 

* Hệ số biến thiên trung bình cộng:

i

 X )2

i 1

n 1


n
Cv 

x100
X

2.2.7. Phương pháp xử lý màng BC từ Acetobacter xylinum
Do màng BC khi được tạo thành còn khá nhiều thành phần dư của môi
trường bám vào nên mục đích của quá trình xử lý màng là loại bớt các sản
phẩm dư (thành phần chính là đường dư), giảm độ pH, làm sạch khuẩn đồng
thời phần nào giúp màng đạt được hiệu quả về mặt cảm quan: màu trắng
trong, dai và bền hơn… Song màng BC chúng tôi nghiên cứu chủ yếu được
ứng dụng sản xuất ở quy mô công nghiệp, vì vậy các bước xử lý màng phải
đơn giản, hiệu quả và ít tốn kém. Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi tiến
hành thử khả năng ngăn cản vi khuẩn, khả năng thấm hút nước và một số loại
thuốc bỏng thông dụng của màng, dựa vào các tiêu chí như: khả năng ngăn

cản vi khuẩn, khả năng thấm hút nước, thấm hút nghệ, thấm hút thuốc kháng
sinh và một số đặc điểm của màng sau xử lý cần đạt được độ pH trung tính,
màu sắc phù hợp, màng có khả năng thấm hút tốt .
Màng BC thu trực tiếp từ dịch nuôi cấy được qua các bước xử lí sau:

K33B Khoa sinh – KTNN

20

Đại học Sư phạm Hà Nội 2