Phát hiện và phân biệt chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn bằng phương pháp multiplex RT PCR (reverse transcription polymerase chain reaction)

BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ THU

PHÁT HIỆN VÀ PHÂN BIỆT CHỦNG VIRUS GÂY
HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN
BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX RT-PCR (REVERSE
TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ THU

PHÁT HIỆN VÀ PHÂN BIỆT CHỦNG VIRUS GÂY
HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN
BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX RT-PCR (REVERSE
TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION)

Chuyên ngành : Động Vật Học
Mã số

: 60 42 01 03

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ DIỆU THÚY

Hà Nội – 2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các
kết quả nêu trong Luận văn chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào
khác. Các số liệu, ví dụ và trích dẫn trong Luận văn đảm bảo tính chính xác,

tin cậy và trung thực. Tôi đã hoàn thành tất cả các môn học và đã thanh toán
tất cả các nghĩa vụ tài chính theo quy định của Phòng Đào tạo sau Đại học,
Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật.
Vậy tôi viết Lời cam đoan này đề nghị Phòng Đào tạo sau Đại học,
Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật xem xét để tôi có thể bảo vệ Luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
NGƢỜI CAM ĐOAN

Nguyễn Thị Thu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Diệu
Thúy, Phó trưởng phòng Công nghệ gen động vật, Viện Công nghệ Sinh học,
Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và truyền
đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ chỉ bảo tận tình về
chuyên môn và sự động viên chân thành của tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng
Công nghệ gen động vật, Viện Công nghệ sinh học.
Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, các Cô Phòng Đào tạo sau đại
học - Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều
kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên,
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày… tháng … năm 2013
Học Viên

NGUYỄN THỊ THU

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... I
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... IV
MỤC LỤC ................................................................................................................. V
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT....................................... VI
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. VIII
DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................... IX
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
NỘI DUNG ................................................................................................................ 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3
1.1. Khái quát về hội chứng hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS - Porcine
reproductive and respiratory syndrome) ................................................................ 3
1.1.1. Sự xuất hiện và phát sinh dịch bệnh của bệnh PRRSV ................................. 3
1.1.2. Triệu chứng lâm sàng .................................................................................... 6
1.1.3. Tác hại của bệnh ............................................................................................ 7
1.1.4. Đƣờng truyền lây của virus............................................................................ 8
1.2. Tổng quan về virus PRRS (Porcine reproductive and respiratory
syndrome virus) ......................................................................................................... 8
1.2.1. Đặc điểm của virus ........................................................................................ 8
1.2.2. Cấu trúc virus ................................................................................................. 9
1.2.3. Chức năng của ORFs .................................................................................. 11
1.2.4. Đặc tính vai trò của Protein chức năng N .................................................... 13
1.3. Các phƣơng pháp phát hiện PRRSV.............................................................. 14

1.3.1.Biểu hiện lâm sàng........................................................................................ 14
1.3.2. Phân lập virus............................................................................................... 15
1.3.3. Phƣơng pháp chẩn đoán huyết thanh học .................................................... 15
1.3.4. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa trên nguyên lý PCR (RT-PCR và realtime RTPCR)....................................................................................................................... 16
1.4. Tình hình nghiên cứu PRRSV trên thế giới và Việt Nam ............................ 22
1.4.1. Tình hình nghiên cứu PRRSV trên thế giới................................................. 22
1.4.2. Tình hình nghiên cứu PRRSV ở Việt Nam ................................................. 25
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 29
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................. 29
2.2. Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 29
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

2.2.1. Mồi sử dụng ................................................................................................. 29
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ....................................................................... 30
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................. 31
2.3.1. Tách RNA tổng số ....................................................................................... 31
2.3.2. Phƣơng pháp thiết kế mồi ............................................................................ 31
2.3.3. Phƣơng pháp RT-PCR ................................................................................. 32
2.3.4. Tinh sạch đoạn ORF7 để giải trình tự ......................................................... 33
2.3.5. Phân tích trình tự gen và amino acid tƣơng ứng của các chủng PRRSV .... 34
2.3.6. Xác định độ đặc hiệu ..................................................................................... 34
2.3.7. Xác định độ nhậy........................................................................................... 34
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................. 37
3.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số ...................................................................... 37
3.2. Kết quả nhân đoạn gen ORF7 ........................................................................ 37
3.3. Kết quả giải trình tự đoạn gen ORF7 ............................................................ 38
3.3.1. So sánh sự khác nhau về trình tự nucleotide của ORF7 .............................. 38
3.3.2.2. So sánh sự khác nhau về thành phần amino acid của ORF7 .................... 43

3.3.2.3.So sánh mức độ tƣơng đồng về trình tự nucleotide và thành phần amino
acid của đoạn gen ORF7 ........................................................................................ 46
3.3.2.4. Phân tích cây phả hệ của PRRSV ở đoạn gen ORF7 ............................... 50
3.4. Thiết kế mồi và kiểm tra độ nhậy của PRRSV.............................................. 52
3.5. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của PRRSV..................................................... 54
3.6. Kết quả kiểm tra độ nhậy của PRRSV .......................................................... 55
3.6.1. Kết quả kiểm tra độ nhậy ............................................................................. 55
3.6.2. Kết quả chẩn đoán dựa vào phƣơng pháp mRT-PCR ................................. 56
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 59
Kết luận .................................................................................................................... 59
Đề nghị...................................................................................................................... 59
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ......... 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 61
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 70

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu

Tên tiếng Anh

cDNA

Complementary Deoxyribonucleic acid

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Tên tiếng Việt

/>

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axit Deoxyribonucleic

RNA

Ribonucleic acid

Axit Ribonucleic

Base paire

Cặp bazơ

bp
cs

Cộng sự

aa

Amino acid

Axit amin

nt

Nucleotide

Nucleotit

Deoxyribonucleic acid triphosphate

Deoxynucleosit triphotphat

Loading buffer

Đệm tra mẫu

Number

Số lƣợng mẫu

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

Reverse Transcription Polymerase
Chain Reaction

Phản ứng chuỗi đồng phân hóa
sao chép ngƣợc

mRTPCR

Multiplex Reverse Transcription
Polymerase Chain Reaction

Phản ứng nhiều chuỗi đồng phân
hóa sao chép ngƣợc

ORF

Open reading frame

Khung đọc mở

NA

North American type

Kiểu Bắc Mỹ

EU

European type

Kiểu Châu Âu

Nsp

non-structural protein

Protein không cấu trúc

NLS

nuclear localization signal

Vùng tín hiệu định vị nhân

NoLS

nucleolar localization signal

Vùng tín hiệu định vị hạch nhân

Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome
Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome Virus

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô
hấp ở lợn
Virus gây hội chứng rối loạn sinh
sản và hô hấp ở lợn

PCV2

Porcine Circovirus type 2

Virus Ciro loại 2

CSFV

Classical swine fever virus

Virus sốt cổ điển lợn

RNase

Ribonuclease

Ribonucleaza

TE

Tris boric acid - EDTA

Đệm TE

µg

Microgram

Mi – cro – gam

µl

Microlitre

Mi – cro – lít

dNTP
LB
n
PCR
RT-PCR

PRRS
PRRSV

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Trình tự mồi dùng để khuếch đại gen ....................................................... 29
Bảng 2.2: Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm........................................................ 30
Bảng 2.3: Các dung dịch đệm cần pha ...................................................................... 30
Bảng 2.4: Các các hóa chất sử dụng ......................................................................... 31
Bảng 2.5: Thành phần của phản ứng tổng hợp cDNA .............................................. 32
Bảng 2.6: Thành phần của phản ứng tổng hợp cDNA .............................................. 32
Bảng 2.7: Chu trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA ......................................... 33
Bảng 2.8: Thành phần của phản ứng khuếch đại gen ORF7..................................... 33
Bảng 2.9: Chu trình phản ứng khuếch đại gen ORF7 ............................................... 33
Bảng 2.10: Danh sách các loại vaccine phòng bệnh PRRS đang lƣu hành ở
Việt Nam ................................................................................................................... 35
Bảng 2. 11: Các mẫu PRRSV phân lập năm 2012, năm 2007 - 2010 và chủng
virus JXA1-R ............................................................................................................ 35
Bảng 2.13: Các chủng trên Genbank lựa chọn để so sánh với gen ORF7 ................ 36
Bảng 3.1: Tỷ lệ phần trăm tƣơng đồng về trình tự nucleotide (phía trên đƣờng
chéo) và thành phần amino acid suy diễn (phía dƣới đƣờng chéo) của gen
ORF7 ......................................................................................................................... 47
Bảng 3.2: So sánh mức tƣơng đồng về trình tự nucleotide (nt) và amino acid
(aa) (%) của ORF7 ở các mẫu phân lập so với một số chủng đại diện (LV, VR2332, 07QN, JXA1, CH-1a, IngelvacMLV vaccine, MLV.becta.vaccine,
JXA1-R vaccines). .................................................................................................... 49
Bảng 3.3: Kết quả chẩn đoán 158 mẫu có triệu chứng nhiễm PRRSV phân lập

ở VN .......................................................................................................................... 57

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Phổi và thận bị xuất huyết của lợn nhiễm PRRSV ....................................6
Hình 1.2. Đại thực bào của tế bào bình thƣờng và tế bào bị nhiễm PRRSV .............9
Hình 1.3. Cấu trúc genome PRRSV ............................................................................9
Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm tách chiết RNA tổng số của mẫu phân lập. .....37
Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR gen ORF7 có kích thƣớc 490 bp. ......38
Hình 3.3. Kết quả so sánh trình tự nucleotide trên đoạn gen ORF7 của các mẫu
PRRSV phân lập (trong nƣớc, chủng VR2332 và các chủng phân lập từ
vaccine JXA1-R, BSL-PS 100, IngelvacMLV). ........................................41
Hình 3.4. Kết quả so sánh thành phần amino acid trên đoạn gen ORF7 của các mẫu
phân lập trong nƣớc, chủng VR2332 và các chủng phân lập từ vaccine
JXA1-R, BSL-PS 100, IngelvacMLV. ......................................................44
Hình 3.5. Cây phân loại di truyền các chủng PRRSV của đoạn gen ORF7 .............51
Hình 3.6. Sơ đồ bộ mồi thuộc ORF7 của PRRSV có kích thƣớc 245 bp (chủng NA),
161 bp (chủng EU). ....................................................................................52
Hình 3.7. Kiểm tra bộ mồi thiết kế trên vùng gen ORF7 có kích thƣớc 245 bp .......53
Hình 3.8. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm multiplex RT-PCR gen ORF7. ..........53
Hình 3.9. Kết quả điện di kiểm tra độ đặc hiệu của các mẫu phân lập với
PCV2/CSFV...............................................................................................55
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen ORF7 có kích thƣớc 245 bp của mẫu
1155 ở các nồng độ pha loãng 10 lần (nồng độ ban đầu là 1,87 ng/ µl)....56
Hình 3.11. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm multiplex RT-PCR gen ORF7 sử dụng cặp
mồi multiplex có kích thƣớc 245 bp (chủng NA), 161 bp (chủng EU). ............56

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

MỞ ĐẦU
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS - Porcine reproductive and
respiratory syndrome) còn gọi là bệnh “tai xanh” là bệnh truyền nhiễm cấp tính
nguy hiểm xảy ra trên lợn. Bệnh gây sảy thai ở lợn nái, rối loạn đƣờng hô hấp trên
lợn sơ sinh và lợn choai, do virus PRRS, thuộc họ Arteriviridae, bộ Nidovirales gây
ra. Bệnh xảy ra lần đầu tiên ở Mỹ vào khoảng năm 1987, sau này đƣợc tìm thấy ở
Châu Âu, và xuất hiện ở Châu Á vào đầu những năm 1990. Cho đến nay, bệnh tai
xanh đã lan rộng trên các vùng khắp thế giới với những đặc trƣng của từng chủng
khác nhau trên từng vùng, gây ra những thiệt hại kinh tế nặng nề hàng năm.
PRRS do Arterrivirus gây nên, loại virus này đƣợc phân lập và định loại vào
năm 1991. Nó là một virus có áo bao, thuộc loại ARN virus, có kích thƣớc vào
khoảng 45 ÷ 80 nm, chịu đƣợc nhiệt độ thấp (tồn tại 4 tháng dƣới nhiệt độ -700C).
Vật chất di truyền của virus PRRS là RNA mạch đơn có kích thƣớc phân tử khoảng
15 kb mã hóa cho protein cấu trúc và protein không cấu trúc. Virus PRRS có gồm 2
gen (ORF1a, ORF1b) mã hóa cho các protein không cấu trúc 7 bảy gen (GP1, GP2,
GP3, GP4, GP5, M và N) mã hóa cho các protein cấu trúc và chức năng.
Virus PRRS có mặt ở Việt Nam từ năm 1994, tuy nhiên từ đầu năm 2007 đến
nay đã liên tục gây ra các đại dịch và ảnh hƣởng nghiêm trọng đến số lƣợng và chất
lƣợng đàn lợn. Ngay cả khi không có dịch bệnh xuất hiện thì bệnh vẫn tồn tại và
lƣu hành trong các đàn lợn, gây nhiều thiệt hại về kinh tế. Theo thống kê của Cục
Thú Y năm 2012, dịch bệnh tai xanh gây thiệt hại nghiêm trọng đến ngành chăn
nuôi lợn, số lợn mắc bệnh là 90.688, tổng số chết là 14.065 con, tổng số lợn phải
tiêu hủy là 51.761 con. Các nghiên cứu gần đây xác nhận chủng virus PRRS lƣu
hành tại Việt Nam có quan hệ gần gũi với các chủng virus PRRS độc lực cao đang
lƣu hành tại Trung Quốc. Nghiên cứu về lĩnh vực này tại Việt Nam đã bắt đầu tập
trung vào các nghiên cứu về dịch tễ học, bệnh học và miễn dịch học virus PRRS,

phát triển các kít chẩn đoán bệnh chính xác, phân biệt chủng virus vaccine và virus
thực địa. Đánh giá mức độ biến đổi di truyền của các chủng virus PRRS thực địa, so
sánh với các chủng vaccine đang lƣu hành góp phần khuyến cáo việc sử dụng chủng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

vaccine hiệu quả nhằm kiểm soát tốt dịch bệnh, hạn chế tổn thất kinh tế.
Thực tế cho thấy, các tác nhân gây bệnh là virus ngày càng có sự biến đổi di
truyền cao do đó hình thành nên các biến chủng/dòng khác nhau gây khó khăn cho
công tác chẩn đoán bệnh một cách chính xác. Cho đến nay, các biện pháp khống
chế bệnh đƣợc áp dụng ở nhiều nƣớc nhƣng vẫn chƣa đem lại hiệu quả nhƣ mong
muốn. Phƣơng pháp RT-PCR đã đƣợc sử dụng để đồng thời nhận diện, phân biệt
nhiều loại virus hoặc các chủng/dòng khác nhau của cùng một loại tác nhân gây
bệnh trong cùng một mẫu dựa vào kích thƣớc đoạn gen đƣợc khuếch đại. Xuất phát
từ thực tiễn và yêu cầu trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Phát hiện và phân biệt
chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn bằng phƣơng pháp
multiplex RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)”.
Mục tiêu:
Giải trình tự toàn bộ vùng gen ORF7 của virus PRRS phân lập tại Việt Nam.
Phân tích đặc tính di truyền ở mức độ nucleotide và amino acid của các
chủng virus PRRS phân lập.
So sánh, đánh giá về quan hệ di truyền của các chủng virus PRRS đang lƣu
hành tại Việt Nam với các chủng virus đã phân lập tại Việt Nam trƣớc đây, các
chủng nguyên thủy, các chủng đang lƣu hành ở các vùng địa lý khác nhau trong khu
vực và trên thế giới, và với các chủng vaccine đang sử dụng.
Thiết kế bộ mồi đặc hiệu để nhận biết và phân biệt virus PRRS kiểu gen Bắc
Mỹ và Châu Âu.
Nội dung:
Thiết kế cặp mồi đặc hiệu.

Tối ƣu phƣơng pháp multiplex RT-PCR.
Kiểm tra độ nhậy của của cặp mồi sử dụng phƣơng pháp multiplex RT-PCR.
Kiểm tra độ đặc hiệu của mẫu nghiên cứu.
Kiểm tra trên các mẫu thực địa để nhận biết và phân biệt chủng virus PRRS đang
lƣu hành.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát về hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS Porcine reproductive and respiratory syndrome)
1.1.1. Sự xuất hiện và phát sinh dịch bệnh của bệnh PRRSV
 Trên thế giới
Bệnh này đƣợc mô tả lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1987 [45], sau đó, đến năm
1990 lan đến Châu Âu [74] và sau cùng là Châu Á. Ban đầu dựa vào vào các biểu
hiện đầu tiên của bệnh và cũng do chƣa xác định đƣợc căn bệnh mà PRRS đƣợc gọi
là “bệnh bí hiểm” sau đó có tên lần lƣợt nhƣ: Hội chứng hô hấp và sẩy thai ở lợn
(SIRS – Swine infertility and Respiratory Syndrome), bênh sốt cao, biếng ăn, sảy
thai ở lợn (HAAT – Hyperthermie Avortements dé Truies), bệnh tai xanh (blue ear
disease). Năm 1992, tổ chức Thú ý thế giới (O.I.E) công nhận tên chính thức là hội
chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS).
Ở Mỹ là một quốc gia đầu tiên phát hiện sự có mặt và chịu ảnh hƣởng nặng nề
của dịch bệnh PRRSV. Bệnh xảy ra ở hầu hết quốc gia có chăn nuôi lợn trên toàn
thế giới và có tác động rất lớn về mặt kinh tế đối với ngành chăn nuôi. Tại Trung
Quốc, dịch bệnh PRRS đã xuất hiện trong những năm gần đây và hiện đang còn tồn
tại. Chủng virus đang lƣu hành tại nƣớc này chủ yếu là chủng thuộc dòng Bắc Mỹ,
chúng đƣợc chia thành hai dạng, gồm chủng cổ điển (gây chết ít lợn mắc bệnh) và
chủng độc lực cao (gây chết nhiều lợn nhiễm bệnh). Vào năm 2006 một dạng độc

tính cao của virus đã ảnh hƣởng đến hơn 2 triệu con lợn và gây ra cái chết của ít
nhất 400.000 con lợn từ tháng 6 đến tháng 9 trên 6 tỉnh thành của Trung Quốc.
 Tại Việt Nam
PRRSV đã xâm nhập vào Việt Nam từ năm 1994 trên đàn giống lợn nhập từ
Mỹ, tuy nhiên từ thời điểm đó đến năm 2006 hầu nhƣ vẫn chƣa có thông tin nào về
đại dịch [22]. Đến đầu năm 2007, diễn biến của dịch tại Việt Nam ngày càng trở
nên phức tạp.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Dấu ấn quan trọng của dịch PRRS tại Việt Nam đƣợc bắt đầu từ 12/3/2007,
hàng loạt đàn lợn tại Hải Dƣơng có những biểu hiện ốm khác thƣờng và có những
triệu chứng lâm sàng tƣơng tự nhƣ bệnh sốt cao ở lợn cái xảy ra ở Trung Quốc
trong suốt năm 2006. Ngày 23/3/2007, lần đầu tiên cơ quan thú y tại tỉnh này đã báo
cáo cho Cục Thú y, ngay sau đó ngày 26/3/2007, Trung tâm chẩn đoán Thú y Trung
ƣơng – Cục Thú y đã tiến hành lấy mẫu xét nghiệm và cho kết quả dƣơng tính với
virus PRRS [2]. Bệnh ngay lập tức lan nhanh ra 6 tỉnh thành của vành đai sông
Hồng là Hƣng Yên, Quảng Ninh, Hải Phòng, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang với
hàng ngàn con lợn bị nhiễm. Thời điểm này, dịch bệnh đã tác động đến khoảng
65.000 con lợn và phải tiêu hủy hơn 15.000 con. Trong năm 2008 – 2009 dịch bệnh
đã bùng phát trở lại ở cả 3 miền với thiệt hại nặng nề [14].
Theo Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, trong năm 2008 dịch tai xanh
đã xảy ra hai đợt chính tại 953 xã, phƣờng thuộc 99 huyện, thị và thành phố của 25
tỉnh. Tổng số lợn mắc bệnh là 308.901 con, số chết, buộc phải tiêu huỷ là 299.988
con: Đợt 1, dịch tập trung chủ yếu tại các tỉnh miền Bắc Trung bộ. Do phát hiện
chậm, không kiểm soát đƣợc việc vận chuyển lợn, thú y âm thầm chữa trị lợn bệnh
và không báo cáo nên dịch đã đồng loạt xuất hiện tại nhiều địa phƣơng, rồi lây lan
rất nhanh ra các địa phƣơng lân cận. Hậu quả là hàng trăm nghìn con lợn đã mắc

bệnh, phải tiêu huỷ tại gần 1.000 xã, phƣờng và thị trấn trong khoảng thời gian
ngắn; Đợt 2, dịch xuất hiện rải rác tại nhiều địa phƣơng ở cả 3 miền (Bắc, Trung và
Nam). Do triển khai áp dụng đồng bộ nhiều biện pháp nên dịch đƣợc khống chế ở
phạm vi và quy mô nhỏ hẹp hơn đợt 1 (trừ Quảng Trị) [3].
Năm 2009, dịch xảy ra ở 69 xã thuộc 26 huyện của 13 tỉnh, thành phố: Bến
Tre, Bình Dƣơng, Đồng Nai, Tiền Giang, Vĩnh Long, Hƣng Yên, Quảng Ninh, Bắc
Giang, Quảng Nam, Gia Lai, Bạc Liêu, Bà Rịa - Vũng Tầu và Đắk Lắk với 7.030
lợn mắc bệnh và 5.847 lợn buộc phải tiêu huỷ [4].
Trong năm 2010, dịch bệnh heo tai xanh có nhiều diễn biến phức tạp, dịch
xảy ra trên diện rộng từ miền Bắc - Trung - Nam dịch xảy ra hai đợt dịch lớn: Đợt
1/2010 (miền Bắc). Dịch lợn tai xanh xảy ra từ ngày 23/3/2010 tại Hải Dƣơng. Tính
đến hết tháng 6/2010, toàn quốc ghi nhận các ổ dịch tai xanh tại 461 xã, phƣờng, thị
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

trấn của 71 quận, huyện thuộc 16 tỉnh, thành phố gồm Hải Dƣơng, Hƣng Yên, Hải
Phòng, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Hà Nội, Nam
Định, Hà Nam, Nghệ An, Quảng Ninh, Hòa Bình, Cao Bằng, Sơn La. Tổng số lợn
mắc bệnh là 146.051 con trong đó số tiêu hủy là 65.911 con; Đợt 2/2010 (miền
Trung và miền Nam): Đợt dịch này bắt đầu từ ngày 11/6/2010 tại Sóc Trăng. Sau đó
dịch xuất hiện tại Tiền Giang (ngày 19/6), Bình Dƣơng (ngày 27/6), Long An (ngày
15/7), Lào Cai (11/7), Quảng Trị (01/7). Trong đợt dịch này, toàn quốc ghi nhận các
ổ dịch tai xanh tại 42.080 hộ chăn nuôi của 1.517 xã, phƣờng, thị trấn thuộc 215
quận, huyện của 36 tỉnh, thành phố. Tổng số lợn trong đàn mắc bệnh là 970.857
con, số mắc bệnh là 717.830 con, trong đó số chết, tiêu hủy là 413.540 con [5].
Năm 2011, dịch tai xanh xảy ra hai đợt, tuy nhiên số ổ dịch và số lợn mắc
bệnh, số lợn bị tiêu hủy giảm rất nhiều (gần 20 lần cả về phạm vi, quy mô dịch và
số lƣợng gia súc phải tiêu hủy) so với năm 2010. Đợt 1: Tổng số lợn mắc bệnh là
14.759 con trong đó có 1.468 con lợn nái, 5.346 con lợn thịt và 7.665 con lợn con;

tổng số lợn phải tiêu hủy là 14.158 con trong đó 1.373 con lợn nái, 4.850 con lợn
thịt và 7.581 con lợn con; Đợt 2: Tổng số lợn mắc bệnh là 27.558 con trên tổng đàn
46.328 con của các tỉnh có dịch, số lợn phải tiêu hủy là 12.361con [6].
Tính từ đầu năm đến 25 tháng 12 năm 2012 toàn quốc ghi nhận các ổ dịch tai
xanh tại 453 xã/phƣờng, thị trấn của 95 quận/ huyện thuộc 28 tỉnh. Tổng số lợn mắc
bệnh là 90.688 con, tổng số chết là 14.065 con, tổng số lợn phải tiêu hủy là 51.761
con. Qua giám sát diễn biến của từng ổ dịch theo từng tháng của năm, có thể thấy
rằng dịch bắt đầu xuất hiện lẻ tẻ vào đầu tháng 1 đến cuối tháng 3, sau đó phát triển
lây lan trên diện rộng trong giai đoạn tháng 4 đến cuối tháng 7 [7].
Năm 2013 dịch lợn tai xanh tuy không bùng phát mạnh nhƣng vẫn xuất hiện
rải rác tại một vài tỉnh trong khoảng thời gian từ tháng 2 đến tháng 5 đã làm chết và
tiêu hủy hơn 6.000 con lợn. Dịch lợn tai xanh: Xuất hiện tại 9 tỉnh là Long An,
Quảng Nam, Quảng Trị, Nghệ An, Thanh Hóa, Hà Tĩnh, Nam Định, Bắc Ninh và
Thái Bình trong 6 tháng đầu năm. Tính đến ngày 22/6/2013 cả nƣớc không còn tỉnh
nào có dịch lợn tai xanh chƣa qua 21 ngày [8].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

1.1.2. Triệu chứng lâm sàng
Dấu hiệu lâm sàng có thể đƣợc quan sát hoặc trong đàn giống hoặc trong đàn
thịt hoặc cả hai nhƣng trong đàn thịt các bệnh khác có lẽ làm che mất sự nhiễm mầm
bệnh chính và làm khó phát hiện hơn. Căn cứ vào sự biểu hiện các triệu chứng của bệnh,
ngƣời ta có thể chia thành hai giai đoạn khác nhau: Giai đoạn 1 là biểu hiện các triệu
chứng rối loạn sinh sản đối với lợn nái và giai đoạn hai là sự biểu hiện của các triệu
chứng hô hấp. Trong khoảng 6-12 tuần sẽ có biểu hiện bệnh trong đàn lợn.
Các triệu chứng trong giai đoạn 1 hay các triệu chứng sinh sản bao gồm: Sốt
39-40oC, bỏ ăn, mệt mỏi, giảm tỷ lệ thụ thai và số con đẻ ra, sảy thai (tỷ lệ này có
thể đến 50 % trong các đàn mới bị nhiễm virus), giảm tiết sữa hoặc mất sữa hoàn
toàn, thai khô (thai gỗ), chết thai, đẻ non, chậm động dục hoặc không động dục trở

lại, rối loạn sinh sản có thể kéo dài đến vài tháng. Giai đoạn biểu hiện các triệu
chứng hô hấp: Loạn hô hấp, lợn biểu hiện đau khi thở. Các triệu chứng ở lợn con:
Tỷ lệ chết trƣớc cai sữa cao, lợn gày yếu, bỏ ăn.
Các triệu chứng thuộc giai đoạn 2 ở lợn con: Hắt hơi, tăng tần số hô hấp, thở
khó, thở đứt quãng, gày, yếu, phù mắt, các nốt phồng rộp trên da, ỉa chảy, đi không
vững và run, đứng choãi chân. Lợn lớn có các biểu hiện sốt nhẹ, bỏ ăn. Các triệu
chứng khác nhẹ hơn. Lợn đực giống có các biểu hiện giảm hƣng phấn, giảm thể tích
và chất lƣợng tinh dịch (hình thái, hoạt lực và nồng độ tinh trùng).

Hình 1.1. Phổi và thận bị xuất huyết của lợn nhiễm PRRSV [18]
Sự biểu hiện lâm sàng của bệnh trên lợn là thân nhiệt cao, ốm và suy nhƣợc,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

lợn mắc bệnh với biểu hiện run rẩy, co giật, triệu chứng khập khễnh và phát ban đỏ
ở tai, triệu chứng nổi mụn nhọt và xuất huyết da, lợn nái chết do bệnh, hay triệu
chứng sảy thai, chết lƣu, lợn con đẻ ra yếu. Ngoài ra, Tiến hành kiểm tra những con
lợn bị ảnh hƣởng thể hiện các biểu hiện lâm sàng của bệnh sốt cao, và run rẩy nội
tạng của chúng bị tổn thƣơng nghiêm trọng, ví dụ, điểm máu trong thận và xuất
huyết trong phổi kết quả tƣơng tự nhƣ những gì quan sát thấy trong năm 2006 dịch
tai xanh bùng phát ở Trung Quốc.
Trong hầu hết các trƣờng hợp, thời gian ủ bệnh có thể lên đến 5 ngày với các
dấu hiệu về sinh sản 2 – 4 tuần sau đó. Có nhiều yếu tố liên quan đặc biệt: loại đàn
(tình trạng sức khỏe tốt, tập quán); mật độ đàn trong vùng có thể góp phần lây lan
bệnh qua đƣờng không khí; mật độ đàn và cách quản lý trong trại; môi trƣờng và
quan trọng nhất là bệnh đã xuất hiện trƣớc đó.
1.1.3. Tác hại của bệnh
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm,
lây lan nhanh và gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn. Đặc điểm bệnh là gây

sảy thai ở lợn nái và rối loạn đƣờng hô hấp trên lợn sơ sinh và lợn nhỡ. Trong cơ
thể, virus tấn công vào đại thực bào (đặc biệt là đại thực bào hoạt động ở phổi), gia
tăng và phá hủy đại thực bào dẫn đến suy giảm chức năng của hệ thống bảo vệ cơ
thể,vì thế, các lợn nhỏ khi bị nhiễm PRRSV sẽ dễ dàng bị chết bởi virus và các tác
nhân gây bệnh khác.
Lợn nái giai đoạn cạn sữa: Trong tháng đầu tiên khi bị nhiễm virus, lợn
biếng ăn từ 7 – 14 ngày (10 – 15 % đàn), sốt 39 – 40oC, sảy thai thƣờng vào giai
đoạn cuối (1 – 6 %), tai chuyển màu xanh trong khoảng thời gian ngắn (2 %), đẻ
non (10 – 15 %), động đực giả (3 – 5 tuần sau khi thụ tinh), đình dục hoặc chậm
động dục trở lại sau khi đẻ, ho và có dấu hiệu của viêm phổi.
Lợn nái giai đoạn đẻ và nuôi con: Biếng ăn, lƣời uống nƣớc, mất sữa và viêm
vú (triệu chứng điển hình), đẻ sớm khoảng 2 – 3 ngày, da biến màu, lờ đờ hoặc hôn
mê, thai gỗ (10 – 15 % thai chết trong 3 – 4 tuần cuối của thai kỳ), lợn con chết
ngay sau khi sinh (30 %), lợn con yếu, tai chuyển màu xanh (khoảng dƣới 5 %) và
duy trì trong vài giờ. Pha cấp tính này kéo dài trong đàn tới 6 tuần, điển hình là đẻ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

non, tăng tỷ lệ thai chết hoặc yếu, tăng số thai gỗ, chết lƣu trong giai đoạn 3 tuần cuối
trƣớc khi sinh, ở một vài đàn con số này có thể tới 30 % tổng số lợn con sinh ra.
Lợn đực giống: Bỏ ăn, sốt, đờ đẫn hoặc hôn mê, giảm hƣng phấn hoặc mất
tính dục, lƣợng tinh dịch ít, chất lƣợng tinh kém và cho lợn con sinh ra nhỏ.
Lợn con theo mẹ: Thể trạng gầy yếu, nhanh chóng rơi vào trạng thái tụt
đƣờng huyết do không bú đƣợc, mắt có dử màu nâu, tiêu chảy nhiều, giảm số lợn
con sống sót, tăng nguy cơ mắc các bệnh về hô hấp, chân choãi ra, đi run rẩy.
Lợn con cai sữa và lợn nhỡ: Chán ăn, ho nhẹ, lông xác xơ. Ngoài ra, trong trƣờng
hợp ghép với bệnh khác có thể thấy viêm phổi lan toả cấp tính, thể trạng gầy yếu, da xanh,
tiêu chảy, ho nhẹ, hắt hơi, chảy nƣớc mắt, thở nhanh, tỷ lệ chết có thể tới 15 %.
1.1.4. Đường truyền lây của virus

Tiếp xúc giữa lợn ốm và lợn khỏe là đƣờng truyền lây chính của bệnh nên
bệnh có thể lây giữa các cá thể trong một đàn hay từ đàn này sang đàn khác (nếu lợn
bị bệnh đƣợc chuyển đàn, chuyển trại...). Lợn mang virus có thể giải phóng virus
trong thời gian 3-4 tháng gây khó khăn cho công tác theo dõi và phát hiện và khống
chế bệnh.
Tinh dịch lợn mang trùng cũng có khả năng nhiễm virus vì vậy bệnh có thể
truyền qua đƣờng sinh dục.
Các chất bài tiết nhƣ phân, nƣớc tiểu lợn bệnh cũng có khả năng có virus.
Virus cũng có thể từ lợn bệnh truyền sang lợn khỏe qua các dụng cụ chăn nuôi.
Virus có mặt trong hạch lâm ba, phổi với số lƣợng lớn hơn nhiều trong thịt và
có khả năng giữ đƣợc độc lực trong điều kiện lạnh (khi giữ thức ăn). Tuy vậy, khả năng
truyền bệnh do cho ăn các phụ phẩm trong quá trình giết mổ các gia súc bệnh chƣa
đƣợc xác định. Tuy nhiên, tốt hơn hết nên cách ly toàn bộ đàn lợn có nguy cơ với mọi
loại nguồn bệnh và không cho ăn các nội tạng từ lợn nghi mắc bệnh.

1.2. Tổng quan về virus PRRS (Porcine reproductive and respiratory
syndrome virus)
1.2.1. Đặc điểm của virus
Lúc đầu, ngƣời ta cho rằng một số virus nhƣ Parvovirus, virus giả dại
(Pseudorabies), virus cúm lợn, Porcine enterovirus, đặc biệt virus gây viêm não –
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

cơ tim (Encephalomyocarditis) gây nên. Sau đó, ngƣời ta đã xác định đƣợc một loại
virus mới, đƣợc gọi là virus Lelystad phân lập đƣợc từ các ổ dịch ở Hà Lan, là
nguyên nhân chính gây ra hội chứng trên. Tác nhân gây bệnh là PRRSV thuộc
giống Arterivirus, họ Arteriviridae và bộ Nidovirales [30], có đặc tính thích ứng cao
với đại thực bào, đặc biệt là các đại thực bào phế nang. Bình thƣờng, đại thực bào sẽ
tiêu diệt tất cả vi khuẩn, virus xâm nhập vào cơ thể, riêng đối với virus PRRS, virus

có thể nhân lên trong đại thực bào, sau đó phá huỷ và giết chết đại thực bào (tới 40
%). Đại thực bào bị giết sẽ làm giảm chức năng của hệ thống bảo vệ cơ thể và làm
tăng nguy cơ bị nhiễm các bệnh kế phát.

Hình 1.2. Đại thực bào của tế bào bình thƣờng và tế bào bị nhiễm PRRSV
1.2.2. Cấu trúc virus

Hình 1.3. Cấu trúc genome PRRSV

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Virus PRRS đƣợc biết đến là virus đặc hiệu vật chủ, chỉ lây nhiễm sang vật
chủ duy nhất là lợn. Tuy nhiên, nó tƣơng đối bền khi ở bên ngoài cơ thể vật chủ, ví
dụ: mẫn cảm với nhiệt độ cao, hoặc có thể tồn tại hàng tháng ở nhiệt độ -200C, chịu
đƣợc trong môi trƣờng pH rộng (<6 và >7,6), chịu đựng lâu trong điều kiện chiếu
tia cực tím và bất hoạt bởi một số loại hóa chất. Hơn nữa, trong điều kiện độ ẩm,
virus PRRS có thể tồn tại đến 11 ngày. Chính những đặc tính sinh học này của virus
PRRS giúp nó dễ dàng tồn tại và phát tán ra môi trƣờng, gây cản trở cho các biện
pháp an toàn sinh học để ngăn ngừa sự lây nhiễm virus.
Virus có vỏ bao với vật chất di truyền là RNA sợi đơn, dƣơng, kích thƣớc hệ
gen khoảng 15kb bao gồm đầu 5’, đầu 3’ và 9 khung đọc mở (Open reading frame –
ORF). Cấu trúc virus bao gồm 2 gen mã hóa cho các protein không cấu trúc (Nsp –
non-structure protein) và bảy gen mã hóa cho các protein cấu trúc và chức năng
(structure protein gene). ORF1a và ORF1b là các gen mã hóa protein không cấu
trúc – chiếm khoảng 75 %, kích thƣớc phân tử nhỏ, có hoạt tính sao chép và
polymerase. ORF1a đƣợc dịch trực tiếp trong khi ORF1b đƣợc dịch bởi một khung
dịch chuyển ribosomal. Bảy ORF còn lại có kích thƣớc phân tử nhỏ hơn, định vị ở
đuôi 3’ của hệ gen, mã hóa các protein cấu trúc bao gồm GP1, GP2, GP3, GP4,

GP5, M và N.
Khi phân tích hệ gen PRRS ngƣời ta thấy rằng các khung đọc mở (ORFs) lồng
vào nhau từ 1 – 253 bp. Ví dụ: khung đọc mở 4 (ORF4) và 5 (ORF5) lồng vào nhau
bởi 1 bp, ORF3 và ORF4 lồng vào nhau bởi 253 bp. Nhƣ vậy, virus sử dụng một
phần gen chung để mã hóa cho các protein khác nhau (Hình 1.3).
Giữa các chủng virus PRRS có sự khác biệt di truyền đáng kể, đó là 2 chủng
gốc nguyên thủy Châu Âu (loại I, điển hình là virus Lelystad –EU type) và Bắc Mỹ
(loại II, virus VR-2332 – NA type) [56], [27]. Hai kiểu gen khác nhau – hai biến
chủng virus PRRS Bắc Mỹ và châu Âu gây ra các hội chứng lâm sàng tƣơng tự
nhau, nhƣng chúng thể hiện 2 kiểu gen riêng biệt với khác biệt di truyền khoảng 2050 % ở mức độ nucleotide [65]. Sự tƣơng đồng giữa 2 chủng trên thể hiện ở sự
giống nhau trong trình tự nucleotide giữa các ORF lần lƣợt là: 57-59 % (ORF7), 7081 % (ORF6), 51-59 % (ORF5), 68 % (ORF4), 58 % (ORF3) và 63 % (ORF2) [27],
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

[51], [52], [53], [57]. Và ngay trong cùng một kiểu gen, mức độ khác biệt di truyền
cao giữa các chủng virus thực địa (field virus) đang lƣu hành tại các vùng địa lý
cũng đƣợc xác nhận. Điều này do đặc tính biến đổi di truyền cao của các chủng
virus giúp nó trốn tránh đƣợc đáp ứng miễn dịch của vật chủ. Gần đây dịch bệnh
xảy ra tại một số nƣớc cho thấy sự biến đổi của chủng NA tại một số nƣớc châu Á
nhƣ Trung Quốc, Việt Nam cho thấy độc lực virus đã có thay đổi đáng kể thể hiện ở
việc dịch bệnh xảy ra với tỷ lệ lợn chết cao [38].
1.2.3. Chức năng của ORFs
ORF1a và 1b mã hoá protein enzyme RNA polymerase có chức năng xúc tác
sao chép và tổng hợp nhƣ các RNA polymerase của các virus RNA khác.
ORF2 đến 6 mã hoá cho các protein kết hợp với màng của virus, trong đó đã
xác định:
Vỏ (Envelope glycoprotein E, ORF5) có trọng lƣợng phân tử từ 24-25 kDa là
protein liên kết vỏ bọc kết hợp glycogen. Các kháng thể trung hoà chủ yếu liên kết
trực tiếp với các epitope có trên bề mặt của protein GP5, do vậy virus có thể bị

trung hoà. Những epitope trung hoà này nằm sát ngay cạnh các vị trí glycosyl hoá.
Ngƣời ta cũng thấy rằng phân tử GP4 và protein M cũng chứa các epitope trung hoà
và phân tử GP3 cũng chứa một epitope trung hoà. Mặc dù vậy, những protein này
có tác dụng kích thích miễn dịch và sinh học nhỏ hơn đáng kể so với protein GP5.
(Envelop protein), nằm trên bề mặt màng
virus, chính là các vị trí tiếp xúc của virus PRRS khi nó nhiễm vào vật chủ. Chính
vì thế ORF5 mã hóa cho GP5 có mức độ
[69]. Và đó chính là lý do mà GP5 rất đƣợc quan tâm nghiên cứu trong
việc phân tích dịch tễ học và tiến hóa phân tử, cũng nhƣ biến đổi vật liệu di truyền
của chủng virus này. Thông tin về trình tự DNA, chuyển đổi sang trình tự amino
acid giúp cho các phân tích về mô hình cấu trúc protein (amino acid motif). Điển
hình là các peptide tín hiệu (signal peptide), vùng ngoại bào virus (extravirion
domains), vùng xuyên màng (transmembrane regions) và vùng nội bào virus (intraviron domains), các điểm trung hòa virus (neutralizing epitope), và những đột biến
quan trọng nhƣ: R13-Q13, R15-G151. Đây là những motif có vai trò quan trọng làm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

thay đổi các yếu tố ảnh hƣởng đến độc lực virus.
là chỉ thị

5 đƣợc xem

ủ
151 thành G

ả định (putative signal peptide sequence) là trình tự sẽ
ể
[78]. S

ớ
[78].

 Màng (Membrane protein: M, ORF6) có khối lƣợng phân tử khoảng 18-19 kDa,
không đƣợc glycosyl hoá, là protein liên kết vỏ bọc, mang tính kháng nguyên và có
tính bảo tồn cao nhất. Protein M có cấu trúc tƣơng tự nhƣ cấu trúc protein M của
các virus thuộc nhóm Coronavirus. Protein M hình thành cầu nối disunfit với
glycoprotein 5 (GP5) cấu thành một phần virus và đƣợc tìm thấy trong tế bào nhiễm
nhƣng cầu nối sunfit này không cấu thành nên hạt virus.
 Nhân (Nucleocapsid protein: N, ORF7) có khối lƣợng phân tử khoảng 14-15
kDa, đây là protein vỏ bọc nhân, có tính kháng nguyên cao. Protein N chiếm
khoảng 20-40 % protein của hạt virus.
 Phân tích trình tự gen mã hóa protein cấu trúc ở chủng virus PRRS đang lƣu
hành nhận thấy vị trí glycosyl hóa ở GP3 (vị trí 131) và GP5 (vị trí 51) có vai trò
quan trọng trong tính mẫn cảm với kháng thể trung hòa đặc hiệu virus PRRS. Thú
vị hơn, hiệu ứng hỗ trợ (synergistic effect) đƣợc nhận thấy khi glycosyl hóa đƣợc
tiến hành đồng thời ở cả GP3 và GP5. Nghiên cứu này khẳng định 1 cách chắc chắn
rằng bên cạnh GP5, GP3 có vai trò tham gia vào việc cảm ứng của kháng thể trung
hòa virus PRRS [70].
 Các kết quả nghiên cứu trên GP4 của virus Lelystad nguyên thủy chủng virus
Châu Âu cho thấy tại các vùng đầu N của GP4 chứa các vị trí có tính quyết định
miễn dịch (Immuno dominant) và trung hòa kháng thể (neutralizing epitope). So
sánh trình tự amino acid GP4 của dòng virus trên có gây đáp ứng miễn dịch với
kháng thể đơn dòng đặc hiệu GP4 phát hiện thấy xuất hiện các đột biến thay thế
amino acid trong vùng epitope trung hòa kháng thể [33]. Điều này cho phép khẳng
định epitope trung hòa kháng thể trên GP4 có đặc tính mẫn cảm với chọn lọc miễn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

dịch. Das và cs (2009) kết luận rằng hiện tƣợng glycosyl hóa đầu N của GP2a, GP3
và GP4 là bắt buộc đối với việc tạo ra các virus gây nhiễm và việc tƣơng tác giữa
chúng với điểm thụ thể tế bào CD163. Hệ gen virus PRRS cũng giống nhƣ các loại
virus khác có các mô hình đáp ứng vật chủ khác nhau [35]. Trong nghiên cứu của
Wang và cs (2010), vai trò của virus PRRS độc lực cao trong các mô hình tƣơng tác
virus – vật chủ khác nhau đã đƣợc thử nghiệm in vitro. Kết quả chỉ ra sự có mặt của
các điểm quyết định miễn dịch với tế bào T ở vùng protein màng (protein M –
tƣơng ứng với ORF6) của dòng virus HuN4 mang độc lực cao [72].
Các nghiên cứu trên cho thấy với mức độ tham gia khác nhau, các protein
chức năng có vai trò trong thành phấn cấu trúc, nhận biết, tƣơng tác và trung hòa
kháng thể kháng virus PRRS.
1.2.4. Đặc tính vai trò của Protein chức năng N
ORF7 mã hóa cho nucleocapsid protein có kích thƣớc phân tử khoảng
không glycosyl hóa, không có

trong cấu trúc phân

tử, đƣợc cấu thành từ 123 hay 128 aa
nguyên thủy

Bắc

–

virus PRRS
) hay Lelystad

) [50].

Nucleocapsid protein (N)

[29], [78]

[61]

57-59 % và tƣơng đồng về thành phần amino acid là
62 % [27].
Sự biến đổi amino acid K46R liên quan đến việc làm thay đổi mạnh chức
năng quy định tính kháng nguyên cao trong vùng tín hiệu định vị nhân (nuclear
localization signal – NLS, 41-47) và vùng tín hiệu định vị hạch nhân (nucleolar
localization signal – NoLS, 41-72) [61]. Nghiên cứu trƣớc đây đã chứng minh rằng
các đột biến tại vị trí 43, 44 trong NLS làm yếu sự tái bản của virus [47]. Đột biến
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

V117A ở các chủng virus PRRS có thể gây ảnh hƣởng lớn đến cấu trúc và kháng
nguyên của protein N dẫn đến tính gây bệnh cao. Rowland và cs, 2003 đã phân tích
trình tự nuclecapsid protein của các chủng trên 2 vùng trình tự tín hiệu định vị nhân
nằm tại vị trí aa 10-13 (NLS1) và 41-42 (NLS2), vùng này đƣợc dự đoán nằm trên
vùng mang tính kháng nguyên cao; protein N của virus PRRS nằm trên vùng kị
nƣớc, tham gia chức năng dịch chuyển protein N từ nhân vào tế bào chất ở các vị
trí amino acid sau 19-30 và 106 -123 [61].

1.3. Các phƣơng pháp phát hiện PRRSV
Những phƣơng pháp sinh học phân tử sử dụng phổ biến nhất hiện nay trong
chẩn đoán đều nhằm phát hiện một số đặc điểm của vật liệu di truyền (DNA, RNA)
ở tác nhân bệnh, thƣờng đƣợc sử dụng để sàng lọc nhanh, phát hiện, định type, định
lƣợng, xác định tính kháng thuốc của các tác nhân bệnh, chủ yếu là virus và vi
khuẩn. Bên cạnh ƣu điểm về độ nhậy, độ đặc hiệu, phát hiệm sớm, thời gian xét
nghiệm nhanh, chẩn đoán phân tử vẫn có một số nhƣợc điểm nhƣ khả năng cho kết

quả dƣơng tính và âm tính giả, ý nghĩa lâm sàng của kết quả chẩn đoán trong một số
trƣờng hợp không rõ ràng, thiếu tính thống nhất trong kết quả thu đƣợc từ các kit
khác nhau, cần thiết bị đắt tiền và kỹ thuật viên lành nghề. Dƣới đây là một số
phƣơng pháp cho phép phát hiện và chẩn đoán sớm tác nhân gây bệnh.
1.3.1.Biểu hiện lâm sàng
Lợn bệnh bị viêm phổi nặng khi xua đuổi thì lợn nhanh mệt, khó thở giống
bệnh suyễn, tim đập nhanh, mạnh và lợn dễ bị chết do trụy hô hấp. Đa phần lợn ốm,
sốt cao trên 400C, đều có sự phát ban đỏ trên da, đặc biệt là rìa tai và chỏm tai, sau
vài ngày rìa tai và chỏm tai có màu xanh tím. Một số khác chảy nƣớc mắt dàn dụa
và phát ban đỏ xung quanh mắt, bị tiêu chảy nặng, phân có mùi khó chịu. Bệnh tích
đặc trƣng ở lợn nái là thai bị sảy, lợn con chết yểu hoặc bị chết lƣu thai, phổi bị
viêm hoại tử, thùy phổi bệnh có màu xám đỏ, có mủ đặc và chắc. Trên xác lợn con
bị chết lƣu thấy một số đám bị hoại tử thối rữa, lợn con sinh ra nhợt nhạt, chết yểu.
phƣơng pháp này cho phép chẩn đoán nhanh nhƣng kém hiệu quả do một số tác
nhân gây bệnh là virus/ vi khuẩn đều có các biểu hiện lâm sàng gần giống nhau.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

1.3.2. Phân lập virus
Virus PRRS chỉ có thể nhân lên trên hai loại tế bào: đại thực bào túi phôi của
lợn (PAMs: pulmonary alveolar macrophage) và dòng tế bào thận khỉ châu Phi.
Virus thƣờng đƣợc phân lập từ nhiều mẫu bệnh có biểu hiện lâm sàng khác nhau
bao gồm: huyết thanh, tinh dịch, màng tế bào, máu, tủy xƣơng, hạch nhân, tim, gan,
phổi, lá lách… Trong đó dịch thu nhận từ phổi và huyết thanh là những mẫu dùng
để phân lập virus tốt nhất khi có dịch PRRS bùng nổ. Môi trƣờng phân lập virus chủ
yếu là môi trƣờng MARC-145. Virus đƣợc nhận diện và phân loại bằng nhuộm màu
miễn dịch với kháng huyết thanh đặc hiệu. Việc phân lập thành công virus PRRS
phụ thuộc rất nhiều vào tuổi của lợn nhiễm bệnh, điều kiện lấy mẫu, giai đoạn lấy
mẫu. Phƣơng pháp phâp lập virus có độ đặc hiệu cao nhƣng lại rất tốn kém, phức

tạp, tiến hành khó khăn, đòi hỏi nhiều thời gian và rất khó để phân lập đƣợc chủng
virus PRRS dòng EU vì chủng này không sao chép trên tế bào dòng mà chỉ sao chép
trên đại thực bào phổi của lợn.
1.3.3. Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học
Có nhiều nghiên cứu để pháp hiện các kháng thể trong huyết thanh đối với
virus PRRS. Phản ứng kháng thể huỳnh quang trực tiếp (indirect fluorescent
antibody - IFA); trung hòa virus huyết thanh (serum virus neutralization - SNV); xét
nghiệm đơn lớp kỹ thuật ô xy hóa (immunoperoxidase monolayer assay - IMPA) và
kỹ thuật xét nghiệm ELISA (enzyme linked immunosorbent assay - ELISA) tất cả
đều có thể đƣợc sử dụng cho việc phát hiện kháng thể đặc hiệu với virus PRRS.
Phản ứng IFA, SNV và ELISA đƣợc sử dụng thƣờng xuyên trong hầu hết các phòng
thí nghiệm ở miền nam nƣớc Mỹ trong khi đó, IMPA đƣợc sử dụng nhiều hơn ở
Châu Âu. Yoon và cs trong một nghiên cứu đã cho thấy IFA có độ đặc hiệu cao đến
99,5 % [79]. Theo Drew (1995), trong một thử nghiệm so sánh của mình, ông cho
rằng IMPA có độ nhậy cao hơn so với ELISA. IMPA thƣờng đƣợc sử dụng nhằm
phát hiện việc nhiễm virus PRRS từ ngày 7 đến ngày 15 sau khi nhiễm. Tuy nhiên,
IMPA cũng cho kết quả đáng tin cậy đối với việc phát hiện kháng thể đặc hiệu sau
hai đến ba tháng nhiễm bệnh [37]. Theo Albina và cs (1992) ELISA cho kết quả có
độ đặc hiệu và độ nhậy cao đối với việc phát hiện kháng thể virus PRRS trong huyết
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

thanh. Điều bất lợi của thử nghiệm này là hay cho kết quả dƣơng tính giả [24].
Những kết quả huyết thanh dƣơng tính từ mẫu máu thu nhận từ lợn có biểu
hiện lâm sàng đối với virus PRRS thì không đủ cơ sở cho việc chẩn đoán virus
PRRS [69], [79]. Albina trong một nghiên cứu năm 1994 cho thấy rằng kháng thể
truyền từ mẹ đƣợc phát hiện trong huyết thanh của lợn con 4 ngày sau khi sinh và
không phát hiện thấy ở 3 tuần sau đó [25]. Kháng thể đặc hiệu từ mẹ đối với
PRRSV tồn tại trong cơ thể lợn con từ 4 đến 10 tuần tuổi và đôi khi tồn tại đến 16

tuần tuổi đối với lợn bú sữa mẹ đã đƣợc miễn dịch. Vì kháng thể thƣờng không kéo
dài trong suốt thời gian sống của lợn và vì sự liên kết trong thời gian ngắn của
kháng thể IFA và ELISA, do vậy lợn nhỏ và tốt hơn hết là đàn lợn giống cần đƣợc
kiểm tra để phát hiện tình trạng nhiễm virus PRRS của đàn [36].
Trần Thị Bích Liên (2008) khi nghiên cứu về dịch PRRS cả Việt Nam và thế
giới cũng nhƣ những đặc điểm cơ bản về PRRSV. Đặc biệt tác giả đƣa ra phƣơng
pháp chẩn đoán PRRS nhƣ phân lập virus bằng phƣơng pháp IPMA, IPMA kết hợp
với PCR, phƣơng pháp phát hiện kháng nguyên, kháng thể. Kết quả cho thấy để
phát hiện kháng thể có hai phƣơng pháp có độ chính xác cao là IPMA và ELISA
[19].Năm 2012, Nguyễn Đức Hiền đã nghiên cứu tình hình nhiễm PRRS trong đàn
lợn ở Cần Thơ. Xét nghiệm cho thấy 290 mẫu huyết thanh lợn chƣa tiêm phòng
vaccine PRRS bằng phƣơng pháp ELISA cho thấy tỷ lệ nhiễm PRRSV ở lợn nuôi
tại thành phố Cần Thơ là 16,90 % [16].
Nhƣợc điểm của phƣơng pháp này có thể cho kết quả dƣơng tính giả, mức độ
kháng thể giảm rất nhanh khi thiếu sự tuần hoàn của virus và khó phân biệt đƣợc
kháng thể của lợn mắc bệnh PRRSV với lợn đã đƣợc tiêm vaccine.
1.3.4. Phương pháp chẩn đoán dựa trên nguyên lý PCR (RT-PCR và realtime
RT-PCR)
Kỹ thuật PCR đƣợc phát triển để phát hiện RNA của virus PRRS trong các
mẫu bệnh phẩm. Vì không cần phải phân lập virus trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào
nên PCR sẽ ít tốn thời gian để phát hiện hơn so với phƣơng pháp nuôi cấy tế bào.
PCR còn đƣợc xem là một phƣơng pháp có độ nhậy và độ đặc hiệu cao.
Phương pháp realtime RT-PCR
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>