khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của giống lan dendrobium mini lai trong điều kiện nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Phạm Thị Thu Ly

KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN
SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA
GIỐNG LAN DENDROBIUM MINI LAI TRONG
ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY IN VITRO
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. BÙI VĂN LỆ

Thành phố Hồ Chí Minh – 2014


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
-

Ban Giám hiệu trường Đại học Sư phạm TP. HCM, Phòng Đào tạo Sau đại học,

Khoa Sinh học, tất cả thầy cô đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi
cho em trong suốt thời gian theo học tại trường.
-

Thầy PGS. TS. Bùi Văn Lệ đã tận tình hướng dẫn, giảng dạy, bồi dưỡng kiến

thức, đóng góp nhiều ý kiến quý báu và luôn tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn
thành luận văn.
-

ThS. Hoàng Minh Tâm, ThS. Đặng Thị Ngọc Thanh – thầy cô đã quan tâm, tận

tình chỉ bảo và cho em những ý tưởng đề tài.
-

Thạc sĩ Nguyễn Văn Vinh, Trạm huấn luyện và thực nghiệm nông nghiệp Văn

Thánh thuộc Trung tâm khuyến nông thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và
giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
-

ThS. Lê Minh Đức đã giúp đỡ và hỗ trợ cho em trong công tác phòng thí nghiệm

để em thực hiện đề tài.
-

Quý Thầy Cô ngành Sinh học khoa Sư phạm Khoa học Tự nhiên trường Đại học

Sài Gòn đã tạo điều kiện thuận lợi để em học tập và hoàn thành luận văn.
-

Các bạn sinh viên ngành Sư phạm Sinh học trường Đại học Sài Gòn đã nhiệt

tình giúp đỡ trong quá trình thực hiện đề tài.
-

Cảm ơn tất cả những người thân, những người bạn đã luôn ở bên cạnh và động

viên tôi trong suốt quá trình học tập.
-

Cuối cùng, con xin chân thành cảm ơn ba mẹ, hai chị và chồng đã luôn yêu

thương, động viên và tạo điều kiện tốt nhất cho con hoàn thành qúa trình học tập.
Một lần nữa xin chân thành cảm ơn.
TP. Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2014
Phạm Thị Thu Ly


MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................3
1.1.

Sơ lược đặc điểm lan Dendrobium và lan Dendrobium mini ............................3

1.1.1.

Đặc điểm hình thái ......................................................................................5

1.1.2.

Điều kiện sinh thái ......................................................................................7

1.1.2.1.

Nhiệt độ ................................................................................................7

1.1.2.2.

Độ ẩm và chế độ tưới nước ..................................................................8

1.1.2.3.

Ánh sáng ...............................................................................................8

1.1.2.4.

Nhu cầu dinh dưỡng .............................................................................8

1.1.3.

Các phương pháp nhân giống cây lan Dendrobium và Dendrobium mini

ngoài tự nhiên ...........................................................................................................9

1.2.

1.1.3.1.

Giao phấn..............................................................................................9

1.1.3.2.

Phương pháp tách chiết ........................................................................9

Sơ lược phương pháp nhân giống in vitro .........................................................9

1.2.1.

Lược sử phát triển của công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật ........................9

1.2.2.

Tầm quan trọng của phương pháp nhân giống in vitro .............................10

1.2.3.

Điều kiện nhân giống in vitro....................................................................11

1.2.4.

Các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật ..........................................................11

1.2.4.1.

Giai đoạn 1: Chọn lựa và khử trùng mẫu ...........................................11

1.2.4.2.

Giai đoạn 2: Tạo thể nhân giống ........................................................11

1.2.4.3.

Giai đoạn 3: Nhân giống in vitro ........................................................11

1.2.4.4.

Giai đoạn 4: Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh ....................................12

1.2.4.5.

Giai đoạn 5: Chuyển cây con ra vườm ươm ......................................12


1.2.5.

Những ưu điểm và khó khăn trong nhân giống in vitro ............................12

1.2.5.1.

Ưu điểm ..............................................................................................12

1.2.5.2.

Khó khăn ............................................................................................13

1.2.6.

Sơ lược các kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô thực vật .............................14

1.2.6.1.

Nuôi cấy phôi .....................................................................................14

1.2.6.2.

Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời........................................................14

1.2.6.3.

Nuôi cấy mô phân sinh .......................................................................15

1.2.6.4.

Nuôi cấy bao phấn ..............................................................................15

1.2.6.5.

Nuôi cấy tế bào đơn ............................................................................15

1.2.6.6.

Nuôi cấy protoplast ............................................................................16

1.2.7.

Các phương pháp nhân giống in vitro cho lan Denrdobium .....................17

1.2.7.1.

Nhân giống bằng chồi nách ................................................................17

1.2.7.2.

Nhân giống bằng chồi đỉnh ................................................................17

1.2.7.3.

Nhân giống bằng chồi bất định...........................................................17

1.2.7.4.

Nhân giống qua nuôi cấy callus .........................................................17

1.2.7.5.

Nhân giống bằng các đoạn giả hành...................................................17

1.2.7.6.

Nuôi cấy hạt lai...................................................................................18

1.2.7.7.

Dung hợp tế bào trần ..........................................................................18

1.3.

Sơ lược về phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) .............................18

1.4.

Sơ lược phương pháp nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng lắc (nuôi cấy dịch

treo tế bào)..................................................................................................................19
1.5.

Giới thiệu về phôi soma và protocorm like bodies (PLBs) ............................20

1.5.1.

Giới thiệu về phôi soma ............................................................................20

1.5.2.

Giới thiệu về PLBs ....................................................................................21

1.6.

Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ...................................22

1.7.

Một số chất hữu cơ dùng trong nuôi cấy in vitro .............................................23

1.8.

Một số công trình nghiên cứu về lan Dendrobium in vitro...............................24

1.8.1.

Trong nước ................................................................................................24

1.8.2.

Trên thế giới ..............................................................................................24


CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................26
2.1.

Vật liệu .............................................................................................................26

2.1.1.

Vật liệu nuôi cấy .......................................................................................26

2.1.2.

Thiết bị và dụng cụ ....................................................................................26

2.1.3.

Hóa chất.....................................................................................................26

2.2.

Môi trường và điều kiện nuôi cấy ....................................................................26

2.3.

Nội dung nghiên cứu ........................................................................................27

2.4.

Phương pháp nghiên cứu .................................................................................27

2.4.1.

Nội dung 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu ..................................27

Thí nghiệm 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu.........................................27
2.4.2.

Nội dung 2: Khảo sát các loại môi trường nuôi cấy cảm ứng tạo chồi lan

Dendrobium mini lai ...............................................................................................29
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng thành phần các loại môi trường nuôi cấy cảm ứng tạo
chồi lan Dendrobium mini lai ..............................................................................29
2.4.3.

Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả

năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai ...................................................30
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng NAA và BA đến
khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai .........................................30
2.4.4.

Nội dung 4: Khảo sát các điều kiện nuôi cấy đến khả năng cảm ứng tạo

chồi lan Dendrobium mini lai .................................................................................31
Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng cảm ứng tạo chồi
lan Dendrobium mini lai......................................................................................31
2.4.5.

Nội dung 5: Khảo sát ảnh hưởng của các hợp chất hữu cơ: vitamin,

đường, nước dừa, khoai tây, bánh dầu đến khả năng nhân nhanh chồi và sự sinh
trưởng của giống lan Dendrobium mini lai ............................................................32
Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ vitamin lên sự tăng sinh chồi
trong môi trường lỏng lắc ....................................................................................32
Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của bánh dầu đến khả năng sinh trưởng chồi của
giống lan Dendrobium mini lai ...........................................................................33


Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu đến khả năng sinh trưởng
chồi của giống lan Dendrobium mini lai .............................................................35
Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu đến sinh trưởng của giống lan
Dendrobium mini lai ở giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh...................................36
2.4.6.

Xử lý, phân tích số liệu, dữ kiện ...............................................................37

2.5.

Thời gian nghiên cứu .........................................................................................2

2.6.

Nơi thực hiện đề tài ............................................................................................2

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ...............................................................38
3.1. Kết quả 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu ..............................................38
Thí nghiệm 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu.........................................38
3.2. Kết quả 2: Khảo sát các loại môi trường nuôi cấy cảm ứng tạo chồi lan
Dendrobium mini lai ..................................................................................................40
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng thành phần khoáng các loại môi trường nuôi cấy đến
cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai .........................................................40
3.3. Kết quả 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng cảm
ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai .......................................................................42
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng NAA và BA đến
khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai .........................................42
3.4. Kết quả 4: Khảo sát các điều kiện nuôi cấy đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan
Dendrobium mini lai ..................................................................................................47
Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng cảm ứng tạo chồi
lan Dendrobium mini lai......................................................................................47
3.5. Kết quả 5: Khảo sát ảnh hưởng của các hợp chất hữu cơ: vitamin, đường, nước
dừa, khoai tây, bánh dầu và vitamin đến khả năng nhân nhanh chồi và sự sinh trưởng
của giống lan Dendrobium mini lai............................................................................50
Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ vitamin lên sự tăng sinh chồi
trong môi trường lỏng lắc ....................................................................................50
Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của bánh dầu đến khả năng sinh trưởng chồi của
giống lan Dendrobium mini lai ...........................................................................53


Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu đến khả năng sinh trưởng
chồi của giống lan Dendrobium mini lai .............................................................59
Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu đến sự sinh trưởng của giống

lan Dendrobium mini lai ở giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh.............................63
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................67
1. Kết luận ..................................................................................................................67
2. Kiến nghị ................................................................................................................68
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................69
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
NAA

: α-naphthaleneacetic acid

BA

: 6-benzyl adenin

ABA

: abcisic acid

IAA

: indol acetic acid

IBA

: indolbutyric acid

TDZ

: thidiazuron

MS

: Murasgige và Skoog

WPM : Woody Plant Medium
PLBs

: Protocorm like bodies

tTCL

: Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào cắt theo chiều ngang

lTCL

: Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào cắt theo chiều dọc

NT

: Nghiệm thức


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Nồng độ javen và thời gian khử trùng mẫu................................................... 27
Bảng 2.2. Nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật bổ sung vào các môi
trường cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai ....................................................... 30
Bảng 2.3. Điều kiện nuôi cấy và nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật bổ

sung vào các môi trường cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai .......................... 31
Bảng 2.4. Nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và vitamin bổ sung vào
các môi trường ảnh hưởng đến sự tăng sinh chồi lan Dendrobium mini lai ................. 33
Bảng 2.5. Nồng độ bánh dầu bổ sung vào các môi trường ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng chồi lan Dendrobium mini lai ............................................................................ 34
Bảng 2.6. Nồng độ cơm dừa và bánh dầu bổ sung vào các môi trường ảnh hưởng
đến sự sinh trưởng chồi lan Dendrobium mini lai ......................................................... 35
Bảng 2.7. Nồng độ cơm dừa và bánh dầu bổ sung vào các môi trường ảnh hưởng
đến sự sinh trưởng lan Dendrobium mini lai ở giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh............... 36
Bảng 3.1. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ javen và thời gian lắc mẫu lên quá trình
khử trùng........................................................................................................................ 38
Bảng 3.2. Ảnh hưởng thành phần khoáng các loại môi trường nuôi cấy đến cảm
ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai ........................................................................... 41
Bảng 3.3. Tỉ lệ mẫu sống dưới ảnh hưởng của BA và NAA ........................................ 43
Bảng 3.4. Tỉ lệ mẫu tạo PLBs dưới ảnh hưởng của BA và NAA ................................ 43
Bảng 3.5. Tổng số chồi thu được dưới ảnh hưởng của BA và NAA ........................... 44
Bảng 3.6. Chiều cao chồi trung bình thu được dưới ảnh hưởng của BA và NAA ....... 44
Bảng 3.7. Tỉ lệ mẫu sống dưới ảnh hưởng của BA và NAA nuôi cấy trong điều
kiện không có ánh sáng ................................................................................................. 47
Bảng 3.8. Tỉ lệ mẫu tạo PLBs dưới ảnh hưởng của BA và NAA nuôi cấy trong
điều kiện không có ánh sáng ......................................................................................... 48
Bảng 3.9. Tổng số chồi thu được dưới ảnh hưởng của BA và NAA nuôi cấy trong
điều kiện không có ánh sáng ......................................................................................... 48


Bảng 3.10. Chiều cao chồi trung bình thu được dưới ảnh hưởng của BA và NAA
nuôi cấy trong điều kiện không có ánh sáng ................................................................. 49
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ vitamin lên sự tăng sinh chồi lan trong môi
trường lỏng lắc sau 49 ngày nuôi cấy ............................................................................ 51
Bảng 3.12. Tỉ lệ nhân chồi lan dưới ảnh hưởng của bánh dầu ..................................... 54

Bảng 3.13. Chiều cao cây trung bình dưới ảnh hưởng của bánh dầu ........................... 55
Bảng 3.14. Số lá trung bình thu được dưới ảnh hưởng của bánh dầu .......................... 56
Bảng 3.15. Hình thái, màu sắc lá dưới ảnh hưởng của bánh dầu ................................. 57
Bảng 3.16. Tổng số chồi thu được dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu ............... 59
Bảng 3.17. Tỉ lệ nhân chồi dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu .......................... 60
Bảng 3.18. Chiều cao chồi trung bình thu được dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh
dầu ................................................................................................................................. 60
Bảng 3.19. Số lá trung bình thu được dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu .......... 61
Bảng 3.20. Hình thái, màu sắc lá dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu ................. 61
Bảng 3.21. Chiều cao cây trung bình thu được dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh
dầu ở giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh......................................................................... 63
Bảng 3.22. Số lá trung bình thu được dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu ở
giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh .................................................................................. 64
Bảng 3.23. Số rễ thu được dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu ở giai đoạn tạo
cây con hoàn chỉnh ........................................................................................................ 64
Bảng 3.24. Hình thái, màu sắc lá dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu ở giai
đoạn tạo cây con hoàn chỉnh.......................................................................................... 66


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 1.1. Tổng quan về lan Dendrobium ........................................................................ 3
Hình 1.2. Cơ quan sinh sản của lan thuộc họ Ochidaceae .............................................. 7
Hình 1.3. Một số kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật .............................. 17
Hình 1.4. PLBs được hình thành từ phương pháp tTCL................................................. 22
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình khử trùng mẫu ...................................................................... 29
Hình 3.1. Chồi lan non thu nhận ngoài vườn, cắt bớt bao lá và lá ................................ 39
Hình 3.2. Kết quả khử trùng chồi lan theo các nghiệm thức ......................................... 40
Hình 3.3. Lan Dendrobium mini lai nuôi cấy trên môi trường MS, Gamborg B5 và
WPM sau 60 ngày.......................................................................................................... 42
Hình 3.4. PLBs sau 60 ngày nuôi cấy trên nghiệm thức 1 đến nghiệm thức 8 ............. 46

Hình 3.5. PLBs sau 60 ngày nuôi cấy trên nghiệm thức 1 đến nghiệm thức 8 trong điều
kiện không có ánh sáng ................................................................................................. 50
Hình 3.6. Sự tăng sinh chồi lan trong môi trường lỏng lắc sau 49 ngày nuôi cấy từ
nghiệm thức 1 đến nghiệm thức 6 ................................................................................. 52
Hình 3.7. Hình thái chồi lan trong môi trường lỏng lắc sau 49 ngày nuôi cấy từ
nghiệm thức 1 đến nghiệm thức 6 ................................................................................. 53
Hình 3.8. Chồi lan Dendrobium mini lai trên các loại môi trường bánh dầu khác
nhau sau 49 ngày nuôi cấy từ nghiệm thức 1 đến nghiệm thức 6 ................................. 58
Hình 3.9. Chồi lan Dendrobium mini lai trên các loại môi trường bánh dầu khác
nhau sau 49 ngày nuôi cấy từ nghiệm thức 7 đến nghiệm thức 12 ............................... 59
Hình 3.10. Lan Dendrobium mini lai trên môi trường MS có bổ sung cơm dừa và
bánh dầu xử lý nhiệt sau 49 ngày nuôi cấy từ nghiệm thức 1 đến 6 ............................. 62
Hình 3.11. Lan Dendrobium mini lai ở giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh trên môi
trường MS có bổ sung cơm dừa và bánh dầu xử lý nhiệt sau 49 ngày nuôi cấy ........... 66


1

MỞ ĐẦU
 Đặt vấn đề
Ngày nay với nền kinh tế ngày càng phát triển, thì nhu cầu vật chất của con người
ngày càng được cải thiện và nâng cao. Và đặc biệt nhu cầu tinh thần của người dân là
không thể thiếu. Một trong những cách mà con người đã chọn để làm đẹp cho cuộc
sống của mình là trồng hoa và cây cảnh. Việc lựa chọn từng loại hoa trồng tùy theo sở
thích, vẻ đẹp của hoa và điều kiện nuôi trồng. Trong đó, hoa lan là hoa được nhiều
người ưa thích. Hoa lan là loài hoa vương giả, với vẻ đẹp kiêu kì huyền bí, có vai trò
quan trọng trong đời sống tinh thần và kinh tế. Ngoài ra chúng có hình dáng, màu sắc,
kích thước phong phú và đa dạng, rất phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam nên
chúng được sản xuất khá phổ biến.
Hoa lan ở nước ta rất phong phú và đa dạng, có nhiều giống khác nhau như:

Cattleya, Phalaenopsis, Oncidium, Mokara, Vanda, Dendrobium… chúng đều cho hoa
rất đẹp và mang nhiều màu sắc khác nhau. Hoa lan có thể dùng để trang trí, trưng bày,
làm quà tặng… hay người ta có thể bán hoa, cắt cành kinh doanh. Trong số đó có lẽ
Dendrobium là giống khá phong phú từ màu sắc, dạng hoa cho đến giống, loài. Mặt
khác, Dendrobium cũng rất dễ trồng, siêng hoa và lâu tàn. Do đó, nó được ưa chuộng
và được trồng phổ biến ở nước ta hiện nay nhằm phục vụ cho nhu cầu cuộc sống.
Trong nhóm Dendrobium, giống lan Dendrobium mini đang được ưa chuộng tại các
thị trường đặc biệt là Nhật và Hàn Quốc với nhiều nguyên nhân như: dễ trồng, không
đòi hỏi nhiều diện tích trồng nhưng lại sản xuất được nhiều cây, lợi nhuận mang đến
lớn hơn kỳ vọng, ra hoa quanh năm và lâu tàn (hoa có thể kéo dài từ 2-3 tháng), thích
hợp trưng bày trên từng bàn làm việc hoặc cho cả phòng họp lớn, thích hợp cho đủ loại
bình, chậu khác nhau. Một số giống lan Dendrobium mini với sắc hoa từ trắng tuyền
đến hồng, hồng phớt, hồng nhạt và điểm vàng… Tuy nhiên, giống lan Dendrobium
mini trên thị trường Việt Nam hiện nay chưa phong phú về màu sắc, nhiều giống còn
mang những khuyết điểm như: thân cây yếu, phát hoa ngắn, hoa mau tàn, màu sắc hoa
nhợt nhạt…, số lượng hoa trên thị trường không nhiều để phục vụ cho nhu cầu của con


2

người. Nên việc nhân giống lan Dendrobium mini để thỏa mãn sự hiếu kì của khách
hàng và thu lại lợi ích kinh tế là một việc làm cần thiết.
Phương pháp nuôi cấy in vitro là phương pháp duy nhất hiện nay có thể nhân
giống lan trên qui mô công nghiệp, các cây lan con được sản xuất hoàn toàn giống
nhau từ một cây bố mẹ quí mới được lai tạo và được xem là có giá trị sau lần ra hoa
đầu tiên. Do đó, đề tài “Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và
phát triển của giống lan Dendrobium mini lai trong điều kiện nuôi cấy in vitro”
được thực hiện.
 Mục tiêu của đề tài
- Xác định được phương pháp khử trùng mẫu.

- Xác định được môi trường cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai tốt nhất.
- Xác định môi trường nhân chồi lan Dendrobium mini lai tối ưu trong điều kiện in
vitro.
- Xác định môi trường tạo cây lan con Dendrobium mini lai hoàn chỉnh tốt nhất
trong điều kiện in vitro.
 Đối tượng nghiên cứu
Giống lan Dendrobium mini lai.
 Nội dung nghiên cứu
Khảo sát quy trình khử trùng mẫu.
Khảo sát môi trường cảm ứng tạo chồi.
Khảo sát môi trường nhân chồi Dendrobium mini lai trong điều kiện in vitro.
Khảo sát môi trường tạo cây lan con Dendrobium mini lai hoàn chỉnh trong điều
kiện in vitro.
 Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 01/12/2013 đến 31/01/2014: Viết và bảo vệ đề cương.
Từ tháng 2/2014 đến tháng 8/2014: Thu mẫu, thực nghiệm, lặp lại nghiệm thức.
Tháng 8/2014: Hoàn thành luận văn.
 Nơi thực hiện đề tài
Phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học, trường Đại học Sài Gòn.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Sơ lược đặc điểm lan Dendrobium và lan Dendrobium mini
Vị trí phân loại: Lan Dendrobium thuộc:
- Giới: Plantae (Thực vật)

- Ngành: Angiospermatophyta (Thực vật Hạt kín)
- Lớp: Liliopsida (Monocotyledones) (Một Lá mầm)
- Lớp phụ: Liliidae (Bạch huệ)
- Bộ: Orchidales (Bộ Lan)
- Họ: Orchidaceae (Phong lan)
- Giống: Dendrobium sp.

Hình 1.1. Tổng quan về lan Dendrobium [20]
Họ Orchidaceae có khoảng 750 chi, 25000 loài, chiếm vị trí thứ hai sau họ Cúc
trong ngành thực vật Hạt kín và là họ lớn nhất trong ngành Một lá mầm. Các loài trong
hệ thống này phân bố rất rộng, do đó hình thái và cấu tạo cũng hết sức đa dạng và
phức tạp [10].
Giống lan Dendrobium được đặt tên vào năm 1799, rất phong phú về chủng loại,
với khoảng 1600 loài phân bố trên các vùng thuộc Châu Á nhiệt đới, tập trung nhiều
nhất ở Đông Nam Á và Úc Châu.


4

Tên Dendrobium có nguồn gốc từ chữ Hy Lạp. Dendron nghĩa là cây gỗ và bios là
tôi sống. Dendrobium là giống phụ sinh, sống trên cây gỗ. Có người gọi là Hoàng Lan,
có người gọi là Đăng Lan. Dendrobium có trên 1.600 loài và chia thành 2 dạng chính
[17]:
- Dạng đứng (Dendrobium phalaenopsis) thường mọc ở xứ nóng, chịu ẩm và rất
siêng ra hoa với các giống tiêu biểu như: Nhất điểm hồng, Nhất điểm hoàng, Báo hỉ, Ý
thảo, Thủy tiên, Sonia.
- Dạng thòng (Dendrobium nobile) chịu khí hậu mát mẽ với các giống tiêu biểu
như: Giả hạc, Hạc vĩ, Long tu, Phi điệp vàng.
Với 1600 loài khác nhau đòi hỏi nhiều cách chăm sóc khác nhau, nguyên do là vì
chúng du nhập từ nhiều địa danh khác nhau như Nhật Bản, Triều Tiên và Newzealand,

đặc biệt là Guinea là nơi sản sinh ra nhiều loài Dendrobium nhất [1]. Ở Việt Nam,
Dendrobium có đến 100 loài, xếp trong 14 tông được phân biệt bằng thân (giả hành),
lá và hoa [14].
Dendrobium là loài lan sống trên các cành cây nhưng không cộng sinh, phân
bố nhiều ở Châu Âu và Nam Thái Bình Dương, được tìm thấy nhiều ở Châu Úc,
Tân Guinea, Thái Lan, Việt Nam và dãy núi Himalaya. Dendrobium được trồng
phục vụ cho lan chậu và lan cắt cành. Hiện nay, thị trường Dendrobium ngày càng
đa dạng và phong phú do các loại lan lai có nguồn gốc khác nhau [10].
Điều kiện sinh thái của Dendrobium rất đa dạng, có loài chỉ mọc và ra hoa ở vùng
lạnh, có loài ở vùng nóng, có loài ở trung gian, và cũng có loài thích nghi với điều kiện
khí hậu nào.
 Lan Dendrobium mini
Lan Dendrobium mini là một loài lai tạo, thân đứng. Loài lan này được chọn lọc từ
Thái Lan và được du nhập vào nước ta. Đặc điểm của loài lan này là cây dạng bụi, lùn
(chỉ cao 15 – 20 cm), nhưng ra hoa rất nhiều, hoa nở quanh năm. Cây nhỏ nhưng nhảy
chồi rất mạnh, nhảy chồi ngay cả trên các thân già hay cây suy yếu. Hoa có kích thước
không lớn chỉ khoảng 4 x 5 cm nhưng hoa rất đẹp, số hoa trên cành nhiều từ 6 - 13 hoa,
hoa rất bền lâu tàn (1,5 – 2 tháng). Thông thường trên một giả hành có tới 3 - 4 phát
(cành) hoa, nếu cây tốt có thể lên đến 5 phát hoa [5].


5

1.1.1. Đặc điểm hình thái
Dendrobium thuộc nhóm đa thân, vừa có thân thật vừa có giả hành. Giống lan này
đều có bộ phận sinh dưỡng như rễ, thân, giả hành, lá và cơ quan sinh sản như hoa, trái
[14].
- Dendrobium có hệ rễ khí sinh, có một lớp hú tẩm dày bao quanh gồm những lớp
tế bào chết chứa đầy không khí nên rễ ánh lên màu xanh bạc. Vì vậy, rễ hút được nước
mưa chảy dọc trên vỏ cây gỗ hay nước lơ lửng trong không khí, hơi sương và hơi

nước, giúp cây hút dinh dưỡng và chất khoáng, mặt khác giúp cây bám chặt vào giá
thể, không bị gió cuốn. Một số loài có thân lá kém phát triển thậm chí tiêu giảm hoàn
toàn, có hệ rễ chứa diệp lục tố giúp cây hấp thụ ánh sáng cần thiết cho sự ra hoa và
quang hợp [14].
Rễ lan Dendrobium cũng giống như rễ lan Vũ Nữ, Cattleya thuộc loại rễ bán gió,
không chịu được lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài rễ cây sẽ bị mục nát và cây bị
chết [10]. Nhóm này thường có rễ nhỏ nhưng rất nhiều rễ, chủ yếu bám vào giá thể,
vào thân cây để hút dưỡng chất dính vào giá thể như nước, cho nên khi trồng vào chậu,
phải để giá thể nhiều hơn, gần như toàn bộ rễ đều bám vào giá thể, vào thành chậu, chỉ
có một số ít rễ chìa ra ngoài. Đối với lan, rễ bán gió phải trồng với giá thể nhỏ hơn và
nhiều hơn, để bộ rễ bám dày đặc hút nhiều dưỡng chất [17].
- Thân: Dendrobium thuộc nhóm đa thân (còn gọi là nhóm hợp trục) có hệ thống
nhánh nằm ngang bò dài trên giá thể hoặc nằm sâu trong đất gọi là thân rễ. Một số
Dendrobium lá chỉ có ở các mầm non, là loài chóng tàn, chóng vàng úa và rụng vào
mùa thu, thân phình to giống như củ không có lá là nơi dự trữ năng lượng [2].
- Giả hành: Là những đoạn phình to, bên trong có các mô mềm chứa dịch nhày
làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cây trong điều kiện khô hạn
khi cây sống bám trên cao. Ngoài ra giả hành còn chứa diệp lục tố nên có thể quang
hợp được [14]. Hình dạng và kích thước của giả hành rất đa dạng: hình cầu, thuôn dài
hay hình trụ xếp chồng lên nhau tạo thành thân có lá mọc xen kẽ. Một số loài ở xứ
lạnh chỉ có nhiệm vụ dự trữ chất dinh dưỡng nên giả hành không có màu xanh nhưng
phía trên có nang lá [10].


6

- Lá: Các lá mọc xen kẽ nhau và ôm lấy thân giả do lá có tận cùng bằng một cuốn
thay thuôn dài xuống thành bẹ ôm thân, hình dạng và cấu trúc lá rất đa dạng [14]. Lá
có hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng. Dạng lá mềm mại mọng nước, nạc, có màu
xanh bóng, đậm hay nhạt tùy thuộc vào vị trí sống của cây. Phiến lá trải rộng hay gấp

lại theo gân vòng cung như cái quạt hay chỉ gấp lại theo gân giữa như hình chữ V.
Những lá sát dưới gốc đôi khi giảm đi chỉ còn những bẹ không phát triển hay giảm hẳn
thành vảy [10]. Các loài thuộc giống Dendrobium vùng nhiệt đới nói riêng và họ
Orchidaceae nói chung đôi khi rụng lá vào mùa khô hạn. Sau đó, cây ra hoa hay sống
ẩn để khi gặp mưa thì cho chồi mới [2].
- Hoa: Dendrobium thuộc nhóm phụ ra hoa ở nách lá. Chồi hoa mọc từ các mắt
ngủ giữa các đọt lá trên thân gần ngọn và cả trên ngọn cây. Sự biểu hiện trước khi ra
hoa khác biệt như có nhiều loài rụng hết lá trước khi ra hoa. Thời gian ra hoa đầu mùa
mưa hay đầu tết. Giống Dendrobium khi đủ dinh dưỡng thì cho hoa thành từng chùm,
phát hoa dài và thời gian ra hoa trung bình 1-2 tháng. Hoa có thể mọc từ
thân thành từng chùm hay từng hoa. Hoa có màu trắng, vàng đến tím. Thường lá đài
sau nằm một mình, hai lá đài bên dài ra dính lại với nhau ở mép dưới và dính vào đáy
của trụ tạo thành một phần dưới chân của trụ phía dưới gọi là cằm. Môi gắn vào
cằm, đôi khi kéo dài về phía sau tạo thành cựa, móc hay túi. Môi nguyên hay có
thùy, gai, sọc có lông hoặc không. Hai cánh hoa bên giống như hai lá đài. Trụ thấp,
phần đực của đỉnh trụ có nắp đậy, nắp gắn vào trụ nhờ một chỉ ngắn về phía sau, bốn
khối phấn nhỏ dính lại với nhau từng cặp [14].
- Quả: Họ Orchidaceae đều có quả thuộc loại quả nang, khi hạt chín, các nang
bung ra chỉ còn dính nhau ở phần đỉnh và gốc. Ở một số loài, khi chín quả không nứt
ra nên hạt chỉ ra khỏi quả khi quả bị mục nát [10].


7

a)

b)

Hình 1.2. Cơ quan sinh sản của lan thuộc họ Ochidaceae [20]
a) Cấu tạo hoa chi tiết

b) Quả lan

1.1.2. Điều kiện sinh thái
1.1.2.1. Nhiệt độ
Nhiệt độ tác động ở cây lan qua con đường quang tổng hợp, cường độ quang hợp gia
tăng theo nhiệt độ, thường nhiệt độ tăng 10 % thì tốc độ quang hợp tăng lên gấp đôi. Nhiệt
độ còn ảnh hưởng đến sự ra hoa ở một số loài lan như lan Bạch Câu Dendrobium
crumenatum đòi hỏi giảm nhiệt độ khoảng 5 - 6oC trong vài giây thì 9 ngày sau chúng sẽ
nở hoa đồng loạt. Ở 18,5oC, Dendrobium nobile chỉ tăng trưởng mà không ra hoa nhưng
chúng sẽ ra hoa khi nhiệt độ hạ xuống 13oC hay thấp hơn [9].
Căn cứ vào nhu cầu nhiệt độ, có thể tạm chia Dendrobium thành hai nhóm chính
[11]:
- Nhóm ưa lạnh: sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ lý tưởng là 150C, gồm các
giống được lấy từ các vùng cao nguyên ở độ cao trên 1.000m. Các loài này nếu được
trồng ở nhiệt độ cao hơn hoặc bằng 25oC, thì cây vẫn sống nhưng hiếm khi ra hoa.
- Nhóm ưa nóng: nhiệt độ thích hợp cho các loài của nhóm này là 25oC, gồm đa số
các giống Dendrobium ở vùng nhiệt đới, và các loài của giống Dendrobium lai hiện
đang trồng tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh phía Nam.
Ngoài ra, còn có một nhóm Dendrobium trung gian có thể sống ở cả vùng lạnh
và vùng nóng, nhưng ở vùng lạnh cây sinh trưởng và ra hoa nhiều hơn như
Dendrobium primulinum, Dendrobium farmeri nhiệt độ lý tưởng của các loài này là
20oC.


8

1.1.2.2. Độ ẩm và chế độ tưới nước
Các cây lan sống bám trên các cây cao, chúng lấy nước từ các trận mưa, từ hơi nước
trong không khí. Chính ẩm độ quyết định sự hiện diện của các loài phong lan. Trong thời

kỳ sinh trưởng cần tưới đủ, nhất là vào mùa nóng. Giữa các lần tưới cần xem xét các
giá thể trồng có bị đọng nước không. Khô hoặc gần khô là tốt nhất. Phải đảm bảo cho
giá thể trồng được thông thoáng làm cho rễ lan có lúc khô, và được khô từng lúc là điều
rất quan trọng. Chế độ thở của lan có một phần nhờ vào rễ. Thời kỳ sinh trưởng độ ẩm
cần từ 60 đến 70 %. Thời kỳ nghỉ cần giảm thích đáng.
Dendrobium cũng giống như các giống lan khác chỉ phát triển tốt trong không khí
ẩm và thoáng. Ẩm độ tương đối cần thiết là 40 – 70%. Cấu tạo giá thể quá ẩm và úng
thì bộ rễ sẽ bị thối và biểu hiện là cây con mọc ra từ phần ngọn của thân [19].
1.1.2.3. Ánh sáng
Dendrobium là loài lan ưa sáng (60 – 70 %), rất thích hợp với ánh sáng mạnh, có
những loài yêu cầu ánh sáng tới 80 – 90 %. Nhờ đó mà chúng phát triển được các giả
hành thật mạnh mẽ, tất nhiên không để ánh nắng chiếu trực tiếp có thể làm cháy lá [16].
Nếu thừa ánh sáng cây sẽ bị vàng lá, giả hành bị teo lại, cây xấu đi nhưng cây sẽ thích
nghi dần, vẫn ra hoa nhiều và đẹp. Nếu thiếu ánh sáng, cây sẽ bị thoái hóa rõ rệt, cây
èo uột và số lượng hoa sẽ ít đi [20].
1.1.2.4. Nhu cầu dinh dưỡng
Dendrobium thân đứng đòi hỏi dinh dưỡng cao, chúng cần rất nhiều phân bón và
có thể dùng nhiều dạng phân bón khác nhau. Còn các loại Dendrobium thân
thòng hấp thu phân chậm nên phải dùng nồng độ thật loãng.
Các loại phân hữu cơ như: phân heo, bánh dầu khô, phân tôm cá, phân trâu có thể
dùng rất tốt bằng cách phân bò khô pha loãng với nước rồi tưới, hoặc vò chặt từng
viên đặt trên bề mặt giá thể, rễ lan sẽ hấp thụ dần dần các dưỡng chất được phóng
thích qua quá trình tưới nước. Các loại phân vô cơ được dùng thường có công thức
30 – 10 – 10 dùng 3 lần/tuần với nồng độ 1 muỗng cà phê/4 lít. Trong suốt mùa tăng
trưởng, ta bón phân 10 – 20 – 30 làm 2 lần/tuần để tạo một sức chịu đựng cho cây
trước khi bước vào mùa nghỉ. Trong mùa tăng trưởng nếu cây có nụ hoa, thay phân 30 –
10 – 10 bằng phân 10 – 20 – 20 với chu kỳ bón như trên cho đến khi hoa tàn. Trong


9

mùa nghỉ hoàn toàn không bón phân cho Dendrobium, hay đúng hơn giảm và không bón
phân cho Dendrobium khi cây hoàn tất thời kì tăng trưởng hằng năm của nó. Thường
phân bón được dùng ở dạng hỗn hợp và bổ sung thêm các chất phụ gia là các sinh tố và
các nguyên tố vi lượng.
1.1.3. Các phương pháp nhân giống cây lan Dendrobium và Dendrobium mini
ngoài tự nhiên
1.1.3.1. Giao phấn
Giao phấn trong tự nhiên là hiện tượng thông thường, gần như bắt buộc đối với
hầu hết các loài lan. Đó là nguyên nhân vì sao họ lan có số lượng chủng loại rất phong
phú. Đó cũng là phương thức tồn tại, phát triển và tiến hoá ưu thế hơn cả của họ thực
vật này trong hướng thụ phấn nhờ côn trùng. Việc giao phấn đều tạo ra những giống
mới, qua chọn lọc, có những đặc tính hơn hẳn cây bố mẹ.
1.1.3.2. Phương pháp tách chiết
Phương pháp này dùng để tách các chậu lan quá đầy, đồng thời làm tăng số lượng
cây mới. Các giả hành già đựợc tách ra khi hoa đã tàn và chỉ tách khi đã trồng đựợc từ
2 - 3 năm. Giả hành già được ươm lại trên giá thể ẩm để tạo chồi con, các chồi con
được nuôi cùng với giả hành cho đến lúc đã tạo ra rễ mới, đủ sức phát triển mới tách
lần thứ hai. Từ một giả hành có thể cho mỗi đợt 1 - 2 cây con. Phương pháp chiết tách
đảm bảo được tính chất di truyền của cây bố mẹ nhưng lại cho một thế hệ cây con sinh
trưởng không đồng đều nên khó cung cấp một số lượng cây con lớn để phục vụ cho
nuôi trồng với quy mô lớn.
1.2.

Sơ lược phương pháp nhân giống in vitro

1.2.1. Lược sử phát triển của công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là thuật ngữ mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ
phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường trong điều kiện vô trùng. Đối
tượng nuôi cấy bao gồm từ các cấu trúc có tổ chức như đỉnh sinh trưởng, chồi bất định,

phôi đến các cấu trúc không có tổ chức như mô sẹo, dịch huyền phù tế bào, tế bào trần
(protoplast) [18].
Năm 1665 Robert Hook quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra
khái niệm tế bào.


10

Năm 1838 Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào.
Năm 1904 Hannig tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy phôi thực vật đầu tiên.
Năm 1924 Hình thành mô sẹo từ rễ cà rốt trong môi trường có acid lactic.
Năm 1934 Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, một hormone thực
vật đầu tiên có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào.
Năm 1939 Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy mô sẹo thành
công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá.
Năm 1946 Sự tạo cây đầu tiên từ đỉnh chồi ở Lupinus và Tropaeolum.
Năm 1951 Nitsch lần đầu tiên nghiên cứu nuôi cấy noãn tách rời in vitro. Skoog
nghiên cứu sử dụng các hoá chất điều hoà sinh trưởng và phát sinh cơ quan.
Năm 1953 Tulecke lần đầu tiên thành công trong nuôi cấy bao phấn và tạo mô
sẹo đơn bội từ hạt phấn Ginkgo biloba.
Năm Năm 1959 Tulecke và Nickell thử nghiệm sản xuất sinh khối thực vật quy
mô lớn (134 L) bằng nuôi cấy chìm.
Năm 1962 Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy mô tế bào thực
vật – môi trường MS.
Năm 1969 Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy tế bào dịch lỏng (huyền phù) của
Hapopappus gracilis.
Năm 1983 Công ty Mitsui Petrochemicals lần đầu tiên đã sản xuất chất trao đổi
thứ cấp trên quy mô công nghiệp bằng nuôi cấy tế bào dịch lỏng Lithospermum spp.
Năm 1985 Flores và Filner lần đầu tiên sản xuất chất trao đổi thứ cấp từ nhân nuôi
rễ tơ ở Hyoscyamus muticus. Những rễ này sản xuất nhiều hoạt chất hyoscyamine hơn

cây tự nhiên [15].
1.2.2. Tầm quan trọng của phương pháp nhân giống in vitro
Phương pháp này có ý nghĩa vô cùng to lớn đối với việc nghiên cứu lý luận sinh
học cơ bản, đồng thời có giá trị đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống.
- Về mặt lý luận sinh học cơ bản: đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu
sắc về bản chất của sự sống. Thực tế đã cho phép tách và nuôi cấy trước hết là mô
phân sinh (meristem) rồi từ đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hoá gọi là mô sẹo
(callus) và từ mô sẹo thì có thể kích thích tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh.


11

- Về mặt thực tiễn sản xuất: Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để phục tráng và
nhân nhanh các giống cây trồng quí, có giá trị kinh tế cao. Hiện nay phương pháp này đã
trở thành phổ biến và áp dụng trong công tác chọn giống cây trồng. Ngoài ra, bằng
phương pháp này chỉ sau thời gian ngắn có thể tạo được sinh khối lớn có hoạt chất sinh
học được tạo ra vẫn giữ nguyên được hoạt tính của mình [13].
1.2.3. Điều kiện nhân giống in vitro
Yêu cầu cơ bản nhất của phòng nuôi cấy mô là phải đảm bảo vô trùng. Khái niệm
vô trùng này bao gồm vô trùng môi trường nuôi cấy và cả sự bảo đảm sao cho mẫu
nuôi cấy được hoàn toàn vô trùng.
Các yêu cầu cơ bản của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật:
- Khi thiết lập phòng nuôi cấy mô thực vật phải đảm bảo được tính liên tục thuận
lợi cho các thao tác, các giai đoạn trong suốt quá trình nuôi cấy mô.
- Đảm bảo được vệ sinh (tính vô trùng) của sản phẩm cuối cùng.
- Chuẩn bị môi trường đúng cách, chọn đúng môi trường cho từng loại thực vật và
từng giai đoạn nuôi cấy.
- Chọn và xử lý mô thích hợp trước khi cấy [10].
1.2.4. Các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật
1.2.4.1. Giai đoạn 1: Chọn lựa và khử trùng mẫu

Mẫu cấy là mảnh thực vật được đặt vào môi trường nuôi cấy. Để tiến hành nuôi
cấy in vitro thành công, khi lựa chọn mô cấy cần lưu ý tuổi sinh lý của cơ quan được
dùng làm mẫu cấy, vụ mùa lấy mẫu, chất lượng của cây lấy mẫu, kích thước và vị trí
lấy mẫu đó. Mẫu cấy sau khi chọn lựa được rửa sạch bằng xà phòng và khử trùng bề
mặt bằng các chất khử trùng hóa học như calcium hypochloride, clorua thủy ngân…
1.2.4.2. Giai đoạn 2: Tạo thể nhân giống
Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân giống in
vitro. Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên
của cây trồng. Đối với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường
nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo. Trong môi trường nhân giống thường
bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác.
1.2.4.3. Giai đoạn 3: Nhân giống in vitro


12

Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi
cấy mô và tế bào thực vật bằng cách tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu nuôi cấy
là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chồi, đôi khi
hàm lượng chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài.
Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh. Cây nhân
giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời gian dài.
1.2.4.4. Giai đoạn 4: Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh
Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá, rễ để chuẩn bị chuyển
ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trường bình
thường. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích
quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện tự nhiên bên ngoài, là một bước
làm thích nghi trước khi tách khỏi điều kiện in vitro. Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu
tố: hàm lượng auxin nội sinh, ánh sáng, sức trẻ hóa của mẫu, kiểu di truyền. Người ta
thường bổ sung auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro.

1.2.4.5. Giai đoạn 5: Chuyển cây con ra vườm ươm
Cây con được ra rễ được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt trong
chậu, luống ươm có cơ chất dễ thoát hơi nước, nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ
chiếu sáng thấp…Trong những ngày đầu cần phủ nilon để tránh sự thoát hơi nước ở lá.
Rễ cây trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần dần lụi đi và rễ mới xuất hiện. Cây con
thường được xử lý ra rễ bằng cách ngâm rễ hay phun lên lá các hợp chất kích thích ra
rễ ở nồng độ thấp để rút ngắn thời gian ra rễ.
Đây là giai đoạn rất quan trọng trong quá trình nhân giống vô tính vì cây con
thường bị chết do sự khác biệt về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro.
1.2.5. Những ưu điểm và khó khăn trong nhân giống in vitro
1.2.5.1. Ưu điểm
Nhân giống in vitro có những ưu điểm sau:
- Tạo các cây con đồng nhất và giống cây mẹ. So với kiểu nhân giống thông
thường (chiết cành, hom), nhân giống bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một
số lượng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trong một thời gian ngắn. Không chiếm
nhiều diện tích trồng. Có thể cung cấp cây giống bất cứ thời điểm nào vì chủ động


13

được, do không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh và tạo ra các cây con
sạch bệnh bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng kết hợp xử lý nhiệt và vi ghép
trong ống nghiệm và nhân được các giống mới bằng kỹ thuật cứu phôi, chuyển gen.
Một số cây quí có thể nhân nhanh để đưa vào sản xuất và việc trao đổi giống được dễ
dàng [3].
- Ngoài ra, kỹ thuật nuôi cấy mô còn giúp cho việc nhân giống hữu tính các đối
tượng quí mà với kỹ thuật nhân giống thông thường khó thực hiện được (như trường
hợp gieo hạt lan). Ngày nay đã có nhiều công thức môi trường gieo hạt cho từng loại
lan [14].
1.2.5.2. Khó khăn

Tuy nhân giống in vitro đạt được những thành tựu to lớn nhưng cạnh đó đã gặp
không ít khó khăn, theo Nguyễn Văn Uyển và cs. (1984) thì có một số khó khăn sau:
- Nhân giống trên môi trường agar thì giá thành sản xuất vẫn còn cao và thời gian
nhân giống dài. Khi sản xuất ở qui mô công nghiệp thì chi phí cho năng lượng và nhân
công vẫn còn ở mức cao.
- Đôi khi xảy ra biến dị soma trong quá trình nuôi cấy, đặc biệt là tái sinh thông
qua mô sẹo.
- Giới hạn sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống do cây con tạo ra thường
đồng nhất về mặt di truyền. Quá trình nhân giống phức tạp. Tính bất định về mặt di
truyền.
- Nhân giống in vitro là tạo quần thể đồng nhất với số lượng lớn. Tuy nhiên trong
một số trường hợp phương pháp này cũng tạo ra biến dị soma, mà tế bào mô sẹo thì có
nhiều biến dị hơn so với đỉnh chồi. Những nhân tố thường gây ra biến dị soma là [10]:
+ Kiểu di truyền: các loài cây khác nhau thì tạo ra các biến dị khác nhau, nói
chung cây càng có mức độ bội thể cao thì càng dễ biến dị.
+ Số lần cấy chuyền: số lần cấy chuyền càng nhiều thì độ biến dị càng cao. Khi
nuôi cấy dài hạn thường gây ra biến dị nhiễm sắc thể.
+ Ngoài ra, khi cấy chuyền nhiều lần, môi trường phát triển các chồi ngang có thể
chuyển sang tạo ra các bất định. Kết quả là có thể tạo ra các biến dị tế bào soma. Vì
vậy, cây con tạo ra không đồng nhất. Đối với mục đích vi nhân giống, sự tạo chồi


14

ngang là kỹ thuật thích hợp đang được sử dụng. Theo nguyên tắc, cách này tạo ra đúng
kiểu cây.
1.2.6. Sơ lược các kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô thực vật
1.2.6.1. Nuôi cấy phôi
Sự ghi nhận đầu tiên về nuôi cấy phôi là công trình của Charles Bonnet ở thế kỷ
XVIII. Ông tách phôi Phascolus và Fagopyrum trong đất và nhận được cây nhưng cây

lùn. Từ đầu thế kỷ XX, các công trình nuôi cấy phôi dần được hoàn thiện hơn. Từ các
công trình nghiên cứu trước đó, Knudson (1922) đã nuôi cấy thành công phôi cây lan
trong môi trường chứa đường và khám phá ra một điều là nếu thiếu đường thì phôi
không thể phát triển thành protocorm.
Raghavan (1976, 1980) đã công bố rằng phôi phát triển quan hai giai đoạn dị
dưỡng và tự dưỡng. Ở giai đoạn dị dưỡng (tiền phôi) cần có các chất điều hòa sinh
trưởng để phát triển. Trong giai đoạn tự dưỡng, sự phát triển của phôi không cần chất
điều hòa sinh trưởng.
Đối với nuôi cấy phôi, như đã biết đường đóng vai trò rất quan trọng. Trong nhiều
trường hợp thì đường sucrose cho kết quả tốt hơn các loại đường khác. Ngoài ra một
số chất tự nhiên như nước dừa, nước chiết malt, casein thủy phân, là những chất rất
cần trong nuôi cấy phôi. Các chất kích thích sinh trưởng như GA3, auxin, cytokinine
thường được dùng nhiều trong nuôi cấy phôi. Auxin thường dùng ở nồng độ thấp,
kinetin có vai trò đặc biệt cho sự phát triển của phôi.
Các yếu tố ngoại cảnh như ánh sáng, nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến sự phát triển
của phôi nuôi cấy in vitro. Thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ và ánh sáng thấp hơn
phôi phát triển tự nhiên [7].
1.2.6.2. Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời
Wetmore (1946) nuôi cấy đỉnh chồi cây nho dại, cùng với một số tác giả khác, ông
đã chứng minh các bộ phận của cây đều có thể nuôi cấy khi gặp điều kiện thuận lợi.
Lon và Ball (1946) với thí nghiệm nuôi cấy đỉnh chồi cây măng tây đã cho thấy khi
nuôi cấy các bộ phận của cây như lá, thân, hoa thì khả năng tạo mô sẹo nhiều hơn.
Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây là khác nhau
nhưng có thể thấy một số yêu cầu chung như nguồn carbon dưới dạng đường và các