Khảo sát thành phần hóa học và hoặt tính chống õi hóa của cao hẽan lá bình bát dây coccinia grandí (l ) j voigt họ cucurbitaceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM
KHOA HÓA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
CỬ NHÂN HÓA HỌC
ĐỀ TÀI:

CHUYÊN NGÀNH HÓA HỮU CƠ
Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Tiến Dũng
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Dân An

Tp.HCM, tháng 5- 2013


LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn thầy Lê Tiến Dũng đã truyền đạt những kiến thức, kinh
nghiệm quý báu, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành tốt trong quá
trình làm khóa luận này.
Em cũng gởi lời cảm ơn chân thành đến thầy Mai Đình Trị, phòng các chất có hoạt
tính sinh học đã giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến giúp em hoàn thành tốt khóa luận
này.
Em xin cảm ơn quý thầy cô khoa Hóa học, trường Đại học Sư Phạm Tp.HCM đã
truyền đạt cho em những kiến thức quý báu giúp em có những kiến thức như một hành
trang giúp ích cho việc hoàn thành khóa luận này.
Em cũng gởi lời cảm ơn đến các anh chị và các bạn làm đề tài tại phòng các hợp chất
có hoạt tính sinh học đặc biệt là các bạn trong lớp cùng làm khóa luận này đã luôn
giúp đỡ nhau và góp ý cho em trong suốt quá trình làm khóa luận này.
Con gởi lời cảm ơn chân thành đến ba, mẹ, và anh chị đã luôn động viên, hỗ trợ con
không những về mặt tinh thần mà lẫn vật chất để con yên tâm hoàn thành tốt khóa
luận tốt nghiệp.

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2013

Nguyễn Thị Dân An


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. 1
MỤC LỤC ...................................................................................................................... 3
DANH MỤC HÌNH ẢNH .............................................................................................. 5
DANH MỤC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ .................................................................................. 6
DANH MỤC PHỤ LỤC................................................................................................. 7
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .................................................... 8
LỜI MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 10
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ........................................................................................ 11
1.1 Giới thiệu về bình bát dây[1,4] ............................................................................. 11
1.1.1 Đặc điểm thực vật ........................................................................................ 11
1.1.2 Phân bố sinh thái[1,4] ..................................................................................... 13
1.2 Tác dụng dược lý ................................................................................................ 13
1.2.1 Theo y học cổ truyền [1] ............................................................................... 13
1.2.2 Theo y học hiện đại [16] ................................................................................ 14
1.3 Thành phần hóa học của bình bát dây[8] ............................................................. 17
1.4 Hoạt tính chống oxi hóa [3,9,15] ............................................................................ 21
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM.................................................................................... 23
2.1 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ .............................................................................. 23
2.1.1 Hóa chất ....................................................................................................... 23
2.1.2 Thiết bị và dụng cụ ...................................................................................... 23
2.2 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu .......................................................... 24
2.2.1 Nguyên liệu .................................................................................................. 24
2.2.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 24
2.2.2.1 Phương pháp phân lập các chất ............................................................. 24

2.2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất hóa học .......................... 24
2.2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH[3,9.15] ..................... 25
2.3 Thực nghiệm ...................................................................................................... 26


2.3.1 Điều chế cao ethanol .................................................................................... 26
2.3.2 Cô lập và tinh chế các hợp chất ................................................................... 27
2.3.3 Sơ đồ phân lâp hợp chất............................................................................... 30
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 31
3.1 Hợp chất BBH7 ................................................... Error! Bookmark not defined.
3.2 Hoạt tính chống oxi hóa ...................................... Error! Bookmark not defined.
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 35
4.1 Kết luận .............................................................................................................. 35
4.2 Kiến nghị ............................................................................................................ 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 36
PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 39


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Dây bình bát
Hình 1.2 Lá bình bát dây
Hình 1.3 Quả bình bát dây
Hình 1.4 Hoa bình bát dây


DANH MỤC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ
Bảng 2.1: Kết quả sắc kí cột cao Hexan
Bảng 2.2: Kết quả SKC trên phân đoạn H5
Bảng 3.1: Bảng so sánh số liệu phổ 1H NMR và

13

C NMR của DFA V với phổ 1H

NMR và 13C NMR của cycloartanol
Bảng 3.2: Kết quả thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa theo phương pháp DPPH các
cao chiết Bình bát dây
Sơ đồ 1: Quy trình chiết
Sơ đồ 2: Quy trình phân lập các hợp chất


DANH MỤC PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của hợp chất BBH7 trong dung môi CDCl 3
Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR của hợp chất BBH7 trong dung môi CDCl 3
Phụ lục 3: Phổ DEPT của hợp chất BBH7 trong dung môi CDCl 3
Phụ lục 4: Phổ HSQC của hợp chất BBH7 trong dung môi CDCl 3
Phụ lục 5: Phổ HMBC của hợp chất BBH7 trong dung môi CDCl 3


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tiếng Anh

H

Hexane

C

Chloroform

EA

Ethyl acetate

EtOH

Ethanol

MeOH

Methanol

Tiếng Việt

SKLM

Sắc kí lớp mỏng

SKC

Sắc kí cột
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

13C-NMR

Carbon (13) Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Resonance

1H-NMR

Hydro (1) Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Resonance

DEPT

carbon (13)

carbon (1)

Distortionless Enhancement by Phổ DEPT
Polarization Transfer

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua
Coherence

HSQC

nhiều liên kết

Heteronuclear Single Quantum Phổ tương tác dị hạt nhân qua
Correlation

một liên kết

δ

Chemical shift

Độ chuyển dịch hóa học

Ppm

Part per million

Phần triệu

Mp

Melting point

Điểm nóng chảy

S

Singlet

Mũi đơn

D

Doublet

Mũi đôi

Dd

Double of doublet

Mũi đôi đôi

J

Coupling constant

Hằng số ghép spin

(M)Hz

(Mega) Hertz


G

Gram

Mg

Milligram

Kg

Kilogram

LỜI MỞ ĐẦU
Từ lâu, chúng ta có nguồn thực vật đa dạng và phong phú trong đó có nhiều loài thực
vật có ích như đậu xanh được dùng để thanh nhiệt, giải độc và tiêu khát; gừng có tác
dụng ngăn ngừa cơn đau thắt ngực, kích thích tiêu hóa... Ngày nay, với sự phát triển
của khoa học và kỹ thuật ngày càng hiện đại . Các nhà khoa học đã quan tâm nhiều
đến việc tạo ra các sản phẩm từ thiên nhiên có ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực như:
y học, dược học, sinh học và nông nghiệp,…Bên cạnh đó các nhà hóa học đã tiến
hành tách chiết, cô lập, bán tổng hợp ngày càng nhiều các hợp chất có hoạt tính sinh
học để tạo ra các sản phẩm từ thiên nhiên để nâng cao chất lượng cuộc sống và không
lãng phí nguồn thực vật phong phú.
Bình bát dây Coccinia grandis L. thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae) là một loại dây leo
chúng ra hoa kết trái quanh năm và phân bố rộng rãi ở Việt Nam với những hoạt tính
sinh học như kháng khuẩn, chống oxi hóa, trị bệnh tiểu đường,…Ngoài ra, người ta
còn sử dụng lá chế biến nhiều loại món ăn khác nhau. Trên Thế giới có nhiều nghiên
cứu về hoạt tính sinh học của bình bát dây nhưng ở Việt Nam thì những công trình
nghiên cứu về loài cây này có rất ít. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần
hóa học và hoạt tính chống oxi hóa từ cao hexan của lá bình bát dây.


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu về bình bát dây[1,4]
− Tên khoa học: Coccinia grandis (L.) Voigt, thuộc họ Bầu bí ( Cucurbitaceae)
− Tên gọi khác: Dây mảnh bát, bình bát dây, mảnh bát.
− Tên nước ngoài: Ivy Gourd, Baby Water Melon, Baby Gourd.
1.1.1 Đặc điểm thực vật
Cây thảo nhẵn và mảnh, mọc leo cao, đôi khi dài tới 5m hay hơn, tua cuốn đơn. Lá
hình 5 cạnh, có răng, rộng 5 – 8 cm, hình tim ở gốc, rất nhẵn, chia 5 thùy tam giác, có
mũi nhọn cứng.

Hình 1.1 Dây bình bát


Hình 1.2 Lá bình bát dây
Hoa đực và hoa cái giống nhau, mọc đơn độc hay xếp lại hai cái một ở nách lá, có
cuống dài 2cm. Quả hình trứng ngược hoặc thuôn, dài 5cm, rộng 2.5cm, khi chín có
màu đỏ và thịt quả đỏ chứa nhiều hạt.

Hình 1.3 Quả bình bát dây


Hình 1.3 Hoa bình bát dây
1.1.2 Phân bố sinh thái[1,4]
Bình bát dây phân bố nhiều ở Ấn Độ, Nam Trung Quốc, Việt Nam,
Malaixia,…cũng gặp nhiều ở Châu Phi và Trung Mỹ. Ở Việt Nam bình bát dây mọc
chủ yếu ở Quảng Ninh, Nam Hà, Ninh Bình, Thừa Thiên- Huế, Quảng Nam, Khánh
Hòa, Lâm Đồng vào tới An Giang.
Mọc hoang trên nương rẫy, bờ rào, lùm bụi từ vùng thấp tới vùng cao 1500m. Ra
hoa kết quả gần như quanh năm.
1.2 Tác dụng dược lý
1.2.1 Theo y học cổ truyền [1]
Lá non và quả dùng làm rau ăn. Ở Campuchia, người ta dùng dịch chiết từ thân
cây để trị bệnh đau giác mạc.
Ở Ấn Độ, người ta còn dùng cả cây để làm thuốc trị bệnh lậu, dịch lá và rễ dùng
trị bệnh đái đường; lá dùng đắp ở ngoài da trị phát ban da, ghẻ lỡ, mụn nhọt, các vết
thương và các vết cắn của rắn rết.
Ở Inđônêxia, cây còn được dung làm thuốc trị bệnh đậu mùa, đau dạ dày và ruột.

Trong dân gian dùng củ ngâm rượu bóp chữa sưng đau hay các khớp bị viêm, hoặc
dùng dây bình bát để ngâm. Ngoài ra, lá bình bát dây phối hợp với Bùm sụm, Cỏ mầm
trầu, Dền gai, mỗi thứ một nắm sắc uống để trị huyết áp.
Coccinia grandis Linn. (Curcubitaceae) là một loại thảo mộc dây leo trồng trên
khắp Ấn Độ. Trong y học cổ truyền quả của nó được sử dụng để điều trị bệnh phong,
sốt, hen suyễn, viêm phế quản và vàng da.
Tóm lại trong y học dân gian thì rễ, lá và trái cây được sử dụng cho nhiều mục
đích như trị vàng da, bệnh tiểu đường, chữa lành vết thương, vết loét, đau dạ dày,
bệnh ngoài da, sốt, hen suyễn, ho.
1.2.2 Theo y học hiện đại [16]
Một số nghiên cứu và bài báo cho thấy bình bát dây Coccinia grandis L. có nhiều
hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, trị bệnh tiểu đường, hoạt tính chống oxi hóa,
chống viêm và giảm đau…
Hoạt tính kháng khuẩn [5]
Cao nước, cao hexan từ lá và cao nước, cao hexane, cao ethyl acetate, cao
ethanol của thân bình bát dây Coccinia grandis đã được thử nghiệm hoạt tính kháng
khuẩn và kết quả thu được là chống lại bốn vi khuẩn gram dương (Bacillus cereus,
Corynebacterium bạch hầu, Staphylococcus aureus và Staphylococcus pyogenes) và
sáu vi khuẩn gram âm (vi khuẩn Salmonella typhi, Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis và Shigella boydii). Trong
đó, cao ethanol của thân cây có hoạt tính đối với Pseudomonas aeruginosa trong khi
cao ethyl acetate và cao hexan từ thân cây có hoạt tính hơn với vi khuẩn Salmonella
typhi và Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus pyogenes, Salmonella typhi và
Pseudomonas aeruginosa. Cao ethanol có hoạt tính chống lại vi khuẩn Salmonella


typhi và Pseudomonas aeruginosa còn cao nước có hoạt tính chống lại vi khuẩn
Shigella boydii.

Hoạt tính chống oxy hóa[7]

Một thử nghiệm cho thấy cao methanol và bột của lá bình bát dây Coccinia
grandis có hoạt tính chống oxy hóa.
Hoạt tính chống loét [11]
Cao methanol, cao nước và bột lá của bình bát dây Coccinia grandis L. được thử
nghiệm hoạt tính chống loét ở chuột trong đó thì cao methanol và bột lá có hoạt tính
còn cao nước hầu như không có.
Hoạt tính hạ máu trong mỡ
Cao ethanol của Coccinia grandis (L.) Voigt cho thấy hiệu ứng làm giảm đáng kể
triglyceride (TG) và cholesterol trong mô hình thử nghiệm ở chuột .
Hoạt tính bảo vệ gan[18]
Cao diethyl ether của lá bình bát dây Coccinia grandis được thử nghiệm trên chuột
có hoạt tính bảo vệ gan chống lại CCl 4 gây độc hại gan ở chuột.
Hoạt động chống viêm, giảm đau và hoạt động hạ sốt [14]
Hoạt tính chống viêm, giảm đau và hạ sốt của lá bình bát dây Coccinia grandis đã
được nghiên cứu ở chuột.
Khả năng ức chế enzyme alpha amylase
Một nghiên cứu cho thấy cao methanol của lá bình bát dây Coccinia grandis có
khả năng ức chế 81,13% hoạt động của enzym alpha amylase và điều này giúp ích
trong việc giảm nguy cơ bệnh tiểu đường.
Khả năng trị bệnh tiểu đường[13]


Cao nước và ethanol của bình bát dây có tác dụng hạ đường huyết. Nó giúp điều
hòa lượng đường trong máu. Các hợp chất trong cây ức chế enzyme glucose-6phosphate hỗ trợ và thúc đẩy một cân bằng giúp cơ thể khỏe mạnh và do đó nó được
khuyến khích cho bệnh nhân tiểu đường.


1.3 Thành phần hóa học của bình bát dây[8]
Hợp chất đầu tiên được phân lập trong Bình bát dây là C 60 -polyprenol bởi G.
Singh.

C 60 -polyprenol
Một số hợp chất được phân lập từ Coccinia indica[16]
Một số hợp chất phân lập từ quả Coccinia indica

Taraxerone (1)

Taraxerol (2)

β – carotene (3)


Lycopene (4)

Cryptoxanthin (5)

Apo-6’-lycopenal (6)

β- sitosterol (7)


Một số hợp chất được chiết tách từ thân và lá Coccinia indica

β-amyrin (9)

Lupeol (8)

β- sitosterol (7)

Stigmast -7- en-3-one (10)

Heptacosane (11)
Một số hợp chất được phân lập từ Coccinia indica bởi Rahman vào năm 1990 như:

Aspartic acid (12)

Glutamic acid (13)

Asparagine (14)

Tyrosine (15)


1.4 Hoạt tính chống oxi hóa [3,9,15]
Khái niệm về gốc tự do
Oxy được xem như một nguyên tố quan trọng giúp con người duy trì sự sống,
chúng tham gia vào quá trình hô hấp ở tế bào, sản sinh năng lượng cung cấp cho mọi
hoạt động sống của con người.
Khoảng vài thập niên gần đây, các nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ rằng oxy vào
cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa và trong các quá trình đó oxy tạo ra những
tiểu phân trung gian gọi là các gốc tự do. Các gốc tự do có nguồn gốc oxy này có hoạt
tính cao, kém bền vững và được gọi chung là các gốc dạng oxy hoạt động (ROS:
Reactive oxygen species) . Ban đầu oxygen nhận một điện tử tạo ra gốc superoxyde
(O), đây là gốc tự do quan trọng nhất của tế bào. Từ superoxyde (O 2 •–) nhiều gốc tự
do và các phân tử khác của oxy có khả năng phản ứng cao được tạo ra như hydroxyl
(HO●), hydroperoxyl (HOO●), peroxyl (ROO●), alkoxyl (RO●), lipoperoxyde (LOO•),
H 2 O 2 . Các dạng oxy hoạt động này do có năng lượng cao, kém bền nên dễ dàng phản
ứng với những đại phân tử như protein, lipid, DNA, … gây rối loạn các quá trình sinh
hóa trong cơ thể. Đồng thời, khi một phân tử sống bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất

điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo
thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây chuyền, gây ra các biến đổi có
tác hại đối với cơ thể .
Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con người mới
sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày. Nếu
không được kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như: ung thư, xơ
vữa động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí
tuệ, teo cơ quan bộ phận ở người cao niên, phá rách màng tế bào khiến chất dinh
dưỡng thất thoát, tế bào không tăng trưởng.
Chúng tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có những vết đồi mồi trên
mặt, trên mu bàn tay. Ngoài ra, chúng còn tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các
phân tử protein, đường bột, lipid, enzyme trong tế bào, gây đột biến ở gene, ở DNA,


RNA, làm chất collagen, và elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ
khớp cứng nhắc.
Theo bác sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây
ra sự hóa già và sự chết của các sinh vật. Ông cho là gốc tự do phản ứng lên ty lạp thể,
gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng
trở nên vô dụng và mất khả năng sản xuất năng lượng.
Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh,
đáng kể nhất gồm có: bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục
thủy tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan.
Các nghiên cứu cũng phát hiện rằng các gốc dạng oxy hóa hoạt động (ROS) sẽ
được loại bỏ bằng các chất chống oxy hóa tự nhiên có sẵn trong cơ thể như enzyme
superoxid dismutase (SOD), enzyme glutathion

peroxidase (GSP-Px),enzyme

catalase (CAT)… để tạo sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống

oxy hóa trong cơ thể con người. Đó là một trạng thái cơ bản của cân bằng nội mô
(homeostasis).
Ngày nay, do ảnh hưởng của điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng ồn,
căng thẳng, lo lắng hay sử dụng các thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa đã tạo điều
kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đó là sự gia tăng các dạng oxy hoạt động.
Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ứng bất lợi, tổn thương cho cơ thể
và là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nan y. Do đó cần có những nghiên cứu, tìm
hiểu về các chất có khả năng chống oxy hóa mang lại những tác dụng tốt, có lợi cho
sức khỏe của con người. Bên cạnh đó, chúng ta cũng cần khảo sát thêm những quy
trình thử hoạt tính chống oxy hóa tối ưu và dễ thực hiện để phục vụ cho việc nghiên
cứu.


CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
2.1.1 Hóa chất
Hạt silica gel cỡ hạt 0.04- 0.06 mm dung cho pha thường.
Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien F254
(Merck) dung cho pha thường.
Dung môi dung cho quá trình thí nghiệm gồm:
− Hexane sử dụng có nhiệt độ sôi 690C.
− Chloroform sử dụng có nhiệt độ sôi 620C.
− Ethyl acetate có nhiệt độ sôi 770C.
− Acetone có nhiệt độ sôi 560C
− Methanol có nhiệt độ sôi 640C
− Ethanol có nhiệt độ sôi 780C
− Nước cất.
Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bảng mỏng: dung 10% H 2 SO 4 /EtOH.
2.1.2 Thiết bị và dụng cụ
Đèn UV tử ngoại cầm tay, bước song 254nm và 365nm hiệu UVITEC.

Máy cô quay chân không Buchi – 11.
Bếp cách thủy Julabo 461 Water Bath.
Thiết bị gia nhiệt hồng ngoại hiệu SCHOTT.
Cân phân tích AND HR 200.
Tủ sấy hiệu Memmert.
Máy đánh siêu âm


Cột sắc kí đường kính từ 2 – 5.5cm.
Các dụng cụ thông thường dùng để trích ly như: bình tam giác, cốc thủy tinh, ống
nghiệm, bình cô quay, ống đong, phễu chiết,…
2.2 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Nguyên liệu
Lá bình bát dây Coccinia grandis L., thuộc họ Bầu bí ( Cucurbitaceae) được thu
hái ở Bến Tre vào tháng 7 năm 2012. Lá tươi sau khi thu hái, loại bỏ những lá sâu
bệnh, vàng úa, rửa sạch, để ráo, sấy khô sau đó xay nhuyễn thành bột, được sử dụng
cho việc nghiên cứu.
2.2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1 Phương pháp phân lập các chất
Sử dụng phương pháp ngâm dầm, trích chiết bằng ethanol để trích ly các hợp chất
ra khỏi nguyên liệu.
Các cao phân đoạn được điều chế bằng phương pháp trích ly pha lỏng cao ethanol
ban đầu với các dung môi có độ phân cực tăng dần: hexan, ethyl acetate, nước.
Sử dụng sắc kí cột silica gel pha thường kết hợp với sắc kí lớp mỏng để cô lập các
chất tinh khiết.
Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 365 nm hoặc dùng
thuốc thử là dung dịch H 2 SO 4 /EtOH.
2.2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất hóa học
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR (500MHz),

13

C-NMR (125MHz)

đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, phổ DEPT, phổ HMBC, phổ
HSQC, Viện Hóa Học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội. Với chất nội
chuẩn là CDCl 3 .


2.2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH[3,9,15]
Hiện nay có rất nhiều phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa: oxigen radical
absorbane capacity (ORAC), Total radical-trapping antioxidant parameter (TRAP),
ferrie reducing antioxidant power assay (FRAP), 1,1 diphenyl -2-picrylhydrazyl
radical scavenging (DPPH),… Tuy nhiên ở đây chúng tôi chọn phương pháp thử hoạt
tính chống oxi hóa DPPH vì những ưu điểm của nó so với các phương pháp khác như
sau:
- Phương pháp đơn giản, thiết bị yêu cầu không quá phức tạp.
- Tiến hành nhanh chóng
- Thích hợp nhiều tác nhân chống oxi hóa. Ngoài ra, nó còn được dùng đo tính
chống oxi hóa cho các sản phẩm thực phẩm.
Marsden Blois là người đầu tiên đặt nền móng cho phương pháp DPPH cách đây
gần 50 năm (1958), ở thí nghiệm đầu tiên Blois đã thử hoạt tính chống oxi hóa của
amino axit cystein bằng cách dùng DPPH chuẩn độ nó rồi đo độ hấp thu theo thời gian
ở bước sóng 517nm.
Tên khoa học của DPPH là 1,1 diphenyl -2-picrylhydrazyl (2,2 diphenylpicrylhydrazyl), là gốc tự do bền, màu tím, phân tử không bị dime hóa như một số gốc
tự do khác.

O2N

N

N

.

NO2

O2N

DDPH (1,1-dihenyl-2-picrylhydrazyl)
Khi DPPH phản ứng với chất có khả năng cho nguyên tử H, nó sẽ chuyển về dạng
khử có màu vàng nhạt (màu của nhóm picryl). Phản ứng được thực hiện như sau: