nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra thành nguyên liệu thực phẩm giàu calcium và protein

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Thị Út Lợt

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT
CHẾ BIẾN XƯƠNG CÁ TRA THÀNH
NGUYÊN LIỆU THỰC PHẨM GIÀU
CALCIUM VÀ PROTEIN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Thị Út Lợt

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT
CHẾ BIẾN XƯƠNG CÁ TRA THÀNH
NGUYÊN LIỆU THỰC PHẨM GIÀU
CALCIUM VÀ PROTEIN
Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. LÊ CHIẾN PHƯƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh - 2012


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Lê Chiến Phương, người đã tận tình
hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề
tài. Và thầy cũng là người giúp tôi gắn kết được khoa học với thực tế.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô Khoa Sinh học Trường ĐH Sư phạm
TP. Hồ chí Minh đã hết lòng dạy dỗ tôi.
Tôi xin giử lời cảm ơn đến các anh chị của phòng thí nghiệm Công nghệ biến
đổi sinh học - Viện sinh học nhiệt đới và phòng thí nghiệm Vi sinh - Sinh hóa, khoa
Sinh học, Trường ĐH Sư phạm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn, động viên,
giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến bà Bùi Thị Truyền, giám đốc Công ty trách nhiệm
chế biến thủy sản Minh Quý - cụm công nghiệp Tân Mỹ Chánh - TP. Mỹ Tho tỉnh Tiền Giang đã cung cấp nguyên liệu cho tôi thực hiện đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè và động
nghiệp đã luôn bên cạnh ủng hộ tôi.


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi, các số liệu,
kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong
bất kỳ công trình nghiên cứu nào. Các tài liệu tham khảo đều có nguồn gốc xác
thực.
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Út Lợt


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................i
LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................... ii
MỤC LỤC .................................................................................................................... iii
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN ................................vi
DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ...........................................................................................x
DANH MỤC CÁC BẢNG ...........................................................................................xi
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................... 3
1.1 Tổng quan về vi sinh vật nghiên cứu .................................................................3
1.1.1 Vi khuẩn Bacillus.......................................................................................... 3
1.1.2 Vi khuẩn lactic .............................................................................................. 7
1.2. Giới thiệu về cá tra ...........................................................................................17
1.2.1 Vị trí phân loại ............................................................................................ 17
1.2.2 Đặc điểm chung .......................................................................................... 17
1.2.3 Tình hình sử dụng phụ phẩm cá tra ........................................................... 18
1.3 Tổng quan về TP giàu calcium và protein ......................................................19
1.3.1 Giới thiệu về calcium .................................................................................. 19

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………25
2.1 Nguyên vật liệu ..................................................................................................25
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 25
2.1.2 Nguyên liệu ................................................................................................. 25
2.1.3 Hóa chất ...................................................................................................... 25
2.1.4 Thiết bị và dụng cụ ..................................................................................... 25

2.2 Môi trường nghiên cứu .....................................................................................26
2.3 Nội dung nghiên cứu .........................................................................................27
2.3.1 Sơ đồ thí nghiệm ......................................................................................... 27
2.3.2 Bố trí thí nghiệm ......................................................................................... 29
2.4 Phương pháp nghiên cứu..................................................................................37
2.4.1 Phương pháp cấy truyền giữ giống [32] [38] ........................................... 37
2.4.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn ......................... 37
2.4.3 Định danh VK bằng phương pháp sinh học phân tử [33] ........................... 40
2.4.4 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm KL [22] [29] [32] ........... 41
2.4.5 Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp khuếch tán trên thạch [11]42
2.4.6 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến [11] [20] .... 44
2.4.7 Phương pháp định tính acid lactic [16] [21] ............................................... 45
2.4.8 Phương pháp định lượng acid tổng [2] [21] .............................................. 46
2.4.9 Phương pháp xác định độ ẩm [3] [10] ........................................................ 46
2.4.10 Phương pháp định lượng calcium [3] [10]................................................ 47
2.4.11 Định lượng đạm tổng số (phương pháp Kjeldahl) [3] [10] ...................... 48
2.4.12 Định lượng đạm formol (phương pháp Sorensen) [3] [10] ...................... 50
2.4.13 Phương pháp xác định đạm ammoniac [3] [10] ....................................... 51
2.4.14 Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................ 53

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ..............................................................54
3.1 Khảo sát thành phần hóa học của bột xương cá tra ......................................54
3.2 Đặc điểm sinh học của Bacillus và VK lactic ..................................................54
3.2.1 Bacillus ....................................................................................................... 55
3.2.2 VK lacic ...................................................................................................... 56
3.2.3 Kết quả định danh đến loài bằng sinh học phân tử ..................................... 58
3.3 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng
hợp protease và acid của 2 chủng VK nghiên cứu ...............................................59
3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh

tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens .............................................. 59


3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh
acid của Lactobacillus casei ................................................................................. 69
3.4 Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân protein từ xương
cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens .........................................79
3.4.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước ........................................................................... 80
3.4.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nuôi cấy ............................................................. 81
3.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ .............................................................................. 83
3.4.4 Ảnh hưởng của thời gian ............................................................................ 84
3.5 Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium từ xương cá tra
bằng dịch lên men Lactobacillus casei ...................................................................85
3.5.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men .............................................................. 85
3.5.2 Ảnh hưởng của thời gian trích ly ................................................................ 86
3.6 Một số chỉ tiêu sinh hóa của dịch xương cá tra sau thủy phân protein và
trích ly calcium bằng VSV ......................................................................................88

CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...........................................................90
4.1 Kết luận ..............................................................................................................90
4.2 Kiến nghị ............................................................................................................90

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................92
PHỤ LỤC .....................................................................................................................98


DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

C Ca 2+
HSTN đht

Hàm lượng calcium
Hiệu suất thu nhận đạm hòa tan

HSTP

Hiệu suất thủy phân

KL

Khuẩn lạc

MT

Môi trường

NF

Nitrogen formol

N NH3

Nitrogen ammoniac

N TS

Nitrogen tổng số

NL

Nguyên liệu

STP

Sau thủy phân

TP

Thực phẩm

t0 opt

Nhiệt độ tối thích

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cây phát sinh loài của VK lactic........................................................................... 8
Hình1.2: Lactobacillus casei ................................................................................................. 10
Hình1.3: Lactobacillus bulgaricus ........................................................................................ 11
Hình 1.4: Lactobacillus brevis ............................................................................................... 12
Hình 1.5: Cá tra ....................................................................................................................... 7

Hình 1.6: Sữa giàu calcium .................................................................................................. 21
Hình 1.7: Một số dược phẩm giàu calcium ......................................................................... 22
Hình 1.8: Một số thực phẩm bổ sung calcium .................................................................... 22
Hình 3.1: Bột xương cá tra ................................................................................................... 54
Hình 3.2: Hình thái KL của Bacillus (x4) ........................................................................... 55
Hình 3.3: Hình thái tế bào của Bacillus (x100) ................................................................... 55
Hình 3.4: Bào tử của Bacillus (x100) ................................................................................... 55
Hình 3.5: Bacillus có catalase dương tính ........................................................................... 56
Hình 3.6: Vòng phân giải casein của Bacillus có hoạt tính protease ................................ 56
Hình 3.7: Hình thái KL của VK lactic (x4) ......................................................................... 57
Hình 3.8: Hình thái tế bào của VK lactic (x100) ................................................................ 57
Hình 3.9: VK lactic có catalase âm tính .............................................................................. 58
Hình 3.10: Định tính acid lactic bằng thuốc thử Uphermen ............................................. 58
Hình 3.11: Vòng phân giải casein của Bacillus amyloliquefaciens khi được nuôi ........... 60
cấy ở các khoảng thời gian khác nhau ................................................................................ 60
Hình 3.12: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ protease của ........................ 60


Bacillus amyloliquefaciens .................................................................................................... 60
Hình 3.13: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến hoạt độ protease của ..................................... 62
Bacillus amyloliquefaciens .................................................................................................... 62
Hình 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến hoạt độ protease của ........................... 63
Bacillus amyloliquefaciens .................................................................................................... 63
Hình 3.15: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt độ protease của .................................. 64
Bacillus amyloliquefaciens .................................................................................................... 64
Hình 3.16: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease của ......................................... 66
Bacillus amyloliquefaciens .................................................................................................... 66
Hình 3.17: Động học quá trình lên men của Bacillus amyloliquefaciens ......................... 67
Hình 3.18: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh acid của
Lactobacillus casei ................................................................................................................. 70

Hình 3.19: Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến khả năng sinh acid của ............................. 71
Lactobacillus casei ................................................................................................................. 71
Hình 3.20: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh acid của ................................. 73
Lactobacillus casei ................................................................................................................. 73
Hình 3.21: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến khả năng sinh acid của
Lactobacillus casei ................................................................................................................. 74
Hình 3.22: Ảnh hưởng của pH ban đầu của MT đến khả năng sinh acid của
Lactobacillus casei ................................................................................................................. 75
Hình 3.24: Động học quá trình lên men của Lactobacillus casei ...................................... 78
Hình 3.25: Ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến quá trình thủy phân protein từ
xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens ............................................ 81


Hình 3.26: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens đến
quá trình thủy phân protein từ xương cá tra ..................................................................... 82
Hình 3.27: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân protein từ xương
cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens ........................................................ 83
Hình 3.28: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân protein từ xương
cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens ........................................................ 85
Hình 3.29: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men Lactobacillus casei đến quá trình
trích ly calcium từ xương cá tra ........................................................................................... 86
Hình 3.30: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình trích ly calcium từ xương cá
tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei ........................................................................... 87
Hình 3.31: Dịch xương cá tra ............................................................................................... 88


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1: Quá trình lên men lactic đồng hình (nét liền) và dị hình (nét đứt) ............. 13
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ thí nghiệm xử lý phụ phẩm cá tra bằng VSV tạo nguyên liệu

TP giàu calcium và protein ............................................................................................... 28
Sơ đồ 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng
sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens.................................................. 31
Sơ đồ 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng
sinh acid của Lactobacillus casei ...................................................................................... 33
Sơ đồ 2.4: Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân protein
từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens .................................... 35
Sơ đồ 2.5: Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium của
xương cá tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei ..................................................... 36


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng trên 100g thành phẩm ăn được ............................... 18
Bảng 1.2: Thành phần hóa học của các phần phụ phẩm cá tra....................................... 19
Bảng 1.3: Hàm lượng protein trong một số loại TP thông dụng ..................................... 24
Bảng 3.2: Đặc điểm sinh học của Bacillus .......................................................................... 55
Bảng 3.3: Đặc điểm sinh học của VK lactic ....................................................................... 56
Bảng 3.4: Mật độ tế bào Bacillus amyloliquefaciens trong giống các cấp ...................... 59
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ protease của ......................... 60
Bacillus amyloliquefaciens................................................................................................... 60
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến hoạt độ protease của ...................................... 61
Bacillus amyloliquefaciens................................................................................................... 61
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến hoạt độ protease của ............................ 63
Bacillus amyloliquefaciens................................................................................................... 63
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt độ protease của ..................................... 4
Bacillus amyloliquefaciens..................................................................................................... 4
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease của .......................................... 65
Bacillus amyloliquefaciens................................................................................................... 65
Bảng 3.10: Động học quá trình lên men của Bacillus amyloliquefaciens ....................... 67

Bảng 3.11: Mật độ tế bào Lactobacillus casei trong giống các cấp ................................. 69
Bảng 3.12: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh acid của
Lactobacillus casei ................................................................................................................ 70
Bảng 3.13: Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến khả năng sinh acid của ............................ 71


Lactobacillus casei ................................................................................................................ 71
Bảng 3.14: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh acid của ................................ 72
Lactobacillus casei ................................................................................................................ 72
Bảng 3.15: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến khả năng sinh acid của
Lactobacillus casei ................................................................................................................ 74
Bảng 3.16: Ảnh hưởng của pH ban đầu của MT đến khả năng sinh acid của
Lactobacillus casei ................................................................................................................ 75
Bảng 3.17: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh acid của .................................... 76
Lactobacillus casei ................................................................................................................ 76
Bảng 3.18: Động học quá trình lên men của Lactobacillus casei..................................... 78
Bảng 3.19: Ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến quá trình thủy phân protein từ
xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens........................................... 80
Bảng 3.20: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens đến
quá trình thủy phân protein từ xương cá tra ................................................................... 82
Bảng 3.21: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân protein từ xương
cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens ...................................................... 83
Bảng 3.22: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân protein từ xương
cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens ...................................................... 84
Bảng 3.23: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men Lactobacillus casei đến quá trình
trích ly calcium từ xương cá tra .......................................................................................... 86
Bảng 3.24: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình trích ly calcium từ xương cá
tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei ......................................................................... 87
Bảng 3.25: Một số chỉ tiêu sinh hóa của dịch xương cá tra sau thủy phân
protein và trích ly calcium bằng VSV ................................................................................ 88

MỞ ĐẦU
 Lí do chọn đề tài
Theo nghiên cứu của Viện dinh dưỡng Việt Nam, lượng calcium từ bữa ăn
hằng ngày của người Việt Nam trung bình là 700mg. Muốn cung cấp đủ calcium
cho cơ thể thì lượng thức ăn phải đảm bảo từ 1.200 - 1.300mg calcium/ngày, thậm
chí nhiều hơn trong một số trường hợp cần thiết. Hiện nay, các thực phẩm (TP) giàu
calcium chủ yếu nhập từ nước ngoài với giá thành cao. Trong khi đó, các nguồn
nguyên liệu TP giàu calcium tại Việt Nam rất nhiều, đặc biệt trong phế phẩm động
vật như vỏ ghêu, vỏ sò, xương cá, xương gia súc, xương gia cầm, … đang bị bỏ phí,
chưa được tận dụng và gây ô nhiễm môi trường (MT). Trong đó, phụ phẩm cá tra
được xem như một nguồn tiềm năng cung cấp nguyên liệu giàu calcium và protein
rất cần thiết cho con người. Vì vậy, vấn đề xử lý phụ phẩm cá tra hiệu quả, kinh tế
và thân thiện với MT đang ngày càng trở nên cấp thiết.
Những năm gần đây, việc tận dụng phụ phẩm cá tra đang được sự quan tâm
đầu tư của các doanh nghiệp chế biến thủy sản nhằm chế biến ra những mặt hàng có
giá trị gia tăng như: đầu, xương chế biến thức ăn công nghiệp phục vụ chăn nuôi, da
cá xuất khẩu sang châu Âu phục vụ công nghiệp TP, dược phẩm, ... Bên cạnh đó
việc xử lý loại phụ phẩm này bằng phương pháp sinh học đang rất được quan tâm,
đặc biệt là sử dụng VSV, vì đây là một trong những biện pháp thân thiện với môi
trường nhằm tạo ra những sản phẩm có nhiều công dụng và giá trị dinh dưỡng cao.
Từ những lý do trên, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật
chế biến xương cá tra thành nguyên liệu thực phẩm giàu calcium và protein”.
 Mục đích của đề tài
Nghiên cứu điều kiện tối ưu để xử lý xương cá tra bằng tác dụng của VSV tạo
ra nguyên liệu TP giàu calcium và protein.
 Đối tượng nghiên cứu
Các chủng VK do phòng thí nghiệm Công nghệ biến đổi sinh học – Viện Sinh
học nhiệt đới Thành Phố Hồ Chí Minh cung cấp.

 Nhiệm vụ của đề tài


- Phân tích một số chỉ tiêu sinh hóa của xương cá tra.
- Khảo sát ảnh hưởng các điều kiện MT nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
protease của Bacillus amyloliquefaciens và khả năng sinh acid của Lactobacillus
casei.
- Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân protein từ xương cá
tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens.
- Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium từ xương cá tra
(sau khi tách protein) bằng dịch lên men Lactobacillus casei.
- Phân tích một số chỉ tiêu sinh hóa của dịch xương cá tra đã được xử lý bằng
VSV.


CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về vi sinh vật nghiên cứu
1.1.1 Vi khuẩn Bacillus
1.1.1.1 Đặc điểm chung
* Vị trí phân loại
Bacillus là giống lớn, đa dạng (có khoảng 48 loài). Theo Ferdinand Cohn
(1872), Bacillus (VK tạo nội bào tử) có vị trí phân loại như sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacilliales
Họ: Bacilliaceae
Giống: Bacillus (trực khuẩn tạo nội bào tử)
Một số loài thường gặp như Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens,
Bacillus cereus, Bacillus mensentericus, ... Loài Bacillus amylolyquefaciens có

quan hệ rất gần gũi với loài Bacilus subtilis là hai loài phụ của nó là Bacillus
licheniformis và Bacillus pumilus tạo nên nhóm Bacilus subtilis. Vì vậy có khi
người ta còn gọi Bacillus amyloliquenfaciens là Bacillus subtilis subsp.
amyloliquefaciens. Danh pháp chủng loại quốc tế của Bacillus amyloliquenfaciens
là chủng (Strain) ATCC 23350. [40]
* Môi trường sống
Bacillus có mặt ở khắp nơi trong tự nhiên như trong rơm cỏ, mùn thực vật, đất,
không khí, trên bề mặt các loại hạt và sản phẩm được chế biến từ hạt, ... [45] [65]
Bacillus có mức độ thích nghi cao. Phần lớn Bacillus là VK ưa nhiệt với nhiệt
độ tối thích (t0 opt ) từ 30 - 450C, một số chịu nhiệt lên tới 650C hoặc ưa lạnh với từ
50C - 250C nhưng thường gặp Bacillus sống ở nhiệt độ 34 – 370C. Bacillus sinh
trưởng trong khoảng pH rộng từ 2 – 11 [41]. Chúng sinh trưởng tốt ở pH = 7 [33].
Ngoài ra, trong chi này chúng ta có thể gặp một số loài có thể phát triển ở những


MT đặc biệt khắc nghiệt như pH cực trị, nhiệt độ rất cao (một số chủng có thể sống
ở MT 1000C trong 30 phút) [45] [65] hoặc rất thấp, và nồng độ muối rất cao mà ít
sinh vật nào có thể chịu được là do chúng có khả năng hình thành nội bào tử (nha
bào) tồn tại ở trạng thái “ngủ đông” trong thời gian dài [41] [52], và tái tổ hợp
DNA bộ gen với DNA lạ [45] [61]. Dưới điều kiện sinh trưởng tối ưu trong phòng
thí nghiệm, Bacillus có thời gian thế hệ là 25phút. [41]
* Về hình thái
KL khô, không màu hoặc màu trắng xám nhạt, hơi nhăn hoặc tạo ra một lớp
màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn hoặc mép lồi, lõm nhiều hay ít bám
chặt vào môi trường thạch. [5] [45] [65]
Tế bào hình que, kích thước 0.3 - 2.2 x 1.2 - 7µm [41], tế bào thường nối với
nhau thành chuỗi có độ dài khác nhau hoặc tạo ra lớp riêng rẽ [45] [65]. Bào tử có
dạng hình cầu elip hay hình trụ tròn nằm trong khoảng trung tâm đến gần cuối tế
bào và túi bào tử phồng hoặc không phồng, bào tử có kích thước 0.6 - 0.9 x 1.0 1.5µm. [43] [68]
* Về sinh lý, sinh hóa

Bacillus là loại trực khuẩn Gram dương, phản ứng Gram của Bacillus có thể
thay đổi trong chu trình sống của nó, chỉ những tế bào còn non mới chắc chắc là
Gram dương. Chúng có sinh bào tử [43], khác với tế bào dinh dưỡng, vách bào tử
mỏng, không bắt màu phẩm nhuộm được bao bọc bởi vỏ trong có cấu tạo từ glycan
peptid và vỏ ngoài nên nó bị khúc xạ ánh sáng mạnh hơn, khó nhuộm màu, bền với
nhiệt và các yếu tố phá hủy khác. Tế bào khi còn non có khả năng di động nhờ tiêm
mao. [1]
Hầu hết các loài thuộc chi Bacillus sống hiếu khí hay hiếu khí tùy tiện. Là
những sinh vật hóa dị dưỡng thu năng lượng nhờ sự oxi hóa các hợp chất hữu cơ,
chúng có khả năng sử dụng chất hữu cơ do nhiều nguồn cơ chất khác nhau cung cấp
như tinh bột, đường, protein đến chất béo, một số VK tự dưỡng không bắt buộc
(Bacillus schlegelli). Chúng có khả năng phát triển trong MT chỉ có CO 2 và tạo ra
ATP thông qua quá trình lên men butandiol cũng như amon hóa nitrate. [36] [46]


Chu trình sống của Bacillus được chia ra làm 3 giai đoạn: tăng trưởng sinh dưỡng,
hình thành bào tử và nảy mầm. Tăng trưởng tế bào sinh dưỡng xảy ra khi các chất
dinh dưỡng dồi dào và tăng trưởng theo hàm số mũ. Khi chất dinh dưỡng cạn kiệt
chúng bắt đầu hình thành bào tử. Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo một bào tử, bào tử
này có khả năng chịu nhiệt, chịu tia bức xạ, chất sát khuẩn, chất hút ẩm. Vì vậy,
Bacillus có thể chịu được nhiều sinh cảnh khắc nghiệt như cát sa mạc, suối nước
nóng, môi trường đất ở Bắc Cực và có khả năng tồn tại ở trạng thái bào tử trong
nhiều năm [43]. Tuy nhiên sự phát triển bào tử không phải là sự phát triển tùy chọn
của tế bào sinh dưỡng mà nó cũng có thể theo những trình tự thay đổi khác nhau,
việc biểu hiện các gen là cần thiết để đáp ứng lại các điều kiện bất lợi của MT hoặc
tìm kiếm các chất dinh dưỡng khác và tăng cường khả năng cạnh tranh chống lại
các loài khác [39]. Việc hình thành bào tử là một quá trình phức tạp tiêu tốn nhiều
năng lượng, tế bào cần giảm nhu cầu sử dụng chất dinh dưỡng để đảm bảo đủ chất
dinh dưỡng cho quá trình hình thành bào tử (Gonzalez – Pastor et al, 2003). Trong
điều kiện đó, chúng có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme như amylase,

chitinase, hemicellulase, glucanase, lipase, protease, ... [43] [37] và các chất chuyển
hóa sơ cấp như chất kháng sinh, inosinic acid, guanilic acid, nucleotide acid, các
hợp chất thứ cấp, ... [1]
1.1.1.2 Một số ứng dụng và tác hại của Bacillus
* Ứng dụng của Bacillus
Bacillus được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như:
- Trong công nghiệp:
+ Bacillus có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme nên được ứng dụng
nhiều trong sản xuất nhiều loại enzyme công nghiệp như được ứng dụng nhiều
trong α - amylase, protease, phytase, ... có vai trò trong công nghệ thực phẩm như
amylase dùng để đường hoá tinh bột hay hệ enzyme của Bacillus subtilis được ứng
dụng nhiều trong sản xuất chất tẩy rửa và sản xuất enzyme công nghiệp. Bacillus
subtilis có khả năng tổng hợp lysine khá cao (15 - 20%) từ tinh bột nên được ứng


dụng để sản xuất lysine, lên men đậu nành [38]. Bacillus amyloliquefaciens được
thế giới sử dụng để sản xuất α – amylase và protease ở quy mô công nghiệp.
+ Ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thuộc da. Việc xử lý da bằng cách sử
dụng enzyme là tốt nhất vì nó mang lại nhiều lợi thế: dễ kiểm soát, nhanh chóng và
giảm được chất thải. Xử lý bằng enzyme sẽ tiêu hủy các sắc tố không mong muốn,
từ đó có được da sạch [42]. George và cộng sự (1995) sử dụng protease kiềm của
B. amyloliquefaciens cho việc làm rụng lông và da.
- Trong nông nghiệp: Do Bacillus có khả năng tạo bào tử, sinh các loài enzyme
ngoại bào và khả năng đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh như Streptococcus
pyogenes, E. coli, Salmonella, Vibrio sp, ... nên được sử dụng làm probiotic. [25]
[35] Ví dụ như Bacillus subtilis bổ sung trong thức ăn chăn nuôi nhằm cải thiện tiêu
hóa, sức tăng trưởng, giảm sự tái phát bệnh tiêu chảy trên gia súc; bổ sung vào ao
nuôi nhằm duy trì chất lượng nước ao, hạn chế bệnh cho thủy sản nuôi [38]. Yerra
Koteswara Rao và cộng sự (2006) đã nghiên cứu và chứng minh được
chủng Bacillus amyloliquefaciens B128 là một tác nhân kiểm soát sinh học

đối với Botrylis elliptica (mầm bệnh màu xám mốc trên hoa huệ).
- Bảo vệ môi trường: Một số loài thuộc chi này có khả năng sinh protease và
cellulase với hoạt tính khá cao như Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacien,
Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus megaterium, ... người ta sử dụng
chúng làm phân bón hữu cơ để thủy phân protein thực vật và động vật có trong rác
hữu cơ hoặc sử dụng để xử lý rác thải [38][23]. Ngoài ra, chúng còn là một trong
những thành phần của sản phẩm dùng để xử lý môi trường nuôi tôm và thức ăn bổ
sung cho tôm. Thành phần của các sản phẩm này là các VSV (Pseudomonas
fluorescens, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Lactic bacteria,
Rhodotorula mucilaginosa, Rhodosporidium toruloides) mà trong đó mỗi loại giữ
một chức năng riêng và tổng của các sản phẩm là hệ VSV có ích, giúp cho con tôm
phát triển khoẻ mạnh, chống lại được một số bệnh và điều kiện khắc nghiệt [50].
- Trong y dược: Bacillus được ứng dụng tạo ra nhiều loại thuốc trị bệnh hữu
hiệu như: Bacillus subtilis được đóng thành từng ống 10ml hoặc gói dạng bột gọi là


subtilin (Humfeld and Feustel, 1943) để điều trị bệnh tiêu chảy cho người do
Coliforms gây ra, bệnh đường ruột do lị trực trùng hoặc dùng để đắp vết thương
ngoài da [38]. Từ Bacillus subtilis có thể thu được nhiều kháng sinh như Subtilin
(Humfeld and Feustel, 1943), Eulycin (Johnson and Durdon, 1946), Bacillomin
(Shtikell and Poplavskii, 1955)
* Tác hại của Bacillus
- Đa số các loài thuộc chi Bacillus là vô hại, một số có hại là do chúng có khả
năng tạo bào tử. Hai loài nổi tiếng làm hỏng thức ăn là:
+ Bacillus subtilis có thể sống sót trong độ nóng rất cao đó là tác nhân chính
làm bánh mì bị hư, gây hỏng một số thực phẩm đồ hộp làm thực phẩm đồ hộp có
mùi thối chua rất khó chịu, là thủ phạm gây hỏng các thực phẩm sữa bánh ngọt,
chocolate, kẹo có nhân được bảo quản khi khí hậu nóng, gây bệnh “chảy nhớt khoai
tây” và “chảy nhớt bánh mì” được Laurent phát hiện đầu tiên 1885. [52]
+ Bacillus coagulans có thể phát triển ở mức pH = 4.2 và gây ra vị chua nặng

ở thức ăn đóng hộp và các thức ăn có tính acid mà bình thường khống chế sự phát
triển của đa số vi khuẩn ở mức thấp nhất.
- Ngoài ra bào tử của loài Bacillus cereus phân bố khắp nơi trong đất, không
khí, ... thường phát triển trên thực phẩm và có thể sinh ra độc tố gây ngộ độc thực
phẩm. [26]
1.1.2 Vi khuẩn lactic
1.1.2.1 Đặc điểm chung
* Vị trí phân loại
Theo khóa phân loại của Bergey (1957), VK lactic thuộc: [44]
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Họ: Lactobacillaceae
Giống: Lactobacillus, Pediococcus
Họ: Enterococcaceae


Giống: Enterococcus
Họ: Leuconoscaceae
Giống: Leuconostoc
Ho: Streptococcaceae
Giống: Streptococcus, Lactococcus

Hình 1.1: Cây phát sinh loài của VK lactic [47]
* Môi trường sống
Trong tự nhiên, VK lactic thường gặp trong đất, nước, không khí, nhưng chủ
yếu là ở thực vật (rau, quả, ...) và các sản phẩm lên men (sữa chua, nem chua, dưa
muối chua, ...). Chúng tồn tại trong đường ruột (có nhiều VK lactic thuộc
Enterococcus và Lactobacillus, trong đó VK Lactobacillus chiếm số lượng nhiều
nhất) và miệng của cơ thể người và động vật [20].

VK lactic không thể phát triển được trong môi trường muối khoáng thuần khiết
chứa glucose, NH 4 +. Đa số chúng cần hàng loạt vitamin và các acid amin.
Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của VK lactic ưa ấm là 25 - 350C, ưa nhiệt 40 450C và ưa lạnh là thấp hơn 50C. Khi gia nhiệt khoảng 60 - 800C thì hầu hết chúng
bị chết sau 10 - 30phút.
* Đặc điểm hình thái


KL tròn, nhỏ, màu trắng sữa, nhẵn bóng, lồi trên bề mặt thạch, có mép đều
hoặc rìa xung quanh bám vào môi trường thạch [17].
Tế bào có dạng hình que (trực khuẩn) kích thước 1 - 8µm, xếp thành cặp hay
chuỗi với chiều dài khác nhau; hoặc hình cầu (cầu khuẩn) kích thước 0.5 - 1.5 µm,
đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi. [20]
* Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
VK lactic là VK Gram dương (tế bào còn non cho kết quả Gram dương, và trở
thành Gram âm khi về già, không sinh bào tử (tuy nhiên, hiện nay người ta tìm thấy
một số giống trong họ VK lactic có khả năng tạo bào tử) và hầu hết không có khả
năng di động.
VK lactic không hô hấp do không có cytochrom và catalase âm tính. Là VK có
khả năng sống được trong MT có oxy và không có oxy. Trong điều kiện hiếu khí,
trong điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành CO 2 ,
H 2 O và tạo ra 36 hoặc 38 ATP; trong điều kiện kỵ khí từ một phân tử glucose chỉ
tạo ra 2 ATP, do đó lượng cơ chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất
kháng sinh. Trong điều kiện hiếu khí sinh khối của VK phát triển nhanh hơn so với
điều kiện kỵ khí. LAB có khả năng tổng hợp peroxydase rất mạnh, chúng phân giải
H 2 O 2 để tạo H 2 O và O 2 để phát triển.
1.1.2.2 Phân loại
Việc phân loại VK lactic khác nhau phần lớn là dựa trên hình thái học, chế độ
và con đường lên men khác nhau, tăng trưởng ở nhiệt độ khác nhau, qui trình sản
xuất acid lactic, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao, và chịu được acid hoặc
kiềm hoặc phân loại theo con đường hóa học như thành phần acid béo và các thành

phần của thành tế bào, ngoài ra phương pháp sinh học di truyền hiện đại cũng được
sử dụng trong phân loại.
VK lactic trao đổi chất chủ yếu bằng quá trình lên men. VK lactic có thể lên
men được các đường monosaccharid, disaccharid, protein tan, pepton, ... Phần lớn
chúng không lên men tinh bột và các polisaccharid khác. Khi nghiên cứu về khả
năng lên men lactic từ nguyên liệu chứa đường, người ta thấy có hai nhóm VK


lactic chuyển hóa đường hoàn toàn khác nhau: VK lactic đồng hình và VK lactic dị
hình [20].
* VK lactic đồng hình
- Lactobacillus casei [6] [20] [67]
+ Là những trực khuẩn nhỏ, có kích
thước rất ngắn. Chúng có thể tạo thành chuỗi,
không chuyển động, Gram dương.
+ Yếm khí tuỳ tiện; lên men tốt glucose,
maltose, lactose tạo ra môi trường có từ 0,8% 1% axit lactic; và không tạo catalase.
Hình1.2: Lactobacillus casei
+ Nguồn nitơ cho vi khuẩn này là peptone. Chúng thuỷ phân casein và
gelatin rất yếu.
+ Nhiệt độ tối thiểu cho chúng phát triển là 10oC, t0 opt từ 28 - 320C.


- Lactobacillus bulgaricus [6] [20] [51]
+ Là trực khuẩn có kích thước rất dài, liên
kết với nhau tạo thành chuỗi, Gram dương, không
có khả năng di chuyển.
+ Nhiệt độ phát triển tối ưu t0 opt từ 45 620C.
+ Chúng có khả năng lên men glucose,
lactose tạo độ axit cao (3,7% axit lactic). Không

lên men được xylose, arabinose, sorbose, dulcitol,
mannitol, dextrin, inulin.
Hình1.3: Lactobacillus bulgaricus
+ Chúng không có khả năng tạo nitrite và nitrat.
- Streptococcus cremoris [19] [20] [70]
+ KL tròn, có thể chuyển từ dạng nhám sang dạng mịn và tạo chất nhày, bề
mặt KL lồi và thường nhỏ hơn 1mm. Tế bào cò dạng hình tròn hoặc hình trứng
(oval) đường kính 0.5 - 1µm thường xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc tạo thành chuỗi
dài. Cầu khuẩn Gram dương, không nha bào, không di động, và thường không tạo
sắc tố.
+ Thường phát triển t0 opt từ 250C - 300C.
+ Lên men glucose, galactose. Khi lên men sinh ra rất ít hoặc không sinh
CO 2 và có thể tạo ra một lượng đáng kể ethanol, acid acetic, acid formic, …
(Gunsalus and Niven, 1942)
* VK lactic dị hình
- Lactobacillus pasteurianus [20]
+ Là trực khuẩn Gram dương có kích thước 0.5 - 1.0µm x 7.0 - 35µm. Trong
tự nhiên chúng tồn tại riêng rẽ, không di động.
+ Nhiệt độ thích hợp là 290C - 330C.
+ pH thích hợp 8.0.