Nghiên cứu thành phần và hiệu quả xử lý nước thải nhà máy bia của chế phẩm sinh học BIO PB

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>
BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

PHẠM THẾ VIỆT

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN VÀ HIỆU QUẢ XỬ LÝ NƢỚC THẢI
NHÀ MÁY BIA CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC BIO - PB

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2014

1


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>
BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

PHẠM THẾ VIỆT

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN VÀ HIỆU QUẢ XỬ LÝ NƢỚC THẢI
NHÀ MÁY BIA CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC BIO - PB

Chuyên ngành

: Vi Sinh Vật Học

Mã số

: 60 42 01 03

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS.PHÍ QUYẾT TIẾN

Hà Nội – 2014
2


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>
MỞ ĐẦU
Việt Nam là nước có nền kinh tế phát triển nhanh, kéo theo đó là sự phát triển
của nhiều ngành công nghiệp chế biến, sản xuất và dịch vụ gia tăng. Việc phát triển
nhanh của các ngành này đã tạo ra một lượng lớn các chất thải và nước thải, nếu không
được xử lý đúng cách sẽ dẫn đến ô nhiễm nguồn nước mặt, nước ngầm và ảnh hưởng
nghiêm trọng đến cuộc sống của người dân, sự phát triển kinh tế và diện mạo của đất
nước. Đối với chất thải và nước thải của các ngành sản xuất thực phẩm như bia, rượu,
chế biến sản phẩm đồ hộp…, thành phần chủ yếu là hỗn hợp các hợp chất hydocacbon,
protein, lipit. Đây là các thành phần dễ phân hủy bởi vi sinh vật, nếu không xử lý triệt
để sẽ gây ra ô nhiễm nghiêm trọng. Có thể xử lý nước thải theo nhiều cách, một trong
những biện pháp xử lý hiệu quả là sử dụng các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy
nhanh, đặc hiệu với các loại hợp chất hữu, có giá thành thấp, ổn định và không gây tác
động xấu đến môi trường.
Trong tự nhiên, vi sinh vật với những đặc tính ưu việt sẵn có vẫn hàng ngày,
hàng giờ phân hủy các chất hữu cơ phức tạp thành các hợp chất trung gian và những
hợp chất đơn giản hơn. Do vậy, hệ vi sinh vật tự nhiên có thể xem như là một nhà máy
xử lý ô nhiễm khổng lồ. Các nhà khoa học đã không ngừng nghiên cứu để khai thác và
ứng dụng những lợi thế của vi sinh vật và tạo điều kiện tốt nhất cho chúng phát triển
trong những điều kiện và quy mô có kiểm soát, từng bước bắt chúng phục vụ cho hoạt
động sống của con người [9; 11]. Hệ vi sinh vật sử dụng trong quá trình xử lý nước
thải gồm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn… trong đó vi khuẩn chiếm số lượng
lớn nhất. Trong các bể xử lý sinh học, vi khuẩn đóng vai trò hàng đầu và chịu trách
nhiệm chính trong phân hủy các thành phần hữu cơ trong nước thải. Theo nhiều học
giả, trong bùn hoạt tính có nhiều vi sinh vật thuộc các chi khác nhau như:
Actinomyces,

Arthrobacter,

Bacillus,

Corynebacterium,

Deslfotomacillium,

Micrococcus, Pseudomonas, Sarcina,… Nhóm nấm men cũng xuất hiện trong xử lý
nước thải với vai trò chuyển hóa đường đơn thành rượu, bao gồm các chi
Saccharomyces, Pichia…và giúp hạn chế sự phát triển của các nhóm vi khuẩn kỵ khí
khác [14; 16].
Trong các hệ thống xử lý nước thải công nghiệp bằng phương pháp sinh học, hệ
vi sinh vật sử dụng trong xử lý nước nước thải có khả năng phân hủy các hợp chất gây
3


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>
ô nhiễm đã được nhiều nhóm nghiên cứu trong và ngoài nước nghiên cứu từ lâu. Tuy
nhiên, trong một số hệ thống quá trình xử lý xảy ra bằng bùn yếm khí có sẵn hoặc bùn
hoạt tính chưa thể xử lý triệt để nguồn ô nhiễm hoặc thời gian xử lý kéo dài. Vì vậy,
bổ sung vi sinh vật hữu ích trong quá trình xử lý chất thải sẽ không gây ảnh hưởng xấu
tới môi trường và giúp cho quá trình xử lý diễn ra nhanh hơn, tiết kiệm chi phí và thời
gian xử lý [14; 17]
Thị trường chế phẩm sinh học ở Việt Nam và nhu cầu sử dụng chế phẩm sinh học
rất lớn và đã được áp dụng thành công ở một số nhà máy sản xuất thực phẩm và công
nghiệp. Tuy nhiên, với chế phẩm thương mại ngoài thị trường rất phong phú và đa
dạng, việc đánh giá chế phẩm sinh học sản xuất trong nước hay nhập khẩu cần phải
kiểm tra và đánh giá tiêu chuẩn. Xuất phát từ yêu cầu của nhà máy bia Hà Nội trong
việc thử nghiệm một loại chế phẩm sinh học Bio-BP nhập ngoại nhằm tăng cường hiệu
quả xử lý nước thải trong hệ thống xử lý sẵn có của nhà máy, yêu cầu đánh giá thành

phần của chế phẩm và hiệu quả sử dụng là hết sức cần thiết. Ngoài ra, trong giai đoạn
sản xuất vào mùa hè, mùi hôi từ hệ thống xử lý nước thải gây ra có thể làm ô nhiễm
nguồn không khí đối với nhà máy và khu vực dân cư lần cận. Chính vì vậy, chúng tôi
thực hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần và hiệu quả xử lý nước thải nhà máy bia của
chế phẩm Bio-PB” với các nội dung nghiên cứu chính:
-

Nghiên cứu thành phần của chế phẩm sinh học Bio-PB

-

Nghiên cứu đặc điểm các chủng vi sinh vật trong chế phẩm Bio-PB

-

Đánh giá hiệu quả hỗ trợ xử lý nước thải của chế phẩm sinh học trong giai đoạn
xử lý vào mùa hè 2013

Đề tài được thực hiện với sự hỗ trợ của Viện nghiên cứu Gia Dày - Bộ Công
Thương và Phòng Công nghệ lên men - Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

4


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>
PHẦN I. TỔNG QUAN
1.1 . Tình hình nghiên cứu xử lý nƣớc thải hữu cơ trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.1. Tình hình nghiên cứu xử lý nƣớc thải hữu cơ trên thế giới
Sự phát triển của phương pháp thứ cấp để xử lý nước thải trong những năm
đầu thế kỷ XX được cho là cải tiến đáng kể nhất đối với y tế công cộng và môi
trường trong suốt thời gian này, đó là việc phát minh ra "bùn hoạt tính" cho quy trình
xử lý nước thải. Fowler và cộng sự tại Đại học Manchester được tiến hành tại Trạm
Thí nghiệm Lawrence ở Massachusetts liên quan đến việc sục khí vào nước thải
trong bình đã được phủ một lớp tảo [13]. Các đồng nghiệp của Fowler, Edward
Ardern và Lockett, những người đã triển khai nghiên cứu cùng với Văn phòng công
ty đường sông Manchester ở công trình xử lý nước thải Davyhulme. Thí nghiệm trên
được thực hiện trong một lò phản ứng bằng cách hút ra và thu vào, việc xử lý cho
hiệu quả cao hơn. Họ sục khí liên tục cho nước thải trong khoảng một tháng và kết
quả đạt được là nitrat hóa hoàn toàn các nguyên liệu mẫu [13]. Điều đó chỉ ra rằng
bùn đã hoạt hóa các chất (một cách tương tự như than hoạt tính) quá trình được đặt
tên là bùn hoạt tính. Kết quả đã được công bố trong công trình tại Hội thảo 1914, và
lần đầu tiên một hệ thống quy mô đầy đủ với dòng chảy liên tục được lắp đặt tại
Worcester hai năm sau đó. Do hậu quả của chiến tranh thế giới thứ nhất phương pháp
xử lý mới được truyền bá nhanh chóng, đặc biệt là Hoa Kỳ, Đan Mạch, Đức và
Canada [13]. Vào cuối những năm 1930, việc xử lý nước thải bằng bùn hoạt tính là
quá trình chủ yếu được sử dụng trên toàn thế giớ
:

Actinomyces,

Arthrobacer,

Bacillus,

Bacterium,

Corynebacterium, Desulfotomacillium, Micrococcus, Pseudomonas, Sarcina …

[16].
Ở Mỹ, hàm lượng nitơ trong nước thải thường dao động trong khoảng 20 đến
85 mg/l trong đó nitơ ở dạng hợp chất hữu cơ trung bình từ 8 đến 35 mg/l, hàm lượng
NH3 từ 12 đến 50 mg/l [32]. Hàm lượng photphate trong nguồn nước không ô nhiễm
nhỏ hơn 0,01 mg/l. Theo quy định của Hà Lan, tiêu chuẩn của Việt Nam, hàm lượng
photphate trong nước uống không được vượt quá 6 mg/l. Theo tiêu chuẩn của cộng
đồng chung châu Âu, trong nước sinh hoạt, hàm lượng photphate không được vượt
quá 2,18 mg/l [30].
5


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>
Xử lý nước thải của quá trình chế biến rau quả các nhà khoa học Thái Lan đã
sử dụng chủng nấm men Candida utilis CBS1517 có khả năng đồng hóa tốt các loại
đường và axit hữu cơ có nhiều trong thành phần nước thải, kết quả thu được cho thấy
sau 96 giờ xử lý trong điều kiện phòng thí nghiệm là COD giảm 89,9% và pH tăng từ
3,5 lên 8,5 [20
[13]: hiệu quả xử lý COD và T-N của quá
trình SBR cấp nước một lần đạt khá cao, tương ứng là khoảng 93% và 88 ÷ 93%. Tải
trọng COD và T-N cũng đạt cao lần lượt là 0,37 kg/(m3.ngày) và 0,13 kg/(m3.ngày)
, của COD
là 57%, T-N là 91% [14].
1.1.2. Tình hình nghiên cứu xử lý nƣớc thải hữu cơ ở Việt Nam
Xử lý nước thải hiện nay luôn là vấn đề thời sự nóng bỏng và nổi cộm ở Việt
Nam hiện nay, theo dự báo của Tổ chức Kinh tế thế giới thì Việt Nam sẽ là một trong
những nước có tốc độ phát triển kinh tế vào loại nhanh trên thế giới với tốc độ tăng
trưởng được dự báo là 7% trong thập kỷ tới. Tuy nhiên, việc tăng trưởng kinh tế một
cách nhanh chóng và mạnh mẽ cũng đồng thời tạo nên những thách thức áp lực tác

động về mặt môi trường, trong đó, tác động của chất thải rắn và nước thải đang là
vấn đề bức xúc ở Việt Nam.
Hiện nay, ô nhiễm môi trường là vấn đề đang được quan tâm không chỉ ở Việt
Nam mà còn ở nhiều quốc gia trên thế giới. Theo báo cáo môi trường Quốc gia năm
2010 của Bộ Tài Nguyên và Môi Trường, từ năm 2007 đến năm 2009, ô nhiễm môi
trường nước mặt ở tất cả các chỉ số đều vượt quá tiêu chuẩn cho phép theo QCVN
40:2011/BTNMT. Các chỉ số COD, BOD đều vượt quá tiêu chuẩn từ 5 đến 10 lần.
Hàm lượng NH4+ trong môi trường nước mặt của sông Nhuệ, sông Đáy và sông Cầu
đều vượt quy chuẩn cho phép QCVN 40:2011/BTNMT cho nước mặt phù hợp với
việc bảo tồn động thực vật thủy sinh là là 0,2 mg/l.
Nước thải chăn nuôi là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm nguồn
nước. Hàm lượng nitơ tổng số nước thải chăn nuôi nằm trong khoảng từ 512 đến 594
mg/l, trong đó NH3 từ 304 đến 471 mg/l, hàm lượng photpho tổng số từ 13,8 ÷ 62
mg/l [7]. Ngày nay, cùng với sự phát triển của dân số, rác thải sinh hoạt ngày một gia
tăng, nước rỉ rác từ các hố chôn lấp tại khu xử lý rác thải gây ảnh hưởng rất lớn đến
6


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>
đời sống của người dân xung quanh, gây ô nhiễm nguồn nước mặt và nước ngầm
quanh khu vực. Tổng hàm lượng nitơ trong nước thải rỉ rác dao động trong khoảng từ
200 ÷ 2000 mg/l, hàm lượng amoni cao, trung bình 200 mg/l, trong khi đó tiêu chuẩn
cho phép là 0,2 mg/l [6].
Với xu hướng hội nhập nền kinh tế quốc tế, đặc biệt từ khi Việt Nam gia nhập
WTO, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của quá trình công nghiệp hoá đất nước, chất
thải công nghiệp cũng đang ngày một gia tăng về khối lượng, đa dạng về chủng loại
và đang là vấn đề cấp bách của xã hội, đòi hỏi phải có nhận thức đúng đắn và đầu tư
thích đáng cho vấn đề xử lý nước thải. Hiện nay công nghệ xử lý nước thải bị ô

nhiễm các hợp chất hữu cơ trên thế giới và Việt Nam chủ yếu là sử dụng các biện
pháp sinh học, trong đó phương pháp xử lý hiếu khí và xử lý kị khí là phổ biến nhất,
với nguồn nước thải có mức độ ô nhiễm cao thông thường người ta xử lý kết hợp kị
khí và hiếu khí. Kết quả nghiên cứu của Vũ Thúy Nga và các cộng sự cho thấy có thể
cải thiện chất lượng nước thải chế biến tinh bột sắn bằng chế phẩm vi sinh vật [11].
Để nhằm khắc phục tình trạng ô nhiễm do nước thải chế biến tinh bột sắn, công trình
nghiên cứu tập trung tuyển chọn bộ giống vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao, sản
xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh vật để nâng cao hiệu quả xử lý nước thải sau
biogas của nhà máy chế biến tinh bột sắn. Kết quả nghiên cứu đã tuyển chọn được 3
chủng vi sinh vật gồm Bacillus velezensis, Streptomyces fradiae và Nitromonas sp.
có khả năng chuyển hóa tốt hợp chất hữu cơ trong nước thải chế biến tinh bột sắn
[11]. Nghiên cứu về ứng dụng vi khuẩn tích lũy poly-photphat trong xử lý nước thải
của Lê Quang Khôi và các cộng sự cho thấy các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P được
tuyển chọn có hiệu suất loại bỏ photphat hòa tan cao [8]. Hai dòng vi khuẩn
Acinetobacter radioresistens TGT013L và Kurthia sp.TGT025L có hiệu quả loại bỏ
PO43- cao nhất trong môi trường tổng hợp sau 25 giờ thí nghiệm. Sự loại bỏ PO43được thực hiện bởi hoạt động của gen ppk 1 dạng IIA trong quá trình chuyển hóa
photphat thành dạng poly-P tích lũy trong tế bào. Kết quả nghiên cứu mang lại nhiều
triển vọng ứng dụng 2 dòng vi khuẩn tích lũy poly-P trên để xử lý photpho hòa tan
trong nước thải chăn nuôi [8].
Với mục đích nghiên cứu phát triển công nghệ xử lý hiệu quả đồng thời hữu
cơ và chất dinh dưỡng trong nước thải ngành chăn nuôi lợn, trong nghiên cứu của
7


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>
Phạm Thị Hải Thịnh và đồng tác giả, đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện
vận hành như tỷ lệ COD/T-N (tỉ lệ giữa nhu cầu oxy hóa học và tổng nitơ) và chế độ
sục khí đến hiệu quả xử lý COD và T-N của quá trình SBR đối với nước thải chăn

nuôi đã qua xử lý kị khí. Với chế độ hai chu trình thiếu - hiếu khí thích hợp, hiệu quả
xử lý COD và T-N đạt khá cao, tương ứng là khoảng 90% và 80 ÷ 85% [13]. Tuy
nhiên nồng độ T-N trong nước thải chăn nuôi lợn là rất cao và thay đổi trong khoảng
khá rộng, vì vậy nghiên cứu nâng cao hiệu quả xử lý nitơ của quá trình nhằm đáp ứng
một cách ổn định các quy chuẩn xả thải là rất cần thiết. Theo Phan Đỗ Hùng và cộng
sự cho thấy ảnh hưởng của tỉ lệ cấp nước thải đến hiệu quả xử lý của quá trình SBR
hai chu trình thiếu - hiếu khí cấp nước hai lần và so sánh với chế độ cấp nước một
lần. Với quá trình SBR hai chu trình thiếu-hiếu khí, cấp nước hai lần là một giải pháp
để nâng cao hiệu quả xử lý T-N của quá trình. Thực nghiệm cho thấy, khi tăng tỉ lệ
cấp nước (tỉ lệ giữa lượng nước thải cấp lần thứ nhất và tổng lượng nước thải xử lý
trong một mẻ), lúc đầu hiệu suất xử lý T-N sẽ tăng, tuy nhiên đến một giới hạn nhất
định hiệu suất xử lý T-N sẽ giảm trở lại. Hiệu suất xử lý T-N ở cả ba tỉ lệ cấp nước
nghiên cứu đều khá cao, trong đó ở tỉ lệ 2/3 đạt cao nhất, trong khoảng 85 ÷ 90%.
Hiệu suất xử lý T-N thực nghiệm ở các tỉ lệ cấp nước thấp 1/2 và 2/3 khá phù hợp
với hiệu suất lý thuyết. Hiệu suất xử lý COD ở chế độ cấp nước hai lần cũng khá cao,
85 ÷ 90% ở tỉ lệ cấp nước 2/3, xấp xỉ với trường hợp cấp nước một lần [7].
1.2.

Sơ lƣợc về tình hình phát thải và xử lý nƣớc thải của nhà máy bia Hà Nội
Tổng công ty Bia – Rượu – Nước giải khát Hà Nội (Habeco) có trụ sở chính tại

183 Hoàng Hoa Thám, Ba Đình, Hà Nội được thành lập ngày 16 tháng 5 năm 2003
theo Quyết định số 75/2003/QĐ – BCN của Bộ trưởng Bộ Công nghiệp (nay là Bộ
Công Thương) trên cơ sở sắp xếp lại Công ty Bia Hà Nội và các đơn vị thành viên;
chính thức chuyển sang tổ chức và hoạt động theo mô hình công ty mẹ - công ty con
tại Quyết định số 36/2004/QĐ-BCN ngày 11/05/2004 của Bộ trưởng Bộ Công nghiệp.
Ngành nghề chủ yếu của Tổng công ty gồm: sản xuất, kinh doanh bia, rượu, nước
giải khát và bao bì; xuất nhập khẩu nguyên liệu, vật tư, thiết bị, phụ tùng, phụ liệu, hoá
chất; dịch vụ khoa học công nghệ, tư vấn đầu tư, tạo nguồn vốn đầu tư, tổ chức vùng
nguyên liệu, kinh doanh bất động sản, các dịch vụ và ngành nghề khác theo luật định.

8


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>
Nước thải của nhà máy bao gồm nước thải sản xuất, nước thải làm lạnh và nước
mưa. Nước thải sản xuất bao gồm các loại sau:
-

Nước thải quá trình tách đại mạch sau khi đã phân huỷ bột

-

Nước thải rửa thiết bị lọc

-

Nước rửa chai và téc

-

Nước rửa nhà, phòng lên men, phòng tang trữ bia

-

Nước thải từ nồi hơi

-

Nước vệ sinh

* Nước thải đầu vào của công ty có các thông số trung bình:
- Lưu lượng: 50 m3/giờ
- Nhu cầu Oxy hóa học (COD) : 2.400 mg/l
- Nhu cầu Oxy sinh học (BOD) : 1600 mg/l
- Tổng chất rắn lơ lửng (TSS): 1.030 mg/l
* Sơ đồ đơn giản quy trình xử lý hiện tại:
Bể điều hòa
(70 m3)

Bể ổn định
lưu lượng

Bể cân bằng
(điều chỉnh pH,
900 m3)

Bể hiếu khí 1
(550 m3)

Bể yếm khí
(550 m3)

Bể
lắng
Bể yếm khí
(550 m3)

Bể hiếu khí 2
(550 m3)

Tuần hoàn bùn

Hình 1.1. Sơ đồ quy trình xử lý nước thải Habeco
Yêu cầu nước thải đầu ra của nước thải nhà máy bia Hà Nội
- Nhu cầu Oxy hóa học COD < 100 mg/l
- Nhu cầu Oxy sinh học BOD < 50 mg/l
- Tổng chất rắn lơ lửng TSS < 100mg/l
9

Dòng thải


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>
Quy trình vận hành tại các bể tại nhà máy bia Hà Nội
-

Bể điều hòa: nhằm thu gom và hòa trộn các nguồn nước thải và lưu lượng ổn định.

-

Bể ổn định lưu lượng: điều chỉnh lưu lượng thích hợp.

-

Bể cân bằng: điều chỉnh pH và nguồn dinh dưỡng bổ sung trước khi đưa vào xử lý.

-

Bể yếm khí: thực hiện quá trình xử lý yếm khí nhằm giảm 60 ÷ 70 % giá trị COD
và BOD trong nước thải.

-

Bể hiếu khí 1, bể hiếu khí 2: được cung cấp đủ lượng oxy cần thiết cho các phản
ứng sinh hóa xảy ra trong bể cấp khí liên tục (cho xử lý hiếu khí và xử lý thiếu khí)
giữ cho bùn hoạt tính (chứa các vi sinh vật) ở trạng thái lơ lửng trong nước thải xử
lý và loại bỏ các thành phần hữu cơ ô nhiễm.
Bể lắng: Bổ sung chất trợ lắng PAC (Poly aluminium chloride) nhằm lắng các

chất lơ lửng còn lại trong nước thải dưới tác dụng của trọng lực.
1.3. Nguyên lý xử lý chất thải hữu cơ trong nƣớc thải bằng phƣơng pháp sinh học
Những chất gây ô nhiễm nghiêm trọng thường có cấu trúc cấu thành từ các
nguyên tử cacbon, nitơ, lưu huỳnh, photpho hay kim loại nặng. Quá trình phân giải
hợp chất cacbon và nitơ là quá trình sinh hoá phức tạp thông qua hoạt động sống của
vi sinh vật, nhờ đó mà một số lượng lớn các chất hữu cơ cao phân tử sẽ được phân giải
thành các chất có khối lượng phân tử thấp, từ đó các vi sinh vật khác nhau chuyển hóa
thành sinh khối tế bào, các khí (CO2, H2S, N2, NH4…) [14]. Các hợp chất
hydratcacbon bao gồm (xenluloza, tinh bột, dextrin…) có nhiều trong nước thải của
các cơ sở chế biến lương thực hay sản xuất rượu bia sẽ được những nhóm vi sinh vật
đặc thù đảm nhận phân giải thành những tiểu phần nhỏ hơn để tế bào vi sinh vật có
thể sử dụng cho các mục đích khác nhau, bao gồm: tạo sinh khối vi sinh vật, tạo ra các
sản phẩm trao đổi chất và các chất khí (N2, CO2)…, các axit hữu cơ như axit focmic,
axit axetic, axit lactic… Để phân giải xenluloza, nhiều loại vi sinh vật có khả năng
sinh ra các enzym hỗ trợ xúc tác quá trình phân giải xenluloza [20]. Cơ chế phân giải
xenluloza như sau:

xenlulaza
Xenluloza

→

xenlobiaza
Đường tan (xenlobioza)

→

Glucoza

Tinh bột là chất dự trữ chủ yếu của thực vật, nó có mặt trong các hạt hòa thảo,
củ, thân cây và lá cây. Tinh bột gồm 2 cấu tử chính là amyloza (25%) và amylopectin
10


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>
(75%) có nhiều trong nước thải của các cơ sở chế biến tinh bột, của các nhà máy bia,
rượu... Dưới tác dụng của một số loại vi sinh vật có khả năng sinh ra hệ enzym như
amylaza, amylo–1,6–glucosidaza, glucoamylaza, tinh bột bị phân giải thành những
chất đơn giản, chủ yếu là đường đơn và axit hữu cơ. Quá trình phân huỷ đường đơn
tiếp theo có thể được thực hiện theo những hướng sau:
Phân huỷ đường đơn nhờ nhóm vi sinh vật lên men kỵ khí: Dưới tác dụng của
một phức hệ enzym vi sinh vật, đặc biệt là của nấm men, các monosaccharit bị
chuyển hoá thành rượu, axit lactic, glixerin… như sau:
Lên men rượu
Glucoza

→

Ethanol + CO2

Nấm men là loại vi sinh vật kỵ khí tuỳ tiện, khi có đủ oxy chúng hô hấp và quá
trình lên men bị ức chế, dẫn tới sự tiêu thụ glucoza, hàm lượng etanol và CO2 giảm và
sinh khối tăng lên. Quá trình được diễn ra theo phương trình:
C6H12O6 + 6 O2

= 6 CO2 +

6 H2 O + Q

Ngược lại khi không có đủ O2 hoặc ở điều kiện yếm khí, nấm men lên men mạnh
nhưng lượng sinh khối không tăng nhiều. Hoạt động của nấm men gây ra sự biến đổi
cơ bản của quá trình chuyển hoá đường, chủ yếu là glucoza và fructoza thành rượu:
C6H12O6 = 2 C2H5OH + 2 CO2 + 33 kcal
Chính quá trình sinh ra rượu của nấm men đã hạn chế sự phát triển của nhóm
vi sinh vật gây hại có trong nước thải, đồng thời rượu là nguồn dinh dưỡng cho
nhóm vi sinh vật lên men lactic và axetic tạo ra môi trường pH axit hạn chế sự phát
triển của nhóm vi sinh vật gây bệnh. Các quá trình lên men rượu còn có sự tạo
thành diaxetil, axetoin, glyxerin và các chất thơm. Các hợp chất chứa

nhóm

cacbonnyl của sản phẩm lên men như aldehyt, xeton, axit cacboxylic, các este, đó
là những nhân tố tạo hương thơm giúp làm giảm bớt mùi thối sinh ra nhóm vi
khuẩn phân hủy protein. Do vậy, tại những nơi xử lý chất thải có mặt của những
nhóm vi sinh vật này sẽ giúp cho quá trình giảm mùi khó chịu rất rõ ràng.

Ngoài ra, glucoza còn được nhóm vi khuẩn lactic sử dụng, chuyển hóa theo con
đường tổng quát:
Lên men lactic
Glucoza

→
11

Axit lactic


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>
Vi khuẩn lactic là tên gọi của những vi khuẩn sinh ra axit lactic như là sản phẩm
chính trong quá trình chuyển hoá cacbonhydro. Trong tự nhiên, các vi khuẩn lactic
phân bố rất rộng rãi, chúng có mặt trong phân, rác, xác động thực vật; trên niêm mạc
miệng và niêm mạc ruột của người, gia súc, gia cầm; trên bề mặt rau, củ, quả, thịt, cá,
tôm. Đặc biệt trong các sản phẩm muối chua như dưa cà muối, mắm tôm chua, sữa
chua, nem chua… có rất nhiều vi khuẩn lactic. Vì vậy, vi khuẩn lactic tồn tại trong hệ
thống xử lý nước thải của các nhà máy chế biến thực phẩm và nông sản khác [18].
Quá trình lên men hiếu khí phân giải triệt để hydratcacbon, glucoza và các
monosaccharit khác tạo sản phẩm cuối cùng là sinh khối, CO2 và H2O.
Sự phân huỷ các chất hữu cơ khác (nitơ, photpho, lưu huỳnh):
+ Phân huỷ nitơ: các hợp chất hữu cơ chứa nitơ bao gồm protein, các đoạn
peptide, các axit amin… có mặt nhiều trong nước thải của các cở sở chế biến thủy hải
sản, sản xuất đồ uống…Quá trình phân giải protein thành axit amin là giai đoạn đầu
của chuyển hóa với sự tham gia của các nhóm vi sinh vật sinh có khả năng sinh
proteaza như Bacillus, Pseudomonas... Tiếp đến quá trình amon hoá các axit amin
thành dạng NH4+ hoặc NH3-. Lượng NH3- dư không dùng hết cho việc xây dựng tế bào

được vi khuẩn Nitromonas chuyển thành nitrit (NO2-) và từ NO2- chuyển thành nitrat
(NO3-) nhờ vi khuẩn Nitrobacter. Sau đó các vi khuẩn phản nitrat hoá chuyển NO3thành nitơ phân tử (N2) bay vào không khí.
+ Phân huỷ photpho: cho đến nay cơ chế của quá trình phân giải các hợp chất
chứa photpho (photpho hữu cơ và photpho vô cơ) ở trong cơ thể vi sinh vật có nhiều
con đường khác nhau, tùy thuộc vào từng nhóm vi sinh sinh vật. Các hợp chất photpho
khó tan dưới tác dụng của vi sinh vật sẽ bị chuyển hoá thành những chất dễ tan. Quá
trình chuyển hóa trên được thực hiện bởi vi sinh vật có khả năng tiết ra các enzym đặc
hiệu sử dụng các hợp chất photpho làm nguồn dinh dưỡng và chuyển hoá chúng từ
dạng khó phân huỷ thành dạng dễ tan.
+ Phân huỷ lưu huỳnh: trong điều kiện kỵ khí hay vi hiếu khí, vi sinh vật thường
phân huỷ các hợp chất chứa lưu huỳnh (có trong protein, axit amin, muối vô cơ) và giải
phóng H2S. Đồng thời, H2S cũng được sinh ra do hoạt động của các vi khuẩn khử sulfat.
1.4. Ứng dụng vi sinh vật trong công nghệ xử lý nƣớc thải

12


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>
Phương pháp xử lý nước thải, chất thải dựa trên hoạt động sống của các vi sinh
vật có khả năng phân hủy các chất hữu cơ hoặc vô cơ làm nguồn năng lượng để thực
hiện quá trình sinh trưởng phát triển của tế bào. Các vi sinh vật xử lý nước thải, chất
thải bao gồm cả nhóm tự dưỡng và dị dưỡng, có thể tiến hành trong điều kiện hiếu khí,
thiếu khí hay yếm khí [16].
Quá trình xử lý nước thải, chất thải gồm ba giai đoạn [11; 15]:
- Di chuyển chất gây ô nhiễm từ pha lỏng (nước) tới bề mặt tế bào vi sinh vật nhờ
khuếch tán đối lưu và khuếch tán phân tử.
- Di chuyển các chất từ mặt ngoài tế bào qua màng bán thấm bằng khuếch tán do sự
chênh lệch nồng độ ở trong và ngoài tế bào.

- Quá trình chuyển hóa các chất ở trong tế bào vi sinh vật với sự sản sinh năng lượng
và quá trình tổng hợp các chất mới của tế bào nhờ hấp thụ dinh dưỡng và năng lượng.
Xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học chủ yếu dựa vào hoạt động sống của
các vi sinh vật dị dưỡng có khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ. Các vi sinh vật dị
dưỡng có thể chia thành ba nhóm nhỏ: vi sinh vật hiếu khí, vi sinh vật kỵ khí và vi sinh
vật vi hiếu khí. Hệ vi sinh vật sử dụng trong quá trình xử lý nước thải gồm vi khuẩn,
nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn… trong đó vi khuẩn chiếm số lượng lớn nhất. Trong các
bể xử lý sinh học, vi khuẩn đóng vai trò hàng đầu và chịu trách nhiệm chính trong
phân hủy các thành phần hữu cơ trong nước thải. Tế bào vi sinh vật sống cùng với các
chất mang quyện lại với nhau tạo thành dạng keo tụ - bùn hoạt tính. Theo nhiều học
giả, trong bùn hoạt tính có nhiều vi sinh vật thuộc các chi khác nhau như:
Actinomyces,

Arthrobacter,

Bacillus,

Corynebacterium,

Deslfotomacillium,

Micrococcus, Pseudomonas, Sarcina,… Nhóm nấm men cũng xuất hiện trong xử lý
nước thải với vai trò chuyển hóa đường đơn thành rượu, bao gồm các chi
Saccharomyces, Pichia…và giúp hạn chế sự phát triển của các nhóm vi khuẩn kỵ khí
sinh hơi khác. Trong số các vi sinh vật nói trên, số lượng nhiều nhất xuất hiện trong
quá trình xử lý nước thải là các loài vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas. Các vi sinh vật
trên oxy hóa các gốc rượu, axit béo, parafin, hydrocacbon thơm và các hợp chất khác
nhờ sinh tổng hợp các enzym thủy phân và oxy hóa khác nhau [6; 21].
Vi khuẩn chiếm tỷ lệ lớn trong khu hệ vi sinh vật xử lý nước thải và đóng vai trò
chủ yếu trong quá trình phân hủy các chất hữu cơ làm sạch nước. Vi khuẩn là nhóm vi

13


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>
sinh vật có cấu tạo đơn bào, cấu trúc tế bào đơn giản. Vi khuẩn có nhiều hình thái khác
nhau như: hình cầu, hình que, hình xoắn, hình dấu phẩy… Đường kính vi khuẩn phần
lớn nằm trong khoảng 0,2 ÷ 2 µm, chiều dài khoảng 2 ÷ 8 µm. Vi khuẩn xử lý nước
thải chủ yếu là các loài thuộc nhóm vi sinh vật hoại sinh thuộc các chi: Pseudomonas,
Bacillus, Alcaligenes, Flavobacterium, Cytophaga, Micrococcus, Lactobacillus,
Achromoabacter, Sporochaeta,… Trong số đó, Pseudomonas và Bacillus thường gặp ở
hầu hết các loại nước thải, chúng có thể đồng hóa được hầu hết các chất hữu cơ kể cả
những chất hữu cơ tổng hợp và tồn tại khá lâu trong môi trường nước [14; 27].
1.5. Đặc điểm các chế phẩm sinh học hỗ trợ xử lý nƣớc thải
Nước thải mới thường ít vi sinh vật, đặc biệt là nước thải công nghiệp đã qua công
đoạn xử lý nhiệt, có khi lúc đầu hầu như không có vi sinh vật. Nước thải trong hệ thống
thoát nước sau một thời gian, dù rất ngắn, cũng đủ điều kiện để vi sinh vật thích nghi,
sinh sản và phát triển tăng sinh khối (trừ những nước thải có chất độc, chất ức chế hoặc
diệt vi sinh vật, như các loại nước thải có hàm lượng các kim loại nặng, các chất hữu cơ
và vô cơ có tính độc, …). Sau một thời gian sinh trưởng, chúng tạo thành quần thể vi
sinh vật có ở trong nước, đồng thời kéo theo sự phát triển của các giới thủy sinh [14].
Việc bổ sung chế phẩm sinh học ở các loại nước thải là không giống nhau. Mỗi
loại nước thải có hệ vi sinh vật thích ứng. Song, nói chung vi sinh vật trong nước thải
đều là vi sinh vật hoại sinh và dị dưỡng. Chúng không thể tổng hợp được các chất hữu
cơ làm vật liệu tạo tế bào mới, trong môi trường sống của chúng cần phải có mặt các
chất hữu cơ để chúng phân hủy, chuyển hóa thành vật liệu xây dựng tế bào, đồng thời
chúng cũng phân hủy các hợp chất nhiễm bẩn nước đến sản phẩm cuối cùng là CO2 và
nước hoặc tạo thành các loại khí khác (CH4, H2S, Indol, mercaptan, scatol, N2, …) [14].
Trong nước thải, các chất nhiễm bẩn chủ yếu là các chất hữu cơ hòa tan, ngoài ra

còn có các chất hữu cơ ở dạng keo và phân tán nhỏ ở dạng lơ lửng. Các dạng này tiếp
xúc với bề mặt tế bào vi khuẩn (trong nước thải vi khuẩn chiếm đa số trong hệ vi sinh
vật) bằng cách hấp phụ hay keo tụ sinh học, sau đó sẽ xảy ra quá trình dị hóa và đồng
hóa. Quá trình dị hóa là quá trình phân hủy các chất hữu cơ có khối lượng phân tử lớn,
có cấu trúc phân tử là mạch dài thành các hợp chất có mạch ngắn, có khối lượng thấp
hoặc thành các đơn vị cấu thành, có thể đi qua được màng vào trong tế bào để chuyển

14


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>
vào quá trình phân hủy nội bào (hô hấp hay oxy hóa tiếp) hay chuyển sang quá trình
đồng hóa [6].
Quá trình tự làm sạch trong nước xảy ra rất phức tạp. Có 3 quá trình tự làm sạch
trong nước: tự làm sạch vật lý, tự làm sạch hóa học và tự làm sạch sinh học. Quá trình tự
làm sạch sinh học xảy ra thường xuyên và mạnh mẽ nhất, quá trình này quyết định mức
độ tự làm sạch toàn diện của nước. Quá trình tự làm sạch sinh học xảy ra do động vật,
thực vật và cả vi sinh vật, trong đó vi sinh vật đóng vai trò quan trọng nhất. Như vậy,
quá trình làm sạch nước thải gồm 3 giai đoạn [22]:
- Các hợp chất hữu cơ tiếp xúc với bề mặt tế bào vi sinh vật.
- Khuếch tán và hấp thụ các chất ô nhiễm nước qua màng bán thấm vào trong tế bào vi
sinh vật.
- Chuyển hóa các chất này trong nội bào để sinh ra năng lượng và tổng hợp các vật
liệu mới cho tế bào vi sinh vật.
Các giai đoạn này có mối liên quan rất chặt chẽ. Kết quả là nồng độ các chất
nhiễm bẩn nước giảm dần, đặc biệt là vùng gần tế bào vi sinh vật nồng độ chất hữu cơ
ô nhiễm thấp hơn ở vùng xa. Đối với sản phẩm do tế bào vi sinh vật tiết ra thì ngược
lại. Phân hủy các chất hữu cơ chủ yếu xảy ra trong tế bào vi sinh vật.

Quá trình chuyển hóa vật chất trong tế bào vi sinh vật gồm hàng loạt các phản
ứng hóa sinh với 2 quá trình đồng hóa và dị hóa, chủ yếu là các phản ứng oxy hóa khử.
Mỗi phản ứng oxy hóa đều có enzym xúc tác thích ứng.
Phản ứng dị hóa cắt các chất hữu cơ mạch dài, phân chia các chất hữu cơ phức
tạp thành các đoạn đơn giản hơn kèm theo sự giải phóng năng lượng sinh học.
Phản ứng đồng hóa thành các chất hữu cơ phức tạp từ các chất hợp phần đơn
giản (các sản phẩm trung gian của quá trình dị hóa) và cần cấp năng lượng sinh học
(thường lấy từ năng lượng được giải phóng của các phản ứng dị hóa) [22; 30; 31].
1.6. Sự tăng trƣởng của tế bào vi sinh vật
Sự sinh trưởng của vi sinh vật là quá trình sinh sản (tăng số lượng, kích thước
tế bào) và tăng sinh khối (tăng khối lượng) quần thể vi sinh vật. Hiệu quả của sự dinh
dưỡng (đồng thời là sự giảm BOD, COD, ...) là quá trình tổng hợp các bộ phận của
cơ thể tế bào và sự tăng sinh khối. Tất cả những biến đổi về hình thái, sinh lý trong
cơ thể được tổng hợp thành khái niệm “Phát triển”.
15


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>
Trong quá trình xử lý nước thải sự sinh trưởng cũng là sự tăng số lượng tế bào,
và sự thay đổi kích thước tế bào được phản ánh qua sự tăng sinh khối của vi sinh vật.
Tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật phụ thuộc vào điều kiện bên ngoài, đặc tính sinh
lý và trạng thái tế bào. Vi sinh vật sinh sản chủ yếu bằng cách phân đôi tế bào. Thời
gian để tăng gấp đôi số lượng vi sinh vật tối thiểu được gọi là thời gian sinh trưởng/
thời gian thế hệ thường từ 20 phút đến vài ngày. Khi các chất dinh dưỡng cạn kiệt,
pH và nhiệt độ… của môi trường thay đổi ngoài các trị số tối ưu thì quá trình sinh
sản bị dừng lại [6; 14].
1.7. Giới thiệu về chế phẩm Bio - BP
Theo hướng dẫn của nhà sản xuất chế phẩm sinh học Bio-PB là 100% tự nhiên,

phân hủy sinh học và an toàn cho sử dụng hàng ngày trong phạm vi gia đình, thương
mại và công nghiệp. Trong xử lý nước thải, Bio-PB là một giải pháp xử lý nước cách
mạng giúp tăng tốc tiêu hủy sinh học các chất dinh dưỡng có hại có trong nước như
amoniac và nitrit. Ứng dụng đã được minh chứng bao gồm phục hồi ao, hồ và đập
nước, kiểm soát tảo, xử lý nước thải, quản lý dinh dưỡng, kiểm soát mùi hôi và mang
lại những lợi ích quan trọng trong sản xuất.
- Cách sử dụng chế phẩm Bio-PB:
Chuẩn bị 2 thùng để pha chế (thể tích các bể phụ thuộc vào tính toán đầu vào),
một thùng để kích hoạt chế phẩm, thùng còn lại để xả chế phẩm vào hệ thống xử lý.
Kích hoạt và xả dung dịch được thực hiện như sau:
Xả đầy nước sạch vào thùng kích hoạt, và cho lượng Bio-PB theo tính toán vào.
Giữ nhiệt độ trong quá trình kích hoạt và các thùng xả trong khoảng 10 oC tới 40 oC.
Thùng kích hoạt được sục khí với loại máy đơn giản như máy sục bể cá.
Kích hoạt Bio-PB trong vòng 24 giờ một chu kỳ.
Sau 24 giờ kích hoạt, bơm hoặc xả dung dịch sang thùng xả.
Bắt đầu xả từ thùng xả vào hệ thống tại hai điểm như hướng dẫn, đồng thời lặp
lại quá trình kích hoạt tại thùng kích hoạt.
-

Thành phần vi sinh trong chế phẩm Bio – PB: Pediococcus sp. 106 CFU/g; Bacillus
sp. 106 CFU/g

-

Phương pháp bảo quản
16


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>
Bảo quản nơi khô ráo thoáng mát, tránh ánh nắng mặt trời. Khi đã mở bao gói,
sản phẩm phải được bảo quản trong hộp kín để tránh bị kích hoạt.

17


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>
PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Chế phẩm sinh học và mẫu nƣớc thải
- Các mẫu Bio-PB được cung cấp bởi Nhà máy bia Hà Nội và sử dụng cho phân
tích thành phần chế phẩm và đánh giá hiệu quả xử lý nước thải tại nhà máy bia Hà Nội
- Các mẫu nước thải được lấy tại nhà máy bia Hà Nội trước, trong và sau quá
trình xử lý với hỗ trợ của chế phẩm Bio-BP trong giai đoạn 1 tháng từ 30/6/2013 –
30/7/2014.
2.1.2. Hoá chất
- Cao thịt (Merk, Đức)
- Cao nấm men ( Merk, Đức)
- Các hoá chất thông dụng khác (Trung Quốc).
- Các đoạn mồi do Invitrogen (Hồng Kông) cung cấp.
- Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR của hãng Invitrogen (Mỹ). Các hóa chất, dung
môi sử dụng của hãng Sigma (Mỹ), Merck (Đức), Invitrogen (Mỹ) và một số hãng khác.
2.1.3. Thiết bị sử dụng
- Kính hiển vi quang học (Model CHD, Olympius, , Nhật Bản)
- Máy đo pH (Mettler Toledo, Thụy Sỹ)
- Cân điện tử ( Mettler Toledo, Thụy Sỹ)
- Nồi hấp khử trùng (ALP MC-40DP, Nhật Bản)

- Tủ ấm (Trung Quốc)
- Máy li tâm (Eppendorf, Đức)
- Máy Vortex (Rotolab OSI, Mỹ)
- Tủ lạnh sâu (Sanyo, Nhật Bản)
- Bể ổn nhiệt (Teche OSI, Mỹ)
- Máy lắc ổn nhiệt (Hàn Quốc)
- Máy PCR (Applied Biosystem AC9700, Mỹ)
- Máy soi gel (BIO-RAD, Mỹ)
- Tủ cấy vô trùng (ESCO, Pháp)
2.1.4. Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật

Môi trường MPA (g/l): cao thịt 3; pepton 10; agar 20; nước 1.000 ml
18


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>
Môi trường MRS (g/l): peptone: 10; cao thịt: 10; cao men: 5; CH3COONa: 5;
glucose: 20; amonicitrat: 2; K2HPO4: 2; MgSO4.7H2O: 0,2; MnSO4.7H2O: 0,04; tween
80: 1ml.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Xác định số lƣợng vi sinh vật theo phƣơng pháp pha loãng tới hạn
Đối với mẫu chế phẩm: Hòa tan 10 gam mẫu chế phẩm vào 90 ml nước muối
sinh lý 0,85% và lắc ở 30oC trong 30 phút. Dịch thu được đã có độ pha loãng là 10-1.
Hút 1 ml dịch này chuyển vào một ống nghiệm sạch đã chứa 9 ml nước muối sinh lý
khử trùng, được độ pha loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng cho tới khi đạt độ pha loãng
10-6 hoặc cao hơn. Bên cạnh đó, mẫu chế phẩm được xử lý nhiệt ở 85oC trong thời
gian 15 ÷ 20 phút nhằm phân lập nhóm Bacillus [4].
Đối với mẫu nước: Từ các mẫu nước hút 1 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm

chứa 9 ml nước muối sinh lý 0,85% khử trùng, lắc đều. Dịch thu được đã có độ pha
loãng là 10-1. Hút 1 ml dịch này chuyển vào một ống nghiệm sạch đã chứa 9 ml nước
muối sinh lý khử trùng được độ pha loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng cho tới khi đạt độ
pha loãng 10-6 hoặc cao hơn.
Dịch đã pha loãng ở mỗi nồng độ được cấy vô trùng và chang đều trên các đĩa
Petri đã có sẵn môi trường thích hợp. Các đĩa Petri được giữ trong tủ ấm 30 ÷ 37oC
trong 3 ngày. Trên mỗi mẫu, lựa chọn các khuẩn lạc có đặc điểm hình thái tương đồng
cao với vi khuẩn thuộc chi Bacillus, Pediococcus. Cấy các khuẩn lạc riêng rẽ vào 1
ống nghiệm với môi trường thạch nghiêng thích hợp. Khi chủng đã phát triển tốt, làm
tiêu bản vết bôi, nhuộm màu và quan sát dưới kính hiển vi. Lặp lại thao tác thêm một
số lần cho tới khi tách được chủng thuần khiết và bảo quản ở 4 oC cho các nghiên cứu
tiếp theo.
2.2.2. Quan sát hình thái tế bào
Các chủng vi sinh vật trong nghiên cứu được nuôi trong môi trường lỏng MPA,
MRS ở nhiệt độ 30oC và 37oC trên máy lắc tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 18
20 giờ. Tế bào vi khuẩn trong dịch nuôi cấy được cố định trên tiêu bản để nhuộm
Gram và quan sát hình dạng tế bào dưới kính hiển vi quét.
* Phương pháp nhuộm Gram [3]
Cách tiến hành:
19


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>
+ Làm tiêu bản vi sinh vật.
+ Cố định vết bôi.
+ Nhuộm bằng tím gential (gential violet) bằng cách nhỏ tím gential lên vết bôi.
Giữ trong 1

2 phút.

+ Đổ hết thuốc nhuộm đi, nhỏ dung dịch Lugol lên tiêu bản và để trong 1 phút.
+ Đổ hết thuốc nhuộm đi rồi nhúng vào cồn 95oC trong 30

40 giây.

+ Rửa lại bằng nước.
+ Làm khô vết bôi.
+ Nhuộm bổ sung bằng Fushin loãng trong 1

2 phút.

+ Rửa lại bằng nước đợi khô sau đó đem quan sát.
Nếu là chủng Gram (+) sẽ có màu tím, chủng Gram (-) có màu hồng.
2.2.3. Khả năng sinh tổng hợp enzym ngoại bào của các chủng nghiên cứu
Để xác định khả năng sinh enzym ngoại bào, các chủng vi sinh vật trong nghiên
cứu được cấy chấm điểm trên đĩa Petri chứa môi trường khoáng có bổ sung các cơ chất
khác nhau trong thời gian 1 ÷ 3 ngày ở 37oC như sau:
+ Bổ sung 0,2% carboxyl metyl xelluloza (CMC) để xác định hoạt tính
CMCaza. Hiện màu bằng dung dịch Lugol (KI 5% (w/v) và I2 10% (w/v)), đo đường
kính vòng phân giải trên đĩa Petri thạch.
+ Bổ sung 0,5% tinh bột tan để xác định hoạt tính amylaza. Hiện màu bằng
dung dịch Lugol, đo đường kính vòng phân giải trên đĩa Petri thạch.
+ Bổ sung 0,5% casein để xác định hoạt tính proteaza. Hiện màu bằng dung
dịch axit tricloacetic 50% (w/v), đo đường kính vòng phân giải trên đĩa Petri thạch.
2.2.4. Phân loại vi sinh vật nhóm vi khuẩn Bacillus sử dụng kit API 50 CHB
Chủng vi khuẩn được lựa chọn sau khi xác định đặc điểm hình thái cho kết quả là
các chủng vi khuẩn Gram (+), tạo bào tử. Để nghiên cứu đặc tính sinh hóa của chủng,
bộ kit API 50CHB (BioMérieux, Pháp) dùng cho vi khuẩn Gram (+) được sử dụng

trong nghiên cứu. Trình tự các bước thí nghiệm:
-

Các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường MPA sau 24 giờ.

-

Hòa tan một vòng que cấy chứa sinh khối vi khuẩn vào trong 2,0 ml nước

muối sinh lý 0,85%.

20


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-

/>
Hút 1,0 ml dịch huyền phù vi khuẩn bổ sung vào môi trường khoáng kèm

theo bộ kit.
-

Hút dịch từ ống môi trường khoáng có chứa vi khuẩn bổ sung vào các giếng

thử của bộ kit.
-

Dùng dầu parafin phủ kín lên bề mặt các giếng thử.

-

Đậy bộ kít thử và nuôi ở nhiệt độ 37oC.

-

Đọc kết quả quả sau 24 và 48 giờ.

-

So sánh kết quả đánh giá phân loại trong bảng chuẩn phân loại API để định

tên sơ bộ vi khuẩn.
2.2.5. Phân loại vi khuẩn bằng phân tích trình tự gen 16S rDNA
- Tách DNA tổng số của vi khuẩn: Quy trình tách chiết ADN tổng số của vi khuẩn
được tiến hành theo phương pháp CTAB/NaCl [1;12]
(1) Vi khuẩn nuôi trong 24 giờ trên môi trường thạch thu sinh khối hòa trong 1,5
ml nước khử trùng. (2) Cặn tế bào được thu bằng cách ly tâm lạnh trong ở tốc độ 5000
vòng/5 phút để thu sinh khối. (3) Cặn tế bào hòa trong 567 µl TE, 5 µl lyzozym mix
đều ủ 37oC trong 20 phút. (4) Bổ sung 3 µl proteaza K, 30 µl SDS 10% vào dung dịch
trên mix đều ủ 37oC trong 30 phút. (5) Sau đó bổ sung 100 µl NaCl 5 M, mix đều, bổ
sung tiếp 80 µl dung dịch CTAB/NaCl (10% cetyltrimethylammoium bromide, 0.7 M
NaCl) mix đều ủ 65oC/10 phút. (6) Chiết 1 V hỗn hợp chloroform : isoamyl (24 : 1),
vortex. (7) Ly tâm 12000 vòng/phút thu dịch nổi (lặp lại chiết dung môi hai lần). (8)
Bổ sung 10 µl Na – acetat 3 M, mix đều, bổ sung tiếp 2 V cồn 100% (lạnh) hoặc 0,7 V
isopropanol (lạnh), mix đều. (9) Để lạnh ở -20oC ít nhất 4 giờ. (10) Ly tâm 12000
vòng/20 phút thu cặn. (11) Rửa tủa bằng 500 µl cồn 70o, ly tâm 12000 vòng/10 phút,
thu cặn. (12) Làm khô. (13) Hòa cặn trong 40 ÷ 60 µl TE - ARNaza, ủ ở 37oC/ 1 giờ.
(14) Kiểm tra độ tinh sạch của ADN bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 260 nm và

280 nm. CADN (protein) = A260 (280) x 50 x độ pha loãng mẫu. Tỉ lệ ADN/protein > 1,8 là
mẫu sạch. (15) Điện di kiểm tra trên gel agaroza 1%, điện thế 100 V. Nhuộm bản gel
trong dung dịch ethidium bromit 1%/ 10 phút.
- Khuếch đại gen 16S rDNA: Trình tự gen mã hóa 16S rRNA của vi khuẩn được
khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F và 14R có trình tự như trong
bảng 2.1 với các bước thể hiện như sau:
21


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>
Bảng 2.1. Trình tự đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen
mã hóa 16S rRNA
Tên đoạn mồi

Trình tự mồi

27F

5'-TAACACATGCAAGTCGAACG-3'

14R

5'-GGTGTGACGGGCGGTGTGTA-3'

- Phản ứng PCR được thực hiện trong hỗn hợp có tổng thể tích 20 µl bao gồm:
DNA 1,0 µl, Taq polymerase 0,2 µl, mồi GF1 (10 pmol/µl) 1,0 µl, mồi GR1 (10
pmol/µl) 1,0 µl, đệm cho phản ứng (10X) 2,0 µl, dung dịch MgCl2 (50 mM) 0,6 µl,
hỗn hợp các deoxyribonucleotide triphosphate (10 mM) 0,4 µl, nước khử ion 13,8 µl.

- Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt: (1) 94oC – 5 phút, (2) 94oC
– 90 giây, (3) 59oC - 60 giây, (4) 72oC – 90 giây, lặp lại 30 chu kỳ từ bước 2 ÷ 4, 72 oC
– 10 phút, bảo quản mẫu ở 4oC.
Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agaroza 1%.
Kích thước của các đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được so sánh với thang
DNA chuẩn (Fermentas). Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PureLink TM –
DNA Purification (Invitrogen) và giải trình tự trên máy máy đọc trình tự tự động ABI
PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer (USA) tại Viện Công nghệ sinh học, Viện
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.6. Phân tích các thành phần hữu cơ, tro trong chế phẩm
Thành phầm đạm thô, độ tro, độ ẩm, chất béo thô, chất xơ thô được phân tích
theo TCVN hiện hành tại Phòng Hóa môi trường, Viện Hóa học, Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam.
2.2.7. Xác định các yếu tố môi trƣờng
Xác định pH: theo TCVN 6492:2011 (ISO 10523:2008) – Chất lượng nước –
xác định pH
Xác định nhiệt độ: theo TCVN 4557:1998 Chất lượng nước - Phương pháp xác
định nhiệt độ
Xác định màu sắc: theo TCVN 6185:2008-Chất lượng nước - kiểm tra và xác
định màu sắc
22


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>
Xác định BODn: theo TCVN 6001-1:2008 (ISO 5815 : 2003) - Chất lượng nước
- xác định nhu cầu oxy sinh hóa sau n ngày (BODn) - Phần 1: Phương pháp pha loãng
và cấy có bổ sung allylthiourea
Xác định COD: theo TCVN 6491 : 1999 (ISO 6060 : 1989) - Chất lượng nước xác định nhu cầu oxy hóa học (COD)

Xác định chất rắn lơ lửng: theo TCVN 6626:2000 (ISO 11923:1997) Chất
lượng nước - xác định chất rắn lơ lửng bằng cách lọc qua cái lọc sợi thủy tinh
Xác định asen: theo TCVN 6626:2000-Chất lượng nước - phương pháp đo phổ
hấp phụ nguyên tử (ký thuật hydro)
Xác định thủy ngân: theo TCVN 7877:2008 (ISO 5666:1999) - Chất lượng nước
- xác định thủy ngân
Xác định coban, niken, đồng, kẽm, cadimi và chì: theo TCVN 6193:1996 Chất
lượng nước - xác định coban, niken, đồng, kẽm, cadimi và chì
Xác định xianua tổng số: theo TCVN 6181:1996 (ISO 6703:1984) Chất lượng
nước - xác định xianua tổng số
Xác định chỉ số phenol: theo TCVN 6216:1996 (ISO6439:1990) Chất lượng
nước - Xác định chỉ số phenol - Phương pháp trắc phổ dung 4-aminoantipyrin sau khi
chưng cất
Xác định sunfua hòa tan: theo TCVN 6637:2000 (ISO 10530:1992) Chất lượng
nước - Xác định sunfua hòa tan - Phương pháp đo quang dung metylen xanh
Xác định hàm lượng amoni: theo TCVN 5988: 1995 (ISO 5664:1984) Chất
lượng nước - Xác định amoni - Phương pháp chưng cất và chuẩn độ
Xác định nitơ: theo TCVN 6638:2000 Chất lượng nước - Xác định nitơ - Vô cơ
hóa xúc tác sau khi khử bằng hợp kim Devarda
Xác định phôt pho: theo TCVN 6202:2008 (ISO 6878:2004) Chất lượng nước Xác định phôt pho - Phương pháp đo phổ dung amoni molipdat
Xác định vi khuẩn coliform, vi khuẩn coliform chịu nhiệt và Escherichia coli
giả định: theo TCVN 6187-1 : 1996 (ISO 9308-1 : 1990) Chất lượng nước- Phát hiện
và đếm vi khuẩn coliform, vi khuẩn coliform chịu nhiệt và Escherichia coli giả định: +
Phần 1: Phương pháp màng lọc hoặc TCVN 6187-2 : 1996 (ISO 9308-2 : 1990) Chất

23


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>
lượng nước - Phát hiện và đếm vi khuẩn coliform, vi khuẩn coliform chịu nhiệt và
Escherichia coli giả định
Xác định Clo tự do và Clo tổng số: theo TCVN 6225-3:2011 (ISO 7393-3:1990)
Chất lượng nước - Xác định Clo tự do và Clo tổng số - Phương pháp chuẩn độ iot xác
định clo tổng số
Xác định hàm lượng nitơ: theo TCVN 6638 : 2000 (ISO 10048 : 1991) Chất
lượng nước - Xác định nitơ - Vô cơ hóa sau khi khử bằng hợp kim Devarda
Xác định clorua, florua: theo TCVN 6494-1:2011 (ISO 10304-1:2007) Chất
lượng nước - Xác định các ion hòa tan bằng phương pháp sắc ký lỏng ion –Phần 1:
Xác định bromua, clorua, florua, nitrat, nitrit, phosphate và sunphat hòa tan
Xác định Salmonella spp.: theo ISO 19250:2010 (E)
2.2.8. Đánh giá hiệu quả sử dụng và tính an toàn của chế phẩm Bio-BP
Chế phẩm Bio-BP có chức năng sử dụng hiệu quả trong xử lý chất thải, nước
thải ô nhiễm hữu cơ.
Tính hiệu quả của chế phẩm Bio-PB khi sử dụng trong hệ thống xử lý nước thải
của nhà máy bia Hà Nội được đánh giá thông việc so sánh các chỉ số cơ bản về chất
lượng nước so với khi không sử dụng chế phẩm: giảm sử dụng hóa chất, năng lượng
sục khí, thời gian lưu, chi phí vận hành, nhân lực trong xử lý và chỉ tiêu chất chất
lượng nước thải sau xử lý ra. Theo dõi biến động chỉ tiêu vi sinh và thành phần nước
thải trong hệ thống xử lý:
+ So sánh chỉ tiêu: độ trong, pH, DO, BOD, COD, NH3, H2S, tổng nitơ, tổng
photpho, tổng chất rắn lơ lửng (TSS),… thành phần các nhóm vi sinh đặc trưng, độ an
toàn của nước sau xử lý.
+ So sánh kết quả và đưa ra kết luận: mức độ giảm sử dụng hóa chất, mức độ giảm
sử dụng năng lượng để sục khí, giảm thời gian lưu, nhân công… và đưa ra kết luận.
2.2.9. Đánh giá chế phẩm tại nhà máy bia Hà Nội
Theo hướng dẫn và đề xuất của nhà cung cấp, chế phẩm Bio-PB sau khi kích
hoạt được đề xuất đưa vào chu trình tại hai điểm (bể hiếu khí 1 và bể hiếu khí 2). Chế
phẩm Bio-PB kích hoạt sẽ được bổ sung 50% vào mỗi đầu dòng chảy của hai bể hiếu

khí. Nhờ đó, chế phẩm Bio-PB có thể có tác động ngay lập tức thay vì phải mất thời
gian điều chỉnh với điều kiện mới. Bổ sung chế phẩm Bio-PB cụ thể theo sơ đồ sau:
24


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Bể điều hòa
(70 m3)

/>
Chế Phẩm BioPB
50%

50%

Bể ổn định
lưu lượng
Bể yếm khí
(550 m3)

Bể hiếu khí 1
(550 m3)
Bể
lắng

Bể cân bằng
(pH, 900 m3)
Bể yếmkhí
(550 m3)

Dòng thải

Bể hiếu khí 2
(550 m3)

Hình 2.1. Sơ đồ bổ sung chế phẩm vào hệ thống xử lý nước thải tại Công ty Bia
Hà Nội
* Liều lượng bổ sung:
Theo lưu lượng đầu vào của nước thải và hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất,
chế phẩm Bio-PB có thể được đưa vào hệ thống với những liều lượng như sau
Bảng 2.2. Lượng chế phẩm Bio – PB bổ sung vào hệ thống xử lý
Ngày

Nồng độ

Bio-PB (kg)

(ppm)

1

5

6,0

2

4

4,8

3

3

3,6

4

2

2,4

...

...

...

30

2

2,4

2.2.10. Đánh giá các tác động của chế phẩm đến môi trƣờng
25