khảo sát khả năng tổng hợp và đặc điểm chất kháng sinh của chủng aspergillus sp sau xử lí bằng uv

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
__________________________

Nguyễn Xuân Đức

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TỔNG HỢP VÀ
ĐẶC ĐIỂM CHẤT KHÁNG SINH CỦA
CHỦNG ASPERGILLUS SP. SAU XỬ LÍ BẰNG UV

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành Phố Hồ Chí Minh - 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
_________________________

Nguyễn Xuân Đức

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TỔNG HỢP VÀ
ĐẶC ĐIỂM CHẤT KHÁNG SINH CỦA
CHỦNG ASPERGILLUS SP. SAU XỬ LÍ BẰNG UV
Chuyên ngành: Vi sinh vật
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. TRẦN THANH THỦY

Thành Phố Hồ Chí Minh - 2012


i

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Thanh Thủy, người đã trực
tiếp giảng dạy, hướng dẫn và động viên tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô Khoa Sinh học Trường Đại học Sư
phạm Tp. Hồ Chí Minh đã trực tiếp giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm của Khoa.
Tôi cám ơn các bạn học viên cao học khóa 19 và 20: Trần Thị Minh Định,
Phan Văn Giác, Đỗ Thị Thu Nga, Trần Thị Ái Liên đã giúp đỡ và động viên tôi.
Tôi gửi lời cám ơn chân thành đến Sở GD-ĐT Tây Ninh, các đồng nghiệp tại
Trường THPT Tân Đông, THPT Nguyễn Chí Thanh đã tạo thuận lợi cho tôi trong
suốt thời gian học.
Tôi bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình luôn bên cạnh và
động viên tôi trong suốt thời gian dài học tập.

Tháng 3 năm 2012


ii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
công trình nào!
Tác giả luận văn

Nguyễn Xuân Đức


iii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ i
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i
MỤC LỤC

............................................................................................................. iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... vi
DANH MỤC CÁC BẢNG....................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... viii
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ .....................................................................................x
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ ..................................................................................... xi
MỞ ĐẦU

...............................................................................................................1

1. Lí do chọn đề tài .................................................................................................1
2. Mục đích đề tài ...................................................................................................2
3. Nhiệm vụ đề tài ...................................................................................................2
4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................................2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU...............................................................3
1.1. Khái quát về CKS ...........................................................................................3
1.1.1. Lược sử nghiên cứu CKS ........................................................................3
1.1.2. Phân loại và cơ chế tác động của CKS ....................................................4

1.1.3. Một số ứng dụng CKS .............................................................................7
1.2. Nấm sợi và khả năng sinh CKS ......................................................................8
1.2.1. Tổng quát về nấm sợi RNM .....................................................................8
1.2.2. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên khả năng sinh CKS từ nấm
sợi

.............................................................................................................11

1.2.3.

Đặc điểm sinh học của Aspergillus .....................................................16

1.2.4.

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về CKS từ nấm sợi .........18


iv

1.3. Đột biến và ứng dụng trong công nghệ vi sinh .............................................19
1.3.1.

Khái quát về đột biến ..........................................................................19

1.3.2.

Phân loại đột biến gen .........................................................................20

1.3.3.

Gây đột biến bằng tia UV ....................................................................22

1.3.4.

Cơ chế sửa sai ......................................................................................24

1.3.5.

Một vài nghiên cứu về ứng dụng tia UV trong gây đột biến nhân tạo 27

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................28
2.1. Vật liệu ..........................................................................................................28
2.1.1.

VSV kiểm định ....................................................................................28

2.1.2.

Hóa chất ...............................................................................................28

2.1.3.

Thiết bị và dụng cụ ..............................................................................28

2.1.4.

Môi trường...........................................................................................29

2.2. Phương pháp .................................................................................................31
2.2.1.

Phương pháp phân lập nấm sợi ...........................................................31

2.2.2.

Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng .........................................32

2.2.3.

Phương pháp quan sát hình thái và định danh nấm sợi .......................33

2.2.4.

Định danh bằng sinh học phân tử ........................................................34

2.2.5.

Phương pháp gây đột biến bằng tia UV ..............................................35

2.2.6.

Phương pháp xác định môi trường và điều kiện nuôi cấy đến khả năng

sinh CKS ...........................................................................................................36
2.2.7. Phương pháp xác định sinh khối NS theo Egorov ...............................37
2.2.8.

Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng lên độ bền CKS ............................37

2.2.9.

Phương pháp xác định dung môi hòa tan CKS thô .............................38

2.2.10. Phương pháp xử lí số liệu ....................................................................38
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ..............................................................39
3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng NS có hoạt tính đối kháng mạnh .................39
3.2. Gây đột biến chủng 11.2’ bằng tia UV .........................................................40
3.2.1. Tác động tia UV đến khả năng sống sót của chủng 11.2’ .....................41


v

3.2.2. Tác động tia UV làm thay đổi hình thái của chủng 11.2’ .....................43
3.2.3. Ảnh hưởng tia UV lên khả năng tổng hợp CKS của chủng 11.2’ ..........45
3.3. Đặc điểm sinh học và phân loại chủng 11.2’ và chủng 20.50.5 ...................47
3.4. Khảo sát môi trường và điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến hoạt tính đối
kháng của chủng gốc và chủng ĐB ......................................................................52
3.4.1. Ảnh hưởng của MT đến hoạt tính KS của chủng gốc và chủng ĐB ....52
3.4.2. Ảnh hưởng nồng độ muối đến hoạt tính KS của chủng gốc và chủng
ĐB.....................................................................................................................54
3.4.3 Ảnh hưởng nguồn carbon đến hoạt tính KS của chủng gốc và chủng ĐB
..........................................................................................................................56
3.4.4. Ảnh hưởng nguồn nitơ đến hoạt tính KS của chủng gốc và chủng ĐB 58
3.4.5. Ảnh hưởng độ pH của MT nuôi cấy đến hoạt tính KS chủng gốc và
chủng ĐB ..........................................................................................................59
3.4.6. Ảnh hưởng nhiệt độ môi trường nuôi cấy đến hoạt tính kháng sinh của
hai chủng gốc và chủng đột biến ......................................................................62
3.5. Động học quá trình lên men của chủng gốc và chủng ĐB ..........................64
3.6. Khảo sát một số đặc tính CKS từ hai chủng gốc và chủng ĐB ....................69
3.6.1. Tính chịu nhiệt của CKS chủng gốc và chủng ĐB ..............................69

3.6.1. Tính chịu pH của CKS thuộc hai chủng gốc và chủng ĐB ...................71
3.7. Xác định dung môi hòa tan CKS của chủng gốc và chủng ĐB ...................72
3.8. Khảo sát phổ kháng khuẩn của DLM chất KS của chủng gốc và chủng ĐB
...............................................................................................................................74
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................77
4.1. Kết luận ..........................................................................................................77
4.2. Kiến nghị........................................................................................................78
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................79
PHỤ LỤC

.............................................................................................................85


vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
CKS

Chất kháng sinh

ĐB

Đột biến

DLM

DLM

G(-)

Vi khuẩn Gram âm

G(+)

Vi khuẩn Gram dương

KL

Khuẩn lạc

KS

Kháng sinh

MRSA

Methicillin Resistant Staphylococcus aureus
(Staphylococcus aureus kháng methicillin)

MT

Môi trường

NS

Nấm sợi

RNM

Rừng ngập mặn

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Khả năng đối kháng các chủng NS phân lập ...............................39
Bảng 3.2. Tác động tia UV lên khả năng sống sót của chủng 11.2’ ............42
Bảng 3.3. Đặc điểm phân loại hình thái chủng 11.2’ và chủng 20.50.5 ......49
Bảng 3.4. Đặc điểm khác về hình thái chủng gốc và chủng ĐB .................50
Bảng 3.6. Ảnh hưởng MT đến họat tính kháng sinh....................................52
Bảng 3.5. Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến hoạt tính kháng sinh ...................55
Bảng 3.7. Ảnh hưởng nguồn carbon đến họat tính kháng sinh ....................57
Bảng 3.8. Ảnh hưởng nguồn nitơ đến họat tính kháng sinh ........................58
Bảng 3.9. Ảnh hưởng pH môi trường đến họat tính kháng sinh ..................60
Bảng 3.10. Ảnh hưởng nhiệt độ MT đến họat tính kháng sinh ...................62
Bảng 3.11. Động học quá trình lên men của chủng gốc và chủng ĐB ........65
Bảng 3.12. Kết quả trước và sau khi tối ưu .................................................68
Bảng 3.13. Khả năng chịu nhiệt của CKS của chủng gốc và chủng ĐB .....70
Bảng 3.14. Khả năng chịu pH của CKS chủng gốc và chủng ĐB ...............72
Bảng 3.15. Xác định dung môi hòa tan CKS của chủng gốc và chủng ĐB 73
Bảng 3.16. Khả năng kháng một số VK gây bệnh ......................................74

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Nấm có vách ngăn và không vách ngăn[32] .................................................... 9
Hình 1.2. Tác nhân base đồng đẳng - 5BU .................................................................... 21
Hình 1.3. Tác nhân thay đổi cấu trúc – EMS ................................................................. 22
Hình 1.4. Cơ chế hình thành dạng hydrate bằng tia UV ................................................ 24
Hình 1.4. Cơ chế hình thành dạng dimer bằng tia UV ................................................... 24
Hình 1.5. Cơ chế quang hoạt phục ................................................................................. 25
Hình 1.6. Cơ chế sửa sai bằng methyltranferase ............................................................ 26
Hình 1.7. Cơ chế cắt nucleotide ..................................................................................... 26
Hình 3.1. Hoạt tính kháng với B. subtilis của chủng 11.2’ ............................................ 40
Hình 3.2. Hoạt tính kháng với E. coli của chủng 11.2’.................................................. 40
Hình 3.3. Bào tử chủng 11.2’ nẩy mầm trên MT YEA.................................................. 41
Hình 3.4. Sự thay đổi hình thái KL sau khi chiếu tia UV lên chủng gốc 11.2’ (Trên
môi trường YEA sau 6 ngày) .......................................................................................... 44
Hình 3.5. Hoạt tính kháng E. coli chủng 11.2’ ............................................................. 46
Hình 3.6. Hoạt tính kháng B. subtilis chủng 11.2’ ........................................................ 46
Hình 3.7. Hoạt tính kháng .............................................................................................. 46
Hình 3.8. Hoạt tính kháng .............................................................................................. 46
Hình 3.9. Hình thái mặt phải KL chủng 11.2’ ............................................................... 47
Hình 3.10. Hình thái mặt trái KL chủng 11.2’ ............................................................... 47
Hình 3.11. Hệ sợi chủng 11.2’ ....................................................................................... 48
Hình 3.12. Hình thái hệ sợi chủng ĐB 20.50.5 .............................................................. 48
Hình 3.13. Mặt phải KL chủng 11.2'.............................................................................. 48
Hình 3.14. Mặt phải KL chủng ĐB 20.50.5 ................................................................... 48
Hình 3.15. Cơ quan sinh bào tử chủng 11.2’ ................................................................. 48
Hình 3.16. Cơ quan sinh bào tử chủng ĐB 20.50. 5 ...................................................... 48
Hình 3.19. Hoạt tính kháng B. subtilis chủng ĐB trên MT1 ......................................... 54

Hình 3.20. Hoạt tính kháng E. coli chủng ĐB trên MT1 ............................................... 54
Hình 3.21. Hoạt tính kháng B. subtilis chủng gốc trên MT1 ........................................ 54


ix

Hình 3.22. Hoạt tính kháng E. coli chủng gốc trên MT1 .............................................. 54
Hình 3.25. Hoạt tính kháng B. subtilis chủng gốc ở pH 6,5 ......................................... 61
Hình 3.26. Hoạt tính kháng E. coli chủng ĐB ở pH 6,5 ............................................... 61
Hình 3.27. Hoạt tính kháng B. subtilis chủng ĐB ở 250C ............................................ 63
Hình 3.28. Hoạt tính kháng E. coli chủng ĐB ở 250C ................................................. 63
Hình 3.29. Hoạt tính kháng B. subtilis chủng gốc ở 250C ............................................. 64
Hình 3.30. Hoạt tính kháng E. coli chủng gốc ở 250C .................................................. 64
Hình 3.31. Hoạt tính kháng B. subtilis chủng ĐB ở 96 giờ ........................................... 67
Hình 3.32. Hoạt tính kháng E. coli chủng ĐB ở 108 giờ ............................................... 67
Hình 3.33. Hoạt tính kháng B. subtilis chủng gốc ở 96 giờ ........................................... 67
Hình 3.34. Hoạt tính kháng E. coli chủng gốc ở 108 giờ .............................................. 67
Hình 3.35. Hoạt tính kháng E. coli sau tối ưu chủng gốc .............................................. 69
Hình 3.36. Hoạt tính kháng E. coli sau tối ưu chủng ĐB .............................................. 69
Hình 3.37. Hoạt tính kháng B. subtilis sau tối ưu chủng gốc......................................... 69
Hình 3.38. Hoạt tính kháng B. subtilis sau tối ưu chủng ĐB ......................................... 69
Hình 3.39. Hoạt tính kháng B. subtilis của chủng ĐB ở 400C ....................................... 71
Hình 3.40. Hoạt tính kháng B. subtilis của chủng ĐB ở 800C ....................................... 71
Hình 3.41. Hoạt tính kháng E. coli của chủng ĐB ở 400C ............................................ 71
Hình 3.42. Hoạt tính kháng E. coli của chủng ĐB ở 800C ........................................... 71
Hình 3.43. Hoạt tính kháng MRSA của chủng ĐB ........................................................ 75
Hình 3.44. Hoạt tính kháng S. pyogenes của chủng ĐB ............................................... 75
Hình 3.45. Hoạt tính kháng E. coli gây bệnh trên heo của chủng ĐB ........................... 76
Hình 3.46. Hoạt tính kháng Shigella gây bệnh trên heo của chủng ĐB ........................ 76
Hình 3.47. Hoạt tính kháng Salmonella gây bệnh trên heo của chủng ĐB ................... 76

x

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Tỉ lệ sống sót bào tử chủng 11.2’ sau khi chiếu tia UV ............................ 41
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng MT lên hoạt tính KS của ........................................................ 52
chủng gốc và chủng ĐB ................................................................................................. 53
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng nguồn carbon đến hoạt tính KS của chủng gốc và chủng ĐB 57
Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng nguồn nitơ đến hoạt tính kháng sinh ...................................... 59
Biểu đồ 3.5. Hoạt tính kháng sinh của CKS thô của hai chủng NS khi thu nhận bằng
các dung môi khác nhau ................................................................................................. 74


xi

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị 3.1. Ảnh hưởng nồng độ muối đến hoạt tính KS chủng gốc và chủng ĐB ...55
Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng pH của MT đến hoạt tính KS chủng gốc và chủng ĐB .......60
Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng nhiệt độ MT đến hoạt tính kháng sinh .................................63
Đồ thị 3.4. Động học lên men sinh KS của chủng gốc .............................................66
Đồ thị 3.5. Động học lên men sinh KS của chủng ĐB .............................................66
Đồ thị 3.6. Tính chịu nhiệt của CKS từ hai chủng gốc và chủng ĐB ......................70
Đồ thị 3.7. Khả năng chịu pH của CKS chủng ĐB và chủng gốc ............................72


1

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài

Sự phát hiện ra penicilin vào 1928 của Alexander Fleming là một bước ngoặt
vĩ đại trong lịch sử phát triển của y học mở đầu cho kỷ nguyên về CKS và đặt mốc
khai sinh ngành công nghiệp sản xuất CKS. Việc lên men, tinh chế thành công và
xác định được hiệu quả điều trị của penicilin (Florey và Chain 1939) đã chính thức
mở ra “kỷ nguyên vàng” của công nghiệp sản xuất CKS và KS là thần dược trong
cuộc chiến chống lại bệnh nhiễm trùng của con người.
Ngày nay, sản xuất CKS có vai trò vô cùng quan trọng không chỉ trong bảo vệ
sức khỏe con người mà còn nhiều lĩnh vực khác như chăn nuôi, trồng trọt. Vì thế
mà ngành công nghiệp sản xuất CKS có sức hấp dẫn rất lớn với các nhà khoa học,
và nó là một trong số ít ngành công nghiệp mang lại hiệu quả kinh tế khổng lồ, đặc
biệt ở các nước phát triển như Anh, Mỹ, Nhật Bản. Tính đến năm 2006, có khoảng
17000 CKS được tìm ra với doanh thu ước tính khoảng 26 tỉ USD.
Thực tiễn điều trị cho thấy hiện tượng mầm bệnh còn sống sót sau khi điều trị
bằng KS gọi là hiện tượng kháng thuốc. Hiện tượng này có xu hướng gia tăng liên
tục với mức độ ngày càng trầm trọng. Do đó, việc tìm kiếm phát hiện ra các KS mới
luôn là vấn đề thời sự, cấp thiết không chỉ ở hiện tại mà cả cho tương lai.
Trong những năm gần đây, xu hướng tìm kiếm CKS từ nấm sợi RNM dành
được nhiều sự quan tâm bởi khoảng ¾ diện tích bề mặt trái đất là nước mặn, và hệ
VSV chưa được khái thác hết tiềm năng. Trên thực tế, người ta đã phát hiện ra
nhiều hợp chất kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng ung thư,… từ nấm sợi
RNM với hoạt tính rất mạnh.
Thời gian gần đây, có rất nhiều công trình nghiên cứu về các chủng nấm sợi
RNM Cần Giờ. Qua khảo sát đã xác định được một số chủng có khả năng sinh tổng
hợp các CKS đối kháng với các tác nhân gây bệnh cho người, vật nuôi và cây trồng.
Thực tế cho thấy các chủng VSV công nghiệp có khả năng “siêu tổng hợp
CKS” là kết quả của sự phối hợp rất nhiều các giải pháp kỹ thuật chọn giống, trong


2

đó có sự đóng góp quan trọng của kỹ thuật gây đột biến. Bằng ĐB, người ta có thể
tác động lên bộ máy di truyền hoặc làm biến đổi nó nhằm chọn các chủng VSV có
khả năng sinh tổng hợp CKS cao với những tính chất mới hơn hẳn những chủng ban
đầu.
Để góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế khi ứng dụng các chủng NS có hoạt
tính KS cao từ RNM. Chúng tôi chọn đề tài: “Khảo sát khả năng sinh tổng hợp và
đặc điểm chất kháng sinh của chủng Aspergillus sp. sau xử lí bằng UV”.

2. Mục đích đề tài
Nghiên cứu chọn lọc chủng Aspergillus sp. đột biến có khả năng sinh tổng hợp
CKS cao làm cơ sở cho việc ứng dụng.

3. Nhiệm vụ đề tài


Phân lập và tuyển chọn chủng nấm sợi từ RNM Cần Giờ có hoạt tính kháng
sinh cao.



Gây đột biến bằng tia UV và tuyển chọn chủng NS sinh tổng hợp CKS cao.



Định danh đến loài bằng sinh học phân tử chủng gốc và chủng ĐB.



Xác định môi trường và điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp CKS
của chủng gốc và chủng ĐB.



Thu nhận và khảo sát đặc điểm dịch kháng sinh thô của chủng gốc và chủng
ĐB.



Khảo sát hoạt tính đối kháng của dịch kháng sinh thô từ chủng gốc và chủng
ĐB với một số VK kiểm định gây bệnh trên người và heo

4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
−

Thời gian: Từ tháng 10/2010 đến tháng 4/2012

−

Địa điểm: Thực hiện đề tài tại Phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa, Khoa
Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU
1.1. Khái quát về CKS
1.1.1. Lược sử nghiên cứu CKS
Cách đây hơn 2500 năm, người Trung Quốc được biết đến như là những người
đầu tiên sử dụng KS để chữa bệnh. Trong các nền văn minh cổ xưa khác như Hy
Lạp và Ai Cập, các thầy thuốc cũng đã sử dụng CKS trong điều trị một số bệnh

nhiễm trùng. Tuy nhiên, trong thời gian này, họ chỉ sử dụng các loại cây và một số
loại nấm để chữa bệnh nhưng chưa nhận biết được tác dụng của CKS trong các loại
dược thảo.
Tháng 10 năm 1928, bác sĩ người Anh, Alexander Fleming(1881 – 1955) tại
bệnh viện Saint Mary, Luân Đôn đã phát hiện ra nấm sợi Penicillium notatum khi
phát triển có thể làm ức chế, tiêu diệt cả khuẩn lạc Staphylococcus aureus. Ông cấy
chủng này vào MT dịch thể và thấy dịch nuôi này cũng có khả năng tương tự,
Fleming gọi dịch này là penicillin. Sau đó, công trình của ông bị lãng quên do
không tinh chế được penicillin. Phải hơn 10 năm sau (1941), khi E.Chain và
H.W.Florey tách chiết thành công penicillin thì KS này mới được ứng dụng trong y
học và mở ra kỷ nguyên nghiên cứu CKS.
Theo Walksman (1940): CKS là một chất hóa học có nguồn gốc từ VSV có khả
năng ức chế sự sinh trưởng và thậm chí phá hủy VSV khác ở nồng độ thấp. Về sau,
khi biết được cấu trúc hóa học, định nghĩa CKS được bổ sung hoàn chỉnh hơn. Theo
viện sĩ Ouchinikov (1987) CKS là những chất có nguồn gốc từ thiên nhiên và các
sản phẩm cải biến chúng bằng con đường hóa học, có khả năng ức chế hoặc tiêu
diệt một cách có chọn lọc sự phát triển của những VSV hoặc tế bào ung thư ngay ở
nồng độ thấp (10-3 – 10-2 µg/ml) [1], [18], [3].
Ngay sau khi CKS được tách chiết thành công, nó đã nhanh chóng trở thành
ngành “công nghiệp CKS” với sự phát triển mạnh mẽ với hàng loạt các CKS được
tìm ra: Năm 1945, penicilin được tinh chiết bởi A.Fleming, E.Chain và H.W.Flore;
actinomixin (Waksman, 1940); chloramphanicol (Erhlich, 1947). Tính đến năm


4

1970, số lượng CKS đã biết khoảng 270, và đến năm 2006 đã tăng tới 17000 CKS;
Thị trường CKS trên thế giới ước tính đến năm 2002 đã đạt 26 tỉ đô la [14], [46].
Ở Việt Nam, những nghiên cứu đầu tiên về CKS được tiến hành bởi Bác sĩ
Đặng Văn Ngữ: Năm 1951, ông tổ chức 5 đội cơ động sản xuất dịch lọc penicillin

để rửa vết thương cho thương binh trong chiến dịch Thu – Đông. Nhiều thương
binh đã được chữa lành vết thương bằng dịch lọc CKS này. Sau kháng chiến 9 năm,
công trình này được nghiên cứu tiếp tục ở trường Đại học Y Dược Hà Nội.
Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội, Trường Đại học Sư phạm I Hà Nội đã
nghiên cứu sự phân bố, sự lên men các chủng xạ khuẩn sinh CKS có hoạt tính
mạnh, phổ rộng từ đất Việt Nam. Viện Khoa học Việt Nam đã nghiên cứu sản xuất
và khả năng ứng dụng của chế phẩm Biovit, Teravit, Bacitracin vào chăn nuôi và
bảo vệ cây trồng trong nông nghiệp [7], [11].
Hàng loạt những công trình nghiên cứu tiếp theo như: Đề tài nghiên cứu cấp nhà
nước “Nghiên cứu công nghệ điều chế 6-APA, 7-ADCA và cephalexin từ penicillin
G”(1999-2000) hoặc “Nghiên cứu áp dụng công nghệ sản xuất các kháng sinh mới
hiệu quả cao bằng nguyên liệu trong nước” (2001-2005) cả hai công trình do TS.
Lê Gia Hy chủ nhiệm; Đề tài “Khảo sát hoạt tính đối kháng và tiềm năng ứng dụng
của các chủng NS phân lập từ một số khu RNM Nam Định và Thái Bình” của Mai
Thị Hằng, Lê Thanh Huyền (2002); Đề tài “Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng
sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam” của Bùi Thị Việt Hà, và còn rất
nhiều những công trình nghiên cứu khác về CKS…
Tuy nhiên, do nhiều nguyên nhân về khách quan và chủ quan nên tình hình
nghiên cứu về CKS ở Việt Nam hiện nay còn phát triển chậm chạp so với trình độ
thế giới [3], [8].
1.1.2. Phân loại và cơ chế tác động của CKS
 Phân loại
CKS là một nhóm chất đa dạng về mặt hóa học. Trọng lượng phân tử biến động
từ 150 – 5000 dalton. Trong đó, thành phần cấu trúc phân tử của một số CKS chỉ có


5

C và H hoặc thường chứa C, H, O và N. Một số khác chứa cả S, P và halogen. CKS
thường chứa các nhóm chức đã biết như hydroxyl, cacboxyl, carbonil, nhóm chức

chứa nitơ… có cấu trúc đặc trưng của chất hữu cơ. Tất cả các CKS đều ở thể rắn và
có cấu tạo hóa học rất khác nhau. Chúng có tính đặc hiệu về cơ chế tác động đến
quá trình sinh học cũng như đối tượng VSV đích... Từ đặc điểm này mà chúng dễ
dàng được phân loại vào các nhóm chính. [27],[28]
Có nhiều tiêu chí để phân loại CKS khác nhau, tùy vào mục đích nghiên cứu:
Dựa vào phổ tác động, có thể chia CKS thành những nhóm sau: Nhóm CKS kháng
khuẩn phổ hẹp (kháng được một số ít VK, chủ yếu là VK G(+); Nhóm CKS kháng
khuẩn phổ rộng (kháng được nhiều đối tượng VSV, cả G(+) và G(-)); Nhóm CKS
kháng VK lao(Mycobacterium tuberculosis); Nhóm CKS kháng nấm [3],[21],[42].
Dựa vào cơ chế tác động, CKS được chia thành những nhóm: Nhóm CKS ức
chế sự tổng hợp thành tế bào, nhóm CKS phá hủy màng sinh chất, nhóm CKS ức
chế tổng hợp acid nucleic, nhóm CKS ức chế sự tổng hợp protein [3], [21], [42].
Dựa vào cấu trúc hóa học, có thể chia CKS thành những nhóm sau: nhóm βlactam, nhóm polypeptide, nhóm aminoglycoside, nhóm tetracyclin, nhóm
macrolide, nhóm polyen [21], [42].
Dựa vào nguồn gốc CKS, ta có nhóm CKS từ thực vật, nhóm CKS từ động vật,
nhóm CKS từ VK, nhóm CKS từ xạ khuẩn, nhóm CKS từ NS. [21], [42]
Hiệu quả tác dụng của CKS phụ thuộc vào bản chất hóa học, nồng độ trong chế
phẩm, tính chất MT biểu hiện và cấu trúc hiển vi của tế bào vi sinh vật đích. Chính
những đặc điểm này tạo nên tính đặc hiệu cao cho CKS và đây là điểm chính mà
CKS khác với chất độc. Tính đặc hiệu gắn liền với cơ chế tác động của CKS.
 Cơ chế tác động của CKS được chia thành các nhóm chính như sau:
Căn cứ theo CKS tác động vào mặt nào của VSV đích mà cơ chế tác động được
chia thành các nhóm:
 Ức chế tổng hợp thành tế bào VK
Thành tế bào VK là cấu trúc bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại áp suất thẩm thấu.
Thành phần cấu tạo chủ yếu thành tế bào VK là peptidoglucan, là một đại phân từ


6

cấu tạo bởi các chuổi polysaccaride bao gồm các đơn phân là các dẫn xuất của
đường glucose nằm xen kẻ nhau và lặp lại một cách liên tục. Độ vững chắc của
peptidoglucan có được là do các chuổi polysaccaride liên kết chéo nhau thông qua
một đoạn peptid ngắn. Để có thể sinh trưởng và phân chia, VK phải tổng hợp các
đơn vị peptidoglucan và vận chuyển nó đến đúng vị trí sinh trưởng của tế bào.
CKS ức chế tổng hợp thành tế bào VK chủ yếu thuộc nhóm β-Lactam như:
penicillin, cephalosporin, vancomycin… chúng liên kết với transpeptidase – là
enzym cần thiết cho sự hình thành liên kết chéo giữa các chuổi peptidoglucan, làm
cho VK không tổng hợp được thành tế bào, trương nước và bị vỡ chết. CKS thuộc
nhóm này thường chỉ có tác dụng trong trong giai đoạn VK đang phân chia.[18],
[21], [23]
 Làm hỏng màng nguyên sinh chất
CKS làm tổn thương màng nguyên sinh chất VSV, những CKS này thuộc nhóm
polypeptid. Ví dụ trong nhóm này, polymixin phá vỡ lớp phospholipit làm chất
nguyên sinh thoát ra ngoài, polyen tác động lên thành phần steron ở màng tế bào
động vật và nấm, không có tác dụng với màng tế bào VK.[18],[1]
 Ức chế quá trình tổng hợp protein
Kháng sinh nhóm này gây cản trở một vị trí nhất định trong quá trình sinh tổng
hợp protein của tế bào, tùy vào từng CKS khác nhau. Thuộc nhóm này có những
chất kháng sinh như:
Nhóm Streptomyxin: gắn với tiểu phần 30S trên ribosome của VK và ức chế
tổng hợp protein
Cloramphenicol và erythromixin: gắn với tiểu phần 50S của ribosome ngăn cản
sự kéo dài của chuổi polypeptid [1].
 Ức chế quá trình tổng hợp axit nucleic
Acid nucleic gồm DNA và RNA là các đại phân tử sinh học không thể thiếu đối
với sự sống của tế bào. Một số CKS có khả năng cản trở quá trình sao chép DNA và
phiên mã ở VSV. Do sự khác biệt giữa DNA tế bào prokaryote và eukaryote rất ít
nên CKS nhóm này không chỉ gây độc cho VK mà còn độc cả cho người. CKS tác

7

động lên quá trình tổng hợp axit nucleic ở nhiều khâu khác nhau: ức chế quá trình
tự nhân đôi DNA (quinolon), ức chế sự khởi đầu tổng hợp RNA (rifampicin)
1.1.3. Một số ứng dụng CKS
 Ứng dụng trong y học
Như đã nói ở trên, việc nghiên cứu CKS mục đích đầu tiên là sử dụng chữa bệnh
cho con người. Nó là động lực cho ngành này phát triển mạnh mẽ, chỉ sau khoảng
60 năm từ khi nó được tinh chiết, số lượng CKS từ con số vài chất đã lên đến con số
vài chục ngàn. Điều đó không có nghĩa là loài người đã đẩy lùi hoàn toàn được
những bệnh do VSV gây ra. Cùng với sự phát triển về số lượng CKS, song song với
nó là hiện tượng kháng kháng sinh, những bệnh mới của thời đại như ung thư.
Ngành công nghiệp kháng sinh vẫn luôn nóng và đòi hỏi cần tìm ra những CKS mới
đáp ứng yêu cầu chữa trị bệnh ở người.
 Ứng dụng trong chăn nuôi, nuôi trồng thủy hải sản
Đối tượng kí sinh gây bệnh không chỉ trên con người, cả trên gia súc, gia cầm,
thủy hải sản là những động vật được con người chăn nuôi phục vụ cho nhiều mục
đích khác nhau. Vì vậy, CKS cũng làm một “công cụ” đắc dụng trong điều trị bệnh
cho chúng. Những CKS được sử dụng nhiều trong chăn nuôi như: penicilin,
biomicilin, tetracilin, teramycin [3].
 Ứng dụng trong trồng trọt
Theo thống kê của tổ chức Nông – Lương thế giới (FAO), các loại cây trồng
đang bị khoảng 100000 loài sâu hại, 10000 loài nấm gây bệnh, 200 loài vi khuẩn,
600 loài tuyến trùng gây bệnh. Hàng năm có khoảng 20% sản lượng lương thực,
thực phẩm mất trắng. Và hiện tại, việc sử dụng thuốc trừ sâu tổng hợp hóa học đã
và đang gây ra những hậu quả nghiêm trọng như ô nhiễm MT, gây độc cho con
người [15].
Hiện nay, người ta đang hướng đến hạn chế sử dụng thuốc trừ sâu hóa học mà
thay bằng những sản phẩm có nguồn từ sinh học trong bảo vệ thực vật. Lợi dụng cơ

chế đấu tranh sinh học giữa các sinh vật, tạo điều kiện thuận lợi cho sinh vật có lợi


8

phát triển khống chế, tiêu diệt sinh vật gây hại cây trồng. Trong đó có rất nhiều sản
phẩm sử dụng dịch chiết, sinh khối từ NS. KS tạo nên từ nấm: grizeofulvin,
trichotesin, trichodermin, microcid... Grizeophulvin: sản phẩm của nấm P. urticae,
P. nigricans... dùng để phòng trừ bệnh thối quả ở cây ăn quả.
Một hướng sử dụng vi sinh vật nói chung và vi nấm nói riêng, đó là những chất
kích thích sinh trưởng được tạo ra sẽ kích thích sự sinh trưởng của cây trồng. Như
năm 1938, người ta đã phát hiện nấm Gibberella fujikuroi tạo được gibberellin –
một hoocmon sinh trưởng ở thực vật[ 4 ].

1.2. Nấm sợi và khả năng sinh CKS
1.2.1. Tổng quát về nấm sợi RNM
Khái quát sơ lược về nấm sợi



Nấm sợi là đại diện điển hình cho VSV nhân thực, chúng thuộc nhóm hiếu khí
bắt buộc, không có khả năng tự dưỡng, hình thức dinh dưỡng chủ yếu là kí sinh
hoặc hoại sinh [5].
Nấm sợi là tên gọi chung cho tất cả các loài nấm mà cơ thể sinh dưỡng có dạng
sợi, không màu, hệ sợi của nấm gồm rất nhiều sợi nhỏ có đường kính 2 – 8 µm và
dài có thể tới nhiều centimet đan xen nhau, các sợi này có thể phân nhánh hoặc
không phân nhánh, trên sợi có thể có vách ngăn (các loại nấm đa bào) hoặc không
có vách ngăn (nấm đơn bào) [hình 1.1]. Toàn bộ hệ sợi nấm được gọi là khuẩn ty
nấm, có kích thước tương đối lớn nên có thể nhìn được được bằng mắt thường.
Khuẩn ty nấm có hai loại: Phần hệ sợi đâm sâu vào môi trường làm nhiệm vụ dinh

dưỡng gọi là khuẩn ty cơ chất, phần hệ sợi vươn vào không khí gọi là khuẩn ty khí
sinh.
Đặc điểm hình thái và cấu trúc khuẩn ty khí sinh rất đa dạng và có thể khác nhau
giữa các loài nấm. Ở nhiều loài NS, đầu các khuẩn ty khí sinh trở thành cơ quan
sinh sản và bào tử được hình thành trên cơ quan này. Bào tử nấm thường có màu
sắc đặc trưng cho loài, đây là một căn cứ phân loại theo hình thái quan trọng.


9

Hình 1.1. Nấm có vách ngăn và không vách ngăn[32]
Khi đang sinh trưởng, phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt. Ở một số loài, sợi
nấm mang sắc tố tạo nên màu sắc sặc sỡ. Một số nấm còn tiết sắc tố ra ngoài MT và
làm đổi màu khu vực có nấm phát triển. Một số nấm còn tiết ra các chất hữu cơ tạo
nên các giọt tiết trên bề mặt khuẩn lạc.
Phần đầu sợi nấm có hình viên trụ gọi là vùng kéo dài. Đỉnh sợi nấm có chóp
nón không tăng trưởng, có chức năng bảo vệ đỉnh. Ngay dưới đỉnh là vùng sinh
trưởng mạnh có thành mỏng. Lúc sợi nấm sinh trưởng mạnh mẽ, vùng này có thể
dài 30µm. Dưới phần này, thành tế bào dày lên và không sinh trưởng thêm được
nữa.
Vì NS có cấu tạo tế bào nhân thực, nên chúng có những cấu trúc đặc trưng như:
ngoài cùng là màng tế bào, trong cùng là nhân có màng nhân bao bọc, tế bào chất có
nhiều bào quan chuyên hóa (ty thể, mạng nội chất, dịch bào hay không bào,
ribosome, thể Golgi, các giọt lipid...) Ngoài ra trong tế bào chất còn có các vi quản
rỗng ruột có đường kính khoảng 25nm, các vi sợi có đường kính 5-8nm.
Trong hệ sợi, một số nấm có vách ngăn ngang (nấm bậc cao) và một số nấm
không có vách ngăn ngang (nấm bậc thấp). Sợi nấm không vách ngăn mang nhiều
nhân nhưng vẫn gọi là đơn bào, nhưng khi hình thành cơ quan sinh sản, hoặc tại các
bộ phận bị thương tổn có thể hình thành vách ngăn nhưng không phải là thành phần
phân loại.

Sợi nấm có vách ngăn là cơ thể đa bào. Mỗi tế bào có 1 nhân hoặc nhiều nhân.
Tuy nhiên sợi nấm vẫn không phải do nhiều tế bào hợp thành mà là do các vách


10

ngăn tách sợi nấm ra thành nhiều tế bào. Vách ngăn ngang được hình thành từ thành
tế bào: lúc đầu là một gờ nhỏ hình khuyên, sau đó tiến dần vào trong và lấp kín lại.
Tuy nhiên vách ngăn thường có 1 hay nhiều lỗ thủng, các lỗ có kích thước bằng
nhau hay có 1 lỗ lớn nhất ở giữa và nhiều lỗ nhỏ ở xung quanh.


Đặc điểm nấm sợi RNM
Biển chiếm ¾ diện tích bề mặt trái đất, với 97% lượng nước và là môi trường

sinh quyển quan trọng cho sự đa dạng sinh vật. Và không chỉ rộng lớn mà biển còn
là MT rất giàu dinh dưỡng, thành phần chất khoáng thích hợp cho nhiều loài sinh
vật, trong đó có NS.
Nấm sợi đã được phân lập từ nhiều nguồn cơ chất khác nhau từ biển như: trên
xác sinh vật, gỗ, trầm tích, cát, trong nước hoặc từ thực vật biển. Nhiều loài được
biết từ các nghiên cứu trầm tích RNM và biển. Nấm sợi có nguồn gốc từ biển được
tìm thấy nhiều nhất thuộc các chi Aspergillus, Cladosporium, Fusarium,
Gliocladium,

Microsphaeriopsis,

Paecilomyces,

Penicillium,

Phomopsis,

Trichoderma và Ulocladium. Chúng được phát hiện với số lượng lớn từ nhiều khu
vực khác nhau: 617 chủng từ các rạn san hô, 1000 chủng từ trầm tích biển, 800
chủng từ thực vật rừng ngập mặn và 1743 từ nhiều nhóm sinh vật biển. Nhiều trong
số các chủng này đã được định danh và nhiều chủng chỉ có thể được xác định đến
chi [35].
Nấm biển đã được chứng minh là nguồn cung cấp các sản phẩm sinh học tự
nhiên phong phú. Do điều kiện MT biển đặc trưng như: độ mặn, dinh dưỡng, áp
suất thẩm thấu cao hơn, sự thay đổi nhiệt độ, cạnh tranh với các vi khuẩn, virus và
các loại nấm khác, nên chúng có thể đã phát triển những con đường trao đổi chất
thứ cấp đa dạng hơn so với các loại nấm trên đất. Một số CKS đã được phát hiện ra
từ việc phân lập NS nước mặn, chúng có những hoạt động dược lý như: kháng
virus, kháng khuẩn và kháng khối u. Chẳng hạn như cytoglobosins và halovirs đã
được phân lập từ nấm biển. Những công trình nghiên cứu gần đây trên NS biển phát
hiện ra nhiều chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học với tiềm năng to lớn,
như là một nguồn thuốc mới trong thời gian sắp tới [35].


11

Nấm biển đã trở thành một hệ sinh thái, và chúng không phải là một nhóm phân
loại độc lập. Được gọi là nấm biển khi chúng chỉ sinh trưởng, phát triển và sinh bào
tử trong MT nước biển, và bào tử của chúng có khả năng nẩy mầm trong nước biển.
Bên cạnh đó, còn có nhóm nấm biển tùy ý, chúng từ MT nước ngọt hoặc trên mặt
đất, và đã trải qua sự thích nghi sinh lý cho phép chúng phát triển và có thể cũng
sinh bào tử trong MT biển [35].
Ở Việt Nam thời gian gần đây, việc nghiên cứu VSV nói chung và NS nói riêng
có nguồn gốc từ nước mặn cũng đã dành được nhiều sự quan tâm.
1.2.2. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên khả năng sinh CKS từ nấm sợi

Hình thức dinh dưỡng của NS là dị dưỡng hoại sinh, phân giải xác sinh vật, các
nguồn chất hữu cơ để lấy chất dinh dưỡng. Môi trường dinh dưỡng có chứa các yếu
tố hữu cơ, vô cơ, vitamin cùng với sự cân bằng pH, nhiệt độ, thông khí và thời gian
là những yếu tố quan trọng cho sự phát triển của NS được sử dụng để sản xuất các
chất chuyển hóa thứ cấp. Tất cả các yếu tố này khảo sát MT nuôi cấy thích hợp cho
VSV . Trong đó, khi một yếu tố thay đổi sẽ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của NS,
thay đổi các chức năng sinh lí, sinh hóa của chúng, từ đó sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả
nuôi cấy [14], [11], [13] .
 Nguồn dinh dưỡng carbon
Nấm sợi có thể sử dụng nhiều nguồn carbon rất khác nhau để làm nguồn nguyên
liệu cho xây dựng cấu trúc tế bào và cung cấp nguồn năng lượng cho hoạt động
sống.
Tuy nhiên, để thực hiện các quá trình sinh lí khác nhau, NS có nhu cầu về từng
loại nguồn carbon khác nhau. Như loại này thích hợp cho sự hình thành hệ sợi nấm
nhưng chưa hẳn đã phù hợp cho sự hình thành cơ quan sinh sản hoặc khả năng tổng
hợp các chất tổng hợp thứ cấp. Ví dụ như sự tổng hợp lovastatin, một chất chuyển
hóa thứ cấp từ Aspergillus terreus, là chất ức chế mạnh nhất của quá trình tổng hợp
cholesterol, thường chỉ sử dụng glucose như một nguồn carbon chính, nhưng thay
thế bằng glycerol thì lượng lovastatin tăng lên đến 30% [5], [31].


12

Trong quá trình nuôi cấy P. chrysogenum, nếu chỉ sử dụng glucose làm nguồn
dinh dưỡng carbon thì lượng penicillin tối đa được tạo thành sau 50 giờ, và sản
lượng penicillin sẽ thấp hơn. Khi chỉ sử dụng lactose thì sản lượng penicillin tăng
lên, lượng penicillin đạt mức độ tối đa ở 150 giờ hoặc 160 giờ. Do đó, trong công
nghiệp sản xuất penicillin người ta sử dụng cả đường glucose và lactose, giúp đảm
bảo tốc độ sinh trưởng của NS và sản lượng penicillin cao [21].
Để đánh giá nguồn carbon thích hợp cho NS, có nhiều tiêu chí để chọn khác

nhau: mức độ tăng trưởng của hệ sợi, mức độ hình thành tối đa số lượng bào tử hay
mức độ tích lũy tối đa của chất chuyển hóa. Trong nhiều trường hợp, nguồn carbon
thích hợp cho sinh trưởng nhưng lại không phù hơp với sự tổng hợp các chất
chuyển hóa.
 Nguồn dinh dưỡng nitơ
Tùy mỗi chủng NS mà nguồn nitơ thích hợp cho mục đích nuôi cấy cũng khác
nhau. NS thường có khả năng sử dụng đa dạng các nguồn nitơ như: nguồn nitơ hữu
cơ hoặc nguồn nitơ vô cơ hoặc đồng thời cả hai.
Nhiều loại NS có khả năng đồng hóa cả muối amon lẫn nitrat hoặc chỉ thích hợp
sử dụng muối amon hơn nitrat hoặc thích hợp muối nitrat hơn muối amon. Đôi khi
có loại NS không thể sinh trưởng trên MT chứa nguồn muối amon, nguyên nhân là
do sau khi đồng hóa các gốc NH 4 +, trong môi trường sẽ tích lũy các anion vô cơ làm
hạ pH xuống rất thấp. Ngược lại với các muối amon, nitrat là muối có tính kiềm
sinh lí, sau khi NS đồng hóa gốc NO 3 - trong môi trường sẽ tích lũy các cation làm
tăng rõ rệt pH của môi trường.
 Nồng độ muối môi trường nuôi cấy
Một yếu tố được quan tâm nhất trong khảo sát NS khu vực nước mặn đó là khả
năng chịu mặn. Nồng độ muối ảnh hưởng chủ yếu đến áp suất thẩm thấu, khả năng
trao đổi chất của tế bào VSV… Tùy theo nguồn gốc của NS, vị trí của khu vực lấy
mẫu mà nồng độ muối là khác nhau. Như ở khu vực RNM Cần Giờ, tuy là giáp biển
nhưng nồng độ muối ở đây biến thiên rất rộng từ 0.4% - 2.4%, do diện tích rừng trãi