khảo sát môi trường và điều kiện nuôi cấy tạo rễ in vitro của cây đương quy nhật bản (angelica acutiloba kitagawa)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN LÊ ANH THƯ

KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN
NUÔI CẤY TẠO RỄ IN VITRO CỦA
CÂY ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN
(Angelica acutiloba Kitagawa)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN LÊ ANH THƯ

KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN
NUÔI CẤY TẠO RỄ IN VITRO CỦA
CÂY ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN
(Angelica acutiloba Kitagawa)

Chuyên ngành: Sinh Học Thực Nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS. TS. NGUYỄN THỊ QUỲNH

Thành phố Hồ Chí Minh – 2012


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng đề tài này là do chính tôi thực hiện, các số liệu,
hình ảnh thí nghiệm được thu thập và phân tích trong đề tài này là trung thực,
đề tài này không trùng với bất kỳ công trình nghiên cứu khoa học nào. Các số
liệu và tài liệu tham khảo hoặc trích dẫn trong luận văn tôi đều chú thích nguồn
tham khảo rõ ràng, chính xác.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 3 năm 2012
Học viên thực hiện

Nguyễn Lê Anh Thư


LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian học tập, nghiên cứu thực hiện đề tài, ngoài sự phấn đấu, nổ lực
bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự động viên, khích lệ rất lớn từ nhà trường,
thầy cô, gia đình và bạn bè.
Trước hết, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến PGS. TS Nguyễn Thị Quỳnh đã
dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và giúp em hoàn thành
luận văn tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Lê Thị Trung đã hết lòng giúp đỡ và tạo điều
kiện cho em hoàn thành luận văn.
Em xin cảm ơn quý thầy cô ở khoa Sinh, Phòng sau đại học của trường Đại
học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh, Đại học Khoa Học Tự nhiên, quý lãnh đạo
Sở Nội vụ Thành phố Cần Thơ, Sở Giáo dục Đào tạo Thành Phố Cần Thơ và Ban

Giám hiệu trường Trung học phổ thông Phan Văn Trị - Thành Phố Cần Thơ đã tạo
điều kiện cho tôi học tập trong suốt thời gian qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Phòng Công
Nghệ Tế Bào Thực Vật – Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Phòng Thí nghiệm Trọng điểm
phía Nam về công nghệ tế bào thực vật nơi tôi thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn chị Vân, các bạn Như Hiến, Ngọc Nhung, Minh
Duy, Phước Hạnh, Quỳnh Giao, Phương Duyên và “bé Cọp” Nguyễn Thanh Hoài
đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận văn tại Viện Sinh học nhiệt
đới. Tôi xin cảm ơn các bạn ở Phòng Sinh lý thực vật – Trường Đại học Sư Phạm
TPHCM, chị Domres, bé Hằng, bé Thanh đã không ngừng động viên, giúp đỡ tôi
trong thời gian qua.
Tôi xin cảm ơn tất cả, gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, giúp đỡ
tôi trong suốt thời gian học tập.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 3 năm 2012
NGUYỄN LÊ ANH THƯ


MỤC LỤC
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục hình ảnh
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 2
1.1.

Giới thiệu về cây Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba (Siebold &
Zuccarini) Kitagawa ......................................................................................... 3

1.1.1.

Phân loại .........................................................................................................3

1.1.2.

Đặc điểm hình thái .........................................................................................3

1.1.3.

Đặc điểm phân bố, sinh thái ...........................................................................5

1.1.4.

Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học .....................................................5

1.1.5.

Tính vị và công dụng dược lý ........................................................................6

1.2.

Tình hình nghiên cứu về cây Đương quy Nhật bản trên thế giới và trong
nước .................................................................................................................. 7

1.2.1.

Trên thế giới ...................................................................................................7

1.2.2.

Trong nước .....................................................................................................8

1.3.

Sự phát sinh rễ ở thực vật và hình thái các loại rễ .......................................... 8

1.3.1.

Rễ trụ ..............................................................................................................8

1.3.2.

Rễ chùm .........................................................................................................9

1.3.3.

Rễ biến dạng...................................................................................................9

1.3.4.

Rễ bất định ...................................................................................................10

1.4.

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật.......................................................................... 13

1.4.1.

Lược sử nuôi cấy mô, tế bào thực vật ..........................................................13

1.4.2.

Nuôi cấy in vitro tạo rễ bất định ..................................................................14

1.5.

Auxin và cytokinin – các chất điều hoà sinh trưởng thực vật thường
dùng trong nuôi cấy tạo rễ .............................................................................. 15

1.5.1.

Auxin ............................................................................................................15


1.5.2.

Cytokinin ......................................................................................................16

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1.

Vật liệu ..............................................................................................................

2.1.1.

Nguồn mẫu ban đầu .....................................................................................19

2.1.2.

Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ....................................................................19

2.1.3.

Một số hóa chất dùng trong thí nghiệm .......................................................20

2.1.4.

Giá thể và môi trường nuôi cấy....................................................................20

2.2.
2.2.1.

Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 21
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật

đến sự hình thành rễ bất định ở mẫu cấy phiến lá và cuống lá của cây Đương quy
Nhật Bản nuôi cấy in vitro ........................................................................................21
2.2.2.

Thí nghiệm 2: Sự phát sinh rễ từ mẫu cấy phiến lá và cuống lá ở các vị trí

khác nhau của cây Đương quy Nhật Bản in vitro dưới sự ảnh hưởng của thành phần
khoáng và vitamin trong môi trường nuôi cấy ..........................................................26
2.2.3.

Thí nghiệm 3: Vai trò của cytokinin lên sự tạo rễ bất định trên mẫu cấy

phiến lá và cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản in vitro .....................................29
2.2.4.

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của đường lên sự tạo rễ bất định ở phiến lá và

cuống lá cây Đương quy Nhật Bản in vitro ..............................................................33
2.3.

Phương pháp tính số liệu ................................................................................ 36

2.3.1.

Tỷ lệ mẫu chết (%) .......................................................................................36

2.3.2.

Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) ............................................................................36

2.3.3.

Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) ....................................................................................37

2.3.4.

Số rễ/mẫu .....................................................................................................37

2.3.5.

Chiều dài rễ/mẫu ( mm) ...............................................................................37

2.3.6.

Trọng lượng tươi rễ/mẫu (mg) .....................................................................37

2.3.7.

Trọng lượng tươi mẫu (mg) .........................................................................37

2.3.8.

Trọng lượng khô rễ/mẫu (mg)......................................................................38

2.3.9.

Trọng lượng khô mẫu (mg) ..........................................................................38

2.3.10. Trọng lượng tươi rễ / trọng lượng tươi mẫu ................................................38

18


2.3.11. Trọng lượng khô rễ/trọng lượng khô mẫu ...................................................38
2.3.12. Phần trăm chất khô của rễ (%) .....................................................................38
2.4.

Phương pháp giải phẫu quan sát sự phát sinh hình thái ................................. 39

2.5.

Phương pháp thống kê .................................................................................... 39

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 40

3.1.

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực
vật đến sự hình thành rễ bất định ở mẫu cấy phiến lá và cuống lá của
cây Đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro ................................................... 41

3.1.1.

Kết quả .........................................................................................................41

3.1.2.

Thảo luận......................................................................................................53

3.2.

Thí nghiệm 2: Sự phát sinh rễ từ mẫu cấy phiến lá và cuống lá ở các vị
trí khác nhau của cây Đương quy Nhật Bản in vitro dưới sự ảnh hưởng
của thành phần khoáng và vitamin trong môi trường nuôi cấy...................... 57

3.2.1.

Kết quả .........................................................................................................57

3.2.2.

Thảo luận......................................................................................................68

3.3.

Thí nghiệm 3: Vai trò của cytokinin lên sự tạo rễ bất định trên mẫu cấy
phiến lá và cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản in vitro .......................... 72

3.3.1.

Kết quả .........................................................................................................72

3.3.2.

Thảo luận......................................................................................................83

3.4.

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của đường lên sự tạo rễ bất định ở phiến lá
và cuống lá cây Đương quy Nhật Bản in vitro ............................................... 85

3.4.1.

Kết quả .........................................................................................................85

3.4.2.

Thảo luận......................................................................................................88

3.5.

Quan sát hình thái ........................................................................................... 90

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 92
4.1.

Kết luận .......................................................................................................... 93

4.2.

Đề nghị ........................................................................................................... 93

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 94
PHỤ LỤC


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ANOVA

: Analysis of variance (Phân tích phương sai)

BA

: N6–benzyladenine

B5

: Môi trường nuôi cấy mô thực vật do Gamborg và cộng sự đề xuất
(1968)

CĐHSTTV : Chất điều hoà sinh trưởng thực vật
cs

: cộng sự

CV

: Coefficient of variation (hệ số biến thiên)

EDTA

: Acid ethylen diamine tetra acetic

IBA

: acid indol-3-butyric

Kinetin

: 6-furfurilaminopurin

MS

: Môi trường nuôi cấy mô thực vật do Murashige và Skoog đề xuất
(1962)

ms

: mô sẹo

NAA

: acid α – naphtalenacetic (α – NAA)

NXB

: Nhà xuất bản

TDZ

: Thidiazuron (N-phenyl-N’-1,2,3-thidiazol-5-ylurea)

TLT

: Trọng lượng tươi

TLK

: Trọng lượng khô

V

: thể tích

%CK

: phần trăm chất khô


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1.

Bố trí thí nghiệm1a ........................................................................... 22

Bảng 2.2.

Bố trí thí nghiệm 1b .......................................................................... 24

Bảng 2.3.

Bố trí thí nghiệm 2a .......................................................................... 26

Bảng 2.4.

Bố trí thí nghiệm 2b .......................................................................... 28

Bảng 2.5.

Bố trí thí nghiệm 3a .......................................................................... 30

Bảng 2.6.

Bố trí thí nghiệm 3b .......................................................................... 32

Bảng 2.7.

Bố trí thí nghiệm 4a .......................................................................... 34

Bảng 2.8.

Bố trí thí nghiệm 4b .......................................................................... 35

Bảng 3.1.

Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên sự tạo rễ bất định trên mẫu

cấy phiến lá của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42........................................ 44
Bảng 3.2.

Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên sự tạo rễ bất định ở mẫu cấy

cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42. ............................................ 51
Bảng 3.3.

Ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin lên tỷ lệ mẫu

tạo rễ, số rễ/mẫu, chiều dài rễ/mẫu và TLT, TLK của rễ đối với mẫu cấy
phiến lá ở các vị trí khác nhau của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42. .......... 58
Bảng 3.4.

Ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin và vị trí mẫu

cấy của cây Đương quy Nhật Bản lên TLT, TLK mẫu, tỷ lệ TLT rễ/TLT
mẫu, TLK rễ/TLK mẫu và % chất khô rễ ở ngày thứ 42. ........................................ 61
Bảng 3.5.

Ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin lên tỷ lệ mẫu

tạo rễ, số lượng rễ/mẫu và chiều dài rễ/mẫu đối với mẫu cấy cuống lá ở các
vị trí khác nhau của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 .................................. 64
Bảng 3.6.

Ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin lên TLT mẫu,

TLK mẫu và tỷ lệ về TLT rễ/TLT mẫu, TLK rễ/TLK mẫu và % chất khô rễ

của cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42. ...................................... 67
Bảng 3.7.

Ảnh hưởng của cytokinin lên tỷ lệ mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu và

chiều dài rễ bất định trên mẫu cấy phiến lá của cây Đương quy Nhật Bản ở
ngày thứ 42

........................................................................................................... 74


Bảng 3.8.

Ảnh hưởng của cytokinin lên TLT và TLK ở rễ và mẫu của

mẫu cấy phiến lá cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 ...................................... 77
Bảng 3.9.

Ảnh hưởng của cytokinin đến tỷ lệ mẫu tạo rễ và chiều dài

rễ/mẫu, TLT và TLK rễ ở mẫu cấy cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản
ngày thứ 42

........................................................................................................... 79

Bảng 3.10.

Ảnh hưởng của cytokinin đến TLT và TLK của rễ và mẫu cấy

cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 ............................................. 81

Bảng 3.11.

Ảnh hưởng của đường lên sự hình thành mô sẹo và rễ bất định

ở mẫu cấy phiến lá cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 25 ................................... 86
Bảng 3.12.

Ảnh hưởng của đường lên sự hình thành mô sẹo và rễ bất định

ở mẫu cấy cuống lá cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 25 .................................. 88


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1.

Cây Đương quy Nhật Bản ................................................................... 3

Hình 1.2.

Cây Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba Kitagawa) ................ 4

Hình 1.3.

Rễ trụ, rễ chùm và cấu trúc của rễ....................................................... 9

Hình 1.4.

Các loại rễ biến dạng ........................................................................... 9

Hình 1.5.

Sự phát sinh rễ phụ ở Lilium sp. ....................................................... 10

Hình 1.6.

Các loại rễ bất định ........................................................................... 12

Hình 1.7.

Rễ bất định từ mô sẹo rễ Sâm Ngọc linh ......................................... 15

Hình 1.8.

Các loại cytokinin tổng hợp thường dùng ......................................... 17

Hình 2.1.

Chồi và mẫu cấy phiến lá ban đầu .................................................... 21

Hình 2.2.

Mẫu cấy phiến lá trong bình ............................................................. 23

Hình 2.3.

Mẫu cấy cuống lá ban đầu................................................................. 23

Hình 2.4.

Mẫu cấy cuống lá trong bình............................................................. 25

Hình 3.1.

Sự hình thành mô sẹo và rễ bất định ở mẫu cấy phiến lá của

cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42. ......................................................... 41
Hình 3.2.

Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên khả năng tạo mô sẹo ở mẫu

cấy phiến lá của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42. .............................. 42
Hình 3.3.

Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên TLT và TLK ở mẫu cấy phiến

lá của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 ............................................... 46
Hình 3.4.

Ảnh hưởng của auxin (NAA và IBA) và kinetin lên sự hình

thành mô sẹo và rễ bất định ở mẫu cấy cuống lá của cây Đương quy
Nhật Bản ngày thứ 42. ...................................................................................... 48
Hình 3.5.

Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên khả năng tạo mô sẹo ở mẫu

cấy cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42. ............................. 49
Hình 3.6.

Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên TLT và TLK ở mẫu cấy cuống

lá của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42. .............................................. 52
Hình 3.7.

Rễ và lông hút trên mẫu cấy phiến lá (a) và cuống lá (b) ở cây

Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42. ............................................................... 53


Hình 3.8.

Ảnh hưởng của thành phần khoáng, vitamin lên mẫu cấy

phiến lá ở các vị trí khác nhau đến khả năng sống và hình thành mô sẹo
của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42. .................................................. 57
Hình 3.9.

Ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin trên trong môi

trường nuôi cấy lên sự hình thành rễ ở các vị trí khác nhau của phiến lá
của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 . ................................................ 60
Hình 3.10.

Ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin lên mẫu cấy

cuống lá ở các vị trí khác nhau đến khả năng tạo mô sẹo của cây Đương
quy Nhật Bản ở ngày thứ 42............................................................................. 63
Hình 3.11.

Ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin trong môi

trường nuôi cấy lên sự hình thành rễ ở các vị trí khác nhau của mẫu cấy
cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản. ........................................................... 66
Hình 3.12.

Sự hình thành mô sẹo và tạo rễ bất định ở mẫu cấy phiến lá và

cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản in vitro ở ngày thứ 42. ....................... 72
Hình 3.13.

Ảnh hưởng của cytokinin lên mẫu cấy phiến lá đến khả tạo

mô sẹo của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 ....................................... 73
Hình 3.14.

(a) Rễ thứ cấp và lông hút trên rễ bất định ở mẫu cấy của

nghiệm thức B0,1 và (b) mô sẹo trên mẫu cấy ở nghiệm thức T1 ngày
thứ 42.
Hình 3.15.

.......................................................................................................... 75
Ảnh hưởng của cytokinin đến khả năng hình thành mô sẹo ở

mẫu cấy cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42. ..................... 78
Hình 3.16.

Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên sự hình

thành mô sẹo và rễ bất định ở phiến lá cây Đương quy Nhật Bản ở ngày

thứ 25.
Hình 3.17.

........................................................................................................... 85
Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên sự hình

thành mô sẹo và rễ bất định ở cuống lá cây Đương quy Nhật Bản ở
ngày thứ 42. ..........................................................................................................

87


Hình 3.18.

Mô sẹo ở mẫu cấy phiến lá và cuống lá dưới kính lúp ở

nghiệm thức được nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung 6 mg l-1
IBA kết hợp với 1 mg l-1 kinetin ở ngày nuôi cấy thứ 21. .............................. 90
Hình 3.19.

Hình thái giải phẫu (a) phiến lá và (b) cuống lá quan sát dưới

kính hiển vi sau 21 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 6 mg
l-1 NAA kết hợp với 1 mg l-1 kinetin (nghiệm thức N6K1). ............................. 90
Hình 3.20.

Mẫu cấy phiến lá quan sát dưới kính hiển vi sau 28 ngày nuôi

cấy trên môi trường Gamborg B5 có bổ sung 6 mg l-1 NAA kết hợp với
1 mg l-1 kinetin (nghiệm thức B2) .................................................................... 91

Hình 3.21.

Mẫu cấy cuống lá quan sát dưới kính hiển vi sau 28 ngày nuôi

cấy trên môi trường Gamborg B5 có bổ sung 6 mg l-1 NAA kết hợp với
1 mg l-1 kinetin (nghiệm thức B2) .................................................................... 91


1

MỞ ĐẦU
Cây Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba (Siebold & Zuccarini)
Kitagawa) là cây thuốc quý, đầu vị và không thể thiếu trong y học cổ truyền đối với
việc điều trị bệnh phụ khoa và bồi bổ cơ thể. Tuy nhiên, tập tính sinh trưởng của
cây Đương quy là ở nơi có không khí mát lạnh và ẩm ướt. Điều kiện sinh trưởng
của cây Đương quy không phù hợp ở Việt Nam, việc nhân giống và chế biến cây
Đương quy gặp nhiều khó khăn, đa số phải nhập từ Trung Quốc, Hàn Quốc, Triều
Tiên, Nhật Bản dẫn đến giá thành các loại cây thuốc quí tăng cao (Phạm Văn Ý,
2000).
Nhu cầu sử dụng và chiết xuất các hợp chất thứ cấp từ các loại thảo dược (như
Nhân sâm, Đương quy) ngày càng tăng theo thời gian, nhưng để thu hoạch rễ cây
Đương quy cần phải mất từ 2 – 3 năm, nhân công lao động và chi phí chăm sóc trên
đồng ruộng cũng làm tăng giá thành sản phẩm lên rất cao (Fukuda và cs, 2009).
Rễ cây Đương quy có chứa rất nhiều hợp chất thứ cấp quan trọng giúp giảm
đau, điều hoà nội tiết, kháng viêm, tăng cường miễn dịch, bồi bổ khí huyết. Kỹ
thuật nuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng mở rộng và tăng khả năng thu
nhận các hợp chất thứ cấp có giá trị trong y dược, gia vị, hương liệu tinh sạch với
hiệu suất cao mà không thể sản xuất từ tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng con
đường hoá học.
Để tạo nguồn sản phẩm sạch, tinh khiết nhằm khai thác được công dụng chữa

bệnh và phục vụ cho việc bào chế dược phẩm từ cây Đương quy, giảm giá thành sản
phẩm, trong đó có rễ cây Đương quy. Vì lí do trên, đề tài: “KHẢO SÁT MÔI
TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TẠO RỄ IN VITRO CỦA CÂY
ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN (Angelica acutiloba Kitagawa)” được thực hiện
nhằm khảo sát khả năng phát sinh rễ in vitro từ các nguồn vật liệu là phiến lá và
cuống lá trên môi trường có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp.


2

CHƯƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU


3

Giới thiệu về cây Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba

1.1.

(Siebold & Zuccarini) Kitagawa
1.1.1.

Phân loại

Theo Nguyễn Bá (2007), cây Đương
quy Nhật Bản được phân loại như sau:
Giới : Plantae

(Thực vật)

Ngành : Magnoliophyta (Thực vật có hoa)
Lớp

: Magnoliopsida (Ngọc lan)

Bộ

: Apiales

(Hoa tán)

Họ

: Apiaceae

(Hoa tán)

Chi

: Angelica

(Bạch chỉ)

Tên khoa học: Angelica acutiloba
(Siebold & Zuccarini) Kitagawa
Tên tiếng Việt

: Đương quy Nhật Bản,

Đông Đương quy
Tên gọi khác

: Yamato Touki (Nhật

Bản); Ribendanggui (Trung Quốc)
Phân bố

Hình 1.1. Cây Đương quy Nhật Bản
( />
: được tìm thấy ở các đảo Honshu và Shikoku (Nhật Bản)

Số lượng nhiễm sắc thể: 2n = 22
1.1.2.

Đặc điểm hình thái

Cây Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) là loài thực vật sống lâu năm,
thân thảo lớn, cây cao 40 – 80 cm, có thân hình trụ, rãnh dọc màu tím, 5 – 7 ngấn,
các ngấn đều có thể mọc thành mầm cành con, hình thành cá thể nhiều cành nhánh.
Thân chia thành thân sinh dưỡng và thân hoa. Thân sinh dưỡng chỉ tồn tại ở thời kì
sinh trưởng sinh dưỡng. Thân rất ngắn, chưa có sự phân hoá của các ngấn thân,


4

cũng chưa phân cọng rõ ràng. Lá mọc so le, xẻ lông chim 3 lần; cuống dài 10 – 30
cm, có bẹ ngắn, dạng máng ôm lấy thân; lá chét phân thùy hình mác dài 2 – 7 cm,
rộng 1 – 3 cm, phía dưới có cuống ngắn hoặc không cuống, các thùy lại phân nhỏ,

gốc hình nêm, đầu nhọn, mép có răng to sắc, lá ở phía ngọn tiêu giảm. Rễ có mùi
hương đặc biệt, rễ 3 năm tuổi được thu hoạch vào mùa thu và mùa đông và được
đem phơi hoặc sấy khô để bảo quản. Cây cho hoa và hoa nở 1 lần từ tháng 6 – 8
hàng năm, cụm hoa tán kép gồm 25 – 40 tán nhỏ dài ngắn không đều; tổng bao và
tiểu bao giống nhau, có lá bắc dạng sợi, hoa nhỏ màu trắng hay lục nhạt, 5 cánh lõm
ở đầu, 5 nhị, bầu hình chóp ngược, có gân lồi, cuống dài. Quả bế đôi hơi dẹt, có
cạnh và gân lồi, gân ở mép rộng dạng cánh, rìa màu tím nhạt (Đỗ Huy Bích và cs,
2004).

Hình 1.2. Cây Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba Kitagawa)
a: Cây 1 năm tuổi; b: hoa; c: lá; d: rễ thành phẩm
/> /> />yNo=15&viewDate=¤tPage=1&listtype=0,
/>

5

1.1.3.

Đặc điểm phân bố, sinh thái

Chi Angelica phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới Bắc bán cầu và New Zealand.
Việt Nam đã nhập giống cây Đương quy Trung Quốc Angelica sinensis (Oliv.)
(Diels.) (1960), Đương quy Triều Tiên Angelica uchyamana Yabe (1978) và gần
đây là Đương quy Nhật Bản Angelica acutiloba Kit. (1996). Giống cây Đương quy
Trung Quốc hiện không còn, hai giống còn lại vẫn đang được trồng ở các tỉnh Hà
Giang, Lào Cai, xung quanh Hà Nội (Đỗ Huy Bích và cs 2003). Cây Đương quy ưa
khí hậu ẩm mát, đến mùa đông toàn bộ phần trên mặt đất tàn lụi, phần củ dưới mặt
đất chịu đựng được băng tuyết và sẽ mọc lại vào mùa xuân năm sau. Cây Đương
quy trồng ở Việt Nam thường cũng phải lựa chọn thời vụ, sao cho mùa gieo hạt và
sinh trưởng của cây trùng với thời gian có nhiệt độ thấp trong năm (Phạm Văn Ý,

2000).
1.1.4.
1.1.4.1.

Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
Thành phần tinh dầu

Ở rễ có ligustilide, n – butylphtalide, n – butylidenphtalide, cnidilide, p –
cymen. Trong lá cây Đương quy Nhật Bản trồng ở Thanh Trì (Hà Nội), tinh dầu có
chứa ligustilid, γ – terpinen, mycren, β – ocimen, limonen, caryophylen oxyde.
Trong lá cây Đương quy Nhật Bản trồng ở Thái Nguyên chứa tinh dầu với thành
phần chính là p. cymen, γ – terpinen (Fukuda và cs, 2009). Tinh dầu trong cây
Đương quy Nhật Bản có tác dụng ức chế sự co tử cung, làm giảm sự căng tử cung,
từ đó hạn chế cơn đau bụng do kinh nguyệt. Ligustilide ở rễ có tác dụng chống hen,
chống co thắt khí quản (Đỗ Huy Bích và cs, 2004).
1.1.4.2.

Glucid

Chủ yếu là glucose, sucrose (40%) và có polysaccharide (khoảng 8%) có tác
dụng điều tiết hệ miễn dịch. Thành phần polysaccharide của cây Đương quy Nhật
Bản có độ an toàn cao, hầu như không độc, tăng cường khả năng miễn dịch của
hạch, chống lại sự phát triển của tế bào ung thư, nâng cao số lượng tế bào lympho T
(Kumazawa và cs, 1982).


6

1.1.4.3.

Các loại acid hữu cơ

Các nghiên cứu cho thấy trong cây Đương quy Nhật Bản có chứa acid ferulic
có hoạt tính chống oxi hoá rất mạnh, có thể loại hết gốc tự do, điều tiết cơ chế sinh
lý cơ thể con người, hạn chế sự tạo dung môi của phần gốc tự do. Mặt khác, acid
ferulic còn có thể hạn chế kết tụ tiểu cầu máu, hạn chế acid amin gốc –OH, hạn chế
nguy cơ tổn hại gan đồng thời phòng tránh xơ cứng động mạch (Lê Kim Loan và cs,
1998; Nguyễn Gia Chấn và cs, 1998).
1.1.4.4.

Một số thành phần khác

Trong cây Đương quy Nhật Bản chứa hơn 23 nguyên tố vô cơ, trong đó có 16
loại cần thiết cho cơ thể con người. Tuy nhiên, do vùng đất trồng khác nhau, hàm
lượng nguyên tố vô cơ cũng có sự khác nhau. Ngoài ra còn có coumarin như
umbeliferon, scopoletin, xanthotoxin, isopimpinelin, bergapten; 17 loại acid amin
trong đó có 7 loại mà cơ thể con người không tự tổng hợp được; polyacetylen như
falcarinol, falcarindiol, falcarinolon và các hợp chất sterol (Nguyễn Gia Chấn và cs,
1998).
1.1.5.

Tính vị và công dụng dược lý

 Tính vị: vị ngọt, hơi đắng, hơi cay, mùi thơm, tính ấm.
 Công dụng dược lý:
Cây Đương quy Nhật Bản cung cấp một vị thuốc dùng rất phổ biến trong y học
phương đông và là vị thuốc đầu vị trong thuốc chữa bệnh phụ nữ, bồi bổ cơ thể và trị
bệnh thiếu máu, suy tim, mệt mỏi, đau đầu, lưng, ngực và bụng. Ngoài ra, cây Đương
quy còn được dùng làm thuốc giảm đau, chống co giật, làm ra mồ hôi, kích thích ăn
ngon. Các hợp chất thứ cấp trong cây Đương quy Nhật Bản di thực trồng ở Việt

Nam có hoạt tính trên chức năng nội tiết sinh dục kiểu oestrogen và progesteron
yếu. Rễ và hạt gây tăng trương lực và biên độ co bóp tử cung. Rễ có tác dụng tăng
lực, tăng sức đề kháng với ammoni clorid, chống viêm cấp tính và mãn tính; có tác
dụng gây trấn tĩnh, giảm đau đói, giải nhiệt, chống viêm, làm giảm khả năng đông
máu; điều kinh, nhuận tràng; và kích thích miễn dịch, gây hoạt hoá tế bào lymphô B


7

và T, làm tăng sản sinh kháng thể. Cây Đương quy Nhật Bản và cây Nhân sâm,
được thử nghiệm dưới dạng cao chiết với nước nóng, thể hiện hoạt tính điều hoà
miễn dịch. Độc tính cấp tính của rễ và hạt Đương quy rất thấp và rễ có độc tính cấp
tính thấp hơn so với hạt. (Đỗ Huy Bích và cs, 2004).

Tình hình nghiên cứu về cây Đương quy Nhật bản trên thế giới và

1.2.

trong nước
1.2.1.

Trên thế giới

Kumazawa và cs (1982) đã tiến hành ly trích polysaccharide có trong dịch
trích của rễ cây Đương Quy Nhật Bản và nhận thấy rằng nó có khả năng kích thích
hệ thống miễn dịch của cơ thể.
Trong dân gian, cây Đương quy thường được trồng bằng hạt. Tuy nhiên, hạt
chỉ có thể thu hoạch được vào một thời gian nhất định trong năm và sức nảy mầm
của hạt giảm nhanh chóng sau một thời gian ngắn. Wanatabe và cs (1998) đã khảo
sát khả năng tạo cụm chồi từ nuôi cấy chồi ngọn cây Đương quy Nhật Bản

(Angelica acutiloba Kitagawa) trên môi trường MS có bổ sung NAA và Kinetin để
tạo nguồn vật liệu nghiên cứu nhận dạng hình thái DNA. Nalawade và Tsay (2004)
đã nghiên cứu nuôi cấy, nhân giống in viro cây Đương quy Trung Quốc (Angelica
sinensis) thông qua việc tạo phôi soma.
Ninh Thị Phíp và cs (2006) đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của việc chọn hạt dựa
trên trọng lượng và trọng lực cụ thể lên tỷ lệ nảy mầm và phát triển của hạt cây
Đương Quy Nhật Bản. Ninh Thị Phíp và cs (2007) đã nghiên cứu sự nảy mầm của
hạt và ảnh hưởng của nồng độ dung dịch dinh dưỡng trong hai hệ thống khí canh và
thủy canh lên sự phát triển của cây Đương Quy Nhật Bản ngoài vườn ươm. Hệ
thống khí canh giúp cây phát triển tốt hơn, tuy nhiên, do rễ thứ cấp là nguyên liệu
thô dùng làm thuốc tại Việt Nam, nên hệ thống thủy canh được xem như là thích
hợp hơn vì hệ rễ thứ cấp phát triển trong hệ thống thủy canh tốt hơn. Ninh Thị Phíp
và cs (2009) đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc xử lý hạt bằng gibberellin (GA 3 ),


8

kinetin và nhiệt độ đến sự nảy mầm và sinh trưởng của cây con Angelica acutiloba
Kitagawa.
1.2.2.

Trong nước

Về nghiên cứu thành phần hoá học của cây Đương quy Nhật Bản, đã có nhiều
công trình về xác định hàm lượng tinh dầu và công dụng dược lý (Lê Kim Loan và
cs, 1998; Nguyễn Gia Chấn và cs 1998). Một số nghiên cứu nội bộ tại Viện Dược
liệu, Hà Nội, đã xác định lại đúng tên khoa học và thành phần dược liệu của cây
Đương quy Nhật Bản là Angelica acutiloba Kitagawa tại Việt Nam.
Nguyễn Thị Quỳnh và cs (2011), tại Viện Sinh học Nhiệt đới đã nuôi cấy lớp
mỏng chồi đỉnh cây Đương quy Nhật Bản trên môi trường MS (Murashige và

Skoog, 1962) có bổ sung vitamin B5 (Gamborg và cs, 1968) bổ sung 10% (v/v)
nước dừa và 40 mg l-1 adenin cho số lượng chồi tăng rõ rệt sau 42 ngày nuôi cấy.
Nguyễn Vũ Ngọc Anh và cs (2011), tại Viện Sinh học Nhiệt đới đã nuôi cấy
phiến lá trên môi trường có thành phần khoáng và vitamin B5 có bổ sung 10 mg l-1
NAA thu được rễ to, ngắn, nhiều lông hút, tỷ lệ tạo rễ cao, số lượng rễ/mẫu cao,
TLT và TLK của rễ cao sau 42 ngày nuôi cấy.

Sự phát sinh rễ ở thực vật và hình thái các loại rễ

1.3.

Rễ là cơ quan sinh dưỡng nằm dưới đất của cây, có nhiệm vụ chủ yếu là hút
nước và muối khoáng hoà tan trong nước để chuyển lên các cơ quan trên mặt đất
(thân và lá). Rễ giữ chặt cây vào đất, dự trữ chất dinh dưỡng, ở một số ít loài, rễ
cũng tham gia vào việc sinh sản sinh dưỡng (Trương Thị Đẹp, 2007).
1.3.1.

Rễ trụ

Theo Nguyễn Bá (2007), rễ trụ là đặc trưng cho các cây hai lá mầm gồm có rễ
chính và rễ phụ. Rễ chính hay rễ cấp một của thực vật có hạt phát triển từ mô phân
sinh tận cùng của đỉnh rễ phôi. Rễ bên hay rễ phụ là rễ thứ cấp từ rễ chính phân
nhánh thành rễ cấp hai, rễ cấp ba... Rễ chính và các rễ bên hợp thành hệ rễ trụ của
thực vật bậc cao (Hình 1.3)


9

1.3.2.

Rễ chùm

Theo Nguyễn Bá (2007), rễ chùm là đặc trưng cho cây một lá mầm như rễ cây
ở lớp Hành. Rễ đầu tiên tồn tại một thời gian ngắn và sau đó hệ rễ được tạo thành từ
các rễ phát sinh từ mấu thân, phân nhánh và phát triển với mức độ gần giống nhau
nên tương đối đồng đều về kích thước (Hình 1.3).

Hình 1.3. Rễ trụ, rễ chùm và cấu trúc của rễ
/> />
1.3.3.

Rễ biến dạng

Hình 1.4. Các loại rễ biến dạng
/> />

10

Cây phát triển ở những môi trường khác nhau, rễ có thể thay đổi hình dạng và
cấu tạo để thực hiện những chức năng đặc biệt:
1.3.3.1.

Rễ củ

Ở một số cây, rễ phồng to và nạc, chứa chất dự trữ tạo thành rễ củ, đây là dạng
biến đổi của rễ và có sự tham gia của trụ thượng diệp và trụ hạ diệp. Rễ củ có thể
phát triển từ rễ chính, như củ cải, carot hoặc có thể phát triển từ rễ bên, như sắn,
khoai lang (Hình 1.4).
1.3.3.2.

Rễ thở (rễ hô hấp)

Thường gặp ở các cây sống vùng ngập mặn hoặc các cây ở vùng đầm lầy, ở
những nơi rễ khó hấp thụ không khí như cây Bụt mọc (Taxodium distichum), cây
Bần (Someratia), cây Vẹt (Bruguiera). Ở các cây này có những rễ chuyên hóa, ngoi
lên khỏi mặt đất trông như những cái cọc hay mũi chông cắm tua tủa xung quanh
gốc cây. Trên rễ có nhiều lỗ ở phần vỏ để lấy oxy cho các phần rễ nằm dưới nước
hay đất lầy (Hình 1.4).
1.3.4.

Rễ bất định

Hình 1.5. Sự phát sinh rễ phụ ở Lilium sp.
/>
Theo Bùi Trang Việt (2000), rễ bất định phát sinh và phát triển không từ phôi
hợp tử mà từ những bộ phận khác của cây như thân, cuống hoặc lá. Rễ bất định là
loại rễ đặc biệt, thường là kết quả của stress hoặc sự tổn thương. Theo Mai Trần


11

Ngọc Tiếng (2001), rễ bất định là những rễ thường gặp ở thực vật có mạch và được
tạo ra ở nhiều vùng trên cơ thể thực vật. Hình thái giải phẫu có thể chung cho rễ thứ
cấp và rễ bất định, chỉ khác biệt là rễ bất định không xuất hiện từ rễ chính (Hình 1.5
và 1.7)
1.3.4.1.

Rễ chống hay rễ cà kheo

Thường gặp ở các cây ngập mặn ven biển như Đước (Rhizôphra), Dà

(Ceriops). Rễ chống phát triển từ thân, cành mọc tỏa ra thành hình cung rồi cắm
xuống đất làm thành hệ thống chống đỡ cho cây chịu đựng được tác động của sóng,
gió, thủy triều (Hình 1.6)
1.3.4.2.

Rễ cột

Rễ cột mọc ra từ cành đâm thẳng xuống đất, to dần lên và phân nhánh, cắm
chặt vào trong đất như ở Đa (Hình 1.6).
1.3.4.3.

Rễ khí sinh

Rễ khí sinh mọc ra từ thân, rơi thỏng xuống, lơ lửng trong không khí. Những
rễ này thường có màu lục do tế bào chứa nhiều chất diệp lục thường thấy ở nhiều
loài phong lan (Hình 1.6).
1.3.4.4.

Rễ bám

Thường gặp ở một số cây leo, chúng giúp cây bám chắc vào tường, vào giàn
như rễ trầu không, rễ cây sộp (Ficus pumila) (Hình 1.6).
1.3.4.5.

Rễ mút

Rễ của các cây ký sinh hoặc nửa ký sinh, hút thức ăn từ chất hữu cơ có sẵn
trong cây chủ. Các rễ này đâm sâu vào mô mềm và các bó mạnh cây chủ, hút lấy
nước và chất hữu cơ cần thiết như rễ tơ hồng, tầm gửi (Hình 1.6).
1.3.4.6.

Rễ tơ (Hairy root)

Rễ tơ là rễ bất định được hình thành ở gần vị trí nhiễm khuẩn sau khi được
chèn đoạn T – DNA của vi khuẩn Gram âm Agrobacterium rhizogenes Conn. sống
trong đất (Chilton và cs, 1982) (Hình 1.6).


12

Hình 1.6. Các loại rễ bất định
/> /> />32, ,
/>