Tách và tinh chế dẫn xuất curcumin trích ly từ củ nghệ vàng

 

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC




LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC




TÁCH VÀ TINH CHẾ DẪN XUẤT CURCUMIN
TRÍCH LY TỪ CỦ NGHỆ VÀNG
(Curcuma longa L.)





SVTH : NGUYỄN THỊ MẠC PHƯỢNG
CBHD : PGS TS. TRẦN THỊ VIỆT HOA
ThS. PHAN THỊ HOÀNG ANH
KS. LÊ XUÂN TIẾN

TP. HỒ CHÍ MINH, 01/2008
 
Đại học Quốc gia Tp.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐH BÁCH KHOA Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
----------- -- --------------
Số:_______/BKĐK
KHOA: KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN: KỸ THUẬT HỮU CƠ

NHIỆM VỤ LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP
HỌ VÀ TÊN : Nguyễn Thị Mạc Phượng MSSV : 60302187
NGÀNH : Kỹ thuật hữu cơ LỚP : HC03CHC
1. Đầu đề luận án:
Tách và tinh chế các dẫn xuất curcuminoid trích từ củ nghệ vàng Curcuma longa L.
2. Nhiệm vụ:
• Tổng quan về curcuminoid, phương pháp tinh chế,cô lập ba thành phần curcuminoid.
• Tinh chế, cô lập ba thành phần curcuminoid bằng phương pháp kết tinh lại và sắc ký cột.
• Xác định độ tinh khiết của ba thành phần curcuminoid cô l
ập được bằng TLC, điểm chảy,
HPLC.
• Xác định cấu trúc của ba thành phần curcuminoid bằng phổ UV-Vis, MS, NMR.
• Xác định hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH và MDA.
3. Ngày giao nhiệm vụ luận án: 08/2007
4. Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 31/12/2007
5. Họ và tên người hướng dẫn: Phần hướng dẫn
PGS.TS Trần Thị Việt Hoa ……………………………………
ThS. Phan Thị Hoàng Anh ……………………………………
KS. Lê Xuân Tiến ……………………………………

Nội dung và yêu cầu của Luận án tốt nghiệp đã

được thông qua Bộ môn


Ngày………tháng ……năm 2007 Ngày………tháng ……năm 2007
CHỦ NHIỆM BỘ MÔN NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH
(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)




TS. Phan Thanh Sơn Nam ThS. Phan Thị Hoàng Anh

PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN
Người duyệt (chấm sơ bộ):

Đơn vị:

Ngày bảo vệ:

Điểm tổng kết:

Nơi lưu trữ luận án:
 
i 

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn cô Trần Trần Thị Việt Hoa, cô Phan Thị Hoàng Anh, thầy
Lê Xuân Tiến, Bộ môn Kỹ thuật Hữu cơ, đã hướng dẫn tận tình tôi trong suốt quá trình
thực hiện luận văn.
Xin cảm ơn phòng thí nghiệm hữu cơ đã hỗ trợ dụng cụ, máy móc thiết bị và cảm ơn
cô Nguyễn Thị Thu Hương trưởng bộ môn dược lý hóa sinh trường Đại học Y Dượ
c
TP. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình tiến hành thí
nghiệm.
Xin cảm ơn các bạn lớp Hữu cơ 03 đã luôn bên cạnh giúp đỡ, động viên trong thời
gian làm thí nghệm tại trường.
Cảm ơn gia đình và người thân đã động viên và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn
thành luận văn.
TP. Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 01 năm 2008
Xin chân thành cảm ơn
  
 
ii 
 
 
 
 
 
TÓM TẮT LUẬN VĂN

Luận văn này đã tiến hành phân lập ba thành phần curcuminoid có trong bột
curcuminoid thương phẩm và xác định cấu trúc, hoạt tính của chúng.
Các kết quả thu được từ thực nghiệm:
1. Phân lập ba thành phần curcuminoid trong hỗn hợp curcuminoid ban đầu bằng

phương pháp TLC, CC, HPLC.
2. Xác định độ tinh khiết, cấu trúc và một số tính chất hóa học của các
curcuminoid phân lập được.
Khảo sát hoạt tính sinh học của hỗn hợp curcuminoid và ba thành phần curcuminoid
pheo hai phương pháp DPPH và MDA. Kết quả tất cả các mẫu đều có hoạt tính sinh
học trong hai phép thử này.

 
iii 




LỜI MỞ ĐẦU

Từ xa xưa, ở các nuớc Châu Á như Ấn Độ, Trung Quốc và các nuớc Đông Nam Á,
nghệ đã được sử dụng như môt loại gia vị truyền thống và một loại thuốc gia truyền sử
dụng trong gia đình. Nghệ được biết đến là một loại cây có tác dụng dược lý rất tốt
chữa nhiều bệnh khác nhau. Curcuminoid là một hỗn hợp gồm ba dẫn xuất
diferuloylmethane đã
đuợc nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước chứng minh là thành
phần chủ yếu đem lại hoạt tính sinh học của củ nghệ. Hoạt tính của các curcuminoid
thành phần có thể khác nhau và khác với curcuminod hỗn hợp. Do vậy, việc tách các
thành phần này ra khỏi hỗn hợp là cần thiết cho việc nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính
dược học của nghệ.
Nội dung đề tài luận văn này xin trình bày việc tách chiết các curcuminoid thành phần
từ
bột curcuminoid thương phẩm và khảo sát cấu trúc, tính chất hóa học cũng như hoạt
tính kháng oxy hóa của các đơn thành phần, đem đến hiểu biết sâu hơn về curcuminoid
và khả năng ứng dụng các thành phần của curcumioid trong thực phẩm và dược phẩm.

 
iv 
DANH SÁCH CÁC BẢNG SỐ LIỆU
Bảng 1.1. Kết quả khảo sát một số hệ dung môi chạy sắc ký bản mỏng TLC
 
Bảng 1.2. Khối lượng và thành phần hỗn hợp curcuminoid sau 3 lần kết tinh (khối
lượng mẫu ban đầu 500mg
) 
Bảng 1.3. Kết quả tách các curcuminoid từ hỗn hợp bằng cột sắc ký silica gel (khối
lượng mẫu khô nạp lên cột 100mg
) 
Bảng 1.4 Kết quả phổ NMR của các chất curcumin, DMC và BDMC
 
Bảng 2.1. Hỗn hợp phản ứng
 
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát hệ dung môi (trichloromethane:methanol
) 
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát hệ dung môi (dichloromethane:methanol)
 
Bảng 3.3. Kết quả kết tinh curcuminoid thô 3 lần trong hỗn hợp methanol:nước
Bảng 3.4. Kết quả tính diện tích peak, % diện tích peak các curcuminoid thành phần
 
Bảng 3.5. Kết quả cột định lượng hỗn hợp curcuminoid sau kết tinh
 
Bảng 3.6. Kết quả cột định lượng hỗn hợp curcuminoid trong nước cái dưới lọc
 
Bảng 3.7 Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân của curcumin
Bảng 3.8 Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân của DMC
 
Bảng 3.9 Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân của BDMC

 
Bảng 3.10. Hoạt tính bắt gốc tự do của curcumin theo phương pháp DPPH
 
Bảng 3.11. Hoạt tính bắt gốc tự do của curcuminoid ban đầu, DMC và BDMC theo
phương pháp DPPH
Bảng 3.12. Hoạt tính bắt gốc tự do của trolox theo phương pháp DPPH
Bảng 3.13. Giá trị IC
50
của curcuminoid ban đầu, curcumin, DMC và BDMC
 
Bảng 3.14. Hoạt tính bắt gốc tự do của curcuminoid thô, curcumin, DMC và BDMC
theo phương pháp MDA
Bảng 3.15. Hoạt tính bắt gốc tự do trolox theo phương pháp MDA
 
Bảng 3.16. Giá trị IC
50
của curcuminoid ban đầu, curcumin, DMC và BDMC
 
 
v 
DANH SÁCH CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ
Hình 1.1 Cây nghệ
Hình 1.2. Cấu trúc các thành phần của curcuminoid
Hình 1.3. Các đồng phân của curcumin
Hình 1.4. Cấu trúc không gian của curcumin dạng enol và diketone
Hình 1.5. Sự phân ly các proton của curcumin
Hình 1.6. Các trạng thái của curcumin thay đổi theo pH
Hình 1.7. Phản ứng phân hủy curcumin trong môi trường kiềm
Hình 1.8. Cấu trúc phức Cu-curcumin (1:1) và (1:2) giữa đồng acetate và curcumin
Hình 1.9. Sơ đồ biểu hiện hai hướng phản ứng của curcumin với gốc tự do

Hình 1.10. Kết quả HPLC tương ứng của BDMC, DMC và curcumin
Hình 1.11. Kết quả sắc kí bản mỏng TLC, HPLC hỗn h
ợp các curcuminoid, curcumin,
DMC và BDMC và cấu trúc của các curcuminoid xác định được
Hình 1.12. Quá trình hình thành và di căn khối u và tác động của curcumin
Hình 1.13. Cấu trúc các chất 1,7-bis(3,4-dimethoxyphenyl)-1,6-heptadiene3,5-dione,
1,7-bis(4-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione) và 1,7-diphenyl-1,6-heptadiene-
3,5-dione
Hình 1.14. Cơ chế phản ứng đánh bắt gốc tự do của curcumin và các chất tương tự
curcumin không chứa nhóm phenol
Hình 1.15. Cấu trúc hóa học của các hợp chất từ 1 đến 6
Hình 1.16. Cơ chế của curcumin chống lại sự oxy hóa lipid chưa bão hòa (EtLO: ethyl
linoleate, EtLOOH: ethyl linoleate hydroperoxide, EtLOO
•
: gốc ethyl linoleate
hydoperoxyl)
Hình 1.17. Liên kết hydro nội phân tử giữa hydro của nhóm phenol với ortho-methoxy
Hình 2.1. Sơ đồ tiến hành thực nghiệm
Hình 2.2. Bột curcuminoid ban đầu
Hình 2.3. Sắc ký bản mỏng (TLC): (A) Triển khai bản mỏng (B) Cách đo khoảng
cách trên bản mỏng sau khi triển khai để tính giá trị R
f

Hình 2.4. Các bước thực hiện sắc ký cột
Hình 2.5. Dung dịch curcumin, DMC, BDMC dùng để đo phổ UV-Vis
 
vi 
Hình 2.6. Dãy hỗn hợp sau phản ứng
Hình 2.7. Phương pháp định lượng MDA
Hình 3.1. Kết quả TLC của curcumin với hệ dung môi CH

3
Cl:CH
3
OH
Hình 3.2. Kết quả TLC của curcumin với hệ dung môi CH
2
Cl
2
:CH
3
OH
Hình 3.3. Kết quả TLC của các mẫu hỗn hợp curcuminoid ban đầu (M) và hỗn hợp
curcuminoid sau lần kết tinh thứ nhất (I), thứ hai (II) và thứ ba (III)
Hình 3.4. Sắc ký đồ HPLC của hỗn hợp curcuminoid: (A)ban đầu; (B) sau kết tinh
Hình 3.5. Kết quả TLC của hỗn hợp curcuminoid ban đầu, curcumin, DMC, BDMC
Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC của curcumin, DMC, BDMC
Hình 3.7. (A) curcumin; (B) demethoxycurcumin (DMC); (C) bisdemethoxycurcumin
(BDMC)
Hình 3.8. Phổ UV-Vis của curcumin
Hình 3.9. Phổ UV-Vis của DMC
Hình 3.10. Phổ UV-Vis của BDMC
Hình 3.11 Curcumin C
21
H
20
O
6
(M=368)
Hình 3.12: Demethoxyurcumin C
20

H
18
O
5
(M=338)
Hình 3.13 Bisdemethoxycurcumin C
19
H
16
O
4
(M=308)
Hình 3.14. Hoạt tính bắt gốc tự do của curcuminoid ban đầu, curcumin, DMC, BDMC
theo phương pháp DPPH
Hình 3.15. Liên kết hydro nội phân tử giữa hydro của nhóm phenol với ortho-methoxy
trong cấu trúc curcumin
Hình 3.16. Hoạt tính bắt gốc tự do của curcuminoid ban đầu, curcumin, DMC, BDMC
theo phương pháp MDA

 
 
 
vii 
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

Cur : curcumin
DMC : demethoxycurcumin
BDMC : bisdemethoxycurcumin
TLC : sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography)
HPLC : sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography)

MS : phổ khối lượng (Mass spectrometry)
IR : phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)
UV-Vis : phổ tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet – visible spectroscopy)
IC
50
: Nồng độ cần thiết để tác động lên 50% chất cần khảo sát (Effective
concentration 50)
Oleoresin : nhựa dầu
Chương 1: Tổng quan
1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về curcumin
Curcumin là hợp chất được chiết từ củ nghệ (Curcuma longa L) – một loài cây phân
bố ở vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới, chủ yếu ở châu Á và được dùng như một loại gia
vị. Curcumin có dạng bột màu vàng, là thành phần chủ yếu tạo nên màu vàng của
nghệ.[6]
Curcumin tương đối trơ và không gây độc đối với cả động vật lẫn con người ngay cả
với lượng lớn. Theo nghiên cứu, curcumin không gây độc với người với lượng lên tới
10g /ngày. [2]
Chính nhờ tính an toàn đó mà curcumin là chất có tiềm năng sử dụng trong ngành
dược. Curcumin đã được sử dụng trong thuốc truyền thống để chữa các bệnh như :
bệnh vàng da, bệnh gan, nhiễm khuẩn, bệnh về da, bong gân, viêm, bệnh cúm [5].
Trong những năm gần đây, người ta rất quan tâm đến nhiều tác dụng dược lý khác của
curcumin nh
ư: tính chống oxy hóa, chống ung thư, chống viêm, kháng khuẩn, kháng
nấm, kháng virus, chống đông máu…[2]

Hình 1.1 Cây nghệ (1) Củ nghệ; (2) Thân và lá nghệ; (3) Bột nghệ.
1.1.1. Các thành phần và các dạng đồng phân của curcumin
Thành phần của curcuminoid trên thị trường ngoài curcumin thực chất còn có một số
loại chất màu khác cùng đem lại màu vàng cho nghệ gọi chung là curcuminoid.
Curcuminoid là các dẫn xuất dicinnamoylmethane. Curcuminoid gồm3 thành phần
chính: [6]
1) Curcumin [1,7-Bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5-dione]
(công thứ
c phân tử: C
21
H
20
O
6
, khối lượng phân tử : 368) (Cur)
(1)
(2)
(3)
Chương 1: Tổng quan
2
(3)
(1) (2)
O
O

H
H
O
CH
3
O
H
O
CH
3
O
H
O
H
3
C
O
H
O
O
H
O
CH
3
H
H
O
O
H
3

C
OH
O
H
H
O
O
CH
3
O
H
2) Demethoxy curcumin [1-(4-Hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-
hepta-1,6-diene-3,5-dione] (DMC)
(công thức phân tử: C
20
H
18
O
5
, khối lượng phân tử : 338)
3) Bis-demethoxy curcumin [1,7-Bis-(4-hydroxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5-
dione]
(công thức phân tử : C
19
H
16
O
4
, khối lượng phân tử : 308) (BDMC)
Trong đó, curcumin chiếm chủ yếu, khoảng 77% đối với sản phẩm thương mại, tiếp

theo là DMC (17%) và BDMC (3%). [14]
O
O
OH
OH
R
1
R
2

1)
R
1
= R
2
= OCH
3
: Curcumin (Cur)
2)
R1 = OCH3 ; R2 = H : Demethoxy curcumin (DMC)
3)
R1 = R2 = H : Bis-demethoxy curcumin (BDMC)
Hình 1.2. Cấu trúc các thành phần của curcuminoid
Mỗi thành phần kể trên còn có các đồng phân hình học: s-cis-diketone, s-trans-
diketone, cis-cisenol. Ngoài ba thành phần chính ở trên, mỗi thành phần nhỏ còn có
thể chia thành các thành phần nhỏ hơn là các đồng phân hình học của chúng.
Curcumin tồn tại ở 3 dạng đồng phân: cis-diketone, trans-diketone và enol.

Hình 1.3. Các đồng phân của curcumin: (1) s-cis-diketone; (2) s-trans-diketone; (3)
enol.
Cấu trúc cis-diketone bền hơn dạng trans-diketone và tỉ lệ cis-trans này phụ thuộc vào
điều kiện dung môi [18].
Trong môi trường acid hay trung tính, curcumin tồn tại dưới dạng cân bằng enol –
ketone đối xứng và ổn định. Dạng ketone tồn tại ở dạng rắn còn dạng enol tồn tại ở
dạng lỏng. Cân bằng này phụ thuộc vào loại dung môi và pH. [18]
Chương 1: Tổng quan
3
OH
R
1
OO
OH
R
2
OH
R
1
O
OH
R
2
O
H
Dạng enol bền hơn ketone nhờ có liên kết hydro nội phân tử và phân tử ở dạng liên
hợp. Ở dạng dung dịch, dạng enol chiếm ưu thế. Cấu trúc của dạng enol hoàn toàn

phẳng và cho phép cộng hưởng bên trong 2 phần benzene. Kết quả là curcumin dạng
enol thể hiện một mũi hấp thu mạnh ở vùng nhìn thấy. Ngược lại, cấu trúc của dạng
ketone lại xoắn nên hấp thụ ở vùng tử ngoại g
ần [2].


Hình 1.4. Cấu trúc không gian của curcumin dạng enol và diketone.
Dạng đồng phân enol có 3 proton có thể ion hóa tương ứng với 1 nhóm enolic và 2
nhóm phenolic. Khi phân ly, dạng enol phân ly thành 2 loại anion. Một loại hình thành
do sự phân ly proton của nhóm enolic có bước sóng hấp thu cực đại là 429 nm và loại
kia do sự phân ly proton của nhóm phenolic có bước sóng hấp thu cực đại là 531 nm.
[2]






Hình 1.5. Sự phân ly các proton của curcumin.
Enolic proton hoạt động hơn phenolic proton và enolic proton có tính acid trội nhất
trong ba proton. Enolic proton đóng vai trò quan trọng đối với quá trình phân ly và
trao đổi proton liên quan đến cơ ch
ế loại bỏ gốc tự do của curcumin. Điều đó có nghĩa
là trong suốt quá trình trao đổi proton để loại bỏ gốc tự do, proton enolic là proton đầu
tiên tách ra. [2]
(1)
(2)
O
H
3C

OH
OHO
O
CH3
OH
-H+-H+
Chương 1: Tổng quan
4
O
H
C
O
H
O
H
3
CO
OCH
3
O
H
O
H
C
H
3
CO
OCH
3
O

H
O
O
H
O
2
.-
HO
2
.

Và trong cơ chế SPLET (Sequential proton loss electron), curcumin đầu tiên chuyển
sang dạng monoanion bằng cách tách enolic proton. [2]
H
3
CO
O
H
C
O
H
H
O
OCH
3
O
H
+H
+
-H

+
H
3
CO
O
H
C
H
OCH
3
O
H
O
O
-e
H
3
CO
O
H
C
H
OCH
3
O
H
O
O

Ngoài ra các thành phần kể trên, một lượng nhỏ các chất dầu và nhựa tồn tại trong bột

nghệ (turmeric) có thể vẫn tồn tại trong curcumin. Đó là các sesquiterpene ketone và
các alcolhol như : α-turmeron, β-turmeron, curlon, zingiberen, ar-turmeron,
turmenorol A, turmeronol B ...[3]
1.1.2. Tính chất hóa lý của curcumin
1.1.2.1. Tính chất vật lý [6]
 Curcumin được trích từ củ nghệ vàng Curcuma Longa L., có dạng bột màu
vàng, điểm chảy 184-185
°
C.
 Curcumin là chất màu tan trong dầu, ethanol, methanol, dichloromethane,
acetone, hầu như không tan trong nước ở môi trường acid và trung tính, tan
trong môi trường kiềm.
 Dung dịch curcumin trong dung môi hữu cơ có độ hấp thu cực đại ở bước sóng
khoảng từ 420 – 430 nm.

1.1.2.2. Tính chất hóa học
a. Sự điện ly
Trong môi trường pH <1, curcumin có màu đỏ thể hiện trạng thái proton hóa H
4
A
+
. Ở
pH từ 1 – 7, hầu hết các diferulolylmethane đều ở dạng trung hòa H
3
A, có khả năng
hòa tan rất thấp và dung dịch có màu vàng. Ở pH > 7.5, màu dung dịch chuyển sang
đỏ. Giá trị hằng số phân ly pK
a
của 3 proton dạng acid của curcumin ( dạng H
2

A
-
,
HA
2
, A
3
-
) được xác định tương ứng là 7.8, 8.5 và 9.0. [3]

Chương 1: Tổng quan
5

Hình 1.6. Các trạng thái của curcumin thay đổi theo pH.
b. Phản ứng với H
2

Do có nối đôi ở mạch carbon nên curcumin có khả năng phản ứng cộng với H
2
với xúc
tác PtO
2
.
H
4
A
+
H
3
A

H
2
A
-
HA

2-
A
3-
OH
H
3
CO
OH
OH
+
OCH
3
OH
OH
H
3
CO
O
OH
OCH
3
OH
OH
H
3
CO
O
OH
OCH
3

O
-
OH
H
3
CO
O
O
-
OCH
3
O
-
O
-
H
3
CO
O
OH
OCH
3
O
-
Chương 1: Tổng quan
6
OH
H
3
CO

O
OH
OCH
3
OH
H
+
H
2
Ni (PtO
2
)
OH
H
3
CO
O
OH
OCH
3
H
O
dihydrocurcumin
OH
H
3
CO
O
OH
OCH

3
H
O
tetrahydrocurcumin
OH
H
3
CO
O
OH
OCH
3
OH
hexahydrocurcumin

Trong đó tetrahydrocurcumin (THC) cũng là một chất có hoạt tính chống oxy hóa có
khả năng loại bỏ gốc tự do như gốc tert-butoxyl và peroxyl. [7]
c. Phản ứng phân hủy trong môi trường kiềm
Curcumin tương đối bền ở pH acid nhưng lại nhanh chóng bị phân hủy ở pH kiềm.
Đầu tiên ferulic acid và ferulolylmethane được tạo thành. Sau đó, eruolylmethane
nhanh chóng tạo thành sản phẩm ngưng tụ có màu vàng đến vàng nâu. Tiếp theo,
eruolylmethane tiếp tục thủy phân tạo ra vanillin và aceton và lượng các chất này tăng
theo thời gian ủ. [3]
Chương 1: Tổng quan
7
OH
OCH
3
O
O

OH
OCH
3
O
OH
OCH
3
OH
OH
OCH
3
O
feruloylmethane
OH
OCH
3
CHO
+
O
vanillin
acetone
ferulic acid

Hình 1.7. Phản ứng phân hủy curcumin trong môi trường kiềm.
Người ta ứng dụng sự thủy phân này của curcumin để sản xuất vanillin và các loại
hương thiên nhiên khác. [9]
Erika Pfeiffer [20] tiến hành ủ các hỗn hợp curcumin có tỉ lệ 3 thành phần
curcuminoid khác nhau trong hệ đệm phosphate pH 7.4 trong điều kiện có và không có
huyết thanh. Kết quả cho thấy curcumin bị phân hủy nhanh chóng trong môi trường
không có huyết thanh. Độ bền của các curcuminoid cũng khác nhau: kém bền nhất là

curcumin và bền nhất là BDMC. Kế
t quả HPLC cho thấy sản phẩn phân hủy của quá
trình này là: vanillin, ferulic acid, feruolylmethane và trans-6-(4-hydroxy-3-
methoxyphenyl)-2,4-dioxo-5-hexenal.
d.
Phân hủy dưới tác dụng ánh sáng
[3]
Curcumin không bền ánh sáng, đặc biệt ở trạng thái dung dịch[3]. Curcumin bị phân
hủy khi tiếp xúc với ánh sáng ngay cả ở dạng rắn. Sản phẩm phân hủy là vanillin,
vanillin acid, ferulic aldehyde và ferulic acid. [11]
OH
‐
 
OH
‐
 
Sản phẩm ngưng tụ

Chương 1: Tổng quan
8
Khi bị chiếu xạ, curcumin bị đóng vòng hoặc phân hủy thành vanillic acid, vanillin và
ferulic acid ( Sasaki et al, 1998)[3].
Khi có mặt của oxy và ánh sáng, curcumin bị phân hủy tạo thành 4-vinyl guaialcol và
vanillin:
OH
H
3
CO
O
O

H
OH
OCH
3
OHC
OCH
3
OH
+
CH
OCH
3
OH
CH
2
+
H
3
CCOCH
3
+
CO
2

e. Phản ứng tạo phức với kim loại
Curcumin là hợp chất β-diketone nên cũng có tính chất hóa học của một β-diketone.
Proton của nhóm methyl ở dạng keto và proton của nhóm hydroxyl ở dạng enol của
hợp chất β-diketone có tính acid. Khi các hydro này bứt ra, diketone sẽ tạo thành anion
1,3-diketonate. Diketonate anion này có thể tạo phức vòng càng với các kim loại
chuyển tiếp và những nguyên tố phân nhóm chính. Muối kim loại thường được sử

dụng cho phản ứng tạo phức là muối acetate, clorua, nitrate, sulfate, carbonate của các
kim loại chuyển tiế
p như: Cu, Fe, Mn, Zn, V, Ga, In, Ni, Co, Pd, Hg. [15] Các phức
này cũng có hoạt tính loại bỏ gốc tự do được ứng dụng trong ngành dược. [14]
H
3
CO
OH
C
OCH
3
OH
O
O
Cu
OH
2
H
3
CCOO

H
3
CO
OH
C
OCH
3
OH
O

O
Cu
OCH
3
OH
C
H
3
CO
OH
O
O


Hình 1.8. Cấu trúc phức Cu-curcumin (1:1) và (1:2) giữa đồng acetate và curcumin.
f.
Phản ứng của nhóm phenolic OH [13]

Một trong những hoạt tính đáng chú ý của curcumin là khả năng loại bỏ gốc oxygen
hoạt động và các gốc nitrogen tự do. Đó là do curcumin có 2 nhóm o-methoxy
phenolic OH đính vào mạch heptadience-dione. Các electron chưa liên kết của nhóm
OH liên hợp với vòng benzen làm cho H của nhóm này linh động hơn. Điều đó giải
thích cho tính acid và khả năng phản ứng với các gốc tự do của curcumin.
Chương 1: Tổng quan
9
H
3
CO
OH
O

O
OCH
3
OH
R*
-H
+
H
3
CO
OH
O
O
OCH
3
O
H
3
CO
OH
O
O
OCH
3
O
H
3
CO
O
O

O
OCH
3
OH
H
3
CO
OH
O
O
OCH
3
O
H
3
CO
OH
O
O
OCH
3
OH
H
3
CO
OH
O
O
OCH
3

OH
Curcumin

Hình 1.9 Sơ đồ biểu hiện hai hướng phản ứng của curcumin với gốc tự do [13].
1.1.3. Phương pháp phân lập 3 thành phần của curcumin
Như đã đề cập ở phần trên, curcumin trên thị trường là hỗn hợp của 3 curcuminoid:
curcumin (Cur), demethoxycurcumin (DMC) và bisdemethoxycurcumin (BDMC).
Trong đó curcumin chiếm chủ yếu (khoảng 77%), tiếp theo là DMC (17%) và BDMC
(3%) [14]. Các thành phần này có cấu trúc hóa học khác nhau nên cũng có màu sắc và
tính chất hóa học khác nhau. Curcumin tinh khiết rất hiếm và đắt trong khi DMC và
BDMC vẫn ch
ưa có trên thị trường. Do đó, việc tách các curcuminoid thành những
đơn chất riêng biệt là cần thiết cho việc nghiên cứu và có ý nghĩa kinh tế. Nhiều
nghiên cứu đã đưa ra các phương pháp nhằm phân lập các thành phần này trong hỗn
hợp curcumin thô ban đầu.
Rasmussen và các đồng sự [15] đã đưa ra phương pháp tách các curcuminoid đơn giản
và hiệu quả sử dụng sắc kí lớp mỏng (TLC) silica gel đã được tẩm dihydrogen
phosphate. Tuy phương pháp này có thể tách và xác định các curcuminoid thành phần
nh
ưng vẫn còn hạn chế do không định lượng được hàm lượng mỗi curcuminoid có
trong hỗn hợp.
Chương 1: Tổng quan
10
Marsin [4] đã sử dụng phương pháp HPLC CO
2
siêu tới hạn với pha động là hệ đệm
acetonitrile/acetate [4]. Một phương pháp khác của Xian-Guo He là tách và xác định
curcumin sử dụng cột Supelcosil LC-18 với pha động là ammonium acetate/ acetic
acid và acetonitrile[16]. Taylor và McDowell đã tách được 3 thành phần curcuminoid
sử dụng cột polymer non-silica với pha động là dung dịch acetonitrile 55%.

Opa Vajragupta và các đồng sự [17] đã tách hỗn hợp curcuminoid ra các thành phần
đơn lẻ bằng phương pháp sắc kí. Bột curcumin trước tiên được hòa tan trong acetone,
sau đó được tách bằng sắc kí silica gel với hệ dung môi rửa giải CHCl
3
:MeOH:AcOH
(98:5:2). Theo phương pháp này, curcumin được rửa giải trước, sau đó là hỗn hợp của
curcumin với DMC, kế đó là BDMC tinh. DMC tinh khiết được tách lần thứ hai cũng
bằng phương pháp sắc kí với hệ dung môi rửa giải CH
2
Cl
2
:MeOH (95:5). Độ tinh
khiết của các thành phần được kiểm tra bằng sắc kí bản mỏng TLC, các phổ cộng
hưởng từ NMR, phổ hồng ngoại IR, khối phổ ion nguyên tử ESI-MS và phân tích
nguyên tố EA.
Guddadarangavvanahally K.Jayaprakasha và các đồng sự [4] đã tách ba thành phần
của curcumin bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC. Các curcuminoid được tách từ
oleoresin sử dụng cột sắc kí silicagel sau khi rửa với hexane để loại béo. Đầu tiên, tinh
dầu nhựa nghệ thương ph
ẩm (CRIO) được hấp phụ lên silica gel, sau đó được nạp lên
cột sắc ký silica gel và rửa với dung môi hexane. Tiếp đó, cột được rửa với benzene và
ethyl acetate với độ phân cực tăng dần. Curumin thu được với hệ dung môi
benzene:EtOAc (82:18 v/v), trong khi DMC và BDMC đươc rửa tương ứng bằng các
hệ benzene:EtOAc (70:30 v/v), benzene:EtOAc (58:42 v/v). Các phân đoạn thu được
qua cột được cô chân không và kết tinh lại. Hiệu suất tách tương ứng của các chất
curcumin, DMC và BDMC tương ứng là đạt 2.2, 4.46 và 3.4%.
Các ch
ất thu được cho một chấm đơn trên sắc kí bản mỏng (TLC) silica gel với hệ
dung môi chloroform/methanol (98:2). Giá trị R
f

tương ứng là 0.55, 0.50, 0.43. Các
chất này cũng cho một mũi đơn trên HPLC. Nhiệt độ nóng chảy đo được của curumin,
DMC và BDMC tương ứng là 186 -187, 175 -176 và 231 - 232
°
C [4]. Bằng phổ
1
H và
13
C NMR, các curcuminoid này được xác định tương ứng là curcumin, DMC và
BDMC. Các kết quả trên chứng tỏ nghiên cứu đã tách thành công các curcuminoid có
oleoresin nghệ và khẳng định đó chính là curcumin, DMC và BDMC.
Péret-Almeida và các đồng sự [1] đã tách được và xác định một số tính chất hóa lý của
từng curcuminoid riêng biệt. Nghiên cứu đã khảo sát một số hệ dung môi để tách 3
thành phần trên bằng sắc kí bản mỏng silica gel 60G (Merk, Darmstadt, Germamy)
(4.5 x 10 mm).

Chương 1: Tổng quan
11
Bảng 1.1. Kết quả khảo sát một số hệ dung môi chạy sắc ký bản mỏng TLC [1]
TLC mobile phases
R
f

Curcumin DMC BDMC
Toluene:ethyl acetate (97:3) 0.9 0.86 0.8
Toluene:ethyl acetate (90:10) 0.84 0.8 0.75
Chloroform:methanol (95:5) 0.4 0.34 0.25
Dichloromethane:methanol (99:1) 0.47 0.28 0.16
Dichloromethane:methanol (95:5) 0.53 0.42 0.33
Dựa vào giá trị R

f
, nhóm nghiên cứu kết luận hệ dung môi dichloromethane:methanol
(99:1) là hệ dung môi thích hợp nhất để tách 3 thành phần curcuminoid ra khỏi hỗn
hợp ban đầu bằng TLC.
Nhóm nghiên cứu đã tiến hành tách các curcuminoid bằng sắc kí cột silica gel 60G
được tẩm natri hydrogen phosphate và dung môi rửa giải dichloromethane. Hỗn hợp
các curcumin trước khi tách bằng sắc kí cột được kết tinh 3 lần curcumin trong hỗn
hợp methanol:nước (5:1 v/v). Kết quả cho thấy sau các lần kết tinh, hàm lượng
curcumin tăng lên rõ rệt. Sau lần kết tinh thứ
nhất, hàm lượng curcumin tăng lên
56.9%, còn lại là các curcuminoid khác. Đến hết lần kết tinh thứ ba, hàm lượng này
lên đến 92.2%, còn lại là DMC và hầu như không còn BDMC trong hỗn hợp. Tuy
nhiên, hiệu suất của quá trình này rất thấp, lượng curcumin thu được chỉ còn 40% so
với ban đầu.
Bảng 1.2. Khối lượng và thành phần hỗn hợp curcuminoid sau 3 lần kết tinh (khối
lượng mẫu ban đầu 500mg) [1]
Lần kết tinh
Khối lượng
(mg)
Thành phần (%)
Curcumin DMC BDMC
1 294 56.9 30.1 13.0
2 214 72.8 19.5 7.7
3 193 92.2 7.8 -
Nước cái thu được từ quá trình kết tinh được gộp lại và nạp lên cột sắc ký Silica gel
60G. Silica gel trước khi nhồi được tẩm natri hydrogen phosphate (NaH
2
PO
4
), dung

môi dùng để rửa giải là dichloromethane. Các phân đoạn thu được từ sắc ký cột được
gom lại thành các nhóm dựa vào kết quả chạy TLC.
Chương 1: Tổng quan
12
Bảng 1.3. Kết quả tách các curcuminoid từ hỗn hợp bằng cột sắc ký silica gel (khối
lượng mẫu khô nạp lên cột 100mg) [1]
Phân đoạn Tổng thể tích (ml) Thành phần
Khối lượng
(mg)
14-1 1120 C 31.2
15-17 240 C , DMC 4.14
18-30 960 DMC 30.97
31-33 240 DMC, BDMC 3.88
34-47 1120 BDMC 31.06
Độ tinh khiết của các curcuminoid riêng lẻ được xác định bằng sắc kí lỏng hiệu năng
cao HPLC và xác định điểm chảy. Kết quả phân tích HPLC cho các peak đơn chứng tỏ
nghiên cứu đã tách thành công các curcuminoid thành các đơn chất tinh khiết. Kết quả
đo điểm chảy của các chất curcumin, DMC và BDMC tương ứng là 184, 172 và 222
°
C
[1].
Hình 1.10. Kết quả HPLC tương ứng của BDMC, DMC và curcumin. [1]
Các curcuminoid thu được còn được định tính bằng phổ các phổ tử ngoại, phổ khả
kiến, hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và bằng phương pháp đo màu. Các kết
quả đo đã xác định các chất thu được chính là curcumin, DMC và BDMC.



Chương 1: Tổng quan
13

Bảng 1.4 Kết quả phổ NMR của các chất curcumin, DMC và BDMC. [1]

13
C Cur DMC BDMC
1 100.9 100.9 100.9
2, 2' 183.2 183.2/183.1 183.2
3, 3' 121.1 121.1/120.8 121.1
4, 4' 140.7 140.7/140.4 140.1
5, 5' 126.4 126.4/125.8 126.8
6, 6' 111.4 111.2/130.4 130
7, 7' 148 148.0/115.7 115.9
8, 8' 149.4 149.8/159.8 159.7
9, 9' 115.7 115.9/115.7 115.9
10, 10' 123.1 123.2/123.1 130
O - Me 55.7 55.7 -
W. Chearwae và các đồng sự [18] cũng đã tách được các tách được ba thành phần nói
trên từ củ nghệ. Đầu tiên, bột nghệ được trích ly từ củ nghệ bằng dung môi ethanol
trong 24h sau đó được loại béo bằng petroleum ether để thu được curcumin thô. Phân
tích HPLC cho thấy bột curumin này chứa ba chất khác nhau với hàm lượng tương
ứng là 78%, 16% và 5%. Các curcuminoid này được tách bằng sắc kí cột silicagel 60
với dung môi CHCl
3
, sau đó thay bằng hệ dung môi CHCl
3
:CH
3
OH với độ phân cực
tăng dần để thu lần lượt ba thành phần riêng rẽ. Các thành phần này được kiểm tra lại
bằng sắc kí bản mỏng (TLC) silica gel 60 F254 và sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC.
Kết quả cho thấy độ tinh khiết của sản phẩm thu được vào khoảng 95-99%.

Chương 1: Tổng quan
14



Hình 1.11. (A) Kết quả sắc kí bản mỏng TLC, các mẫu từ trái sang lần lượt là hỗn
hợp các curcuminoid: curcumin (curcumin I), DMC (curcumin II) và BDMC
(curcumin III). (B) Kết quả HPLC của các chất theo thứ tự từ trên xuống: hỗn hợp
các curcuminoid, curcumin (curcumin I), DMC (curcumin II) và BDMC (curcumin
III). (C) Cấu trúc của các curcuminoid xác định được curcumin (curcumin I),
DMC (curcumin II) và BDMC (curcumin III) [18]
1.2. Hoạt tính sinh học của curcumin và các dẫn xuất curcuminoid
Từ xa xưa, ở các nước Ấn Độ, Trung Quốc và các nước Đông Nam Á, nghệ (Curcuma
longa L.) đ
ã được sử dụng làm gia vị, chất bảo quản và màu thực phẩm. Nghệ còn là
vị thuốc trong gia đình để chữa các bệnh khác nhau: rối loạn mật, chứng biếng ăn, ho,
viêm gan, xoang … Những thập niên gần đây, người ta ngày càng chú ý nhiều đến
hoạt tính sinh học của nghệ và curcumin. Nhiều công trình đã nghiên cứu hoạt tính và
tác dụng dược lý của curcumin. Kết quả cho thấy, curcumin có hoạt tính sinh học
mạnh và đa dạ
ng, bao gồm: hoạt tính chống viêm, chống ung thư, chống đột biến,
chống đông máu, chống vi khuẩn, chống nấm, chống virus, làm lành vết thương, giảm
cholesterol; chữa một số bệnh như: Alzheimer, đái tháo đường, viêm khớp, HIV-AIDS
… [6, 22]

Vì hoạt tính của curcumin khá đa dạng và phong phú, nội dung của luận văn này chỉ
xin trình bày hoạt tính chống ung thư và chống oxy hóa của curcumin.
Chương 1: Tổng quan
15
1.2.1. Hoạt tính chống ung thư
Curcumin có khả năng ức chế sự tạo khối u, tác động đến hầu hết các giai đoạn của
quá trình hình thành và phát triển khối u.





Hình 1.12.

Quá trình hình thành và di căn khối u và tác động của curcumin [23].
Trong giai đoạn đầu của bệnh, các tế bào bình thường bị tác động bởi các gốc tự do và
bị biến đổi thành các tế bào ung thư. Curcumin có thể ngăn chặn quá trình này bằng
cách bắt giữ các gốc oxy hóa khác nhau như: gốc hydroxyl OH
•
, gốc peroxyl ROO
•
,
singlet oxygen, nitric oxide NO và peroxynitrite ONOO
¯
[18, 24]. Curcumin có khả
năng bảo vệ lipid, hemoglobin và AND khỏi quá trình oxy hóa. Curcumin tinh khiết có
hoạt tính kháng các ion oxy hóa mạnh hơn demethoxycurcumin (DMC) và
bisdemethoxycurcumin [24]. Kết quả nghiên cứu của Conney [24] cho thấy curcumin
còn có tác dụng ức chế các chất gây ung thư benzo[a]pyrene (BaP) và 7,12-
dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) trên da chuột. Curcumin được chứng minh là có

khả năng chống di căn đối với một vài loại tế bào ung thư đồng thời ức chế sự phát
triển của tế bào ung thư. Khả năng làm giảm quá trình di căn này curcumin phụ thu
ộc
vào nguồn gốc của khối u và loại khối u ác tính [22, 24].
1.2.2. Hoạt tính kháng oxy hóa
Như đã nói ở phần giới thiệu chung về hoạt tính của curcumin, curcumin có hoạt tính
sinh học mạnh và đa dạng. Một vài hoạt tính sinh học đó bắt nguồn từ tính kháng oxy
hóa của curcumin. Curcumin là một chất kháng gốc oxy hóa tự do mạnh. Các nghiên
cứu trên thế giới đã chứng minh in vitro curcumin ức chế sự phát sinh của nhiều tác
nhân gây oxy hóa (ROS) nh
ư: anion superoxide, H
2
O
2
, gốc nitrite đồng thời làm giảm
lượng ROS in vivo. Các dẫn xuất của curcumin là demethoxycurcumin và
bisdemethoxycurcumin cũng có hoạt tính kháng oxy hóa.[22]
Cấu trúc curcumin có hydrogen của nhóm phenol và hydrogen của nhóm methyl giữa
mạch đều có khả năng tạo nên hoạt tính kháng oxy hóa. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều
tranh cãi xung quanh việc hoạt tính của curcumin thực chất do hydrogen ở vị trí nào
đem lại.
Liang Shen [2] cho rằng enolic proton hoạt động hơn phenolic proton và là proton có
tính acid trội nhất trong ba proton. Enolic proton đóng vai trò quan trọng đối với quá
Tế bào
bình thường
Tế bào
ung thư
Khối u tăng
trưởng
Khối u di

căn
Curcumin
Biến đổi
Phát triển Lan rộng
Chương 1: Tổng quan
16
trình phân ly và trao đổi proton liên quan đến cơ chế loại bỏ gốc tự do của curcumin.
Điều đó có nghĩa là trong suốt quá trình trao đổi proton để loại bỏ gốc tự do, proton
enolic là proton đầu tiên tách ra. [2]
O
H
C
O
H
O
H
3
CO
OCH
3
O
H
O
H
C
H
3
CO
OCH
3

O
H
O
O
H
O
2
.-
HO
2
.
Wei-Feng Chen [25] đã nghiên cứu khả năng ức chế 2,2’-azobis(2-amidinopropane
hydrochloride) (AAPH) và Cu
2+
trong oxy hóa lipoprotein nồng độ thấp của curcumin
và một số chất có cấu trúc tương tự curcumin nhưng cấu tạo không có nhóm phenol.
Các chất đó là: 1,7-bis(3,4-dimethoxyphenyl)-1,6-heptadiene3,5-dione (1), 1,7-bis(4-
methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione (2) và 1,7-diphenyl-1,6-heptadiene-3,5-
dione (3). Kết quả hoạt tính của các chất này yếu hơn curcumin. Do đó, nhóm nghiên
cứu đã kết luận rằng nhóm phenol trong phân tử đóng vai trò quan trọng trong hoạt
tính kháng oxy hóa của curcumin
.
 
 
 
 
 
 

Hình 1.13. Cấu trúc các chất 1,7-bis(3,4-dimethoxyphenyl)-1,6-heptadiene3,5-dione
(1), 1,7-bis(4-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione (2) và 1,7-diphenyl-1,6-
heptadiene-3,5-dione (3) [25].
Wright, J. S. [19] lại chỉ ra rằng vai trò của nhóm phenol và methyl đối với khả năng
kháng oxy hóa của curcumin phụ thuộc vào loại gốc tự do và môi trường phản ứng.
Nghiên cứu cho rằng curcumin bắt gốc tự do curcumin theo cơ chế HAT (H-atom
transfer):
FR
•
+ Cur – H → FR – H + Cur
•+

Trong đó: FR
•
: gốc tự do tấn công
(1)
O
O
OCH
3
OCH
3
H
3
CO
H
3
CO

(2)
O
O
OCH
3
H
3
CO
(3)
O
O