Các biện pháp tách và làm sạch enzym

Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các
chế phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết
trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế…
Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000
tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác
nhau. .
Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại
enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm
là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên .
Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản
xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho ma
́
t, làm mềm thịt, bổ
sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm
trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông
nghiệp…
Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung
cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra
nhiều hơn. Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng
Các phương pháp tinh sạch enzyme
1
Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sa
̉
n xuâ
́
t. Các chế phẩm thu được
sau quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh
khiết cao vì protein chỉ chiếm 20-30% .Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến

phương pháp tách và tinh chế enzyme nhằm thu được chế phẩm có độ tinh
khiết cao rất cần thiết. Để tách và tinh chế enzyme nói riêng và protein nói
chung thường có một loạt phương pháp hóa-lý và hóa học khác nhau. Có thể
chia làm năm nhóm phương pháp sau:
- Phương pháp biến tính chọn lọc
- Phương pháp kết tủa phân đọan
- Phương pháp hấp thụ chọn lọc
- Phương pháp sắc ký
- Phương pháp tách hệ hai pha nước
Cho đến nay không có phương pháp tách và làm sạch chung cho các
enzyme. Để xây dựng phương pháp tách và làm sạch một enzyme nào dó cần
biết lựa chọn và phối hợp một cách có hiệu quả nhất các biện pháp tách và
làm sạch khác nhau.

PHẦN I: TỔNG QUAN
Các phương pháp tinh sạch enzyme
2
Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
I/Khái niệm enzyme
- Enzyme là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hoá
học với mức độ đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp.
- Enzyme có trong tất cả các tế bào sống, là các chất xúc tác sinh học.
- Enzyme có đầy đủ các tính chất của chất xúc tác, nhưng enzyme có
hiệu suất xúc tác lớn hơn tất cả các chất xúc tác hữu cơ và vô cơ khác.Enzyme
không những có thể xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong cơ thể sống, mà
sau khi tách khỏi hệ thống sống, ở những điều kiện nhất định chúng vẫn giữ
được hoạt tính xúc tác.
Như vậy,có thể nói một cách khái quát, enzyme là những phân tử lớn
tồn tại trong tự nhiên, hay được tổng hợp có khả năng xúc tác cho một hay
nhiều phản ứng với mức độ đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ và áp suất bình

thường.
II/Những tiêu chuẩn tinh sạch của enzyme
Để xác định xem protein được chiết tách ra có phải là enzyme tinh
khiết không hay còn chứa những tạp chất protein không họat động, người
ta sử dụng một số phương pháp chủ yếu dựa trên việc nghiên cứu những
tính chất vật lý của protein.
Các phương pháp tinh sạch enzyme
3
Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
- Làm lắng (kết tủa) dung dịch protein trong phần quay phân tích của
máy siêu ly tâm: phát hiện một đỉnh của protein thì đó là protein
thuần nhất. Tuy nhiên một số protein tuy khác nhau nhưng có cùng
trọng lượng phân tử và có hình dạng tiểu phân ( hoặc có khi có sự bù
phụ của các ảnh hưởng của khối lượng và hình dạng) thì có hằng số
lắng trùng nhau. Vì thế khi siêu ly tâm, chúng có thể lắng với tốc độ
như nhau và cho một đỉnh chung.
- Điện li ( phương pháp ranh giới di động): phương pháp này rất hiệu
quả. Tuy nhiên khó mà phân biệt được những protein giống nhau về
trị số di động điện li. Dung dịch enzyme khi được điện li khu vực
trong jela tinh bột hoặc thạch chỉ ra một đỉnh cân đối thì đó là dấu
hiệu của enzyme thuần nhất. Thế nhưng khi hàm lượng những
protein tạp nhỏ(<=1%) thì khó phát hiện ra đúng.
- Xác định họat độ riêng, mật độ quang học riêng trong những đỉnh
quang phổ đặc trưng cùng hàm lượng các nhóm ngọai đặc hiệu.
- Biện pháp khá nhạy cảm để xác định mức độ thuần nhất của enzyme
( cũng như protein khác) là kết hợp sự phân tích điện li và những
phản ứng miễn dịch hóa học đặc hiệu, đặc biệt điện di trên thạch
theo grabar.
Các phương pháp tinh sạch enzyme
4

Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
- Biện pháp nghiên cứu có triển vọng nhưng tương đối ít nhạy về độ
thuần nhất của protein là sự xác định độ hòa tan của nó theo
norchrop.
Thường để xét độ thuần nhất của enzyme, người ta dựa trên sự so
sánh những kết quả thu được từ một vài phương pháp khác nhau.
Đặc biệt, những chế phẩm enzyme càng tinh khiết thì càng dễ hỏng
và khi bảo quản trong các dung dịch ở 4
0
C đều nhanh chóng mất hoạt
tính. Vì thế, khi tái kết tinh enzyme lặp lại ta thường thấy có sự giảm
hoạt độ riêng vì các tinh thể đã bị ô nhiễm bởi phần enzyme bị ức chế.
Các phương pháp tinh sạch enzyme
5
Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
PHẦN II
TÁCH CHIẾT& TINH SẠCH ENZYME
I. Các điều cần lưu ý khi tách chiết và tinh sạch enzyme
Có 3 khó khăn trong khi tách enzyme khỏi tế bào cần phải hết sức lưu ý.
- Enzyme có trong tế bào sinh vật với lượng không lớn so với các thành
phần khác.
- Enzyme là chất hữu cơ không bền, chúng rất dễ bị biến tính khi bị tác
động của các yếu tố bên ngoài.
- Enzyme là prôtêin. Prôtêin enzyme luôn luôn đi cùng những loại
prôtêin không phải enzyme nhưng lại có tính chất lý hoá rất giống prôtêin
enzyme. Do đó, rất dễ mất hoạt tính sinh học khi bị tách ra khỏi tế bào và cơ
thề.Việc mất hoạt tính có thể do nhiệt độ cao, sự thuỷ phân bởi các enzyme
proteolytic, tác dụng của pH thấp, các chất oxy hoá hay chất khử, các chất gây
biến tính,các chất ức chế bất thuận nghịch…Tuy nhiên, các enzyme khác
nhau có thể nhạy cảm với những tác nhân nêu trên ở các mức độ rất khác

nhau.
Trong sản xuất chế phẩm enzyme thì việc giữ được hoạt tính của enzyme
là một trong những yêu cầu hàng đầu.Thông thường qua mỗi bước tinh sạch
Các phương pháp tinh sạch enzyme
6
Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
thì một phần enzyme cũng như hoạt động của chế phẩmbị mất đi, giá thành
cao lên do chiphí về thiết bị, nguyên liệu, công sức và do mất hoạt độ. Với
enzyme dùng trong mục đích công nghiệp, không phải lúc nào cũng cần phế
phẩm có độ tinh sạch cao,trong một số trường hợp có thể dùng phế phẩm
enzyme ở dạng thô.
Để hạn chế tối đa sự giảm hoạt độ enzyme trong quá trình tinh sạch thì
thường cần chọn dung dịch chiết rút enzyme thích hợp, vừa cho hiệu suất
chiết suất enzyme cao, vừa không làm biến tính enzyme. Các bước tinh sạch
thường được tiến hành ở nhiệt độ thấp ( khoảng 40C hoặc thấp hơn, tuỳ yếu
tố gây kết tủa) để vừa hạn chế sự biện tính enzyme cũng như tác dụng phân
giải của các enzyme proteolytic có mặt trong dịch chiết.Đối với nhiều
enzyme,có thể bổ sung các chất ức chế của enzyme proteolytic vào dịch chiết
để hạn chế sự thuỷ phân đối với các enzyme quan tâm. Các enzyme
proteolytic được phân thành 4 lớp là:
+ protease serine
+ protease cystein
+ protease axit
+ protease chứa kim loại.
Trên cơ sở của 4 lớp protease này, nhười ta cũng cha các chất ức chế của
các enzyme này theo 4 lớp tưong ứng. Tuy vậy, do sự phổ biến của 2 loại
Các phương pháp tinh sạch enzyme
7
Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
protease serine và protease cystein, nên việc bổ sung vào dịch chiết protein

enzyme các chất ức chế của hai loại protease này là phổ biến. Trong một số
trường hợp, đối với các enzyme nhạy cảm với các phân cắt proteolytic, thì cả
4 loại chất ức chế đều được sử dụng.
Bổ sung các yếu tố làm bền ( như CaCl
2
, hay MgCl
2
ở nồng độ 2-5mM,
glycerol 10-20%...) chất chống oxy hoá, xây dựng quy trình tinh sạch đơn
giản ít bước nhất cũng là những cách để hạn chế sự giảm hoạt động của
enzyme. Đối với một số enzyme bền nhiệt thì có thể dùng bước xử lý nhiệt
( 70-80
0
C, trong vòng 15-30 phút) ở ngay giai doạn đầu để vừa hạn chế tác
dụng phân cắt proteolytic, vừa loại bỏ một số protein không monh muốn
khác. Tương tự có thể dùng bước xử lý axit 9 đưa pH xuống 3-4) ở giai đoạn
đầu đối với các enzyme bền ở pH thấp.
III. Thu nhận chế phẩm enzyme thô
Ngoài trừ một số trường hợp enzyme quan tâm là enzyme ngoại bào từ
vi sinh vật ( enzyme được tiết vào môi trường trong quá trình nuôi cấy tế bào)
và các enzyme ngoại bào từ các dịch của động vật và thực vật, các trường hợp
còn lại, bước đầu tiên trong nghiên cứu enzyme là phải thu nhận dịch chiết
enzyme từ nguyên liệu.Để thu dịch chiết mô hoặc tế bào chứa enzyme, trước
hết phải phá vỡ tế bào.
Các phương pháp tinh sạch enzyme
8
Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
Để thu nhận enzyme nội bào, người ta phải phá vỡ tế bào bằng nhiều
phương pháp.Các phương pháp phá vỡ tế bào thường được sử dụng để phá vỡ
tế bào như:

+ Phương pháp cơ học. Nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền như bột
thuỷ tinh, cát thạch anh, đồng hoá bằng thiết bị đồng hoá…
+ Phương pháp vật lý như dùng sóng siêu âm …
+ Phương pháp hoá học như dùng các loại dung môi, butylic, aceton,
glycerol, ethylacetate.
Sau khi phá vỡ tế bào, người ta thường sử dụng nước, dung dịch đệm,
dung dịch muối trung tính để tách enzyme ra khỏi sinh khối đã xử lý theo
những phương pháp trên. Dịch chiết thu được,người ta gọi là chế phẩm
enzyme thô. Sở dĩ gọi là chế phẩm enzyme thô vì trong chế phẩm này,ngoài
enzyme ra còn có nước, protein không phải enzyme các thành phần của tế
bào.
Chế phẩm thu được ở các bước ban đầu này thường chứa rất nhiều
protein và các hợp chất không mong muốn, nồng độ enzyme quan tâm thấp.
Dịch chiết có thể được cô đặc ở nhiệt độ thấp để làm tăng nồng độ
enzyme, hoặc được bổ sung tác nhân gây kết tủa protein enzyme để loại bỏ
một số chất không mong muốn, sau đó hoà tan enzyme trong một thể tích nhỏ
dung dịch đệm thích hợp.
Các phương pháp tinh sạch enzyme
9
Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
Để kết tủa protein cho mục đích tinh sạch, người ta thường dùng dung
môi hữu cơ như ethanol hay aceton hoặc muối trung tính. Các dung môi hữu
cơ khi thêm vào dung dịch nước sẽ làm giảm hằng số điện môi của dung dịch,
do đó làm thay đổi tính tan của protein và dẫn đến làm kết tủa protein. Nồng
độ của các dung môi gây kết tủa protein thường từ 80% (V/V) trở lên. Sự kết
tủa có thể có tính chọn lọcmột phần, nghĩa là các protein khác nhau có thể
được kết tủa bằng các nồng độ khác nhau của dung môi. Dung môi hữu cơ
sau đó có thể được loại bằng cách cho bay hoi trong chân không, hay thậm chí
trong hkông khí.
Để kết tủa enzyme từ dịch chiết thô, người ta cũng có thể dùng một số

muối trung tính, thường dùng nhất là ammonium sulfatese, do muối này có
mức độ hoà tan rất cao trong nước, ít làm mất hoạt tính enzyme, thậm chí còn
có tác dụng làm bền enzyme. Một số ưư điểm nữa của muối ammonium
sulfate là khả năng kết tủa chọn lọc protein, do đó sẽ loại bỏ được nhiều
protein không mong muốn trong dịch chiết. Lưu ý khi sử dụng muối
ammonium sulfate là phải bổ sung vào dung dịch enzyme một cách từ từ, kết
hợp khuấy đều để tránh khả năng tăng quá nhanh cục bộ của nồng độ muối,
làm mất di tính kết tủa chọn lọc của nó, thậm chí có thể làm biến tính một số
enzyme kém bền. Hạn chế của phương pháp sử dụng ammonium sulfate chính
là mất nhiều thời gian, do nồng độ ammonium sulfate cao nên tỷ trọng của
Các phương pháp tinh sạch enzyme
10
Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
dung môi lớn, để kết tủa được các protein cần phải ly tâm ở tốc độ cao và
nhiệt độ thấp, sau đó cần loại muối khỏi chế phẩm khi chuyển sang bước tinh
sạch tiếp theo.
IV/Các phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme
*Khái niệm
Việc làm sạch enzyme chính là việc loại protêin không phải là enzyme,
nước,các thành phần khác của tế bào khỏi enzyme. Công vịêc này hoàn toàn
không dễ dàng. Do đó, việc làm sạch enzyme đòi hỏi người làm nghiên cứu
về enzyme, ngoài sự hiểu biết về enzyme ra còn phải nắm vững rất nhiều thao
tác kỹ thuật khác nhau để tránh gây mất tính hoạt động của enzyme.
Trong dịch chiết, ngoài enzyme còn chứa các protein tạp và nhiều chất
khác, để loại bỏ chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác nhau.
Để loại bỏ muối và các tạp chất có phân tử lượng thấp thường dùng các
biện pháp thẩm tích đối với nước hay đối với các dung dịch đệm loãng hoặc
bằng cách lọc qua gel sephadex.
Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác,
thường dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biện tính chọn

lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa
phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các hpương pháp
sắc ký( sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion),điện di, phương pháp lọc gel.
Các phương pháp tinh sạch enzyme
11
Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
1/Phương pháp biến tính chọn lọc
Phương pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH làm biến tính các loại
protein tạp. Phương pháp này chỉ thích hợp với enzyme chịu axít và bền
nhiệt.Người ta đưa nhiệt độ của dung dịch enzyme lên 50-70
0
C và pH <=5.Ở
điều kiện này những enzyme không bền nhiệt và không chịu được pH thấp sẽ
bị biến tính.Sau đó, bằng phương pháp ly tâm hoặc phương pháp lọc để loại
bỏ các thành phần không phải là enzyme mà ta mong muốn.
2/Phương pháp kết tủa phân đọan
Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH
4
)
2
SO
4
dựa trên cơ sở sự khác nhau
về khả năng kết tủa của các protein enzyme ở một nồng độ muối (tính theo
phần % nồng độ bão hòa) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu
protein tạp của các dịch enzyme. Các loại muối có thể được dùng là (NH
4
)
2
SO

4
, Na
2
SO
4
, MgSO
4
... người ta đã nhận thấy muối (NH
4
)
2
SO
4
là tốt nhất vì
nó không làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại enzyme. Loại
muối này lại rẻ và phổ biến. Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bão hòa 767g/l ở
250C).
Phương pháp này chỉ dùng vói những enzyme ít bị biến tính bởi các dung môi
được chọn dùng. Để giữ cho enzyme khỏi bị mất khả năng hoạt động, quá
trình kết tủa phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp (-5
0
C).
Các phương pháp tinh sạch enzyme
12
Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
3/Phương pháp hấp phụ chọn lọc
Người ta có thể cho chất hấp phụ trực tiếp vào dung dịch enzyme, hoặc
cho dung dịch enzyme chảy qua một cột, trong cột có chứa chất hấp phụ. Chất
hấp thụ được sử dụng rộng rãi là hyđrocyapatite. Người ta có thể thực hiện
một trong hai cách sau: hoặc là hấp phụ enzyme hoặc là hấp phụ protein tạp.

Để tránh làm biến tính enzyme, người ta thường thực hiện quá trình hấp phụ ở
nhiệt độ 0
0
C.Sau khi hấp phụ, người ta lại tiến hành chiết enzyme (quá trình
phản hấp phụ) bằng các dung môi thích hợp.
4/Phương pháp sắc ký
* Phương pháp sắc ký trao đổi ion
Dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein tan trong nước
hoặc dung dịch đệm loãng và tác nhân trao đổi ion, người ta áp dụng phương
pháp sắc ký trao đổi ion để làm sạch enzym. Người ta thường sử dụng các tác
nhân trao đổi ion sau:
- Nhựa trao đổi ion
- Dẫn xuất ester của cellulose như carboxymethyl-cellulose,
diethylamino-ethyl-cellulose (DEAE-cellulose), triethylamino-ethyl-
cellulose.
Người ta thường sử dụng dietylaminoetylxelluloza (DEAE-cellulose)
hơn cả. Ưu điểm của DEAE-cellulose là với dịch chiết thích hợp ngoài tạp
Các phương pháp tinh sạch enzyme
13
Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
chất protein còn có khả năng loại bỏ các tạp chất axit nucleic.Điều đó cho
phép không cần dùng đến các biện pháp nhằm loại bỏ axit nucleic khó và
phức tạp như kết tủa protamin hoặc streptomixin sunfat thường được dùng
trước đây.
Sephadex là dẫn xuất của polysaccharide dextran.Trong chất này, các
phân tử của chúng thường liên kết vói nhau bởi các liên kết ngang nhờ tác
dụng của epiclohydrin, tao thành “sàng phân tử”. Số lượng liên kết ngang tạo
thành càng nhiều, kích thước của lỗ sàng phân tử càng nhỏ.Khi tiến hành lọc,
các chất phân tử có khích thước nhỏ sẽ khuếch tán vào bên trong các hạt
sephadex đã được ngâm trong dung dịch đệm, còn các phân tử có kích thước

lớn hơn không có khả năng đi vào các hạt sẽ được chiết nhanh ra khỏi cột.
Vậy cơ sở của phương pháp lọc gel sephadex dựa vào sự khác nhau về kích
thước, hình dáng và phân tử lượng của các chất có trong hỗn hợp.Phương
pháp này được áp dụng rộng rãi trong kỹ thuật enzyme.
* Phương pháp sắc ký cột
Dịch chiết enzyme đã được loại bỏ phần lớn các protein tạp nhưng vẫn
chưa đảm bảo độ đồng nhất cần thiết. Do đó dịch chiết enzyme được tiếp tục
làm sạch bằng phương pháp sắc ký cột.
Phương pháp dùng chất rây phân tử (lọc gel - gel filtration). Để đảm bảo
cho việc tách enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chất trơ, không phản
Các phương pháp tinh sạch enzyme
14
Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
ứng với protein enzyme. Chất này cũng không hòa tan và tương đối bền với
các yếu tố về cơ học cũng như sinh học. Ngoài ra chất được sử dụng cho mục
đích lọc phân tử phải là chất không có tính đàn hồi (không co) và phải là chất
ưa nước (hydrophyl).
5/Phương pháp tách hệ hai pha nước.
Cơ sở kỹ thuật này dựa vào sự phân bố khác nhau của hỗn hợp trong
dung dịch hai pha không hòa tan vào nhau. Các hệ hai pha đặc trưng bằng
cách trộn các hệ dung môi vào nhau để tạo thành hai pha riêng biệt. Hệ dung
môi được sử dụng trong phương pháp này có thể là polymer/polymer như:
polyethylene glycol (PEG) và dextran hoặc polymer/muối như PEG và
potassium phosphate, sodium sulphate, sodium phosphate,... Các protein và
mảnh vỡ tế bào có khả năng hòa tan khác nhau giữa hai pha, vì vậy phương
pháp này có thể được dùng cho cả hai trường hợp: phân tách protein khỏi
mảnh vỡ tế bào và phân chia các enzyme trong suốt quá trình tinh sạch
protein. Hệ hai pha nước được xem là phương pháp tốt cho việc phân tách và
tinh sạch các hỗn hợp, vì phân tách chất lỏng có mật độ khác nhau dễ dàng
hơn phân tách các chất rắn ra khỏi các chất lỏng. So với các phương pháp tinh

sạch khác thì hệ hai pha nước có một số ưu điểm hơn như: có độ hòa tan trong
nước của hai pha lớn (70-80%), đạt độ tinh sạch cao, hiệu suất cao, dễ dàng
sử dụng ở quy mô lớn và đặc biệt polymer được tái sử dụng.
Các phương pháp tinh sạch enzyme
15
Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
Sự phân tách đạt hiệu quả cao tùy thuộc vào các thông số như khối lượng
phân tử và điện tích của đối tượng nghiên cứu, nồng độ và khối lượng phân tử
của các polymer, nhiệt độ, pH, thời gian, lực ion của hỗn hợp và sự hiện diện
của các loại muối đa hóa trị như phosphaste hoặc sulphate...
6/ Ngoài ra còn có các phương pháp :
- Phương pháp dùng chất hấp phụ đặc hiệu sinh học
- Phương pháp sắc ký ái lực (affinity chromatography)
Hiện nay, chưa có một phương pháp chuẩn nào thật sự có hiệu quả trong
việc làm sạch enzyme.Do đó, việc làm sạch chỉ thật sự có hiệu quả khi ta biết
lựa chọn các phương pháp riêng,kết hợp với nhau, tạo ra hệ thống phương
pháp nối tiếp với nhau một cách hài hòa nhất.
Các phương pháp tinh sạch enzyme
16
Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
V/Quy trình sản xuất
1/Từ nguồn thực vật
a.Enzyme bromel
Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm
sulfhydryl, có khả năng phân giải protein được thu nhận từ họ bromeliaceae,
đặc biệt là ở cây dứa (thân và trái).
Enzyme bromelin có thể thu được từ trong thân, trong phần thịt quả và
trong chồi quả. Tùy theo nguồn thu nhận mà người ta phân biệt bromelin thân
hay bromelin quả và bromelin thân là nhóm có giá trị kinh tế. Ở mỗi bộ phận
khác nhau trên cây dứa, bromelin có pH tối ưu khác nhau và có cấu tạo khác

nhau.
Bromelin chiếm 50% protein trong quả dứa. Nó có khả năng thủy phân
khá mạnh và hoạt động tốt ở pH từ 6-8. Bromelin có hoạt tính xúc tác sự phân
giải protein tương tự như papain trong mủ đu đủ hay ficin trong cây thuộc họ
Sung. Enzyme bromelin có trọng lượng phân tử khoảng 33.000 DA, lớn gấp
1,5 lần so với papain.
Thịt quả dứa chỉ có hoạt tính enzyme bromelin khoảng từ 3 tháng trước
khi chín, trong đó hoạt tính bromelin cao nhất là khoảng 20 ngày tước khi
chín. Khi trái chín, hoạt tính bromelin giảm xuống nhưng không mất hẳn.
Các phương pháp tinh sạch enzyme
17
Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
Bromelin còn có thể thu được từ trong thân dứa(trung bình có thể thu
được 3,6 kg bromelin từ 378l nước rút ra từ thân cây dứa.

Các phương pháp tinh sạch enzyme
18
Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
Việc thu nhận và tinh sạch bromelin có thể thực hiện theo sơ đồ sau:
Các phương pháp tinh sạch enzyme
Quả/thân/chồi dứa
Xay nhuyễn, lọc
Dịch lọc
Ly tâm
Bã
Chế phẩm
brommeli
n
Sấy khô
Tinh sạch

19
Dịch ly tâm
Kết tủa
Sản phẩm enzym
tinh khiết
Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
Thu dịch enzyme thô
Quả dứa hoặc thân được xoay nhuyễn, vắt kỹ, lọc bỏ bã và thu dịch lọc, ly
tâm dịch lọc với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 10 phút để lọai bỏ chát xơ sẽ
thu được dịch chiết có chứa bromelin.
Các phương pháp tách bromelin
* Phương pháp kết tủa enzyme
Đối với enzyme protein cũng như các protein enzyme khác, để có thể thu
được enzyme, điều cần thiết là phải phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh phân
tử này bằng cách bổ sung vào dung dịch protein enzyme các dung môi hoặc
các hoá chất ưa nước có ái lực với nước mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra
khỏi phân tử protein đó, giúp cho protein kết tủa xuống.
Các dung môi thường được sử dụng để kết tủa bromelin là acetone và
ethanol, còn các hóa chất khác như các muối trung tính ở nồng độ cao cũng có
thể kết tủa được enzyme.
Heinicker và Gortner đã dùng acetone để kết tủa bromelin từ thân và trái.
Bromelin trong dung dịch nước rất nhạy cảm với các dung môi hữu cơ do đó
để sự kết tủa đạt hiệu quả cao thường tiến hành quá trình kết tủa trong điều
kiện lạnh. Như vậy, nước ép từ thân và trái dứa phải được làm lạnh ở 0-4
0
C
và aceton tinh khiết ở 20
0
C.Ethanol cũng được sử dụng để kết tủa protein và
hỗn hợp bromelin-ethanol cũng phải giữ ở điều kiện nhiệt độ lạnh. Sau khi

Các phương pháp tinh sạch enzyme
20
Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
thu được kết tủa, tủa bromelin phải đươc rửa bằng aceton và làm khô thật
nhanh để bromelin không bị biến tính.
Để có thể thu nhận enzyme, việc đầu tiên là phải phá vỡ tổ chức mô có
chứa enzyme bằng các nghiền mô để thu dịch chiết có chứa bromelin rồi sau
đó dùng các tác nhân khác nhau để kết tủa bromelin. Những yếu tố chính ảnh
hưởng đến hiệu suất và chất lượng của chế phẩm enzyme đó là:
- Nồng độ của ammonium sulfate.
- pH của dịch chiết.
- Nhiệt độ kết tủa.
- Thời gian tiếp xúc của tác nhân đệm và dịch chiết.
* Phương pháp hấp phụ
Có thể sử dụng kaolin hay betonite để hấp phụ bromelin.
Cách làm: cho kaolin khô ( hoặc đã ngâm trương nở ) vào dung dịch
nước dứa sau ly tâm với tỷ lệ 25 mg kaolin/ml dung dịch nước dứa. Khuấy
đều bằng máy khuấy từ, sau đó ly tâm để thu tủa. Tủa được gọi là bromelin-
kaolin.
* Phương pháp siêu lọc
Sử dụng màng FS 50PP có giá trị lọai trừ 30.000, diện tích màng 336
cm
2
.
Các phương pháp tinh sạch enzyme
21
Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
Dịch dứa sau ly tâm được cho qua siêu lọc, trong quá tr2inh này thêm
nước cất vào để tinh sạch và thu được dung dịch cô đặc. Thu nhận tủa bằng
cách sử dụng acetone hoặc sấy thăng hoa dung dịch cô đặc.

Thu nhận bromelin bằng phương pháp sử dụng cacboxyl methyl
cellulose (CMC). Phương pháp tách bromelin bằng CMC cho phép thu được
bromelin ở dạng bột trắng có họat tính cao, thời gain nhanh và đơn giản hơn
so với các phương pháp khác.
Phương pháp tinh sạch enzyme bromelin
Enzyme bromelin được tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích, lọc
qua sephadex, phương pháp sắc ký.
* Tinh sạch bằng phươg pháp thẩm tích.
Cân 1g enzyme thô, pha trong 10ml dung dịch đệm sodium
phosphate 0,03M có pH7,2. Sau khi tất cả enzyme đã hoà tan thì cho hỗn hợp
vào túi cellophane rồi đặt túi vào cốc có chứa 1L dung dịch đệm sodium
phosphate 0,03M, pH 7,2. Túi cellophane được chuẩn bị bằng cách trước khi
dùng được tráng đầy bằng dung dịch đệm tương tự như trên. Tiến hành thẩm
tích trong 6 giờ và cứ sau 2giờ thay dung dịch đệm bên ngoài 1 lần. Dung
dịch đệm phía ngoài túi được khuấy liên tục bằng 1 máy khuấy từ. Trong quá
trình thẩm tích, để làm giảm sự biến tính của enzyme do nhiệt, người ta
thường tiến hành tinh sạch enzyme ở nhiệt độ thấp.
Các phương pháp tinh sạch enzyme
22
Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
* Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex.
- Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-50.
- Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-10.
* Tinh sạch bromelin bằng phương pháp sắc ký.
Bromelin thân được cho chảy sắc ký trên Duolite CS101 ở pH 6,05
cho 2 phân đoạn khác nhau về điện tích với hoạt tính xúc tác phân giải BAEE,
casein và glucagon.
Bromelin thân và bromelin quả thô được cho chạy sắc ký gel trên
sephadex G-75, tiếp theo sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion trên sulfo
ethyl sephadex chỉ cho một phân đoạn protein đơn có hoạt tính phân giải

protein.
b/ Enzyme papain :
Được tách từ nhựa trái đu đủ xanh, papain thuộc nhóm enzyme thuỷ
phân có nguồn gốc thực vật được nghiên cứu nhiều nhất về tính chất và cơ
chế hoạt động. papain là một sulfhydryl protease, đầu tiên đựoc tách ra bởi
Bals và cộng sự của ông, sau đó bởi Kimmel và Smith từ nhựa khô.
Thu nhận nhựa đu đủ.
Điều kiện lấy nhựa.
Cây: đang sinh trưởng tốt, không bị sâu bệnh, thân cây mập mạp cho
nhựa nhiều.
Các phương pháp tinh sạch enzyme
23
Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
Quả: lấy ở những quả đang còn xanh, vỏ quả mịn, có trọng lượng từ 0,3-
1kg là tốt nhất.
Thời gian lấy nhựa: sáng sớm, kết thcs vào giữa buổi sáng. Khi độ ẩm
không khí thấp, dòng nhựa chảy chậm và đặc, khó thu nhận.
-Mùa khô: nhựa ít, đặc, nồng độ protein cao.
-Mùa mưa: nhựa nhiêu, loãng, nồng độ protein thấp.
Tiến hành :
- Nhựa đu đủ lấy ở quả xanh còn ở trên cây.
- Dùng dao inox có đầu nhọn rạch vài đường theo quả ở chỗ đường kính
quả to nhất.
- Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thuỷ tinh màu miệng rộng trong 4-6
phút, sau khi lấy nhựa xong đậy nắp kín giữ trong tối.
- Bảo quản lạnh:
- Khi lấy nhựa cần tránh không cho các chất bẩn hoặc công trùng lẫn
vào.
- Không nên trôn nhựa khô với nhựa tươi vì nó làm giảm chất lượng.
- Khi tiến hành các thao tác với nhựa tươi, tránh không cho nhựa tiếp

xúc vào da vì nó sẽ gây bỏng. Đồng thời cũng không nên để nhựa tiếp
xúc với các dụng cụ làm từ kimloại nặng như sắt, đồng… vì nó làm
biến màu và giảm hoạt tính enzyme.
Các phương pháp tinh sạch enzyme
24
Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm
- Nhựa tươi không bền, vì thế nên sấy khô tới 5% độ ẩm.
Phương pháp thu nhận papain tinh khiết.
- Hoà tan nhựa đu đủ, mục đích là loại bỏ các chất nhựa, cặn, tạp lớn…
- Loại bỏ các chất không tan ở pH 9.
- Quá trình phân đoạn bằng ammodium sulfute.
- Quá trình phân đoạn bằng NaCl.
- Kết tinh.
- Tái kết tinh.
- Sấy chân không.
Phương pháp tinh sạch enzym tinh khiết.
* Phương pháp hấp phụ có chọn lọc.
Để thực hiện phương pháp này người ta cho dịch enzyme chảy từ từ
qua cột chất hấp phụ. Khi đó, tùy theo khả năng tương tác của chất hấp
phụ với từng loại enzyme, các enzyme khác nhau sẽ được hấp phụ trên
chất hấp phụ với khả năng khác nhau. Sau đó dùnf các dung dịch đệm
thích hợp để chiết rúr enzyme ra khỏi cột. Phương pháp hấp phụ thường
dùng để làm đặc dung dịch enzyme. Có thể hấp phụ chọn lọc các enzyme
theo 2 cách:
Các phương pháp tinh sạch enzyme
25