Giáo trình công nghệ sinh học động vật

MỞ ĐẦU
I. KHÁI NIỆM
Công nghệ Sinh học (CNSH) (Biotechnology) đòi hỏi sự tập hợp của trí tuệ, kỹ thuật dựa
trên nền tảng cơ bản của khoa học sự sống. Đó là kết quả của việc ứng dụng những nguyên lý khoa
học và công nghệ để chế tạo, sản xuất nguyên vật liệu bằng những tác nhân sinh học, nhằm tạo ra
hàng hóa và dịch vụ phục vụ con người.
Công nghệ Sinh học trên người và động vật (CNSH N&ĐV) là những kỹ thuật CNSH tiến
hành hoặc ứng dụng trên đối tượng người và động vật. Ở nước ta, CNSH trên người chưa thực sự
phát triển thành một lĩnh vực độc lập, nên thường được gọi chung là Công nghệ Sinh học Động
vật (CNSH ĐV).
CNSH ĐV có lịch sử tiềm tàng lâu dài, các kiến thức và sự ứng dụng sơ khai đã diễn ra
cách đây 8.000 năm ở khu vực Tây Bắc Á, khi con người lần đầu tiên biết săn bắt các loài động vật
hoang dại về nuôi để lấy thịt, lông, sữa…và sau đó thuần hóa chúng làm phương tiện vận chuyển.
Cách đây nhiều thập niên, con người đã có nhiều cải tiến mạnh mẽ trong chăn nuôi động
vật, biết chọn lọc những cá thể khỏe mạnh, tiêm chủng để phòng ngừa bệnh, thực hiện nhiều kỹ
thuật khác để tăng cường khả năng sinh sản của chúng. Tuy nhiên, CNSH ĐV hiện đại (dựa trên
thành tựu tế bào học và di truyền học) chỉ thật sự bắt đầu vào những năm 60 của thế kỉ XX và bùng
nổ trong hai thập kỷ gần đây.

II. NỀN TẢNG KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT
II.1. GENOMICS VÀ BỘ GEN NGƯỜI
II.1.1. Genomics
Genomics là lĩnh vực nghiên cứu về thành phần, tổ chức, chức năng và tiến hóa của thông
tin di truyền chứa trong bộ gen.
Ba lĩnh vực chính của genomics: hệ gen cấu trúc (structure genomics), hệ gen chức năng
(functional genomics), hệ gen so sánh (comparative genomics). Genomics được xem là tâm điểm
của sinh học, bởi mọi kết quả từ nghiên cứu genomics đã, và đang đóng góp tích cực vào các lĩnh
vực ứng dụng như chăm sóc sức khỏe con người, nông nghiệp, lâm nghiệp và nhiều lĩnh vực khác.
Sự phát triển nhanh chóng của genomics có sự trợ giúp của các ngành khoa học kỹ thuật khác,
chẳng hạn các thiết bị giải trình tự… Ngoài ra, sự “đua nhau” giải mã bộ gen các sinh vật từ những
năm 1990 với nhiều quy mô, nhiều mức độ khiến công việc này trở nên sôi động. Đến nay, có trên

dưới 100 loài được giải mã bộ gen.
II.1.2. Bộ gen người
Ý tưởng giải trình tự cả bộ gen người được đưa ra từ các cuộc họp được tổ chức vào những
năm 1984-1986 bởi Cơ quan Năng lượng Mỹ (U.S. Department of Energy).
Chương trình được khai trương khi Cơ quan Năng lượng và Viện sức khỏe Mỹ kết hợp. Vào
cùng thời điểm này, việc giải trình bộ gen người cũng được bắt đầu ở Pháp, Anh và Nhật bản. Với
xu hướng này, việc thành lập Tổ chức Bộ gen Người (Human Genome Organisation_HUGO) vào
mùa xuân năm 1988, đã kéo theo một số quốc gia khác cùng tham gia chương trình và có đóng góp
vào kế hoạch này, đặc biệt là Đức và Trung Quốc.
1


Tháng 6-1988, cuộc họp quan trọng về việc giải trình tự và lập bản đồ bộ gen (Genome
Mapping và Sequencing Meeting) đầu tiên được tổ chức tại Cold Spring Harbor đã chứng kiến nỗ
lực của kế hoạch giải trình tự bộ gen người của Celera Genomics (nhóm thứ hai giải trình tự bộ gen
người do Craig Venter chủ trì). Cuộc họp được xem như là một điểm nhấn ban đầu cho HGP. Nhờ
sự phát triển, hợp tác quốc tế, nhờ tiến bộ của genomics, cũng như kỹ thuật máy tính, bản phác
thảo hành động (working draft) bộ gen người đã được hoàn thành vào 26/6/2000.
Tháng 2/2001, các phân tích của bản phác thảo hành động được công bố.
Dự án bộ gen người hoàn thành và tuyên bố kết thúc vào ngày 14/4/2003, sớm hơn 2 năm ở
Hội nghị khoa học của NIH kỉ niệm 50 năm chuỗi xoắn kép DNA. Tháng 5-2006, trình tự của NST
người cuối cùng được công bố trên tạp chí Nature.
Mặc dù hầu hết các bài báo đều cho rằng bộ gen người đã hoàn thành, thật ra đến năm
2006, nó vẫn còn chưa hoàn tất và sẽ mất nhiều năm nữa mới có thể hoàn thành trọn vẹn, bởi các
vùng trung tâm của mỗi NST (như centromere) luôn bao gồm các trình tự DNA lặp lại cao, rất khó
có thể giải trình tự chúng với kỹ thuật hiện nay.
* Ứng dụng và triển vọng của việc nghiên cứu bộ gen người
Các kỹ thuật và công nghệ mới, các tiền đề được tạo ra từ HGP, và những nghiên cứu
genomics khác, đang có nhiều tác động mạnh lên khắp các ngành của khoa học sự sống.
Một số ứng dụng hiện tại và tiềm năng của việc nghiên cứu bộ gen:

- Thuốc phân tử (Molecular medicine).
- Các nguồn năng lượng và các ứng dụng môi trường.
- Đánh giá rủi ro.
- Sinh khảo cổ, nhân loại học, tiến hóa và sự di cư người.
- DNA pháp y (DNA forensic).
- Nông nghiệp, sinh sản vật nuôi và chế biến sinh học.
II.2. PROTEOMICS
II.2.1. Khái niệm
Proteomics là khoa học nghiên cứu proteome. Proteome là toàn bộ các protein được biểu
hiện bởi cả genome. Vì một số gen mã hóa cho nhiều protein khác nhau, nên kích thước của
proteome thường lớn hơn so với số lượng gen. Thỉnh thoảng khái niệm này còn sử dụng nhằm để
mô tả toàn bộ protein được biểu hiện ở một tế bào, hay một mô đặc biệt nào đó.
II.2.2. Các công cụ của proteomics
Công cụ đầu tiên của proteomics là dữ liệu. Các dữ liệu protein, EST và trình tự bộ gen
được thu thập tạo ra mục lục các protein được biểu hiện trong sinh vật. Chẳng hạn, dựa vào các
phân tích tất cả trình tự mã hóa của Drosophila, người ta thấy có đến 110 gen Drosophila mã hóa
cho các domain giống EGF, và 87 gen mã hóa cho các protein với các domain xúc tác tyrosine
kinase. Theo đó, khi tiến hành proteomics ở loài này, cần có một bản liệt kê các protein đã biết, nếu
nghiên cứu gặp phải các thông tin giới hạn, hay các dữ liệu từ phương pháp khối phổ không rõ
ràng, người ta có thể xác định thành phần protein từ sự trùng khớp với dữ liệu đã có sẵn này.

2


Công cụ thứ hai là khối phổ (Mass spectrometry_MS). Các thiết bị MS có nhiều thay đổi
trong thập niên qua, đặc biệt là độ nhạy. MS có thể thực hiện ba kiểu phân tích rất cần thiết cho
proteomics. Thứ nhất là, MS cung cấp sự đo lường chính xác khối lượng phân tử của một protein
nguyên vẹn như 100 kDa hay hơn. Do đó, phân tích MS có thể là cách tốt nhất để xác định khối
lượng phân tử (hơn cả phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide). MS cũng cung cấp sự
đo khối lượng chính xác các peptide từ quá trình protolytic. Dữ liệu từ các peptide này được tìm

kiếm trực tiếp, nhằm xác định chính xác protein mục tiêu. Cuối cùng, phân tích MS cũng cung cấp
các trình tự của peptide từ quá trình thủy giải. Các dữ liệu từ MS sẽ cung cấp chiến lược rõ ràng (và
mạnh nhất) trong việc xác định protein.
Công cụ thứ ba là các phần thu gom, kết hợp các dữ liệu MS với các trình tự protein đặc
biệt có sẵn trong cơ sở dữ liệu. Các phần mềm này sẽ lấy các dữ liệu MS không được giải thích rõ
ràng và kết hợp nó với những trình tự ở cơ sở dữ liệu protein, hay EST và trình tự bộ gen với các
thuật toán đặc biệt. Khía cạnh mạnh nhất của những công cụ này, là chúng cho phép tự động hóa
được một lượng lớn các dữ liệu MS, cho các kết hợp trình tự protein khác nhau.
Công cụ cần thiết thứ tư là kỹ thuật phân tách protein. Sự phân tách các protein có hai mục
đích trong proteomics. Thứ nhất, chúng làm đơn giản các hỗn hợp protein thành các protein đơn lẻ
hay các nhóm nhỏ. Thứ hai, bởi chúng cho phép phát hiện các khác biệt trong các mức độ protein
so sánh giữa hai mẫu, nên kỹ thuật phân tách, nhằm phân tích protein sẽ cho phép người tiến hành
xác định được các protein đặc biệt. Thông thường, phương pháp điện di protein hai chiều (2D-SDSPAGE) được sử dụng trong proteomics. Một số kỹ thuật khác cũng được sử dụng là 1D-SDSPAGE, hay sắc ký lỏng hiệu năng cao (high-performance liquid chromatograph_HPLC), các kỹ
thuật chạy điện di mao quản (Capillary electrophoresis_CE), sắc ký ái lực…
II.2.3. Các ứng dụng của proteomics
Kỹ thuật proteomics thật sự có tác động lớn với bốn ứng dụng chính.
Khai thác (Mining): xác định các protein có trong một mẫu từ cơ sở dữ liệu gen.
Ghi nhận sự biểu hiện đặc biệt (Protein-expression profiling): xác định các protein trong
một mẫu đặc biệt, cũng như chức năng của một trạng thái đặc biệt của tế bào hay cơ thể (trạng thái
biệt hóa, trạng thái phát triển, trạng thái bệnh…), hay chức năng của sự tiếp xúc với thuốc, các kích
thích hóa lý.
Lập các sơ đồ mạng lưới protein (Protein-network mapping): xác định phương thức các
protein tương tác với nhau trong các hệ thống sống.
Lập bản đồ các biến đổi protein (Mapping of protein modification): xác định phương thức
và vị trí các protein bị biến đổi.
II.3. CYTOMICS
Cytomics là nghiên cứu các quá trình sinh hóa, nhằm kết hợp các cơ chế ở mức thấp hơn
vào các quá trình ở mức tế bào và cuối cùng là cơ thể.
Cytomics giúp hiểu và tái thiết lập các quá trình chuyển hóa (genome, proteome,
metabolome), mô phỏng tế bào và các cơ thể nhỏ.

Phân tích các quá trình chuyển hóa nội bào, metabolome, giúp hiểu được mạng lưới protein,
và sự hiện diện các gen im lặng (silent gene).

3


II.4. CÔNG NGHỆ NANO VÀ MICRO
Công nghệ nano liên quan đến khả năng sắp xếp các phân tử và các nguyên tử thành các cấu
trúc phân tử. Nó có tác động chính lên máy tính, các vật liệu và sự sản xuất các công cụ, thiết bị,
khả năng can thiệp vào các cấp độ điều trị bệnh.
Các kỹ thuật thiết kế máy micro đang phát triển nhanh chóng và có nhiều ứng dụng trong
các vi dòng (microfluidic), các trong sensor, sợi quang học...
Các microrobot và nanorobot hoạt động như các robot di động nhỏ trong dịch cơ thể là công
cụ tuyệt vời cho các thao tác tế bào.
Sự ra đời của biochip là một tiến bộ vượt bậc của công nghệ sinh học nano, chúng chứa
đựng một phạm vi rộng các vấn đề nghiên cứu như genomics, proteomics, sinh học máy tính và
dược học, cũng như một số hoạt động khác. Những tiến bộ trong lĩnh vực này tạo ra những phương
pháp mới, gỡ rối cho những quá trình sinh hóa xảy ra trong tế bào, với mục đích là tìm hiểu và chữa
trị các căn bệnh cho người. Các biochip được xem là các phòng thí nghiệm thu nhỏ, bởi lẽ trên nó
có thể tiến hành hàng trăm đến hàng ngàn phản ứng sinh hóa. Biochip giúp các nhà nghiên cứu có
thể sàng lọc nhanh một lượng lớn các chất sinh học với nhiều mục đích khác nhau, từ chẩn đoán
bệnh đến phát hiện các tác nhân nguy hại sinh học.
II.5. KỸ THUẬT TẾ BÀO ĐỘNG VẬT IN VITRO
Việc các tế bào động vật có thể nuôi cấy, duy trì và tăng sinh trong các chai, lọ ngày càng
dễ dàng hơn trong phòng thí nghiệm, đã mở ra hướng mới quan trọng trong nghiên cứu CNSH
N&ĐV- đó là công nghệ tế bào động vật. Các dòng tế bào cũng được thiết lập, đây là mô hình in
vitro lý tưởng cho các nghiên cứu nói chung.
Nuôi cấy các tế bào động vật lượng lớn là nền tảng của sản xuất vaccine virus và nhiều sản
phẩm công nghệ sinh học khác. Các chất sinh học được sản xuất bằng kỹ thuật DNA tái tổ hợp
trong nuôi cấy tế bào động vật như enzyme, hormone, các kháng thể đơn dòng, interleukin…hay

các nhân tố kháng ung thư. Mặc dù nhiều protein đơn giản hơn có thể được sản xuất ở vi khuẩn,
nhưng nhiều dược chất cần sự glycosyl hóa, điều này hầu như phải được tiến hành trong tế bào
động vật.
Thu nhận, nuôi cấy và biệt hóa tế bào là một thành công mới trong lĩnh vực nuôi cấy tế bào
động vật. Tuy mới phát triển, nhưng các tế bào gốc (stem cell) đã hứa hẹn nhiều ứng dụng to lớn
trong y sinh học.

4


CHƯƠNG 1
NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
I. GIỚI THIỆU
I.1. LƯỢC SỬ PHÁT TRIỂN
Kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào động vật là kỹ thuật nuôi cấy in vitro các tế bào, mô và cơ
quan của động vật nhằm duy trì và/hay tăng sinh các tế bào, mô, cơ quan đó một cách độc lập, tách
khỏi những biến đổi của hệ thống in vivo ở điều kiện bình thường hoặc stress. Kỹ thuật này đầu tiên
được thực hiện với các mẫu mô, và tốc độ tăng sinh của chúng rất chậm.
Việc nuôi cấy mô và tế bào động vật đã được tiến hành hơn 100 năm nay, thông qua những
nghiên cứu đầu tiên nhằm tìm hiểu một số vấn đề trong lĩnh vực sinh học phát triển. Chẳng hạn
Ross Harrison (1907) đã thành công trong việc nuôi tế bào thần kinh bằng dịch huyết ếch trưởng
thành. Alexis Carrel cũng đã nuôi phôi gà trong môi trường bổ sung các chất dinh dưỡng và giữ
được tim phôi gà hoạt động đến tháng thứ ba (1912).
Năm 1955, Harry Eagle’s khẳng định dịch chiết mô phức tạp, dịch huyết và những chất
đang dùng nuôi tế bào có thể được thay bởi “một hỗn hợp các amino acid, vitamin, các co-factor,
carbohydrate và muối, bổ sung với một lượng nhỏ protein huyết thanh…”, điều này đã mở ra một
thời kỳ mới trong nuôi cấy tế bào động vật in vitro.
Sau đó, hàng loạt các kỹ thuật nhằm khai thác, biến đổi và ứng dụng các tế bào động vật
nuôi cấy in vitro được tiến hành như tạo các tế bào biến đổi di truyền, nghiên cứu sự chuyển hóa và
sinh lý tế bào, thu nhận và tạo dòng in vitro các dòng tế bào bình thường (tế bào sinh dưỡng, sinh

dục), và bất thường (tế bào ung thư) của người, cũng như của nhiều động vật khác.
Từ một thực tế là những khối u của người có thể tạo nên dòng tế bào liên tục (như dòng tế
bào Hela được Gey và cs thiết lập năm 1952), nuôi cấy mô của người đã được đầu tư nghiên cứu.
Sau đó, vào năm 1961 Hayflick và Moorhead khảo cứu về các tế bào bình thường có đời sống xác
định. Các dòng tế bào đầu tiên đã được thiết lập thành công, chúng duy trì ít nhất một phần đặc
điểm, chức năng ban đầu như các tế bào tuyến thượng thận, tế bào tuyến yên, tế bào thần kinh, tế
bào cơ...
Sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô ngày càng tinh vi, hiện đại do nhu cầu bức thiết của
hai hướng nghiên cứu chính: tạo vaccine kháng virus và nghiên cứu về ung thư.
Hiện nay, các nhà nghiên cứu đang tiến tới sử dụng dạng tế bào lai (hybridoma) giữa tế bào
động vật và tế bào ung thư, như là một hệ thống sản xuất các protein tái tổ hợp, ví dụ kháng thể đơn
dòng, vaccine, interferon… Gần đây, nuôi cấy tế bào gốc (stem cell) trở thành mũi nhọn mới trong
công nghệ tế bào, với nhiều hy vọng ứng dụng y sinh.
I.2. SƠ LƯỢC VỀ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
Các tế bào động vật có vú là tế bào eukaryote, chúng được liên kết với nhau bởi các nguyên
liệu gian bào để tạo thành mô. Mô động vật thường được phân chia theo bốn nhóm: biểu mô
(epithelium), mô liên kết (connective tissue), mô cơ (muscle) và mô thần kinh (nerve). Trong nuôi
cấy tế bào động vật, người ta phân biệt hai nhóm: các tế bào dịch huyền phù và các tế bào dính
bám.

5


- Các tế bào dịch huyền phù: là những tế bào không bám dính khi sinh trưởng trong môi
trường nuôi cấy in vitro, ví dụ các tế bào máu và tế bào lympho; những tế bào này không đòi hỏi bề
mặt để sinh trưởng.
- Các tế bào dính bám: Hầu hết các tế bào động vật bình thường là các tế bào dính bám, vì
thế chúng cần có bề mặt để gắn vào và sinh trưởng (thủy tinh, plastic), được sử dụng phổ biến trong
các ứng dụng là các tế bào biểu mô và nguyên bào sợi (fibroblast). Người ta thường sử dụng đĩa
petri hoặc các chai trục lăn để nuôi cấy các tế bào dính bám. Các giá thể là polymer bọt biển

(spongy), thể gốm (ceramic), các sợi rỗng, microcapsule hoặc các thể mang có kích thước hiển vi
(microcarrier) cũng được sử dụng rộng rãi để tăng tỷ lệ diện tích/thể tích trong nuôi cấy.
Có một mối quan hệ quan trọng giữa hình dạng tế bào và tính chất bám dính của chúng.
Nếu tế bào bám dính vào bề mặt nuôi cấy, chúng sẽ có hình dài, trải rộng trên mặt đáy hộp nuôi,
ngược lại, nếu không bám dính, tế bào sẽ có hình khối cầu đều.
* Đặc điểm của các tế bào động vật
- Tế bào động vật không có vách, nhưng kích thước khá lớn (khoảng 10 µm), nên tính bền
cơ học yếu. Do đó, tế bào động vật trong nuôi cấy in vitro rất dễ vỡ bởi các lực tác động khi khuấy
trộn để tách tế bào, thao tác… Vì vậy, khi thao tác với tế bào động vật, cần cố gắng thao tác nhẹ
nhàng và trong thời gian ngắn nhất.
- Tế bào động vật có tăng trưởng và phân chia chậm, nên hiệu suất sản sinh các chất có
hoạt tính sinh học rất thấp, chậm. Do đó, để sản xuất các chất có hoạt tính từ tế bào động vật, cần
phải có thời gian dài và khối lượng tế bào lớn.
- Ở tế bào động vật, có cơ chế kìm hãm ngược (negative feed-back), có nghĩa là sự gia tăng
nồng độ của một chất nào đó trong môi trường sẽ dẫn đến ức chế tế bào tổng hợp và tiết chất đó ra
môi trường. Điều này có thể gây tổn thương tế bào, thậm chí còn có thể làm chết hàng loạt. Vì vậy,
khi nuôi cấy mô – tế bào động vật, sau mỗi khoảng thời gian nuôi cấy nhất định, cần thiết phải thay
mới môi trường nuôi.
- Trừ tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục, hầu hết các mô và tế bào động vật
cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phân chia. Thông thường tế bào tăng trưởng tốt khi gắn vào
bề mặt rắn. Tế bào sẽ ngừng phân chia khi đã hình thành lớp đơn liên tục trên bề mặt của dụng cụ
nuôi. Tuy vậy, một số dòng tế bào như tế bào ung thư, hoặc dòng tế bào liên tục từ mô bình thường,
sau khi được thuần hóa, có thể sinh trưởng và phân chia trong trạng thái lơ lửng mà không cần bám
vào nền.
- Các tế bào động vật có thể thay đổi kiểu gen và kiểu hình, thông qua quá trình dung hợp
hai tế bào có nhân khác nhau tạo thành tế bào lai (hybridoma) hoặc quá trình biến nạp. VD: chủng
tế bào bình thường có thể cảm ứng thành tế bào có các tính chất của tế bào ung thư, thông qua quá
trình biến nạp được thực hiện bởi một virus cảm ứng ung thư hoặc bằng hóa chất.
- Các dòng tế bào động vật có thể được bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng (-197oC) suốt
nhiều năm. Khi được giải đông và hoạt hóa, tế bào phục hồi khả năng tăng trưởng và phân chia như

ban đầu.
Ngoài các đặc tính trên, tế bào động vật còn có các đặc điểm khác như kém thích nghi với
môi trường, nhạy cảm với ion kim loại, và đa số tế bào động vật cần huyết thanh, hormone… để
tăng trưởng và phân chia. Tất cả những đặc điểm trên cần được lưu ý trong quá trình nuôi cấy in
vitro.

6


I.3. ƯU ĐIỂM VÀ HẠN CHẾ CỦA NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
* Ưu điểm
- Hệ thống tế bào động vật là các “nhà máy tế bào” thích hợp cho việc sản xuất các phân tử
phức tạp và các kháng thể dùng làm thuốc phòng bệnh, điều trị hoặc chẩn đoán: như các enzyme,
hormone, vaccine, kháng thể đơn dòng, thuốc trừ sâu sinh học, interferon và interleukin, các tế bào
nguyên vẹn để thử nghiệm chất độc hóa học…
- Các tế bào động vật có quá trình biến đổi hậu dịch mã chính xác (post translational
modifications) đối với các sản phẩm protein sinh-dược (biopharmaceutical protein) như phân giải
protein, liên kết tiểu đơn vị (subunit), hoặc nhiều phản ứng kết hợp khác như glycosylation,
methylation, carboxylation, amidation, hình thành các cầu nối disulfide hoặc phoshorylation các
gốc amino acid. Những sửa đổi này rất quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của sản phẩm.
Ví dụ quá trình glycosylation có thể giúp bảo vệ protein chống lại sự phân giải chúng, duy trì khả
năng ổn định cấu trúc và biến đổi kháng nguyên.
- Sản xuất các viral vector dùng trong liệu pháp gen nhằm chữa trị nhiều bệnh như ung thư,
HIV, viêm khớp, các bệnh tim mạch và xơ hóa u nang.
- Sản xuất các tế bào động vật để dùng như một cơ chất in vitro trong nghiên cứu độc chất
học và dược học.
- Phát triển công nghệ mô hoặc phát sinh cơ quan để sản xuất các cơ quan thay thế nhân tạosinh học hay các dụng cụ trợ giúp, như: da nhân tạo để chữa bỏng, mô gan để chữa viêm gan, đảo
Langerhans để chữa tiểu đường…
* Hạn chế
Mặc dù tiềm năng ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật là rất lớn, nhưng việc nuôi cấy

một số lượng lớn tế bào động vật thường gặp các khó khăn sau:
- Tế bào động vật có kích thước lớn hơn và cấu trúc phức tạp hơn tế bào vi sinh vật.
- Tốc độ sinh trưởng của tế bào động vật rất chậm so với tế bào vi sinh vật. Vì thế, sản
lượng của chúng khá thấp và việc duy trì điều kiện nuôi cấy vô trùng trong một thời gian dài
thường gặp nhiều khó khăn hơn.
- Các tế bào động vật được bao bọc bởi màng huyết tương, mỏng hơn nhiều so với thành tế
bào dày chắc thường thấy ở vi sinh vật hoặc tế bào thực vật, và kết quả là chúng rất dễ bị vỡ.
- Nhu cầu dinh dưỡng của tế bào động vật chưa được xác định một cách đầy đủ, và môi
trường nuôi cấy thường đòi hỏi bổ sung huyết thanh máu rất đắt tiền.
- Tế bào động vật là một phần của mô đã được tổ chức (phân hóa) hơn là một cơ thể đơn
vào riêng biệt như vi sinh vật.
- Hầu hết các tế bào động vật chỉ sinh trưởng khi được gắn trên một bề mặt.
I.4. MỘT SỐ KHÁI NIỆM DÒNG TẾ BÀO
- Dòng tế bào (cell line): là thuật ngữ dùng để chỉ một quần thể tế bào giống hệt nhau bắt
nguồn từ một tế bào ban đầu.
- Dòng tế bào liên tục (continued cell line; established cell line): là dòng tế bào nuôi cấy
trong điều kiện in vitro qua nhiều thế hệ, và có thể duy trì khả năng phân bào trong một thời gian
rất dài, có khi là vĩnh viễn mà không thay đổi đặc tính. Ví dụ: CHO (chinese hamster ovary: tế bào
7


buồng trứng chuột Trung quốc), Schneider-2 (tế bào phôi ruồi giấm), COS1 (tế bào thận khỉ xanh
Châu Phi), Hela (tế bào ung thư cổ tử cung người), Vero (tế bào thận khỉ xanh Châu Phi)...
- Dòng tế bào tạm thời (temporary cell line): là dòng tế bào chỉ sống trong điều kiện nuôi
cấy ở một thời gian giới hạn. Đây thường là các dòng tế bào thường (không phải ung thư).
- Tế bào sơ cấp (primary cell): là các tế bào được nuôi cấy trong điều kiện in vitro lần đầu
tiên (nuôi cấy sơ cấp) sau khi được tách ra từ khối mô.
- Tế bào thứ cấp (secondary cell): là các tế bào đã qua vài lần cấy truyền (nuôi cấy thứ cấp)
sau khi được tách từ khối mô.
I.5. CÁC CẤP ĐỘ NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Nhìn chung, trong phòng thí nghiệm thường có ba cấp độ chính: nuôi cấy cơ quan, nuôi cấy
mô phát triển sơ cấp và nuôi cấy tế bào.
I.5.1. Nuôi cấy tế bào
Tế bào trong điều kiện in vitro có những điểm khác biệt so với in vivo. Thứ nhất là tế bào
nuôi cấy in vitro không có đặc tính tương tác tế bào chuyên biệt (tương tác đa chiều) như mô của tế
bào in vivo. Thứ hai là môi trường in vitro thiếu vài thành phần liên quan đến sự điều hòa in vivo,
do đó chuyển hóa của tế bào in vitro ổn định và dễ kiểm soát hơn trong in vivo, nhưng có thể không
thực sự đại diện cho mô.
Tuy nhiên, dù thế nào đi nữa thì nuôi cấy mô – tế bào động vật cũng đã thể hiện nhiều khả
năng đặc biệt trong nghiên cứu và ứng dụng, nó đã và đang là công cụ rất hữu ích.
Có nhiều hình thức nuôi cấy khác nhau tùy đặc tính tế bào, hay tùy thuộc vào phương pháp:
nuôi cấy sơ cấp (Primary culture), nuôi cấy thứ cấp (Secondary culture), nuôi cấy huyền phù
(Suspension culture) và nuôi cấy lớp đơn (Monolayer culture).
Nuôi cấy sơ cấp: là nuôi cấy các tế bào sau khi được tách ra từ cách mảnh mô và trước lần
cấy chuyền đầu tiên. Nuôi cấy sơ cấp thường được sử dụng để khai thác các tế bào ban đầu trong
những mảnh mô, nhằm tạo ra các dòng tế bào mới.
Trong nuôi cấy sơ cấp, các tế bào ban đầu thường là một hỗn hợp các dòng khác nhau, hoặc
chứa một kiểu tế bào trội nhất, trong đó có những tế bào quan tâm và những tế bào khác (tế bào
nhiễm). Có thể loại bỏ các tế bào nhiễm bằng cơ học, hay enzyme khi tách mô, hay bằng cách duy
trì các điều kiện chọn lọc dương tính cho sự sống sót của một kiểu tế bào quan tâm cần thu nhận.
Quy trình nuôi cấy sơ cấp: thu nhận các mảnh sinh phẩm, các mảnh mô sống xử lý sơ bộ,
loại bỏ vi khuẩn, nấm và các thành phần không mong muốn khác
tách tạo huyền phù tế bào đơn
đưa vào môi trường nuôi cấy.
Nuôi cấy thứ cấp được tiến hành sau khi tế bào được tạo dòng từ nuôi sơ cấp.
Nhiều dòng tế bào đã được thiết lập và thương mại hóa. Phần lớn các dòng này được thu
nhận từ khối u (ví dụ tế bào Hela, RD…) hay từ các tế bào bị biến đổi in vitro. Tuy nhiên, các dòng
tế bào này được nuôi cấy trong các phòng thí nghiệm khác nhau nên có thể dẫn đến sự phát sinh
các đặc tính mới khác nhau và khác với các tế bào sơ khai ban đầu. Các tế bào nuôi cấy thứ cấp là
đối tượng chính cho nghiên cứu và ứng dụng của công nghệ tế bào động vật.

Quy trình nuôi cấy thứ cấp: giải đông (đối với các tế bào được bảo quản lạnh)
môi trường thích nuôi cấy thích hợp

đưa vào

8


Nuôi cấy huyền phù thường được tiến hành với các tế bào thu nhận từ máu (bạch cầu…).
Có thể coi đây là phương pháp nuôi cấy trong không gian ba chiều với kỹ thuật nhân sinh khối
bằng fermenter, thông qua hệ thống bioreactor, nhằm thu nhận lượng lớn các tế bào mong muốn.
Nuôi cấy lớp đơn được ứng dụng với những dòng tế bào khác thu nhận từ các mô rắn (phổi,
thận, cơ, xương, mỡ…) cần nuôi phát triển thành lớp đơn. Các dòng tế bào bám dính có thể được
phân loại như tế bào nội mô: BAE-1; tế bào biểu mô: Hela; mô thần kinh: SH-SY5y hay fibroblast:
MRC-5. Thông thường, hình dạng in vitro của các tế bào sống nói trên luôn phản ánh nguồn gốc
của mô.
Ngoài ra, một số dòng tế bào khi nuôi sẽ biểu hiện trạng thái bán bám dính (semi-adheret)
như B95-8. Khi đó, trong dụng cụ nuôi sẽ xuất hiện hỗn hợp hai quần thể tế bào: các tế bào bám và
các tế bào huyền phù.
* Những thuận lợi của nuôi cấy tế bào
- Có thể phát triển một dòng tế bào qua nhiều thế hệ.
- Có thể nuôi cấy ở quy mô lớn.
* Những bất lợi của nuôi cấy tế bào
- Tế bào bị mất đi một số đặc tính đã biệt hóa trong mô.
I.5.2. Nuôi cấy mô
Nuôi cấy mô phát triển sơ cấp được tiến hành bằng cách đặt các mảnh mô lên trên bề mặt
rắn bằng nhựa, hay thủy tinh bao phủ bởi các chất dinh dưỡng dạng lỏng. Trong điều kiện thích
hợp, các mảnh mô sẽ bám vào bề mặt rắn, các tế bào ở phần rìa của mảnh mô sẽ tăng sinh làm nới
rộng mảnh mô. Kỹ thuật này cung cấp mô hình thử nghiệm thuận lợi hơn so với các thử nghiệm in
vivo, đặc biệt khi tiến hành các nghiên cứu về độc tố. Nuôi cấy mô phát triển sơ cấp còn dùng để

thu nhận các quần thể tế bào.
* Những thuận lợi của nuôi cấy mô
- Các yếu tố lý hóa của môi trường (pH, nhiệt độ, áp suất thẩm thấu, O2, CO2) được kiểm
soát tốt. Các yếu tố bổ sung có thành phần không xác định cũng đang dần được hiểu rõ và được
thay thế bởi những thành phần xác định.
- Mẫu mô không đồng nhất nhưng sau vài thế hệ nuôi cấy in vitro, những dòng tế bào này
trở nên đồng nhất hơn hay ít nhất là cùng dạng.
- Những tế bào nuôi cấy có thể tiếp xúc trực tiếp với một chất ở nồng độ thấp và xác định,
và chất này có thể xâm nhập trực tiếp vào tế bào.
- So với nuôi cấy cơ quan thì trong nuôi cấy mô, một số chức năng bình thường của mô vẫn
được duy trì và có thể nuôi cấy trên quy mô lớn (nhưng khó tiến hành).
* Những khó khăn của nuôi cấy mô
- Tổ chức ban đầu của mô bị mất.
- Kỹ thuật nuôi cấy cần được thực hiện ở điều kiện vô trùng tuyệt đối. Tế bào động vật đòi
hỏi được cung cấp một môi trường phức hợp, giống huyết tương máu hay dịch lỏng ở kẽ các tế bào.
Do đó, đòi hỏi người thực hiện phải có kỹ năng thành thạo và hiểu biết tốt về lĩnh vực này.
- Tiêu hao nhiều công sức và tiền bạc nhưng chỉ thu được một lượng nhỏ. Giá thành việc
nuôi cấy cao, do đó chỉ nên sử dụng khi cần thiết.
9


- Sau một thời gian phân chia liên tục, có thể tạo thành các tế bào với bộ NST đa bội không
hoàn chỉnh. Ngay cả với nuôi cấy trong thời gian ngắn, mặc dù các tế bào có thể ổn định về mặt di
truyền, nhưng sự không đồng nhất về tốc độ tăng trưởng của từng tế bào có thể tạo ra sự thay đổi từ
thế hệ này sang thế hệ khác.
I.5.3. Nuôi cấy cơ quan
Kỹ thuật nuôi cấy cơ quan được phát triển từ các phương pháp nuôi cấy mô nhằm phục vụ
nghiên cứu, đây có thể là mô hình chức năng trong nhiều thử nghiệm. Đó là kỹ thuật nuôi cấy in
vitro những mảnh của một cơ quan hay cả cơ quan, duy trì cấu trúc của mô và hướng nó phát triển
bình thường. Môi trường nuôi cấy cơ quan có thể ở dạng môi trường rắn hay môi trường lỏng.

Việc nuôi cấy cơ quan thu nhận từ phôi thai dễ dàng hơn các cơ quan từ cơ thể trưởng
thành, bởi nhu cầu O2 của những mô trưởng thành lớn hơn nhiều. Vì vậy, để nuôi được các cơ quan
từ cơ thể trưởng thành phải sử dụng môi trường với các thiết bị đặc biệt.
Những thuận lợi của nuôi cấy cơ quan:
- Chức năng sinh lý bình thường của cơ quan được duy trì.
- Tế bào giữ trạng thái biệt hóa hoàn toàn.
Những bất lợi của nuôi cấy cơ quan:
- Không thể nuôi cấy quy mô lớn.
- Cơ quan nuôi cấy phát triển chậm.
- Thường xuyên phải cấy chuyền sang môi trường mới cho mọi thí nghiệm.

II. ĐIỀU KIỆN LÝ – HÓA TRONG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO ĐỘNG
VẬT
II.1. Nhiệt độ
Tế bào của các loài động vật khác nhau có nhiệt độ nuôi cấy thích hợp khác nhau. VD: tế
bào của động vật có vú và của người phát triển tốt ở 37 ± 10C, nhiệt độ tế bào của các loài chim
phát triển tốt ở 38,50C, còn tế bào của các loài côn trùng phát triển tốt ở nhiệt độ 25 ± 20C. Một số
dòng tế bào phát triển ở nhiệt độ thấp hơn thân nhiệt bình thường của cơ thể, VD: tế bào biểu mô,
tế bào tinh trùng...
Trong nuôi cấy in vitro, tế bào động vật không chịu được nhiệt độ cao hơn 20C so với nhiệt
độ phát triển thích hợp của chúng, nhưng tế bào lại có khả năng chịu đựng được nhiệt độ thấp hơn
nhiệt độ phát triển tối ưu của chúng mà rất ít ảnh hưởng đến sự phát triển của chúng sau này.
Để duy trì nhiệt độ nuôi cấy, thường phải sử dụng tủ ấm (incubator). Nhìn chung, các tủ ấm
duy trì nhiệt độ bằng cách làm ấm và tuần hoàn khí nóng để đáp ứng với những thay đổi nhiệt và sẽ
trả lại nhiệt độ nhanh chóng sau khi mở hay đóng cửa tủ. Đối với các tủ ấm có bổ sung nước ở khay
bên dưới sẽ duy trì độ ẩm cao.
II.2. pH
pH không chỉ quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng ion thích hợp mà còn duy trì chức
năng tối ưu của các enzyme nội bào, cũng như sự gắn kết của các hormone và nhân tố tăng trưởng
lên các receptor bề mặt. Sự biến đổi pH có thể làm thay đổi chuyển hóa tế bào, dẫn tới sự cảm ứng

10


sản xuất protein shock nhiệt, một quá trình dẫn đến sự chết tế bào (apoptosis). Do vậy, kiểm soát
pH là cần thiết để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy.
pH tối ưu cho sự phát triển của tế bào nuôi cấy khác nhau tùy theo loài và tùy theo dòng tế
bào. Hầu hết các tế bào sống trong môi trường có ngưỡng pH 6,5 – 7,8 nên môi trường nuôi cấy
thường được điều chỉnh pH ở 7,0 – 7,4 (trung bình là 7,2). Một số dòng tế bào thích hợp với pH cao
hơn (VD: tế bào fibroblast người thích hợp với pH 7,4 – 7,7) hay thấp hơn (VD: tế bào côn trùng
phát triển tốt ở pH 6,2±0,1).
Môi trường có pH ổn định ít thay đổi có thể giúp tế bào sống tốt hơn.
Hầu hết các môi trường thương mại chứa phenol red như là một chất chỉ thị pH. Môi trường
chuyển màu vàng cho biết pH giảm (acid) và màu hồng nếu pH tăng (kiềm).
II.3. Áp suất thẩm thấu
Áp suất thẩm thấu của môi trường được xác định bởi chính công thức môi trường. Muối và
glucose là hai tác nhân chính hình thành nên áp suất thẩm thấu, mặc dù các amino acid cũng quan
trọng. Thay đổi áp suất thẩm thấu của tế bào hầu như luôn tác động lên sự tăng trưởng và chức
năng tế bào. Nếu tế bào nằm trong môi trường có áp suất không thích hợp, chúng sẽ biến dạng: tế
bào co lại trong môi trường có áp suất thẩm thấu quá cao, còn trong môi trường có áp suất quá thấp,
chúng sẽ căng phồng lên.
Để kiểm tra áp suất thẩm thấu của môi trường, thường sử dụng Osmom kế (Osmometer).
Các môi trường thương mại được thiết kế để áp suất thẩm thấu là 300 mOsm (tế bào phát triển
trong khoảng 290 - 310 mOsm).
Có thể điều chỉnh áp suất thẩm thấu bằng cách thêm NaCl, cứ 0,0292 g/lít NaCl sẽ làm tăng
1 mOsm (sử dụng 5M NaCl với 1ml/lít sẽ làm tăng áp suất thẩm thấu lên 10 mM). Chú ý là trong
môi trường còn có các thành phần đường, ion, các amino acid…chúng cũng đóng góp vào sự tạo áp
suất thẩm thấu.
II.4. Các loại khí
Ba loại khí cần quan tâm: CO2, O2 và N2. Tỷ lệ của chúng được phối trộn thích hợp theo

các chương trình thiết kế sẵn của tủ nuôi, nhờ đó các phân áp khí được tạo ra thích ứng với đặc
điểm sinh lý của tế bào và mô sống.
O2 có vai trò quan trọng trong sinh trưởng, tăng sinh và biệt hóa tế bào. Tuy nhiên, nhu cầu
về O2 của tế bào nuôi cấy thấp hơn nhu cầu O2 của mô sống. Áp suất O2 trong tủ nuôi cấy tế bào
thường thấp hơn áp suất O2 trong không khí. Trong quá trình nuôi cấy tĩnh, các phân tử oxy trong
không khí luôn có xu hướng khuếch tán vào môi trường nuôi, qua lớp môi trường dày chừng vài
milimet. Do vậy, nếu sử dụng quá nhiều môi trường trong một thể tích hẹp sẽ kìm hãm sự khuếch
tán oxy. Nồng độ O2 phổ biến dùng trong tủ nuôi tế bào thường từ 16 – 20%.
Tác động của CO2 lên nuôi cấy tế bào khó được xác định một cách chính xác, bởi nó liên
quan đến hàm lượng CO2 hòa tan, pH, nồng độ HCO3-. Áp suất CO2 trong không khí có thể điều
hòa trực tiếp nồng độ CO2 hòa tan, với sự tham gia của yếu tố nhiệt độ. Chính sự biến đổi thuận
nghịch CO2 thành HCO3- có thể sẽ làm thay đổi pH của môi trường nuôi, do vậy, nồng độ CO2
trong tủ nuôi có tính quyết định đến pH của môi trường nuôi cấy. Điều này được hiểu là, có thể
dùng nồng độ CO2 để ổn định pH của môi trường nuôi. Tùy vào mỗi loại tế bào để chọn nồng độ
CO2 tương ứng.

11


III. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào động vật phức tạp hơn rất nhiều so với môi trường
nuôi cấy vi sinh hay tế bào thực vật, thường chứa các thành phần không xác định. Do thành phần
phức tạp, khó ổn định nên người ta quan tâm dần đến nghiên cứu, tạo các môi trường tổng hợp để
có thể chủ động bảo quản, sử dụng, điều chỉnh và ổn định thành phần trong những lần nuôi cấy
khác nhau.
Môi trường nuôi cấy chứa phần lớn là nước. Nếu nguồn nước không ổn định có thể tạo nên
sự khác biệt quan trọng trong chất lượng sử dụng. Điều này đặc biệt quan trọng đối với các môi
trường không có huyết thanh, vì các hợp chất hữu cơ và kim loại hiện diện trong nước cất vô trùng
khử ion có thể gây độc nghiêm trọng đối với một số kiểu tế bào.
III.1. Vai trò của môi trường

Môi trường nuôi cấy cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của tế bào in
vitro. Các chất dinh dưỡng thiết yếu giúp tế bào phân chia như amiono acid, acid béo, đường, các
ion, các vitamine, cofactor và các phân tử cần thiết để duy trì môi trường hóa học cho tế bào. Một
số thành phần có thể giữ nhiều vai trò hơn, VD: sodium bicarbonat duy trì pH thích hợp và tạo áp
suất thẩm thấu cho môi trường.
III.2. Thành phần của môi trường
a. Muối vô cơ
Các muối vô cơ trong môi trường giữ vai trò quan trọng đối với sự phát triển tế bào in vitro,
như: cân bằng áp suất thẩm thấu, duy trì cơ chế vận chuyển chất qua màng, giúp điều hòa điện thế
màng, bám gắn tế bào, hoạt động như các cofactor...
b. Hệ đệm
Hệ đệm có vai trò điều hòa pH của môi trường nuôi cấy. Hầu hết các môi trường sử dụng hệ
đệm bicarbonate với CO2 là thành phần chính. Ngoài ra, còn có hệ thống đệm phosphat và các đệm
hữu cơ phức tạp khác. Cũng có thể sử dụng hệ đệm hữu cơ hay huyết thanh trong môi trường cơ
bản.
Khi sử dụng bicarbonate làm hệ thống đệm chính trong môi trường thì sự tương tác của CO2
thu nhận từ các tế bào (hay từ không khí) với nước, sẽ dẫn đến sự điều chỉnh pH môi trường theo
cân bằng của phương trình:
H2O + CO2 = H2CO3 = H+ + HCO-3
Sử dụng hệ đệm bicarbonate/CO2 cần duy trì không khí với 5–10% CO2 trong tủ.
Bicarbonate, CO2 rẻ, không độc đối với tế bào nên được dùng phổ biến.
Hệ đệm hữu cơ được sử dụng nhiều nhất là HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2ethane sulfonic acid). Các hệ đệm hữu cơ không nhạy cảm với CO2, chúng cung cấp một hệ thống
tốt để các tế bào chuyển hóa mạnh (sản xuất nhiều CO2) có thể ổn định pH.
Một số dung dịch đệm như Tris [Tris (hydroxymethyl) aminomethane] thường sử dụng
trong sinh hóa có thể gây độc đối với tế bào in vitro.
c. Carbohydrate
Đường trong môi trường là nguồn cung cấp C và năng lượng cho sự phát triển tế bào in
vitro. Các đường chính được sử dụng là glucose và galactose, một số môi trường còn sử dụng
12

maltose hay fructose. Nồng độ đường khác nhau giữa các môi trường cơ bản từ 1g/l– 4,5g/l. Môi
trường chứa nồng độ đường cao sẽ giúp phát triển nhiều kiểu tế bào.
d. Vitamine
Vitamine là cơ chất cho nhiều cofactor, chúng có nhiều trong thành phần huyết thanh. Tuy
nhiên, nhiều loại môi trường cần được bổ sung vitamine thích hợp bởi chúng rất quan trọng trong
nuôi cấy tế bào. Đặc biệt vitamine nhóm B cần thiết cho sự phát triển tế bào, và đối với một số tế
bào, vitamine B12 là thiết yếu. Một số môi trường có nhiều vitamine A và E. Thông thường
vitamine được sử dụng trong môi trường là riboflavin, thiamine và biotin.
e. Các protein và peptide
Các thành phần này giữ vai trò quan trọng trong nuôi cấy hầu hết các tế bào, đặc biệt khi
nuôi cấy với môi trường không huyết thanh. Một số protein, peptide rất cần thiết như albumin,
transferring, fibronectin và fetuin thường có sẵn trong huyết thanh.
f. Acid béo và lipid
Giống với protein và peptide, các chất này rất cần thiết trong môi trường nuôi không huyết
thanh và cho một số tế bào đặc biệt. Chúng hiện diện trong huyết thanh với các dạng như
cholesterol và steroid.
g. Yếu tố vi lượng
Bao gồm kẽm, đồng, selenium… và các tricarboxylic acid trung gian, trong đó selenium là
chất giúp tách các gốc oxy tự do. Ngoài ra, tùy vào mục đích nghiên cứu để có thể đưa vào môi
trường một số vi lượng cần thiết khác.
h. Huyết thanh
Trong hầu hết các loại môi trường nuôi cấy tế bào động vật đều có mặt huyết thanh bởi nó
có những vai trò quan trọng như sau:
- Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như các amino acid thiết yếu, tiền chất
của nucleic acid, các nguyên tố vi lượng…
- Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích cho tế bào tăng trưởng và phân chia.
- Kích thích sự phục hồi các tổn thương của tế bào khi cấy chuyền, và các protein trong
huyết thanh làm bất hoạt trypsin, tránh các enzym gây tổn thương tế bào.
- Cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng.

- Chống oxy hóa: huyết thanh kháng oxy hóa mạnh, và ức chế độc tính của oxy.
- Cải thiện tính dính của tế bào lên bề mặt bình nuôi nhờ các yếu tố làm tăng độ dính của tế
bào lên giá đỡ.
Huyết thanh rất cần cho việc nuôi cấy tế bào động vật. Tuy nhiên, bên cạnh những tác động
tốt nêu trên, huyết thanh cũng có những tác động không tốt:
- Nuôi cấy tế bào với môi trường bổ sung huyết thanh chi phí cao, nhất là huyết thanh bò
(FBS)
làm tăng giá thành lên đáng kể (huyết thanh chiếm 90% giá thành của môi trường nuôi
cấy).
- Huyết thanh dễ bị nhiễm virus, mycoplasm và khó ổn định chất lượng của những lô môi
trường khác nhau.
13


- Huyết thanh còn chứa những thành phần gây ức chế sự phân bào và cảm ứng sự phân hóa
(VD: TGF - có tác dụng ức chế sự phân chia của tế bào thượng bì khí quản, làm tế bào biến thành
hình có góc cạnh; TGF- còn có tác dụng kìm hãm sự phân chia của dòng tế bào biểu bì người và
chuột), (do đó khi nuôi cấy, cần chọn loại huyết thanh phù hợp không chứa yếu tố ức chế đối với
dòng tế bào nuôi cấy).
- Một số tế bào nuôi cấy không (hoặc kém) phát triển trong huyết thanh, chúng thích ứng
với các môi trường cục bộ chuyên biệt, có tính chất khác biệt rõ rệt với huyết thanh.
- Nhiều chất trong huyết thanh (vitamin C, các lipoprotein...) thường không ổn định khi
đông lạnh hay bảo quản lâu. Môi trường bổ sung huyết thanh sẽ có nồng độ hormone hay các nhân
tố tăng trưởng không thích hợp với sự phát triển của một số tế bào.
- Huyết thanh không pha loãng sẽ độc với nhiều loại tế bào (cũng có một số loại tế bào có
khả năng chịu đựng được nồng độ huyết thanh cao hơn các tế bào khác, VD: các tế bào nội mô
thành mạch vì chúng phát triển trong môi trường tương tự huyết thanh nhưng không hoàn toàn
giống huyết thanh)
- Khi mất nồng độ hormone thích hợp, huyết thanh cũng có thể chứa cơ chất ức chế sự phát
triển, biệt hóa hay chức năng. Huyết thanh cũng kích thích sự biệt hóa của các tế bào vào trạng thái

không nguyên phân, làm chúng không thể duy trì dòng tế bào bất tử.
Vì vậy, nhiều nhà nghiên cứu hướng đến xây dựng các môi trường tổng hợp không dùng
huyết thanh (như M-199) hay dùng với lượng thấp (CMRL 1066, NTCT 109). Để phát triển tế bào
trong môi trường không huyết thanh, c1o nhiều cách tiếp cận, tất cả các chiến lược này đều nhằm
kết hợp sự thay đổi liên tục với việc làm giàu các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi:
- Tạo sự thích nghi của các tế bào với môi trường không huyết thanh và không bổ sung
hormone nào.
- Sử dụng huyết thanh đã được làm giảm (hay loại bỏ hoàn toàn) các lớp hormone không
cần thiết.
- Bổ sung thường xuyên vào môi trường không huyết thanh các nhân tố tăng trưởng, bám
dính và các nhân tố phù hợp khác.
III.3. Chọn lọc môi trường thích hợp
Nếu một dòng tế bào mới được mang vào phòng thí nghiệm, cần xác định môi trường thích
hợp để phát triển. Các thông tin này có thể được đưa ra bởi nhà cung cấp. Cũng có thể tự tìm được
thông tin thông qua việc sàng lọc, thử nghiệm với nhiều loài môi trường khác nhau trong cùng điều
kiện nuôi để xác định môi trường thích hợp cho nuôi cấy những tế bào phát triển sơ cấp đầu tiên,
những dòng tế bào còn thiếu thông tin hoặc muốn tìm môi trường mới thay thế cho một dòng tế bào
nào đó.
Hiện nay, trừ những dòng tế bào đã thiết lập được thuần hóa với môi trường tổng hợp hoàn
toàn, đa số các dòng tế bào còn lại được nuôi cấy trong môi trường tổng hợp có bổ sung 5–10%
huyết thanh (có dòng tế bào cần bổ sung 20% huyết thanh). Được sử dụng phổ biến là huyết thanh
bê, cũng có một số loại tế bào đòi hỏi bổ sung huyết thanh bào thai bò trong môi trường nuôi cấy.
Ngoài huyết thanh, một số những dịch chiết sinh học phức tạp (sữa, dịch chiết phôi, huyết tương...),
các nhân tố tăng trưởng, hormone... cũng thường được bổ sung vào môi trường.

14


III.4. Kỹ thuật pha môi trường
- Thành phần môi trường: khác nhau tùy vào loại sử dụng. Khi pha môi trường cần phải

đảm bảo cung cấp đầy đủ các thành phần theo đúng công thức.
- Điều kiện nuôi cấy: thông thường các tế bào động vật phát triển tốt nhất ở nhiệt độ ấm
khoảng 36-39oC. Đặc biệt khi nuôi cấy tế bào động vật, điều kiện về độ ẩm và nồng độ CO2 trong
không khí rất quan trọng. Trong các tủ nuôi cấy tế bào động vật thường đặt một khay nước để tạo
độ ẩm cao trong không khí, tránh bốc hơi nước từ môi trường nuôi, dẫn đến thay đổi áp suất thẩm
thấu của môi trường. Nồng độ CO2 trong tủ nuôi thường 5%, đặc biệt có khi đến 95%.
- Sự vô trùng: đây là yếu tố cực kỳ quan trọng và được lưu ý đặc biệt trong nuôi cấy tế bào
động vật. Virus và các vi sinh vật ngoại nhiễm là những nguy cơ lớn, có thể làm chết tế bào nuôi
cấy. Tùy theo tính chất hóa học của các thành phần môi trường để chọn cách khử trùng thích hợp,
có thể là hấp ướt hoặc lọc vô trùng bằng milipore.

IV. KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO
IV.1. NUÔI CẤY SƠ CẤP
Quy trình nuôi sơ cấp gồm:
THU NHẬN MẪU MÔ

Cắt nhỏ
(Chọn lọc mẫu mô quan
tâm, cắt bỏ phần mô chết)

Cắt nhỏ
(Mảnh nhỏ để nuôi)

Tách tế bào bằng
cơ học (nghiền, ép)

Tách tế bào bằng
enzyme (Ủ…)

Trypsin lạnh

Nuôi mẫu
mô sơ cấp

Trypsin ấm

Collagenase

Ly tâm
NUÔI
SƠ CẤP
Thu nhận tế bào
mới
Nuôi mảnh
mô thứ cấp

Tái huyền phù

Cấy chuyền

DÒNG TẾ BÀO
Hình 1.1. Sơ đồ nuôi cấy sơ cấp

15


+ Bước 1: thu nhận mô (tươi hay đông lạnh) có chứa tế bào sống.
+ Bước 2: phẫu tích và/ hay tách rời tế bào, xác định nồng độ.
+ Bước 3: nuôi cấy.
IV.1.1. Thu nhận mẫu và xử lý sơ bộ

Mẫu thu nhận có thể bao gồm bất kỳ ở mô nào của cơ thể. Tại nơi thu nhận, mẫu cần được
làm sạch (rửa và sát trùng bằng cồn) rồi đưa vào bảo quản trong dung dịch DPBS rồi chuyển nhanh
về phòng thí nghiệm. Tùy loại mẫu mô cũng như thời gian cần thiết đưa về phòng thí nghiệm, để có
kế hoạch vận chuyển chúng trong điều kiện nhiệt độ ấm (370C), nhiệt độ lạnh hay đông lạnh tạm
thời.
Xử lý sơ bộ mẫu mô: rửa nhiều lần bằng dung dịch DPBS có bổ sung kháng sinh, kháng
nấm
cắt bỏ các phần mô chết, phần thừa
cắt mảnh nhỏ ra thành từng mảnh 2-3 mm2
nuôi
mẫu mô sơ cấp hoặc tách rời các tế bào.
VI.1.2. Tách rời các tế bào
Mô là tập hợp các tế bào được tổ chức tinh vi và đặc trưng, chúng liên kết thành một khối
thống nhất, thông qua các cầu nối gian bào. Tách các tế bào ra khỏi mô cần phá bỏ những cầu nối
liên bào này, nhưng không gây tổn thương đáng kể cho tế bào. Có hai biện pháp chính để tách rời
các tế bào:
a. Tách bằng cơ học
- Cắt nhuyễn mô: Dùng kéo cắt nhuyễn mảnh mô, huyền phù trong dung dịch PBS (-), để
lắng và thu dịch trong (huyền phù thu nhận các tế bào đơn). Phương pháp này cho khả năng sống
của tế bào cao nhưng số lượng tế bào đơn thu nhận ít nên thường được áp dụng cho những mẫu mô
có kích thước lớn và không khan hiếm.
Trên thực tế, việc cắt nhuyễn mô thường dùng để làm tăng khả năng tiếp xúc của mô với
enzyme trong kỹ thuật tách bằng enzyme được tiến hành sau đó.
- Ép nhuyễn mô sử dụng hai phiến lame: thường được sử dụng để tách tế bào ở những mô có
liên kết yếu (như mô lách). Ngoài ra còn có thể sử dụng các pittong của syringe để ép mô trong đĩa
petri nhằm tách rời các tế bào.
- Ép bằng màng lọc tế bào (Cell strainer): đặt mẫu mô lên trên màng lọc (có đường kính lỗ
70 – 100µm), sử dụng pittong của syringe để chà sát mạnh mảnh mô, khi đó, những tế bào sẽ va
chạm vào lưới lọc và tách rời. Những tế bào đơn (có đường kính nhỏ hơn lỗ lọc) sẽ lọt qua lỗ lọc.
b. Tách bằng enzyme

Cầu nối gian bào có bản chất là protein (các tế bào liên kết với nhau và với ECM), do vậy
các protease sử dụng để tách tế bào là những enzyme thuỷ phân protein như: trypsin, collagenase,
elastase, pronase, dispase hay những tổ hợp khác. Việc sử dụng enzyme có thể riêng lẻ, hay kết hợp
tùy thuộc vào mục đích.
Trypsin cắt liên kết giữa nhóm carboxyl (-COOH) của lysin hoặc arginin và gốc amin (NH2) của axid amin bất kì đứng liền kề với nó trong polypeptid, ngoại trừ liên kết giữa lysin và
arginin. Xử lý trypsin dẫn đến sự cuộn tròn tế bào. Khi các tế bào co lại, các liên kết trở nên lỏng
lẻo và tế bào dễ dàng được tách ra bởi tác động cơ học.
Trypsin hoạt động trong môi trường pH 6 – 9, tối ưu ở pH 8 – 9, rất bền vững trong môi
trường acid yếu.
16


Canxi được xem như chất bảo vệ cho trypsin, hoạt tính xúc tác của trypsin bị giảm 50% khi
vắng mặt Ca2+ vì trypsin trở nên trơ. Một số kim loại như coban, mangan… có khả năng hoạt hóa
trypsin. Hoạt tính của trypsin sẽ bị kìm hãm bởi huyết thanh bò có thai hoặc DFP (di-isopropyl
fluoro phosphate).
Nồng độ trypsin thường dùng để tách tế bào là 0,01–0,5% (thường là 0,25%), đôi khi là 1%.
Có thể sử dụng quy trình trypsin ấm (370C) hay trypsin lạnh (40C).
Trypsin không tác động đặc hiệu cho loại protein, vì vậy có thể phân cắt các protein ở màng
và gây vỡ tế bào khi dùng nồng độ cao, hoặc cho tác động trong thời gian dài. Cần trung hòa
trypsin bằng huyết thanh ngay sau khi thu đuợc tế bào đơn.
Collagenase là enzyme thủy phân các liên kết peptid dạng poly-L prolin đặc trưng cho vùng
xoắn của collagen. Collagenase thu nhận từ động vật hữu nhũ thì cắt chuỗi collagen tại những điểm
riêng biệt, còn thu nhận từ vi khuẩn thì cắt tại nhiều vị trí dọc trên chuỗi collagen.
Đa số các collagenase hoạt động ở pH trung tính hoặc hơi kiềm (pH 7- 8), nhiệt độ thích
hợp dưới 400C, và giảm hoạt tính ở nhiệt độ trên 450C. Có 4 loại collagenase:
- Collagenase loại I: chứa một lượng trung bình những hoạt chất (collagenase, caseinase,
clostripain, trypsin hoạt động). Chúng thường được dùng cho việc tách tế bào da, gan, phổi, mỡ và
những tế bào mô thượng thận.
- Collagenase loại II: chứa hợp chất clostripain nhiều hơn, được sử dụng để tách tế bào từ

tim, xương, cơ và sụn.
- Collagenase loại III: có hoạt tính phân giải protein thấp.
- Collagenase loại IV: có hoạt tính trypsin thấp, thường dùng phân tách tế bào tụy.
Collagenase và dispase phân cắt không hoàn toàn các cầu nối nên ít làm hư hại tế bào.
Người ta còn sử dụng hyaluronidase kết hợp với collagenase để phân hủy các chất dịch nội bào,
DNase được sử dụng để phân hủy các DNA thoát ra từ các tế bào bị ly giải.
Chymotrypsin có tính đặc hiệu kém hơn trypsin, nó phân giải các liên kết peptide tạo thành
bởi nhóm carboxyl của acid amin thơm (như tyrosin, phenylalanin, tryptophan, methionin và
leucin) với một nhóm amin của một acid amin khác. Chymotrypsin có pH thích hợp từ 8 – 9, và bị
ức chế bởi DFB (di-isopropyl fluoro phosphate)
Papain thủy phân protein thành các polypeptid và các acid amin. Papain chịu được nhiệt độ
tương đối cao (dạng khô không bị biến tính ở 1000C trong 3 giờ), hoạt động ở pH từ 4,5 – 8,5 (tùy
vào cơ chất để lựa chọn độ pH thích hợp nhất cho mỗi phản ứng). Papain bị kìm hãm bởi các chất
oxy hóa như oxy, ozone, hydroperoxyte, iod acetamid, thủy ngân chlobenzoate, cystin và các hợp
chất disulfur khác.
Elastase thủy phân một số lượng lớn protein nền. Elastase là enzyme duy nhất có khả năng
thủy phân elastin, một chất nền không bị tác động bởi trypsin, chymotrypsin hay pepsin.
Elastase thường được sử dụng có kết hợp với các enzyme khác như collagenase, trypsin và
chymotrypsin. Elastase là enzyme được chọn để tách tế bào từ phôi.
c. Tách tế bào bằng các phương pháp khác
+ Phương pháp ly tâm theo gradient tỷ trọng: được sử dụng để phân tách tinh trùng hay các
tế bào đơn nhân trong máu. Môi trường ly tâm thường sử dụng là Percoll, Ficoll…

17


VD: Quy trình Ficoll dùng để phân tách tế bào máu đơn nhân:
- Pha loãng máu (có chất chống đông) 2 lần với dung dịch đệm PBS
- Đặt 35 ml máu pha loãng lên 15ml Ficoll, ly tâm ở tốc độ 400g trong 20 phút ở 240C
- Thu dịch nổi, huyền phù trong cùng một lượng dung dịch đệm

- Ly tâm lần nữa ở tốc độ 500g trong 20 phút ở 240C
- Thu cặn, huyền phù trong cùng một lượng dung dịch đệm
- Bảo quản dịch huyền phù tế bào ở 2 – 80C
+ Phương pháp tách tế bào dựa vào marker bề mặt (là những receptor bề mặt của tế bào):
được sử dụng để đánh dấu và phân lập tế bào gốc. Những tế bào gốc hiếm hoi được chọn từ hàng
triệu tế bào khác. Dịch tế bào được đính một phân tử huỳnh quang vào receptor, dưới tác dụng của
lực đẩy, dịch (có tế bào) sẽ đi qua một đầu kim rất nhỏ, sao cho mỗi lần chỉ có một tế bào. Ở đầu ra
của kim là một nguồn ánh sáng, thường là tia laser và sau đó là một điện trường. Những tế bào phát
huỳnh quang sẽ mang điện tích âm, còn những tế bào không phát huỳnh quang mang điện tích
dương. Sự tích điện khác nhau như vậy cho phép thu nhận tế bào cần.
Mặc dù mỗi loại mô có những yêu cầu về điều kiện tách khác nhau, nhưng cho dù là mô
nào, khi tách tế bào để nuôi cấy đều cần lưu ý một số điểm sau:
- Các mô mỡ, mô chết, mô tạp phải được loại bỏ ra trong quá trình tách.
- Mô nên được cắt nhuyễn bằng dụng cụ nhọn, bén để tránh hư hại tế bào.
- Enzyme sử dụng trong quá trình tách tế bào, trước đó phải được tách ra khỏi dung dịch
(bằng ly tâm), hay phải bị bất hoạt (bằng huyết thanh).
- Nồng độ tế bào thu nhận cho nuôi cấy sơ cấp phải đảm bảo, đồng thời luôn cao hơn nồng
độ tế bào nuôi cấy sau đó.
- Hồi phục tế bào bằng cách nuôi trong môi trường dinh dưỡng cao hay bổ sung huyết thanh
với nồng độ cao.
- Phân tách tế bào từ mô non hay phôi nhanh hơn, hiệu quả cao hơn, tế bào thu được nhiều
hơn, sống và tăng sinh mạnh hơn so với các mô đã trưởng thành.
IV.1.3 Nuôi cấy thu nhận tế bào
a. Nuôi tế bào sơ cấp
Ly tâm dịch tách tế bào
loại bỏ dịch nổi, thu cặn
huyền phù tế bào
đưa dịch huyền
0
phù tế bào vào bình nuôi cấy (bình Roux), bổ sung môi trường

ủ ở 37,5 C trong tủ nuôi, sau 24
giờ thay môi trường mới và tiếp tục ủ.
Sau lần nuôi cấy sơ sẽ cấp thu được các tế bào sơ cấp. Thành phần tế bào sơ cấp rất phức
tạp, bao gồm nhiều loại tế bào khác nhau cùng hiện diện trong bình nuôi. Để có dòng tế bào thuần
nhất, cần thực hiện bước tiếp là chọn dòng.
b. Nuôi cấy phát triển mảnh mô sơ cấp
Đối với trường hợp lượng mẫu mô quá ít, cần nuôi cấy nguyên mảnh mô để thu nhận tế bào,
tránh mất mẫu khi tách mô: đặt các mảnh mô trong đĩa nuôi, sử dụng cùng môi trường với môi
trường nuôi tế bào từ mô đó.

18


Các mảnh mô thường nổi, hay lơ lửng trong môi trường nuôi cấy, thường bị chết nhanh nếu
không bám vào bề mặt nuôi. Có thể bổ sung ít môi trường để tăng sự bám dính của mảnh mô vào
bề mặt dụng cụ nuôi hoặc cố định mẫu mô bằng huyết tương/ huyết thanh.
Khi các tế bào đã phát triển và lan rộng ra từ các rìa của mảnh mô, tiến hành tách bỏ mẫu
mô và thu được tế bào.
c. Cấy chuyền
Cấy chuyền rất cần để cung cấp chất dinh dưỡng và không gian cho các dòng tế bào phát
triển liên tục. Tần số và tỷ lệ pha loãng, hay nồng độ tế bào trong cấy chuyền phụ thuộc vào các đặc
tính của mỗi dòng. Nếu dòng được cấy chuyền quá thường xuyên hay nồng độ tế bào quá thấp,
chúng có thể bị mất.
Cấy chuyền bao gồm các thao tác sau:
- Tách bỏ môi trường nuôi cấy cũ.
- Rửa bề mặt giá thể nuôi (có tế bào bám).
- Tách các tế bào bám khỏi bề mặt dụng cụ nuôi.
- Pha loãng các tế bào bằng môi trường mới.
Cấy chuyền các tế bào bám dính:
- Tách bỏ môi trường khỏi hộp nuôi. Nếu các tế bào bám chặt, có thể đổ bỏ môi trường. Nếu

nhiều tế bào nổi hay bám yếu, nên lắc nhẹ và rửa, sau đó làm lỏng sự bám dính các tế bào bằng
dung dịch trypsin.
- Rửa dụng cụ nuôi với PBS.
- Bổ sung dung dịch trypsin.
- Ủ trong tủ ấm 370C chừng 2 – 3 phút (tùy kiểu tế bào và kiểu nuôi) xem dưới kính hiển
vi: nếu các tế bào có hình tròn có nghĩa là chúng đã tách ra khỏi bề mặt giá thể nuôi.
- Huyền phù với môi trường có bổ sung huyết thanh, và rửa tế bào bằng cách ly tâm ở 800
vòng/phút trong 5 – 10 phút
tái huyền phù bằng môi trường nuôi (bước này có thể bỏ nếu tỷ lệ
pha loãng cao trong môi trường có chứa huyết thanh)
Cấy chuyền các tế bào huyền phù:
Nuôi cấy các tế bào trong các flask hay các spinner có thể được duy trì bằng việc pha loãng
một lượng tương đương của huyền phù tế bào bằng môi trường tươi:
- Giữ flask đứng thẳng, dùng pipette huyền phù vài lần tách rời các cụm tế bào.
- Tách lấy một lượng huyền phù để đếm hoặc pha loãng vào bình nuôi mới ly tâm
thu
cặn, loại bỏ dịch nổi tái huyền phù cặn vón vào môi trường tươi lấy một thể tích tương đương
lượng tế bào mong muốn vào các bình nuôi và tiến hành nuôi.
IV.2. TẠO DÒNG TẾ BÀO
Việc tạo dòng đảm bảo tất cả các tế bào con cháu đều xuất phát từ một tế bào đơn và có
cùng một đặc tính di truyền. Ý nghĩa của việc tạo dòng là ngăn cản những thay đổi nhanh, và không
đoán trước trong kiểu hình nuôi cấy. Hơn nữa việc tạo dòng cho phép sàng lọc số lượng lớn các
dòng cũng như chọn lọc các dòng tế bào với đặc tính mong muốn. Nói chung việc tạo dòng cho
phép chọn lọc một chủng tế bào với các đặc tính tối ưu cho nghiên cứu.
19


Tái tạo dòng (recloning) là công việc thiết lập lại các đặc tính vốn có của dòng, một khi
chúng bị biến đổi (bởi các dòng tế bào đã thiết lập có thể tạo ra một sự biến đổi nào đó với các đặc
tính phù hợp hơn, trong môi trường nuôi nào đó).

Nếu muốn thay đổi các đặc tính tế bào thông qua đột biến hay chuyển nhiễm, thì việc tạo
dòng không cần thiết. Do đó, có thể tạo các biến đổi quan trọng trong các kiểu hình đặc biệt, sau
một vài thế hệ cấy chuyền.
Trong môi trường nuôi cấy, một tế bào riêng rẽ sẽ nguyên phân tạo nhiều tế bào con. Các tế
bào này quần tụ tại vị trí của tế bào mẹ ban đầu, hình thành nên một tập đoàn (colony). Như vậy,
các tế bào của một tập đoàn sẽ có cùng đặc tính kiểu gen và kiểu hình, hay nói cách khác, chúng
cùng một dòng.
IV.2.1. Kỹ thuật chọn dòng tế bào
Phương pháp tiến hành:
- Dùng dung dịch trypsin tách rời các tế bào từ đĩa nuôi cấy, tạo huyền phù tế bào.
- Cấy tế bào vào đĩa nuôi có môi trường mới với mật độ thấp (để các tế bào cách xa nhau
trong đĩa nuôi). Nuôi ủ tế bào cho đến khi chúng phát triển các colony riêng rẽ.
- Chọn một colony tế bào cần tạo dòng, cô lập bằng một một ống kim loại nặng có kích
thước phù hợp. Hút bỏ môi trường trong ống và tách các tế bào từ colony này bằng trypsin, cấy
sang đĩa môi trường mới.
Nếu cần thiết có thể thực hiện bước chọn dòng này vài lần nữa cho đến khi đảm bảo thu
được dòng tế bào từ một tế bào đầu tiên.
Cấy chuyền tế bào
- Đổ bỏ môi trường cũ.
- Cho PBS vào bình Roux (-), lắc nhẹ để rửa sạch tế bào chết và huyết thanh, đổ bỏ PBS (-),
lập lại 2 lần.
- Cho trypsin-EDTA cho vào bình Roux.
- Lắc nhẹ bình Roux.
- Đổ bỏ trypsin, vỗ nhẹ bình Roux để tế bào tách khỏi vách bình Roux.
- Cho 2ml E’MEM vào bình Roux, tráng đều lên bề mặt bình Roux có tế bào.
- Hút vào mỗi bình Roux mới 5ml môi trường E’MEM.
- Dùng pipette hút sục môi trường và phun đều vào bề mặt bình Roux có tế bào để tạo
huyền phù.
- Hút dịch huyền phù cho vào bình Roux mới, lắc nhẹ, ủ ở 37,50C trong tủ nuôi.
- Sau 24 giờ, đổ bỏ môi trường cũ, cho môi trường mới vào để loại bỏ trypsin và các tế bào

chết.
Một bình Roux chứa đầy tế bào có thể cấy chuyền sang 3 hoặc 4 bình Roux mới.

20


IV.2.2. Các phương pháp tạo dòng
a. Phương pháp ống syringe: giúp thu nhận các tập đoàn tế bào quan tâm được nuôi cấy
trên môi trường thạch.
Cách tiến hành:
- Tách các tế bào bằng trypsin.
- Tái huyền phù trong môi trường phát triển.
- Đếm một thể tích tế bào.
- Huyền phù tế bào.
- Thêm môi trường vào dịch huyền phù, hút–nhả bằng pipette vài lần để tách các tế bào
riêng rẽ.
- Ủ trong tủ ấm và quan sát bắt đầu vào ngày thứ 5.
- Khi tập đoàn phát triển chừng 50 – 100 tế bào, có thể “nhặt ra” các tập đoàn chọn lọc, cần
chắc chắn rằng các tập đoàn chọn lọc đủ xa khỏi các “hàng xóm cũ” của nó để vòng nhẫn tạo dòng
sẽ chỉ chứa một tập đoàn duy nhất.
- Hút bỏ môi trường và rửa với PBS.
- Trét mặt dưới một ống syringe (bằng thép không gỉ) một lớp mỡ silicone đã hấp khử
trùng. Dùng kẹp syringe vào đĩa, ấn xuống để chắc chắn nó được gắn tốt. Mỗi syringe không nên
chứa hai tập đoàn.
- Tiếp tục đến khi có 5 – 10 tập đòan/đĩa được chọn và bao phủ đều.
- Cho trypsin vào syringe, ủ đến khi các tế bào trở nên tròn và nổi lên khi kiểm tra dưới kính
hiển vi.
- Pha loãng trypsin với môi trường phát triển và cẩn thận hút đảo nhẹ khi kiểm tra dưới kính
hiển vi.
- Thêm môi trường tăng trưởng vào giếng.

- Lấp đầy các giếng với nước cất vô trùng hay PBS.
- Ủ ở 370C và kiểm tra sự phát triển hàng ngày.
b. Phương pháp pha loãng tới hạn
Ở các nồng độ pha loãng rất thấp, trong một thể tích dung dịch nhất định có thể chỉ chứa
một tế bào duy nhất. Các tế bào đơn này được nuôi cấy trong các vi giếng, hình thành một tập đoàn.
Dòng tế bào quan tâm được chọn trực tiếp từ những tập đoàn này.
Phương pháp này có thể được sử dụng với các tế bào huyền phù hay tế bào bám.
Tiến hành:
- Xử lý các đĩa nuôi bằng trypsin để thu được dịch huyền phù tế bào đơn. Quan sát, kiểm tra
dưới kính hiển vi.
- Rửa các tế bào hai lần bằng cách ly tâm ở tốc độ thấp.

21


- Điều chỉnh sao cho để thu được nồng độ 10 – 100 tế bào/ml trong môi trường phát triển
hòan chỉnh.
- Cho môi trường vào các giếng nuôi của đĩa 96 giếng, nồng độ sử dụng phụ thuộc vào hiệu
quả trải của các tế bào sử dụng. Để tối đa cơ hội có các tế bào đơn/giếng, chừng một nửa số giếng
có thể sẽ không có tế bào nào.
- Từ 12 – 14 giờ kiểm tra các dòng sau khi trải, đánh dấu các đĩa có tế bào đơn. Nếu có
giếng có từ hai tế bào trở lên phải bỏ giếng đó.
- Các dòng có thể được trực tiếp sàng lọc từ các giếng nuôi của đĩa.
- Khi một dòng được chọn, chúng được nhặt ra và nuôi vào đĩa 24 giếng, 35mm và cuối
cùng là 100mm. Có thể sử dụng cùng loại môi trường ở lần nuôi đầu tiên.
c. Phương pháp dùng môi trường không huyết thanh
Tạo dòng trong môi trường không huyết thanh tương tự với phương pháp tạo dòng nêu trên,
ngoại trừ cần phải trung hòa trypsin với STI và rửa bằng cách ly tâm.

V. CÁC HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

V.1 HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ BÀO TRUYỀN THỐNG (NUÔI CẤY TẾ BÀO 2D)
Nuôi cấy tế bào truyền thống là phương pháp nuôi cấy trên đĩa Petri 2D, đĩa nhiều giếng 2D
hay bề mặt lam kính 2D. Tuy nhiên, cấu trúc môi trường bình thường của một tế bào trong cơ thể
sống là 3D gồm một mạng lưới phức tạp các vi sợi khuôn ngoại bào với các vi lỗ; trong đó các tế
bào được các tế bào khác bao quanh, với các ligand ngoại bào, bao gồm nhiều loại colagen, laminin
và các protein nền khác, không chỉ cho phép liên kết tế bào – tế bào, tế bào – màng cơ bản mà còn
dẫn oxy, hormone, dưỡng chất vào và loại bỏ các sản phẩm thải. Vì vậy, phương pháp nuôi cấy
truyền thống thể hiện một số hạn chế, đó là:
- Không thể thiết lập một gradient 3D “đúng” trong nuôi cấy 2D – điều này có ảnh hưởng
nhất định đến sự biệt hóa sinh học, quyết định số phận của tế bào, sự phát triển cơ quan, truyền tín
hiệu, truyền thông tin thần kinh và vô số các quá trình sinh học khác.
- Tế bào được phân lập trực tiếp từ cơ thể thường xuyên thay đổi sự chuyển hóa và các kiểu
biểu hiện gen hi được nuôi cấy 2D vì sự thích ứng của các tế bào với đĩa petri 2D đòi hỏi sự điều
chỉnh đáng kể của quần thể tế bào đang sống không chỉ để thay đổi oxy, dưỡng chất và các tương
tác ECM mà còn để loại bỏ chất thải.
- Các tế bào tăng trưởng trong môi trường 2D có thể thay đổi đáng kể khả năng xản xuất các
protein ECM của riêng chúng và thường xuyên chịu những biến đổi về hình thái (VD: gia tăng sự
trải rộng).
- Các tế bào nuôi cấy in vitro thiếu các tác nhân tín hiệu và hormone chủ yếu (như bình
thường, chúng được cung cấp đầy đủ trong cơ thể từ hệ tuần hoàn).
V.2 HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ BÀO 3D
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 3D được ứng dụng nhằm phát triển các mô và cơ quan thay thế.
Trong kỹ thuật này, người ta đưa tế bào và các nhân tố tăng trưởng vào trong các scaffold tổng hợp
(hoạt động như ECM tạm thời) để giúp các tế bào tổ chức thành các mô khác nhau (da, sụn, gan,
thần kinh, mạch...) hay thậm chí là cả cơ quan.
Scaffold là một khuôn ngoại bào nhân tạo có cấu trúc lỗ xốp, giúp điều tiết tế bào, hướng
dẫn tăng trưởng và tái tạo mô ba chiều. Sau khi được đưa vào scaffold, các tế bào sẽ bám, sau đó
22

sao chép, biệt hóa và tổ chức thành mô khỏe mạnh bình thường, cùng với việc tiết ra các thành
phần nền ngọai bào cần để tạo mô. Vì vậy, việc chọn lựa scaffold là cốt yếu để tạo ra các mô và cơ
quan có hình dạng và kích thước mong muốn. Oxy và dưỡng chất được cung cấp từ môi trường
lỏng nuôi cấy tế bào. Các tế bào bắt đầu tăng sinh và di cư vào các lỗ của scaffold.
Các polymer tổng hợp (như PGA, PLA, PLGA, PCL) và các polymer tự nhiên (alginate,
agarose, gel collagen, polyglycosaminoglican...) xuất hiện trong những thập kỷ gần đây được lựa
chọn phổ biến để chế tạo scaffold vì sự hấp dẫn, linh hoạt để ứng dụng cho sự tăng trưởng của phần
lớn các mô.
Phương pháp này cũng tồn tại một số hạn chế:
- Sự phân hủy các polymer tổng hợp (cả trong điều kiện in vitro và in vivo), giải phóng các
sản phẩm phụ có tính acid, khiến vi môi trường scaffold không lí tưởng cho sự tăng trưởng mô.
- Các polymer tự nhiên có thể gây đáp ứng miễn dịch, do đó cần làm giảm tính kháng
nguyên của chúng bằng cách khâu mạch, hoặc xử lí pepsin để loại những vùng telopeptid.
- Các phương pháp chế tạo scaffold không thể kiểm soát chính xác kích thước và hình dạng
lỗ, cũng như sự phân bố không gian của các lỗ và cấu trúc các kênh bên trong scaffold. Dung môi
còn dư đọng lại trong scaffold cũng là vấn đề quan trọng cần giải quyết vì nguy cơ độc tố và gây
ung thư cao.
- Các tế bào không thể phân bố đồng nhất trong khắp scaffold – hầu hết các tế bào không
thể di cư vào bên trong sâu hơn 500µm. Để khắc phục tình trạng này, nên cấy thêm tế bào vào
scaffold trong suốt quá trình thiết kế để kiểm soát tốt hơn sự phân bố tế bào. Tuy nhiên, điều này
không thể thực hiện được với hầu hết các quy trình thiết kế scaffold vì có liên quan đến các hóa
chất độc và nhiệt, làm tổn thương các tế bào sống.
- Các tế bào lấp đầy các lỗ và bắt đầu tiết ECM của riêng chúng, lớp tế bào trên cùng tiêu
thụ phần lớn oxy và dưỡng chất, làm hạn chế sự khuếch tán của các thành phần này, do đó làm
giảm số tế bào tiên phong di cư sâu vào bên trong scaffold. Cuối cùng, sự di cư của tế bào bị dừng
lại do thiếu oxy và dưỡng chất cung cấp.
- Ngay cả khi tế bào đã phân bố khắp scaffold quy mô lớn, vẫn cần cung cấp mạch máu để
nuôi dưỡng các tế bào ở sâu bên trong scafflod. Các mô mạch xung quanh có thể tăng trưởng vào
trong một scaffold cấy ghép, nhưng phải mất thời gian cho quá trình phát triển mạch này, các tế bào
ở sâu bên trong có thể chết khi mạch phát triển tới nơi.

V.3. NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT TRONG BÌNH KHUẤY
Hầu hết việc nuôi cấy mô tiến hành trên quy mô nhỏ, cung cấp một lượng ít tế bào để tiến
hành các thí nghiệm. Việc nuôi tế bào động vật với quy mô lớn được bắt đầu thử nghiệm từ đầu
những năm 1950 bằng cách dùng Jar Fermentor. Khi nuôi cấy tế bào động vật ở quy mô lớn, cần
chú ý một số đặc điểm không có lợi cho nuôi cấy quy mô lớn sau:
- Tế bào động vật khá lớn, khoảng 10 µm. Tính bền cơ học đối với sự khuấy yếu.
- Thời gian tăng sinh gấp đôi chậm, khoảng 1 ngày. Nhạy cảm với ion kim loại.
- Kém khả năng thích ứng với môi trường. Cần huyết thanh và hormone.
- Đa số tế bào động vật cần sống và phân chia trên một giá đỡ.
Khi tăng lượng tế bào nuôi cấy, cần phải điều chỉnh hàng loạt các thông số và thiết bị cần
thiết. Chẳng hạn, một số vấn đề cần lưu ý như chất dinh dưỡng, sự trao đổi khí (đặc biệt là oxy) và
23


việc loại bỏ các độc tố do chuyển hóa tạo ra (ammonia, lactic acid...). Để tối ưu hóa quá trình, thể
tích nuôi chừng 1 lít là tốt nhất.
Nuôi cấy tế bào động vật trong bình khuấy là bước tăng quy mô đầu tiên trong việc nuôi cấy
tế bào huyền phù tự nhiên, hay tế bào sau khi được thuần hóa, hoặc gắn tế bào với các vi vật mang.
Tế bào được nuôi cấy huyền phù trong một bình nuôi, có bộ phận cánh khuấy hoạt động nhờ từ
trường của nam châm. Ngoài ra bình nuôi cấy này còn có hai nhánh ở hai bên, thuận lợi cho việc
thêm tế bào, thay môi trường, hay cung cấp khí O2, hoặc không khí giàu CO2.
V.4. NUÔI CẤY TẾ BÀO Ở QUY MÔ PILOT VÀ SẢN XUẤT
Việc lựa chọn hệ thống và hình thức nuôi cấy phụ thuộc vào tốc độ phát triển và đặc điểm
tạo sản phẩm của các dòng tế bào.
* Hệ thống nuôi cấy: thường sử dụng là hollor-fibre (sợi rỗng) và ceramic matrix modules
(các đơn vị chất nền ceramic), bioreacter khuấy và fermentors.
Tế bào có thể được nuôi cấy trong hệ thống nuôi cấy không đồng nhất hay đồng nhất:
- Hệ thống nuôi cấy không đồng nhất: tế bào được cố định trong phòng tăng sinh. Hầu hết
các hệ thống có phòng tăng sinh với các hollow fibre, hay chất nền ceramic xốp.
- Hệ thống nuôi cấy đồng nhất: tế bào được nuôi trong bioreacter với khuấy cơ học, hay sục

khí để giữ chúng ở trạng thái huyền phù.
* Hình thức nuôi cấy gồm: batch (theo mẻ), fed-batch (theo mẻ có cung cấp thêm tế bào),
chemostat (nuôi cấy liên tục) và perfusion (chảy tràn). Batch và fed-batch được dùng phổ biến nhất.
Hình thức chemostat và perfusion thì đòi hỏi thao tác, hóa chất nhiều hơn vì nó cho phép tạo MAbs
liên tục. Tất cả các phương pháp nói trên đều có thể áp dụng được với hệ thống nuôi cấy đồng nhất
và không đồng nhất, trừ chemostat.

VI. MỘT SỐ KỸ THUẬT LIÊN QUAN
VI.1. KỸ THUẬT VÔ TRÙNG
Kỹ thuật vô trùng được thiết lập để diệt (lập hàng rào vô trùng) một phổ rộng các vi sinh vật
(động vật nguyên sinh, nấm, vi khuẩn, mycoplasma, virus...). Tùy theo từng đối tượng vi sinh vật,
đặc biệt là khả năng để kháng của chúng, để có phương pháp khử trùng đạt hiểu quả tối đa. Các
phương pháp khử trùng thường được dùng là:
- Sử dụng autoclave để tạo nước ở nhiệt độ 1210C (dạng hơi nước dưới điều kiện áp suất).
- Chiếu xạ: chiếu tia UV (Ultraviolet light), tia Gamma (Gamma ray)...
- Vô trùng bằng hóa chất: alcohol (loại 70%), khí formaldehyde...
- Vô trùng bằng lọc: sử dụng các bộ lọc vi khuẩn và nấm, bộ lọc virus, máy lọc HEPA
(High efficiency particulate air).
VI.2. QUAN SÁT TẾ BÀO
- Quan sát trực tiếp bằng mắt, trên các đĩa nuôi để nhận biết sự thay đổi của các yếu tố môi
trường nuôi: độ pH (dựa vào màu sắc của môi trường nhờ bổ sung chất chỉ thị màu pH), nồng độ
CO2 (do tủ nuôi báo), độ đục của môi trường (gây nên bởi vi sinh vật nhiễm hoặc các mảnh vỡ của
tế bào chết).
- Quan sát dưới kính hiển vi để đánh giá về hình dạng, số lượng tế bào.

24


VI.3. KIỂM SOÁT NHIỄM
Các vi sinh vật nhiễm thường được nhận biết khá dễ dàng vì thông qua những quan sát bằng

mắt hoặc quan sát dưới kính hiển vi. Những đĩa nuôi có độ acid bất thường hay có vẻ đục hay có
các quả cầu, các dây... cần được quan sát dưới kính hiển vi để phát hiện kịp thời tác nhân nhiễm.
Nếu sau khi kiểm tra khẳng định mẫu bị nhiễm, cần cách li các đĩa nuôi đó và khử trùng, đồng thời
sát trùng kính hiển vi, vị trí đặt đĩa nuôi, tay và các dụng cụ khác.
Sự nhiễm virus thường rất khó và tốn kém để phát hiện. Và khó phát hiện nhất là kiểu
nhiễm dòng tế bào này với một dòng tế bào khác (gọi là sự nhiễm chéo – cross contaminated cell
lines)– chúng có thể xảy ra nhiều năm mà không được phát hiện.
Ngăn ngừa nhiễm là điều cần thiết, đòi hỏi sự căn bằng giữa việc duy trì môi trường vô
trùng trong phòng nuôi cấy và thiết bị, thời gian và chi phí liên quan.
Cách tốt nhất để loại bỏ sự nhiễm trong nuôi cấy là bỏ đi các đĩa, vật dụng đã nhiễm. Thậm
chí, khi cần thiết sẵn sàng hủy bỏ cả các mẫu thí nghiệm.
VI.4. ĐÔNG LẠNH
Kỹ thuật đông lạnh nhằm giữ tế bào trong nitơ lỏng ở nhiều năm với khả năng sống sót cao
là thuận lợi của các nghiên cứu in vitro. Ngân hàng tế bào đông lạnh sẽ cung cấp thường kì các
dòng tế bào chuẩn, chúng được giải đông và sau đó nuôi cấy thứ cấp. Khi thiết lập dòng tế bào,
chúng có thể được bảo quản đông lạnh sau 3 – 5 lần cấy chuyền. Đối với các tế bào người bình
thường, thời gian sống in vitro có giới hạn, do vậy, đông lạnh là cách duy nhất để sử dụng dòng tế
bào này trongnhiều thí nghiệm khác nhau.
Vấn đề đặt ra là khi các tế bào qua đông lạnh và giải đông, nếu hầu hết bị chết, quần thể tế
bào không thể được đông lạnh trở lại như quy trình đã tiến hành. Quá trình đ6ong lạnh và giải đông
có thể thay đổi kiểu nhân tế bào, đặc biệt là các tế bào chuột. Do đó, đông lạnh vẫn có thể tạo ra dị
hợp trong tế bào đối với một số trường hợp.
Nếu các tế bào được giữ trong nitơ lỏng, phải cẩn thận bởi đây là cơ hội nhiễm, nhất là
nhiễm chéo, hoặc sự lan rộng các tác nhân nhiễm như mycoplasma. Cuối cùng, người ta nhận thấy
rằng các tế bào lưu trữ lại (-1800C) thường giảm sức sống.

VII. ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
- Nuôi cấy tế bào động vật để làm mô hình thử nghiệm và chẩn đoán bệnh.
- Sản xuất các hợp chất sinh học như interferon, vaccine virus, các protein (các nhân tố
đông máu và hoạt hóa plasminogene…), enzyme (Rtase…)…

- Tạo nguồn mô – tế bào động vật làm vật liệu cấy ghép: ghép tế bào tụy tạng tạo ra insulin
của heo vào người, ghép tế bào thần kinh từ thai giúp phục hồi chức năng não hay chức năng vận
động, tạo mạch máu từ nuôi cấy tế bào động mạch chủ của bò… Sự phát triển xa hơn của kỹ thuật
này trong y học là việc tạo nguồn tế bào – mô để thực hiện ghép tự thân: lấy tế bào/mô từ cơ thể
bệnh nhân để nuôi cấy in vitro, cho biệt hóa để thu được tế bào/mô ghép lại cho chính bệnh nhân
đó, phục hồi các mô tổn thương. Triển vọng lớn nhất trong lĩnh vực này là sử dụng các tế bào gốc
phôi thai.
- Sản xuất các virus diệt côn trùng bằng cách nuôi cấy các tế bào côn trùng và cho nhiễm
virus, sau đó thu chế phẩm.

25