Sản xuất Interferon alpha 2b của người (hIFN-α2b) bằng hệ thống nấm men Pichia pastoris

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
****

Sản xuất Interferon alpha 2b của người (hIFN-α2b)
bằng hệ thống nấm men Pichia pastoris
GVHD: TS. Lê Kim Hòa

Nhóm 6:
1. Hoàng Văn Dương
2. Lăng Văn Đức
3. Phạm Thị Bích Phượng
4. Nguyễn Kim Oanh


Nội dung
1. Giới thiệu hIFN-α2b và Pichia pastoris
2. Tạo dòng và biểu hiện hIFN-α2b
3. Lên men Pichia pastoris sản xuất protein hIFN-α2b
4. Lọc và tinh sạch protein hIFN-α2b

5. Đông khô protein hIFN-α2b


Interferon alpha 2b của người (hIFN-α2b)
- Gene mã hóa hIFN-α2b nằm trên
9p22 với chiều dài 498 bp.
- Protein hIFN-α2b có kích thước
165 aa, trọng lượng phân tử 19,2
kDa

- Ứng dụng trong điều trị viêm gan
B, Viên gan C và một số bệnh ung
thư (da, thân…).
/>mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=6520


Hệ thống biểu hiện Pichia pastoris
- Pichia pastoris là một eukaryote  có
thể cung cấp môi trường thích hợp cho
protein tái tổ hợp tiết và gấp cuộn cũng
như thực hiện các biến đổi sau dịch mã.
- Khi Pichia pastoris biểu hiện protein là
độc đối với tế bào thì protein đó vẫn được
duy trì sản xuất trong tế bào.
Pichia pastoris

- Có thể biểu hiện protein với hàm lượng
từ mg tới g.


Hệ thống biểu hiện Pichia pastoris
- Gen mục tiêu được sát nhập vào bộ gen của Pichia pastoris
theo con đường tái tổ hợp tương đồng tạo ra thể biến nạp ổn
định (E. coli không thể thực hiện được).
- Có một promoter mạnh AOX1. Chất cảm ứng là Methanol (rẻ
hơn chất cảm ứng khi sử dụng E coli).
- Có thể phát triển với mật độ cao hơn nhiều lần so với
S. cerevisiae.
- Có khả năng phát triển ở pH từ 3-7.

QUI TRÌNH
SẢN XUẤT
hIFN-α2b

6


Tổng hợp gene mã hóa cho hIFN-α2b

Cơ chế khuyếch đại gene mã hóa
hIFN-α2b bằng phương pháp PCR
7


Nhân dòng gen mã hóa cho hIFN-α2b
Gắn gen mã hóa hIFN α2b
vào vector pJET1.2

Biến nạp vào E. coli DH5α
(bằng pp điện biến nạp)
KT sự hiện diện của gen (LB có
Amp 50μg/ml, PCR với cặp mồi
pJET-F/pJET-R, giải trình tự)

Thu nhận vector pJET1.2 chứa
gene mã hóa hIFN-α2b

Thu vector pPIC9K
chứa gen hIFN-α2b

Biến nạp vào E. coli
DH5α (điện biến nạp)

Gắn gen hIFN-α2b vào
vector pPIC9K

Thu nhận gen hIFN-α2b
(EcoRI và NotI)
8


Biểu hiện hIFN-α2b trong Pichia pastoris
Vector pPIC9K chứa gen hIFN-α2b
được cắt SalI và chuyển vào tê bào
Pichia pastoris GS115
(bằng pp điện biến nạp)
Kiểm tra tế bào chứa protein
hIFN-α2b (YPD K/s G418 (4mg/ml)
và MM có methanol)

Kiểm tra biểu hiện protein hIFNα2b (SDS-PHAGE, lai khuẩn lạc với
kháng thể đơn dòng)

Thu dòng Pichia pastoris biểu
hiện mạnh protein hIFN-α2b
(Minimal Methanol, 20 o C/72 h
9

90

men
protein
hIFN-α2b
Lên men Lên
Pichia
pastoris
sản
xuất hIFN-α2b


Lên men Pichia pastoris sản xuất hIFN-α2b
Môi trường:
BSM: 26.7 mL 85% H3PO4, 0.93 g CaSO4, 18.2 g
K2SO4, 14.9 g MgSO4.7H2O, 4.13 g KOH, và 40.0 g
glycerol.
PTM1: 6.0 g CuSO4.5H2O, 0.08 g NaI, 3.0 g
MnSO4.H2O, 0.2 g Na2MoO4.2H2O, 0.02 g H3BO3,
0.5 g CoCl2, 20.0 g ZnCl2, 65.0 g FeSO4.7H2O, 0.2 g
biotin và 5.0 mL H2SO4. 4,35 ml PTM1 được cho vào
mỗi lit môi trường BSM.


Lên men Pichia pastoris sản xuất hIFN-α2b

• BioFlo III fermentor trang bị một bộ vi xử lý để điều
khiển DO, nhiệt độ, PH, tốc độ khuấy, tỉ lệ bổ sung môi
trường.

CÁC GIAI ĐOẠN CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN
• Tạo sinh khối
từ những tế bào
đông lạnh.


Lên men Pichia pastoris sản xuất hIFN-α2b
* Chuẩn bị chủng lên men

1. Rã đông tế bào (khoảng 1ml) ở nhiệt độ phòng sau
đó nuôi cấy lắc trong bình flask 250 ml chứa 50 ml
môi trường MGY.
2. Ủ flask trong điều kiện lắc ở 300 C trong 20-24 h khi
đó OD600nm = 3 – 4
3. Đưa chủng vào fermentor sử dụng ống tiêm vô
trùng.


Quá trình lên men
1. Glycerol Batch

• DO tăng cao
Hết glycerol
• OD600nm = 65-70


2. Glycerol fed-batch
• Giải phóng
promoter PAOX1 khỏi

sự kìm hãm
• OD600nm = 110-120

• DO spike: khóa bơm glycerol và đo thời gian xem mất bao
lâu để nồng độ oxy hòa tan tăng 10%. Khi DO tăng 10%,
bơm glycerol lại được mở ra.


3. Methanol fed-batch



Lọc protein hIFN-α2b
Tangential Flow Filtration (TFF)
- TFF chia thành microfiltration
(MF) và Ultafiltration (UF) .
- Trans-membrane pressure (TMP):

Pfeed is the feed inlet pressure,
Pretentate is the retentate outlet pressure
Ppermeate is the permeate pressure.


Lọc protein hIFN-α2b
- Sử dụng TFF cho lọc protein tạo ra bằng lên men sử
dụng Pichia pastoris vì:
+ Sản phẩm lên men chứa xấp sỉ 50% các chất rắn.
+ Protein đích được biểu hiện ra ngoài tế bào.
Sử dụng TFF cho lọc protein hIFN-α2b.

Lọc protein hIFN-α2b


Lọc protein hIFN-α2b


Lọc protein hIFN-α2b

Microfiltration system


Lọc protein hIFN-α2b


Lọc protein hIFN-α2b

Retentate tank
Permeate
tank

Permeate
tank