KHẢO SÁT SỰ TĂNG TRƯỞNG IN VITRO CỦA CÂYĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN (Angelica acutiloba (Siebold & Zucc.)Kitagawa) DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ HÓA HỌC VÀ VẬT LÝ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HOÀNG NGỌC NHUNG

KHẢO SÁT SỰ TĂNG TRƯỞNG IN VITRO CỦA CÂY
ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN (Angelica acutiloba (Siebold & Zucc.)
Kitagawa) DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ HÓA
HỌC VÀ VẬT LÝ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm – hướng Sinh lý Thực vật
Mã số chuyên ngành: 60 42 30
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. NGUYỄN THỊ QUỲNH

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2012


LỜI CÁM ƠN
Để hoàn thành luận văn, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến:
 Cô PGS. TS. Nguyễn Thị Quỳnh, người đã giảng dạy, tận tình hướng dẫn và
truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu và động viên em rất nhiều trong suốt thời
gian học tập và thực hiện luận văn. Đó sẽ mãi là hành trang trên suốt chặng đường
học tập và rèn luyện của em sau này.
 Em xin được bày tỏ lời cảm ơn đến tất cả Thầy Cô Bộ môn Sinh lý Thực vật đã
truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian
học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp.
 Các bạn chuyên ngành Sinh lý Thực vật: chị Hồng Anh, chị Linh, chị Diệu, chị
Mỹ, chị Xuân, Trúc mập đã luôn động viên và giúp đỡ Nhung suốt thời gian học
tập.

 Em xin chân thành cám ơn chị Vân, anh Hiến đã chia sẻ kinh nghiệm và giúp đỡ
em thực hiện đề tài này.
 Cám ơn gà mẹ, gà mập, gà ngố đã luôn quan tâm và giúp đỡ Nhung trong suốt
thời gian thực hiện luận văn.
 Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến Bố Mẹ, những người đã
sinh thành, chăm sóc, yêu thương, dạy bảo và luôn tạo những điều kiện tốt nhất để
con có thể học tập và hoàn thành tốt nhất luận văn tốt nghiệp.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 12 tháng 09 năm 2012
Hoàng Ngọc Nhung


i
129

MỤC LỤC
MỤC LỤC .................................................................................................................. i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................. v
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. vi
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ viii
MỞ ĐẦU..................................................................................................................... 1
1.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................... 3

1.1.

Giới thiệu sơ lược về cây Angelica acutiloba Kitagawa................................ 3

1.1.1. Phân loại ........................................................................................................ 3
1.1.2. Đặc điểm thực vật .......................................................................................... 4

1.1.3. Phân bố sinh thái ........................................................................................... 4
1.1.4. Thành phần hóa học ...................................................................................... 5
1.1.5. Công dụng dược lý......................................................................................... 6
1.1.6. Trồng và chế biến (Fukuda và cs, 2009) ....................................................... 6
1.2.

Một số nghiên cứu về cây đương quy Nhật Bản Angelica acutiloba (Siebold

& Zucc.) Kitagawa ..................................................................................................... 8
1.2.1. Trong nước .................................................................................................... 8
1.2.2. Ngoài nước ..................................................................................................... 9
1.3.

Nuôi cấy mô tế bào thực vật ........................................................................ 10

1.3.1. Nuôi cấy lớp mỏng tế bào ............................................................................ 10
1.3.2. Vi nhân giống truyền thống (conventional micropropagation) ................. 12
1.3.3. Vi nhân giống quang tự dưỡng (photoautotrophic micropropagation) .... 17
1.4.

Những đặc điểm của một số yếu tố hóa học và vật lý in vitro và ảnh hưởng

của chúng đối với sinh trưởng của cây .................................................................... 25
1.4.1. Yếu tố hóa học ............................................................................................. 25


130
ii

1.4.2. Yếu tố vật lý ................................................................................................. 28

2.

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................................ 33

2.1.

Vật liệu ......................................................................................................... 33

2.1.1. Vật liệu thí nghiệm ...................................................................................... 33
2.1.2. Vật liệu sinh trắc nghiệm ............................................................................ 33
2.1.3. Các dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm....................................................... 33
2.1.4. Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ........................................................ 33
2.1.5. Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm...................................................... 34
2.1.6. Giá thể sử dụng trong thí nghiệm ............................................................... 34
2.2.

Phương pháp................................................................................................ 35

2.2.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên sự tạo chồi đương quy Nhật
Bản từ các nguồn vật liệu khác nhau ...................................................................... 35
2.2.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ đường, vitamin và độ thông thoáng
của hộp nuôi cây lên sự tăng trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in
vitro và tác động lên cây con ex vitro ....................................................................... 37
2.2.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của thành phần khoáng và giá thể lên sự tăng
trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng ....... 39
2.2.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng
lên sự tăng trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản in vitro nuôi cấy quang tự
dưỡng ...................................................................................................................... 41
2.2.5. Quan sát hình thái giải phẫu ....................................................................... 42
2.2.6. Hàm lượng chlorophyll a, b (mg/g lá khô).................................................. 42

2.2.7. Hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh .............................. 43
2.2.8. Hàm lượng đường tổng số, hàm lượng tinh bột ......................................... 45
2.2.9. Hiệu suất quang hợp thuần Pn (µmol mol-1 h-1/cây) ................................... 46
2.2.10. Tốc độ tăng trưởng tương đối (Relative growth rate, RGR) (mg mg-1 ngày) và hiệu suất đồng hóa thuần (Net assimilation rate, NAR) (mg cm-2 ngày-2) ..... 47

1


131
5

2.2.11. Chiều dài, chiều rộng và số lượng khí khổng ............................................. 47
2.3.

Phương pháp tính toán số liệu .................................................................... 48

2.3.1. Tỷ lệ (%) cây sống trong giai đoạn ex vitro ................................................ 48
2.3.2. Gia tăng trọng lượng tươi (GTTLT) (mg/cây) ........................................... 48
2.3.3. Gia tăng trọng lượng khô (GTTLK) (mg/cây) ........................................... 48
2.3.4. Tỷ lệ trọng lượng thân lá/rễ ........................................................................ 48
2.3.5. Số lá (SL) (lá/cây) ........................................................................................ 48
2.3.6. Chiều cao tán (CCT) (mm/cây) ................................................................... 49
2.3.7. Chiều dài rễ (CDR) (mm/cây) ..................................................................... 49
2.3.8. Phần trăm chất khô (% CK) ....................................................................... 49
2.3.9. Diện tích lá (DTL) (cm2/cây) ....................................................................... 49
2.4.

Phân tích thống kê ....................................................................................... 49

2.5.

Nơi thực hiện đề tài nghiên cứu của luận văn ............................................ 49

3.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................... 50

3.1.

Kết quả ......................................................................................................... 50

3.1.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên sự tạo chồi đương quy Nhật
Bản từ các nguồn vật liệu khác nhau ...................................................................... 50
3.1.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ đường, vitamin và độ thông thoáng
của hộp nuôi cây lên sự tăng trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in
vitro và tác động lên cây con ex vitro ....................................................................... 58
3.1.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của thành phần khoáng và giá thể lên sự tăng
trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng ....... 67
3.1.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng
lên sự tăng trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản in vitro nuôi cấy quang tự
dưỡng ...................................................................................................................... 80
3.2.

Thảo luận ..................................................................................................... 95


132

3.2.1.

Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên sự tạo chồi đương quy Nhật Bản từ các

nguồn vật liệu khác nhau ......................................................................................... 95
3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường, vitamin và độ thông thoáng của hộp nuôi
cây lên sự tăng trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro và tác
động lên cây con ex vitro .......................................................................................... 98
3.2.3. Ảnh hưởng của thành phần khoáng và giá thể lên sự tăng trưởng của chồi
cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng................................. 102
3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng lên sự tăng
trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản in vitro nuôi cấy quang tự dưỡng ..... 108
4.

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................. 115

4.1.

Kết luận...................................................................................................... 115

4.2.

Đề nghị ....................................................................................................... 115

TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 116
Tài liệu tiếng Việt ................................................................................................... 116
Tài liệu tiếng Anh ................................................................................................... 117
PHỤ LỤC


7133

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
CĐHSTTV:

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

NAA:

1-naphthalene acetic acid

TDZ:

1-phenyl-3-(1,2,3-thiadiazol-5-yl)urea

QDD:

Quang dị dưỡng

QTD:

Quang tự dưỡng

Pn:

Hiệu suất quang hợp thuần (Net photosynthesis rate)

MS:

Murashige and Skoog (1962)

B5:

Gamborg’s B5 (1968)

Enshi:

Enshi-Shoho (1966)

CĐAS:

Cường độ ánh sáng

TGCS:

Thời gian chiếu sáng

GTTLT:

Gia tăng trọng lượng tươi

GTTLK:

Gia tăng trọng lượng khô

% CK:

Phần trăm chất khô

TLT:

Trọng lượng tươi

TLK:

Trọng lượng khô

SL:

Số lá

CCT:

Chiều cao tán

CDR:

Chiều dài rễ

DTL:

Diện tích lá

RGR:

Tốc độ tăng trưởng tương đối (Relative growth rate)

NAR :

Hiệu suất đồng hóa thuần (Net assimilation rate)

CD:

Chiều dài

CR:

Chiều rộng

SLKK:

Số lượng khí khổng

Chl:

Chlorophyll


134

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Bảng bố trí thí nghiệm 1 ............................................................................ 36
Bảng 2.2. Bảng bố trí thí nghiệm 2 ............................................................................ 37
Bảng 2.3. Bảng bố trí thí nghiệm 3 ............................................................................ 40
Bảng 2.4. Bảng bố trí thí nghiệm 4 ............................................................................ 41
Bảng 3.1. Sự hình thành chồi đương quy Nhật Bản theo thời gian nuôi cấy ............... 51
Bảng 3.2. Tỷ lệ chồi hình thành theo vị trí lát cắt sau 42 ngày nuôi cấy ..................... 53
Bảng 3.3. GTTLT, GTTLK, % CK, TLT rễ và TLK rễ của cây đương quy Nhật Bản in
vitro nuôi cấy trong điều kiện QTD và QDD vào ngày nuôi cấy thứ 42 ...................... 58
Bảng 3.4. CCT, CDR, SL mở và DTL của cây đương quy Nhật Bản in vitro ở các điều
kiện nuôi cấy khác nhau sau 42 ngày nuôi cấy ........................................................... 60
Bảng 3.5. Hàm lượng chlorophyll a, b, chlorophyll a + b và tỷ lệ chlorophyll a/b của

cây đương quy Nhật Bản in vitro ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau sau 42 ngày ..... 60
Bảng 3.6. GTTLT, GTTLK, % CK, TLT rễ, TLK rễ và % CK rễ của cây đương quy
Nhật Bản in vitro sau 150 ngày trồng ở vườn ươm ..................................................... 63
Bảng 3.7. Chiều cao tán, chiều dài rễ, số lá mở và diện tích lá của cây đương quy Nhật
Bản ex vitro sau 150 ngày ở vườn ươm ...................................................................... 66
Bảng 3.8. GTTLT và GTTLK của cây đương quy Nhật Bản dưới tác động của các
thành phần khoáng và giá thể vào ngày nuôi cấy thứ 21 và 42.................................... 67
Bảng 3.9. TLT rễ, TLK rễ, tỷ lệ cây có rễ thứ cấp và CDR của cây đương quy Nhật
Bản sau 42 ngày nuôi cấy ........................................................................................... 70
Bảng 3.10. SL héo, SL mở và DTL của cây đương quy Nhật Bản in vitro ở ngày nuôi
cấy thứ 21 và 42 ......................................................................................................... 76
Bảng 3.11. Hàm lượng chl a, chl b, chl a+b và tỷ lệ chl a/b của lá cây đương quy Nhật
Bản sau 42 ngày nuôi cấy ........................................................................................... 78


vii
135

Bảng 3.12. Cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng và lượng ánh sáng cung cấp/ngày
tương ứng của từng nghiệm thức trong thí nghiệm 4 .................................................. 80
Bảng 3.13. GTTLT, GTTLK và tốc độ tăng trưởng tương đối (RGR) của cây đương
quy Nhật Bản vào ngày nuôi cấy thứ 42 ..................................................................... 81
Bảng 3.14. % CK, TLK thân lá/rễ, TLK rễ và TLK lá của cây đương quy Nhật Bản sau
42 ngày nuôi cấy ........................................................................................................ 85
Bảng 3.15. SL mới, SL mở, DTL mới và DTL mở của cây đương quy Nhật Bản sau 42
ngày nuôi cấy ............................................................................................................. 86
Bảng 3.16. Tỷ lệ chl a/b, chiều dài (CD) khí khổng, Chiều rộng (CR) khí khổng và số
lượng khí khổng (SLKK) của cây đương quy Nhật Bản sau 42 ngày nuôi cấy............ 89
Bảng 3.17. Hiệu suất đồng hóa thuần (NAR), đường tổng và tinh bột của cây đương
quy Nhật Bản sau 42 ngày nuôi cấy............................................................................ 92

Bảng 3.18. Hoạt tính các CĐHSTTV nội sinh trong cây đương quy Nhật Bản sau 42
ngày nuôi cấy ............................................................................................................. 93
Bảng 3.19. Hàm lượng các ion đa lượng và tỷ lệ ion giữa các môi trường................ 106


136
10

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây đương quy Nhật Bản 3 năm tuổi ........................................................... 3
Hình 1.2. Một số hợp chất hóa học chính có trong tinh dầu Cây đương quy Nhật Bản . 5
Hình 1.3. Quy trình trồng cây đương quy Nhật Bản tại miền Bắc tỉnh Sichuan, Trung
Quốc (Fukuda và cs, 2009)........................................................................................... 7
Hình 1.4. Các loại nắp hộp nuôi cây làm tăng khả năng trao đổi khí .......................... 19
Hình 1.5. Các giai đoạn nuôi cấy trong vi nhân giống quang dị dưỡng và quang tự
dưỡng (Kozai và Kubota, 2005a)................................................................................ 22
Hình 2.1. Mẫu ban đầu: (a) phiến lá, (b) cuống lá, (c) chồi ........................................ 35
Hình 2.2. Chồi cây đương quy Nhật Bản in vitro ....................................................... 37
Hình 2.3. Sơ đồ ly trích chất điều hòa sinh trưởng thực vật........................................ 43
Hình 3.1. % mẫu tạo chồi theo thời gian .................................................................... 50
Hình 3.2. Cụm chồi đương quy Nhật Bản ở các nghiệm thức vào ngày nuôi cấy thứ 42
...................................................................................................................... 52
Hình 3.3. Sự phát sinh chồi từ lớp mỏng chồi đương quy Nhật Bản........................... 54
Hình 3.4. Sự biến đổi của phiến lá ở các nghiệm thức vào ngày thứ 42...................... 55
Hình 3.5. Sự biến đổi hình thái của cuống lá ở các nghiệm thức vào ngày thứ 42 ...... 56
Hình 3.6. Cây đương quy Nhật Bản in vitro sau 42 ngày nuôi cấy ............................. 59
Hình 3.7. Nồng độ CO2 bên ngoài (OUT) phòng nuôi cây và bên trong (IN) hộp nuôi
cây ở hai nghiệm thức QTD và QDD theo thời gian ................................................... 61
Hình 3.8. Pn của cây đương quy Nhật Bản in vitro theo thời gian nuôi cấy ................ 62
Hình 3.9. Cây đương quy Nhật Bản in vitro trồng tại vườn ươm ngày thứ 150 .......... 64

Hình 3.10. Cây đương quy Nhật Bản in vitro trồng tại vườn ươm ngày thứ 100 ........ 65
Hình 3.11. Bộ rễ của cây đương quy Nhật Bản sau 150 ngày trồng tại vườn ươm...... 65
Hình 3.12. Cây đương quy Nhật Bản sau 42 ngày nuôi cấy trên các thành phần khoáng
và giá thể khác nhau ................................................................................................... 69


137
11

Hình 3.13. Rễ đương quy Nhật Bản sau 42 ngày nuôi cấy dưới ảnh hưởng của khoáng
và giá thể.................................................................................................................... 72
Hình 3.14. Sự hình thành rễ bất định của cây đương quy Nhật Bản ở nghiệm thức EV
(khoáng Enshi, giá thể Vermiculite) ........................................................................... 73
Hình 3.15. Ảnh hưởng của thành phần khoáng và giá thể lên tỷ lệ trọng lượng khô thân
lá/rễ của cây đương quy Nhật Bản in vitro vào ngày nuôi cấy thứ 42 ......................... 75
Hình 3.16. Pn của cây đương quy Nhật Bản theo thời gian nuôi cấy........................... 79
Hình 3.17. Cây đương quy Nhật Bản sau 42 ngày nuôi cấy dưới tác động của thời gian
chiếu sáng và cường độ ánh sáng ............................................................................... 82
Hình 3.18. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng lên TLT lá và
TLT rễ của cây đương quy Nhật Bản ở ngày nuôi cấy thứ 42 ..................................... 84
Hình 3.19. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng lên chiều cao tán
và chiều dài rễ cây đương quy Nhật Bản sau 42 ngày nuôi cấy ............................. 88
Hình 3.20. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng lên chiều dài
chiều rộng và số lượng khí khổng sau 42 ngày nuôi cấy. ............................................ 90
Hình 3.21. Pn của cây đương quy Nhật Bản in vitro theo thời gian nuôi cấy .............. 91


Luận văn thạc sĩ

Danh mục

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Vai trò và chức năng các protein đặc trưng của virus cúm A..................... 3
Bảng 1.2. Các epitope virus cúm ở người được lựa chọn để kiểm tra khả năng
phòng ngừa virus ..................................................................................... 8
Bảng 1.3. Danh sách các epitope đã được dự đoán bằng phương pháp Tin Sinh học bởi
đề tài KC.04.18/06-10 ..................................................................... 15
Bảng 2.1. Trình tự nucleotide của các mồi sử dụng trong luận văn ......................... 28
Bảng 2.2. Thành phần gel điện di polyacrylamide 12,5%........................................ 42
Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ plasmid pVFT-hab .................................................. 53
Bảng 3.2. Mật độ tế bào (OD600) sau 4 giờ cảm ứng với các nồng độ IPTG khác
nhau....................................................................................................... 61
Bảng 3.3. Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ GST-H:1,2-HAeB
theo các nồng độ IPTG cảm ứng ........................................................... 62
Bảng 3.4. Mật độ tế bào (OD600) sau 4 giờ cảm ứng ở các nhiệt độ khác nhau ........ 63
Bảng 3.5. Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ GST-H:1,2HAeB theo các nhiệt độ cảm ứng khác nhau .......................................... 63
Bảng 3.6. Mật độ tế bào (OD600) sau 4 giờ cảm ứng ở các tốc độ lắc khác nhau...... 65
Bảng 3.7. Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ GST-H:1,2HAeB theo các tốc độ lắc khác nhau...................................................... 65
Bảng 3.8. Kết quả phân tích hàm lượng và độ sạch mẫu protein tinh chế bằng đo hấp
thu quang phổ ........................................................................................ 68

Trang iii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT
ANN

artificial neural network

bp

base pair

BSA

bovine serum albumin

CEP

conformational epitope prediction

CFA

complete Freund adjuvant

DNA

deoxyribose nucleic acid

dH2O

distilled water (nước cất)

dNTP

deoxynucleotide triphosphate

ĐHKHTN

Đại học Khoa học Tự nhiên

ĐHQG-HCM

Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh

E. coli

Escherichia coli

EDTA

ethylene diamine tetra acetic acid

ELISA

enzyme-linked immunosorbent assay

GST

gluthathione-S-tranferase

HA

hemagglutinin (heamagglutinin)

hab

gen mã hóa cho epitope HAeB

HAeB

epitope hemagglutinin H5N1 được nhận diện bởi tế bào B

His

polyhistidine

HMM

hiden Markov model

IFA

incomplete Freund adjuvant

IPTG

Isopropyl-β-D-thio-galactoside

IL

interleukin

INF

interferon

Kan

kanamycin

Kanr

kanamycin resistance (kháng kanamycin)

kDa

kilo Dalton

LB

môi trường Luria-Bertani

MBP

protein gắn maltose
Trang i


MCS

multiple cloning site

MDP

muramyl dipeptide

MHC

major histocompatibility complex

NA

neuraminidase

NFDM

non fat dry milk

OPD

o-phenylene diamine

PBS

phosphate buffered saline

PBST

phosphate buffered saline tween

PCR

polymerase chain reaction

PMSF

phenyl methyl sulphonyl fluoride

PTN.CNSHPT Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử

RNA

ribose nucleic acid

RNase

ribonuclease (enzyme thuỷ giải RNA)

SDS-PAGE

sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis

TEMED

N, N, N’, N’-tetramethyl-ethane-1,2-diamine

TLR

Toll-like receptor

Trx

thioredoxin

Trang ii


15

MỞ ĐẦU

Cây đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba (Siebold & Zucc.) Kitagawa) là loài
thảo dược lâu năm được sử dụng trong rất nhiều đơn thuốc tại Nhật Bản và nhiều quốc
gia châu Á trong đó có Việt Nam. Cây đương quy Nhật Bản được trồng rộng rãi tại
châu Á nhờ vào bộ rễ có chứa nhiều hợp chất có tính dược liệu cao và các lá non có thể
ăn được (Ninh và cộng sự, 2006). Chỉ tính riêng tại Nhật Bản, sản lượng rễ đương quy
Nhật Bản năm 2005 đạt xấp xỉ 197 tấn trong khi nhu cầu thực sự là vào khoảng
450 tấn hoặc nhiều hơn. Do đó, một lượng lớn rễ đương quy Nhật Bản trồng tại Trung
quốc được nhập vào Nhật Bản (Fukuda và cs, 2009).
Cây đương quy Nhật Bản được trồng tại Việt Nam từ những năm 1990 để thu
hoạch rễ dùng làm nguồn nguyên liệu thô cho ngành công nghiệp sản xuất dược liệu.
Thời gian trồng cây đương quy Nhật Bản tại Nhật Bản là 2 năm để thu được rễ trưởng
thành trong khi tại Việt Nam, do rất nhiều yếu tố bất lợi, thời gian trồng cây chỉ là 1
năm, do đó, sản lượng thấp (Phạm Văn Ý, 2000). Trong suốt quá trình phát triển, cây
đương quy Nhật Bản chịu tác động rất lớn từ các yếu tố môi trường chẳng hạn như sự
tấn công của sâu bệnh và côn trùng ảnh hưởng trực tiếp đến sản lượng và chất lượng.
Khả năng sản xuất thấp cũng như các điều kiện tự nhiên không thuận lợi đã hạn chế
việc mở rộng diện tích trồng cây đương quy Nhật Bản. Chính vì vậy, tại Việt Nam,
80% lượng rễ đương quy Nhật Bản được nhập từ Trung Quốc (Viện dược liệu, 2000).
Bên cạnh những khó khăn trong vấn đề canh tác, một trong những lý do khiến
giống cây thuốc quý này đang mất dần đi tại Việt Nam là do chất lượng giống không
đồng nhất và thiếu hụt. Cây đương quy Nhật Bản hiện nay vẫn được trồng bằng phương
pháp gieo hạt. Tuy nhiên, hạt đương quy Nhật Bản được gieo trồng tốt nhất là trong
điều kiện lạnh và phải gieo ngay sau khi hạt được thu hoạch bởi vì khả năng sống rất
ngắn và mất đi sức nảy mầm nhanh chóng của chúng (Huxley, 1992).
Từ những lý do trên, đề tài: “Khảo sát sự tăng trưởng in vitro của cây đương quy


Nhật Bản (Angelica acutiloba (Siebold & Zucc.) Kitagawa) dưới tác động của một số
yếu tố hóa học và vật lý” đã được tiến hành nhăm tim ra biện pháp nhân giống loài cây
này để tạo ra nguồn giống lớn, đồng nhất, đồng thời tìm ra môt sô điều kiện tối ưu để

gia tăng sự tăng trưởng của cây đương quy Nhật Bản. Bên cạnh đó, một số chỉ tiêu sinh
lý cũng được nghiên cứu nhằm giúp hiểu rõ hơn sự tăng trưởng của cây trong các điều
kiện in vitro khác nhau.


1.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.

Giới thiệu sơ lược về cây Angelica acutiloba (Siebold & Zucc.) Kitagawa

1.1.1. Phân loại
Giới (Kingdom):

Plantae

Ngành (Division):

Magnoliophyta

Lớp (Class):

Magnoliopsida

Bộ (Order):

Apiales

Họ (Family):

Apiaceae

Chi (Genus):

Angelica

Loài (Species):

Angelica acutiloba (Siebold & Zucc.) Kitagawa

Tên thường gọi ở Nhật là Touki, ở Việt Nam là cây đương quy Nhật Bản.

Hình 1.1. Cây đương quy Nhật Bản 3 năm tuổi
Ghi chú: A: hoa; B: hạt; C: rễ cây đương quy Nhật Bản đã phơi khô sau thu hoạch
( />

1.1.2. Đặc điểm thực vật
Cây đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba (Siebold & Zucc.) Kitagawa) là loài
thực vật thân thảo lớn, sống nhiều năm, cao 40 – 80 cm, không lông. Lá mọc so le, ở
phía dưới có cuống dài 10 – 30 cm, gốc có bẹ ngắn dạng máng, xẻ lông chim 1 – 2 lần,
lá chét phân thùy hình mác dài 2 – 7 cm, rộng 1 – 3 cm, có cuống ngắn hoặc không
cuống; các thùy lại phân nhỏ, gốc hình nêm, đầu nhọn, mép có răng to sắc; lá ở phía
ngọn tiêu giảm. Cụm hoa là tán kép, có cuống dài từ 5 – 20 cm gồm 25 – 40 tán; tổng
bao và tiểu bao giống nhau có lá bắc dạng sợi; hoa nhỏ màu trắng lục nhạt; dài không
có răng, tràng năm cánh lõm ở đầu; nhị 5, bầu hình chóp ngược, có gân lồi. Quả bế đôi,
hơi dẹt, có cạnh và gân lồi, gân ở mép rộng dạng cánh (Đỗ Huy Bích và cs, 2003).
1.1.3. Phân bố sinh thái
Chi Angelica có khoảng 70 loài, phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới Bắc bán cầu và

New Zealand. Việt Nam đã 3 lần nhập giống cây đương quy Nhật Bản từ Trung Quốc
(khoảng giữa năm 1960), Triều Tiên (1978) và gần đây là từ Nhật Bản (1996). Giống
cây đương quy Nhật Bản nhập từ Trung Quốc hiện không còn, hai giống còn lại vẫn
đang được trồng ở các tỉnh Hà Giang, Lào Cai, xung quanh Hà Nội (Đỗ Huy Bích và cs,
2003). Gần đây, diện tích trồng cây đương quy Nhật Bản được mở rộng từ cao nguyên
đến khu vực sông Hồng (Ninh và cs, 2009).
Cây đương quy Nhật Bản ưa khí hậu ẩm mát, đến mùa đông toàn bộ phần trên mặt
đất tàn lụi, phần củ dưới mặt đất chịu đựng được băng tuyết và mọc lại vào mùa xuân
năm sau. Cây đương quy Nhật Bản trồng ở Việt Nam thường cũng phải lựa chọn thời
vụ, sao cho mùa gieo hạt và sinh trưởng của cây trùng với thời gian có nhiệt độ thấp
trong năm. Theo Phạm Văn Ý (2000), thời gian gieo hạt tốt nhất là đầu tháng 10. Việc
gieo hạt vào thời điểm muộn hơn (tháng 11 đến tháng 2) sẽ dẫn đến tỷ lệ nẩy mầm cũng
như trọng lượng của rễ thu được giảm đáng kể do nhiệt độ giảm mạnh ở thời điểm này.


1.1.4. Thành phần hóa học
Cây đương quy Nhật Bản chứa nhiều các hợp chất hóa học khác nhau trong đó
quan trọng nhất là tinh dầu. Du và cs (2002) đã tiến hành phân tích các hợp chất có
trong tinh dầu cây đương quy Nhật Bản bằng GC-MS (sắc ký khí khối phổ). Kết quả
cho thấy tinh dầu chứa 47 hợp chất khác nhau trong đó ligustilide (22,8%) và
butylidenephthalide (19,5%) là những hợp chất chính.
Theo Đỗ Huy Bích và cs (2003) các hợp chất có trong cây đương quy Nhật Bản
gồm tinh dầu, coumarin, saccharid, acid amin, polyacetylen, sterol. Tinh dầu ở rễ chiếm
0,26%, chứa ligustilid 0,1941%, n-butylphtalid 0,0244%, n-butylidenephtalid
0,1762%, cnidilid, p. cymen. Tinh dầu ở lá chiếm 0,6 – 0,7% (so với khối lượng khô
tuyệt đối), chứa γ-terpinen 36,5%, p. cymen 17,1%, ligustilid 16,1%, myrcen 5,1%, βocimen 3,1%.

Hình 1.2. Một số hợp chất hóa học chính có trong tinh dầu Cây đương quy Nhật Bản
Bighelli và các cs (2010) bằng phương pháp GC(RI), GC/MS và 13C-NMR đã
phân tích các thành phần chính có trong tinh dầu của hạt đương quy Nhật Bản là

dodecyl acetate (33,0%), (Z)-ligustilide (17,4%), dodecanol (7,1%), p-cymene(6,4%),
gamma-terpinene (5,9%) và tetradecyneacetate (5,0%).
Theo Ninh và cs (2007) hàm lượng ligustilde là chỉ tiêu chính để xác định chất
lượng cho việc làm thuốc.
Fukuda và cs (2009) đã tiến hành nghiên cứu chất lượng rễ cây đương quy Nhật
Bản được trồng tại Trung Quốc và Nhật Bản. Trong đó thì các chất ligustilid, zbutylidenephtalid, falcarindiol, ferulic acid, adenosin, fructose, glucose, sucrose được
đo lường để xác định chất lượng rễ.
1.1.5. Công dụng dược lý
Cây đương quy Nhật Bản 3 năm tuổi được đào vào mùa thu để lấy rễ. Rễ được sấy
than, cắt thành lát mỏng dùng làm thuốc. Những lá non có thể ăn sống hoặc làm trà tươi
uống. Cây đương quy Nhật Bản là một vị thuốc dùng rất phổ biến trong đông y, là đầu
vị trong thuốc chữa bệnh phụ nữ, đồng thời được chỉ định trong nhiều đơn thuốc bổ và
trị bệnh như thuốc chữa thiếu máu xanh xao, đau đầu, cơ thể gầy yếu, suy tim, mệt mỏi,
đau lưng, đau ngực bụng, viêm khớp, chân tay đau nhức lạnh, tê bại, tê liệt, đại tiện táo
bón, mụn nhọt lở ngứa, tổn thương ứ huyết, kinh nguyệt không đều, đau kinh, bế kinh
(uống trước khi thấy kinh 7 ngày). Ngày uống 10 – 20 g dạng thuốc sắc hoặc rượu
thuốc (Đỗ Huy Bích và cs, 2003; Yoon và cs, 2007).
1.1.6. Trồng và chế biến (Fukuda và cs, 2009)
 Trồng
Cây đương quy Nhật Bản thường trồng 2 năm để thu hoạch rễ, tuy nhiên, một số
cây có thể được trồng đến 3 năm để thu hạt cho vụ mùa tiếp theo.
Hạt đương quy Nhật Bản được thu hoạch vào tháng 5 của năm đầu tiên và được
gieo ngay lập tức trong khoảng từ tháng 5 đến tháng 6. Những cây con được trồng giữa
những luống ngô để tránh bị khô. Vào tháng 3 hoặc tháng 4 của năm tiếp theo, cây con
với rễ cái có đường kính lớn hơn 10 mm sẽ được xử lý phương pháp “Mekuri”.
“Mekuri” là một phương pháp xử lý truyền thống được tiến hành bằng cách khoét một

lỗ trên ngọn thân cây đương quy Nhật Bản để ngăn chặn sự tăng trưởng của cuống hoa.
Cây con sau đó được chuyển sang cánh đồng và trồng nghiêng một góc 35 – 45o (Hình
1.3).

Hình 1.3. Quy trình trồng cây đương quy Nhật Bản tại miền Bắc tỉnh Sichuan, Trung
Quốc (Fukuda và cs, 2009)
 Thu hoạch và chế biến
Rễ cây đương quy Nhật Bản được thu hoạch từ giữa đến cuối tháng 12 của năm
thứ hai. Rễ đương quy Nhật Bản sau khi thu hoạch sẽ trải qua 2 lần làm khô. Ở lần làm
khô đầu tiên, rễ được treo trên các kệ để làm khô một cách tự nhiên mà không cần bất
kỳ xử lý nào khác trong khoảng từ 2 – 3 tháng.
Lần làm khô thứ hai được xử lý bằng phương pháp “Yumomi”. Đầu tiên, rễ được
ngâm trong nước nóng (khoảng 55oC) khoảng 45 – 50 phút. Bước thứ hai, rễ được chà


xát một cách cẩn thận trên một bảng đựng nước nóng (nhiệt độ của nước là vào khoảng
45oC) để rửa sạch đất và và các chất bẩn. Bước thứ ba, rễ được xếp cuộn lại. Sau khi
tiến trình Yumomi kết thúc, rễ được phơi khô dưới mặt trời khoảng 3 – 4 ngày. Sau đó,
các chân lá còn lại sẽ được loại bỏ hoàn toàn. Cuối cùng, rễ được xếp cẩn thận thành
từng đống để làm khô cho tới khi rễ trở nên chắc, bền. Lượng nước xấp xỉ 10 - 15% sau
khi làm khô.
1.2.

Một số nghiên cứu về cây đương quy Nhật Bản Angelica acutiloba (Siebold

& Zucc.) Kitagawa
1.2.1. Trong nước
Cây đương quy Nhật Bản được du nhập vào Việt Nam từ những năm 1990 và từ
đó đến nay đã có nhiều công trình về loài cây này ở Việt Nam được công bố. Nổi bật
nhất trong các nghiên cứu về cây đương quy Nhật Bản tại Việt Nam là các công trình

nghiên cứu tại Viện Dược liệu, Hà Nội (Viện Dược liệu, 2001). Có thể liệt kê một số
công trình như: Nghiên cứu chọn lọc giống cây đương quy Nhật Bản thích hợp với điều
kiện khí hậu miền Bắc Việt Nam; Trồng khảo nghiệm cây đương quy Nhật Bản
(Angelica acutiloba Kitagawa) tại 2 huyện Đồng Văn và Quản Bạ - Hà Giang; Nghiên
cứu sơ chế và bảo quản rễ củ đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba Kit.) di thực từ
Nhật Bản; Tác dụng sinh học của cây đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba Kit.) di
thực từ Nhật Bản; Kết quả thử tác dụng kích thích miễn dịch của Angala trên lâm sàng
(Angala là thuốc kích thích miễn dịch bào chế từ chế phẩm polysaccharid toàn phần
chiết xuất từ rễ củ cây đương quy Nhật Bản); Nghiên cứu đa dạng hóa sản phẩm làm
thuốc từ cây đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba Kit.) di thực từ Nhật Bản; v.v.
Có thể nhận thấy các nghiên cứu này tập trung nghiên cứu cây đương quy Nhật Bản
ngay từ khâu trồng trọt đến chế biến và tạo ra cũng như thử nghiệm các chế phẩm dược
liệu.


Bên cạnh đó, nhiều công trình về công dụng dược lý của cây đương quy Nhật Bản
cũng đã được công bố chẳng hạn như: Nghiên cứu tác dụng của cây đương quy Nhật
Bản và cây đương quy Trung Quốc với hệ đông máu in vitro của Lê Kim Loan và cs
(1998); Tác dụng phục hồi miễn dịch của polysaccharid chiết xuất từ rễ cây đương quy
Nhật Bản (Angelica acutiloba Kitagawa) thông qua thông báo số 2: Tác dụng phục hồi
đáp ứng miễn dịch dịch thể và đáp ứng miễn dịch tế bào của Nguyễn Gia Chấn và cs
(1998).
Năm 2000, Phạm Văn Ý thực hiện luận án tiến sĩ với đề tài “Nghiên cứu, tuyển
chọn và xây dựng quy trình sản xuất Angelica acutiloba Kitagawa di thực vào miền Bắc
Việt Nam”.
Năm 2009, Ninh và cs cũng đã tiến hành nghiên cứu về ảnh hưởng của việc xử lý
hạt bằng gibberellin (GA3), kinetin và nhiệt độ lên nảy mầm và sinh trưởng của cây con
A. acutiloba Kitagawa.
Năm 2012, Hoàng Ngọc Nhung và cs đã tiến hành nghiên cứu sự phát sinh cơ
quan từ lớp mỏng tế bào cây đương quy Nhật Bản Angelica acutiloba Kitagawa nuôi

cấy in vitro bằng cách sử dụng vật liệu là lớp mỏng chồi và phiến lá để tạo chồi và rễ.
1.2.2. Ngoài nước
Cây đương quy Nhật Bản được nghiên cứu ở nhiều nước từ rất sớm, tuy nhiên, đa
phần các nghiên cứu tập trung chứng minh công dụng dược liệu của loài cây này.
Kumazawa và cs (1982) đã tiến hành ly trích polysaccharide có trong dịch trích rễ cây
đương quy Nhật Bản và nhận thấy rằng nó có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch
của cơ thể. Hatano và cs (2004) đã chứng minh rằng dịch trích từ rễ cây đương quy
Nhật Bản tăng cường sự tạo máu bằng cách hoạt hóa các tế bào hồng cầu chưa trưởng
thành của chuột. Thêm vào đó, Yoon và cs (2007) cũng nhận thấy rằng dịch trích từ rễ
cây đương quy Nhật Bản còn có vai trò điều hòa đại thực bào của chuột phản ứng lại
với sự viêm.


Bên cạnh công dụng dược lý, dịch trích từ rễ cây đương quy Nhật Bản còn được
xem như là một loại thuốc trừ sâu tự nhiên. Miyazawa và cs (2004) đã chứng minh khả
năng chống lại ruồi Drosophila melanogaster nhờ vào các hợp chất phthalides và
furanocoumarins có trong dịch trích từ cây đương quy Nhật Bản. Khả năng trừ sâu của
dịch trích cây đương quy Nhật Bản được so sánh với rotenone, một hợp chất hóa học
không mùi được sử dụng rộng rãi trong việc trừ sâu bệnh. Kết quả cho thấy (Z)butylidenephthalide có hoạt tính trừ sâu mạnh hơn cả rotenone. Các tác giả này nhận
định rằng hợp chất này rất có thể là một tác nhân mới trong việc điều khiển sâu bệnh.
Watanabe và cs (1998) đã khảo sát sự tạo cụm chồi từ nuôi cấy chồi ngọn
Angelica acutiloba Kitagawa trên môi trường MS có bổ sung NAA và kinetin để tạo
nguồn vật liệu nghiên cứu nhận dạng hình thái DNA.
Ninh Thị Phíp và cs (2006, 2007) tại đại học Chiba, Nhật Bản, đã nghiên cứu về
sự nảy mầm của hạt và ảnh hưởng của nồng độ dung dịch dinh dưỡng trong hai hệ
thống khí canh và thủy canh lên sự phát triển của cây đương quy Nhật Bản Nhật Bản
ngoài vườn ươm. Hệ thống khí canh giúp cây phát triển tốt hơn, tuy nhiên do các rễ thứ
cấp là nguyên liệu thô dùng làm thuốc tại Việt Nam, hệ thống thủy canh được xem như
là thích hợp hơn vì hệ rễ thứ cấp phát triển trong hệ thống thủy canh tốt hơn.

1.3.

Nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.3.1. Nuôi cấy lớp mỏng tế bào
Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) được mô tả bởi Tran Thanh Van
K. (1973) và được thực hiện lần đầu tiên trên cây thuốc lá. Với hệ thống này, Tran
Thanh Van K. tách một hay vài lớp tế bào thực vật đã biệt hóa ra khỏi mạng lưới tương
quan giữa cơ quan/mô /tế bào của thực vật, và chương trình hóa lại chúng trong nuôi
cấy in vitro. Quá trình “biệt hóa” là tiêu chuẩn quan trọng nhất để theo dõi mẫu cấy.
Điều này cho phép các nhà nghiên cứu tế bào thực vật lần theo dấu vết những sự kiện


tại mỗi thời điểm bắt đầu. Hệ thống nuôi cấy lớp mỏng tế bào thường được chia thành
2 loại chính:
-

Lớp mỏng cắt theo chiều dọc cơ quan (lTCL), mẫu được thu nhận (cắt) theo
chiều dọc với kích thước khoảng 1 mm x 0,5 hoặc 1,0 mm. lTCL chỉ mang
một loại mô, ví dụ như lớp tế bào biểu bì.

-

Lớp mỏng cắt theo chiều ngang cơ quan (tTCL), mẫu được thu nhận theo
chiều ngang với bề dày khoảng 0,2 – 0,5 mm hoặc 3 – 6 lớp tế bào. tTCL
mang một số lượng nhỏ tế bào của nhiều loại mô khác nhau như: biểu bì, nhu
mô vỏ, tượng tầng, mô mạch, nhu mô lõi.

Một số ưu điểm của phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào
-

Diện tích tiếp xúc của lớp mỏng tế bào với môi trường lớn, do đó tế bào dễ
dàng hấp thu chất dinh dưỡng từ môi trường.

-

Dễ định vị vùng cho phản ứng do chỉ có một vài lớp tế bào.

-

Lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV) nội sinh trong mẫu
thấp nên các CĐHSTTV ngoại sinh dễ tác động lên mẫu.

-

Mẫu nuôi cấy đồng nhất và đáp ứng nhanh với các cảm ứng.

-

Tạo thực vật hoàn chỉnh ít bị biến dị

-

Giảm sự phân cực tế bào.

-

Tương tác giữa các cơ quan thực vật với toàn bộ cơ thể thực vật được triệt
tiêu.

Ứng dụng của TCL
-

Nghiên cứu về mô học hay tế bào học có thể thực hiện được trên hệ thống
TCL trong suốt chương trình biệt hóa.

-

Tái biệt hóa lại thành những cơ quan khác nhau trên những tế bào đã biệt
hóa.

-

Xác định các marker sinh hóa và phân tử trên TCL