PHÂN LẬP VI KHUẨN HÒA TAN KALI TRONG ĐẤT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC

­­­­­­­­­­­­­  ­­­­­­­­­­­­­

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN HÒA TAN
KALI TRONG ĐẤT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGS.TS. CAO NGỌC ĐIỆP
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

SINH VIÊN THỰC HIỆN
QUANG THỊ CHI
LỚP CÔNG NGHỆ SINH HỌC K31
MSSV: 3052809

Cần Thơ 6/2009



LỜI CẢM TẠ
Tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp không chỉ với những cố gắng và nỗ lực
của của riêng tôi, mà tôi còn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ.
Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu và Phát
Triển Công nghệ Sinh học, Khoa Khoa Học, Trường Đại Học Cần Thơ đã tạo điều
kiện cho tôi học tập, nghiên cứu, nâng cao trình độ trong những năm qua.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy hướng dẫn, Tiến sĩ Cao Ngọc Điệp
đã hướng dẫn, dìu dắt và cho tôi những lời khuyên quý báo trong suốt thời gian học
cũng như khi tiến hành thí nghiệm và viết luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Xuân Mỵ, chị Trần Thị Giang, anh
Võ Văn Phước Quệ và các anh chị học viên cao học đang làm đề tài trong phòng Vi
sinh vật đất thuộc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học về sự quan
tâm giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi trong thời gian tôi học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin được gởi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy cố vấn học tập, quí thầy cô trong
Khoa Khoa Học, quí thầy cô trong Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh
Học đã truyền đạt những kiến thức bổ ích trong suốt bốn năm qua.
Cảm ơn các bạn lớp Công nghệ sinh học khóa 31 đã cùng tôi, giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình học tập.
Ba mẹ ơi, mặt dù ba mẹ không nói ra nhưng con vẫn biết ba mẹ đã phải khó
khăn, vất vã thật nhiều để cho con được đến trường, được học tập như tất cả các bạn
khác. Để con có được như ngày hôm nay cũng là nhờ ba mẹ, ba mẹ ơi con cám ơn ba
mẹ thật nhiều.


TÓM TẮT
Mười sáu dòng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ cây một số tỉnh Đồng
Bằng Sông Cửu Long và miền Đông Nam Bộ trên môi trường có bổ sung Kaolinite (có
chứa kali không hòa tan). Các dòng vi khuẩn đều có khuẩn lạc dạng bìa nguyên, hình
que, có khả năng chuyển động và hòa tan được kali khó tan trong Kaolinite. Kết quả
ghi nhận hai dòng vi khuẩn (1B, ĐL) có lượng kali hòa tan tốt nhất sau 6 ngày nuôi.
Dòng vi khuẩn ĐL (Đà Lạt- LĐ) có mật số log10(8,85)/lit, nồng độ kali hòa tan 38,53
mg/lit, dòng vi khuẩn 1B (Q.Bình Thủy- CT) đạt mật số log10(6,73)/lit, nồng độ kali
hòa tan 23,05 mg/lit sau 6 ngày ủ trên máy lắc. Đề nghị sử dụng hai dòng vi khuẩn
trên làm phân bón vi sinh góp phần hòa tan kali bị cố định trong đất cho cây trồng hấp
thu.
Từ khóa: Vi khuẩn hòa tan kali, đất vùng rễ, phân vi sinh, Kaolinite, mật số vi khuẩn.

Luận văn tốt nghiệp ngành CNSH

MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC ........................................................................................................... 3
DANH SÁCH BẢNG ......................................................................................... 5
DANH SÁCH HÌNH .......................................................................................... 6
Chương 1: Giới thiệu .......................................................................................... 7
1. Đặt vấn đề....................................................................................................... 7
2. Mục tiêu đề tài ................................................................................................ 7
Chương 2: Lược khảo tài liệu............................................................................... 8
Bảng 1.1: Sự khác nhau giữa phân hóa học và phân vi sinh................................. 8
1. Giới thiệu chung về kali .................................................................................. 9
2. Hàm lượng và các dạng kali trong đất ........................................................... 10
3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phóng thích và cố định kali trong đất............... 10
4. Ảnh hưởng của kali đối với cây trồng............................................................ 11
5. Điạ điểm thu mẫu............................................Error! Bookmark not defined.
6. Vi khuẩn chuyển hóa kali.............................................................................. 13
7. Các nghiên cứu về vi khuẩn hòa tan kali ....................................................... 14
Chương 3: Phương tiện – phương pháp ...............................................................15
1. Địa điểm và thời gian:................................................................................... 15
a. Địa điểm:.................................................................................................15
b. Thời gian:................................................................................................15
2. Vật liệu thí nghiệm:....................................................................................... 15
3. Phương tiện:.................................................................................................. 15
a. Thiết bị, dụng cụ phân lập vi khuẩn .........................................................15
b. Một số thiết bị dùng để nhận diện và trữ vi sinh vật.................................15
4. Hóa chất:....................................................................................................... 16

5. Phương pháp nghiên cứu:.............................................................................. 16
a. Môi trường phân lập có bổ sung Kao linite ( Lin Qi-mei et al., 2002): .....16
b. Chuẩn bị môi trường phân lập: ................................................................16

Quang Thị Chi 3052809

Trang 3


Luận văn tốt nghiệp ngành CNSH
c. Phân lập vi khuẩn: ...................................................................................17
6. Các chỉ tiêu phân tích:................................................................................... 18
a. Đo kali hòa tan ........................................................................................18
b. Đếm mật số vi khuẩn...............................................................................19
Chương 4: Kết quả -thảo luận .............................................................................21
1. Khả năng hòa tan kali của một số dòng vi khuẩn........................................... 23
2. Mật số vi khuẩn:............................................................................................ 25
3. Sự tương quan giữa mật số vi khuẩn và [K+] ................................................. 27
Chương 5: Kết luận và đề nghị............................................................................30
1. Kết luận......................................................................................................... 30
2. Đề nghị ......................................................................................................... 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................31
Phụ lục: SỐ LIỆU VÀ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ.............................33
1.Số liệu và kết quả đo nồng độ kali.................................................................. 33
2. Số liệu và kết quả đếm mật số ....................................................................... 36
3. Sự tương quan giữa mật số vi khuẩn và nồng độ kali hòa tan. ....................... 39

Quang Thị Chi 3052809

Trang 4

Luận văn tốt nghiệp ngành CNSH

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1.1: Sự khác nhau giữa phân hóa học và phân vi sinh................................. 8
Bảng 4.1: Đặc điểm khuẩn lạc........................................................................... 21
Bảng 4.2: Hình dạng và sự chuyển động của tế bào vi khuẩn hòa tan kali ......... 23
Bảng 4.3: Khả năng giải phóng K+ của các dòng vi khuẩn theo thời gian .......... 24
Bảng 4.4: Log10 mật số vi khuẩn sau các ngày nuôi........................................... 26
Bảng 4.5: Mối liên hệ giữa mật số vi khuẩn và nồng độ kali dòng vi khuẩn ĐL 28
Bảng 4.6: Mối liên hệ giữa mật số vi khuẩn và nồng độ kali dòng vi khuẩn1B.. 29
Bảng 1: Kết quả đo nồng độ kali sau thời gian nuôi .......................................... 33
Bảng 2: Kết quả so sánh sự khác biệt của các dòng vi khuẩn ở ngày thứ 3 ........ 33
Bảng 3:Kết quả so sánh sự khác biệt của các dòng vi khuẩn ở ngày thứ 6 ......... 34
Bảng 4:Kết quả so sánh sự khác biệt của các dòng vi khuẩn ở ngày thứ 9 ......... 35
Bảng 5:Kết quả so sánh sự khác biệt của các dòng vi khuẩn ở ngày thứ 12 ....... 35
Bảng 6: Kết quả phân tích sự khác biệt của một số dòng vi khuẩn..................... 36
Bảng 7: Mật số trung bình của các dòng vi khuẩn ............................................. 36
Bảng 8: Log10 của mật số vi khuẩn .................................................................. 37
Bảng 9: So sánh sự khác biệt về mật số một số dòng vi khuẩn .......................... 37
Bảng 10: Kết quả so sánh sự khác biệt về mật số giữa các dòng vi khuẩn ở ngày
thứ 6.................................................................................................................. 38
Bảng 11: Kết quả so sánh sự khác biệt về mật số giữa các dòng vi khuẩn ở ngày
thứ 12................................................................................................................ 39
Bảng 12: Sự tương quan giữa log10 mật số và nồng độ K ................................. 39

Quang Thị Chi 3052809

Trang 5


Luận văn tốt nghiệp ngành CNSH

DANH SÁCH HÌNH
Trang

Hình 3.1: Mô tả phương pháp đếm mật số vi khuẩn ......................................... 19
Hình 4.1& 4.2: các khuẩn lạc của vi khuẩn hòa tan kali trên môi trường Kaolinite
.......................................................................................................................... 22
Hình 4.3: Hàm lượng kali hòa tan của một số dòng vi khuẩn theo thời gian ...... 25
Hình 4.4: Sự tương quan giữa log10 mật số vi khuẩn và nồng độ K hòa tan ....... 27

Quang Thị Chi 3052809

Trang 6


Luận văn tốt nghiệp ngành CNSH

Chương 1: Giới thiệu
1. Đặt vấn đề
Bón phân là một trong những biện pháp kỹ thuật được thực hiện phổ biến,
thường mang lại hiệu quả lớn trong sản xuất nông nghiệp. Phân bón là nhân tố
trực tiếp để tăng năng suất cây trồng và cải thiện chất lượng của lương thực, thực
phẩm. Ngoài ra, khi sử dụng phân bón hợp lý sẽ cải thiện độ phì nhiêu của đất và
giúp cho cây trồng có sức chống chịu cao dưới tác dụng của sâu bệnh và tác động
xấu của thời tiết. Tuy nhiên, việc lạm dụng phân hóa học cũng gây ảnh hưởng xấu
đến chất lượng cây trồng, gây ô nhiễm đất, nước và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe

con người.
Do đó, các nhà nông nghiệp khuyến cáo nên sử dụng phân hữu cơ thay thế
cho phân hóa học. Nông dân từ rất lâu đã biết sử dụng phân xanh, phân chuồng để
bón cho cây trồng, tuy nhiên tác dụng của các loại phân này thường chậm và
không ổn định.
Ngày nay với sự phát triển của Công nghệ sinh học, người ta đã nghiên cứu
và sản xuất được các loại phân vi sinh để thúc đẩy sự phát triển của cây trồng và
không gây ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên, các sản phẩm phân vi sinh trên thị
trường còn rất ít so với phân hóa học, vì vậy nhu cầu sản xuất phân vi sinh là rất
lớn. Đã có nhiều nghiên cứu để sản xuất phân đạm vi sinh, phân lân vi sinh hoặc
phân chứa hỗn hợp đạm và lân vi sinh, nhưng chưa có nghiên cứu về phân kali vi
sinh hòa tan kali cho nên đề tài “Phân lập vi khuẩn hòa tan kali trong đất” được
thực hiện.

2. Mục tiêu đề tài
 Phân lập một số dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan kali cố định trong
đất.
 Chọn lọc những dòng vi khuẩn hòa tan kali tốt.

Quang Thị Chi 3052809

Trang 7


Luận văn tốt nghiệp ngành CNSH

Chương 2: Lược khảo tài liệu
Phân vi sinh đang có nhiều điểm nổi bật hơn phân bón hóa học, ngoài việc
nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng, giảm chi phí sản xuất thì phân vi sinh
còn góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nền nông

nghiệp bền vững. Sự khác nhau giữa phân vi sinh và phân hóa học được thể hiện
qua Bảng 1.1.
Bảng 1.1: Sự khác nhau giữa phân hóa học và phân vi sinh
Phân vi sinh

Phân hóa học

Đây là các vi sinh vật sống

Đây là các hợp chất vô cơ

Cung cấp chất hữu cơ từ từ và kéo dài

Cung cấp chất dinh dưỡng hóa học
với khối lượng lớn cùng một lúc

Tác dụng chậm

Tác dụng nhanh

Cải tạo đất

Làm chai đất

Không gây ảnh hưởng xấu đến chất Gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng
lượng nông sản

nông sản

Đây là vi sinh vật sống nên thời gian Thời gian bảo quản lâu

bảo quản không quá 3 tháng
Không được đón gói kín mà phải để Đóng gói kín
không khí lọt vào
Bón nhiều phân vi sinh không gây ngộ

Bón nhiều phân hóa học cây bị ngộ

độc cho cây, đất được cải tạo tốt hơn

độc và chết

Sau đạm và lân, thì kali cũng là một nguyên tố khoáng rất cần thiết đối với
cây trồng. Mặc dù hàm lượng kali trong đất tương đối cao, nhưng cây trồng không
hấp thu được hết, vì có một lượng lớn kali nằm trong các khoáng sét cây trồng
không hấp thu được. Ngoài ra, có một vài nghiên cứu cho rằng không chỉ ở Việt
Nam mà còn ở một số nước khác trên thế giới như: Trung Quốc, Hàn Quốc, Ấn
Độ, Ai Cập,…ít quan tâm đến hàm lượng kali có trong phân bón tạo ra hiện tượng

Quang Thị Chi 3052809

Trang 8


Luận văn tốt nghiệp ngành CNSH
mất cân đối trong sự phát triển của cây trồng từ đó dẫn đến cây trồng giảm khả
năng chống chịu sâu bệnh và thời tiết, năng suất giảm, chất lượng sản phẩm không
đạt yêu cầu. Do vậy, để khắc phục hiện tượng này thì trước tiên cần phải bổ sung
K+ cho cây trồng và giải pháp tốt nhất là sử dụng phân vi sinh có khả năng hòa tan
kali trong các khoáng không tan.
Nhiều giống vi sinh vật trong vùng rễ (rhizophere) có khả năng kích thích sự

phát triển và tăng trưởng của cây trồng gọi là nhóm vi khuẩn vùng rễ (PGPR=
Plant Growth Promoting Rhizobacteria) (Kopper et al., 1989; Antoun et al., 1998).
Vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật, cải thiện sự tăng trưởng thực vật
và gia tăng năng suất với cơ chế gián tiếp (hạn chế sự phát triển vi sinh vật gây
hại) và cơ chế trực tiếp (cố định đạm, hòa tan lân, kali khó tan) (Brown, 1974;
Kopper et al., 1986, 1989; Davision, 1988). Trong nhóm các vi sinh vật này có
một loài vi khuẩn gọi là vi khuẩn silicate, có thể giải phóng kali ra khỏi các
khoáng không tan, tan được trong nước và cung cấp cho cây trồng.

1. Giới thiệu chung về kali
Kali là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng thứ ba đối với cây trồng. Kali được
hấp thu với số lượng lớn hơn các nguyên tố khoáng khác, ngoại trừ nitơ. Kali có
khả năng phân cực lớn và có bán kính thủy hóa thấp hơn so với Al3+, Ca2+, Na+,
Li+ do đó có khả năng được lôi kéo đến gần bề mặt khoáng sét cao hơn trong phản
ứng trao đổi cation.
Có thể biểu diễn hàm lượng kali có trong đất, cây trồng và phân bón dựa vào
hàm lượng K2O hoặc kali. Hàm lượng kali có trong các loại phân bón thường
được biểu diễn bằng % K2O. Theo hệ thống đo lường quốc tế thì hàm lượng kali
trong đất, cây trồng và phân bón thường được tính toán dựa vào hàm lượng kali.
Sự biến đổi giữa hai đơn vị này được tính như sau:
%K2O = %K  1.2

Quang Thị Chi 3052809

%K = K2O  0.83

Trang 9


Luận văn tốt nghiệp ngành CNSH

2. Hàm lượng và các dạng kali trong đất
Không giống như lân, kali hiện diện với số lượng lớn trong hầu hết các loại
đất. Hàm lượng kali tổng số có trong đất biến động rất lớn từ 0,1% đến nhỏ hơn
4,29%, với khoảng biến động thông thường là từ 0,3 đến 2% (Mutscher, 1995), và
hàm lượng kali trung bình là khoảng 1,7% (Reitemeier, 1951). Sự biến động hàm
lượng kali tổng số trong đất là tùy thuộc vào thành phần các loại khoáng nguyên
sinh và khoáng sét có trong đất.
Kali trong đất tồn tại ở bốn dạng thường được quan tâm đến là: Kali của
khoáng vật, kali không trao đổi, kali trao đổi và kali hòa tan. Kali của khoáng vật
chứa 90-98% kali trong một số khoáng như fenspat và mica (James, 1998), kali
không trao đổi thường có khoảng 1-10% và liên kết với cấu trúc khoáng sét, kali
trao đổi có từ 1-2% trong vị trí các cation trao đổi hoặc trong dung dịch đất. Trong
4 dạng kali chỉ có kali ở dạng trao đổi cây trồng có thể sử dụng được. Hầu hết các
loại đất đỏ vàng, vàng đỏ phát triển trên đá bazan gọi chung là đất ferrasols đều có
lượng kali tổng số nghèo, trừ đất ferrasols phát triển trên đá vôi (K2O = 1,75%).
Hàm lượng kali dễ tiêu trong đất ferrasols (bao gồm trao đổi và hòa tan trong
nước) cũng đều thấp (2,07 – 5,76 mg/100g đất) và đất ferrasols phát triển trên đá
vôi (14,56 mg/100 g đất). Đất xám miền Đông Nam bộ có tỷ lệ sét thấp chỉ 14 –
15%, khoáng chủ yếu là Kaolinite nên kali tổng số nghèo (0,03 – 0,09%) kali trao
đổi cũng thấp 0,04 ldl/100g đất. Đất phèn chủ yếu khoáng illit và Kaolinite nên có
kali trao đổi thấp; khả năng cố định kali cao. Điều đó có thể do sự phong hóa
khoáng sét trong điều kiện pH thấp đã làm tăng cường sự phóng thích kali để trở
thành dạng hòa tan sau đó bị rửa trôi. Đối với đất phèn đồng bằng sông Cửu Long
(ĐBSCL), theo Kyuma (1976) thì khoáng sét chủ yếu là Kaolinite, illit, chỉ có rất
ít montmorilonit nên kali trong đất cũng nghèo.

3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phóng thích và cố định kali trong
đất
Theo Goulding (1987), các yếu tố ảnh hưởng đến sự phóng thích và cố định

kali trong đất bao gồm: Thành phần và kích cở cấu tử khoáng sét; nhiệt độ và
lượng mưa; sự khô và ẩm của đất, và hiện tượng đóng băng và tan băng; việc bón
chất hữu cơ; rễ cây trồng.
Quang Thị Chi 3052809

Trang 10


Luận văn tốt nghiệp ngành CNSH
Thành phần và kích cở cấu tử khoáng sét: Theo Rich (1972), các khoáng sét
như mica, tràng khoáng giàu kali, illite có khả năng phóng thích kali cao. Illite và
vermiculite đồng thời cũng có khả năng cố định kali cao, còn các khoáng sét như
montmorrillonite, kaolinite có khả năng cố định kali thấp (Shaviv et al., 1985).
Cơ chế của sự cố định kali có thể thay đổi từ dạng khoáng sét này đến loại
khoáng sét khác. Trong trường hợp illite, và vermiculite, K+ có thể lọt vào lưới
tinh thể và bị mắc kẹt ở đây, khi các lớp này co lại trong giai đoạn khô. Các
khoáng sét tích điện âm cao gây ra do Al3+ thay thế cho Si4+ sẽ liên kết mạnh với
K+ và ngăn cản nó trao đổi. Các loại khoáng sét khác nhau có khả năng cố định
kali khác nhau. Ví dụ khoáng sét loại 2:1 như Kaolinite, và các loại đất chứa
khoáng sét này cố định ít kali. Các loại khoáng sét 2:1 như vermiculite, illite dễ cố
định kali với số lượng lớn. Sét vermiculite có khả năng cố định kali lớn hơn
khoáng sét montmorillonite.
Sự khô và ẩm của đất, và hiện tượng đóng băng và tan băng: Đất ướt và
khô, đóng băng và tan băng luân phiên, ảnh hưởng đến cả 2 tiến trình phóng thích
và cố định kali trong đất. Beckett et al.(1985) đã liệt kê rất nhiều tài liệu đồng
quan điểm với ý kiến trên. Theo Goulding (1985) hiện tượng mất nước có thể gia
tăng sự cố định kali là do các lá sét co lại làm cho K+ bị giữ chặt, đồng thời sự
đóng băng có thể làm gia tăng khoảng trống giữa các lá sét do đó làm cho sự di
chuyển của K+ và các ion khác gia tăng làm dễ dàng cho sự phóng thích kali, sự
tan băng không làm cho lá sét co lại nên ít có khả năng làm tăng sự cố định kali.

Ảnh hưởng của rễ cây trồng: Rễ cây trồng tiết ra H+ và nhiều loại acid hữu
cơ khác trong đất do đó làm tăng khả năng phóng thích kali. Ngoài ra, khả năng
thu hút kali còn tùy thuộc vào tính chất của rễ cây trồng và sự phân bố của rễ.
Barber (1985) báo cáo rằng rễ cây trồng thu hút kali chỉ từ 14% của thể tích đất.

4. Ảnh hưởng của kali đối với cây trồng
Kali có vai trò rất quan trọng đối với lúa, một loại lương thực chủ yếu ở
Việt Nam và nhiều quốc gia trên thế giới. Hàm lượng K2O tổng số chiếm cao nhất
trong ba loại dưỡng chất chính đối với sự phát triển của cây lương thực này.

Quang Thị Chi 3052809

Trang 11


Luận văn tốt nghiệp ngành CNSH
Mặc dù không trực tiếp tham gia vào cấu trúc vật chất cấu tạo nên tế bào
nhưng kali lại có vai trò quan trọng trong việc ổn định các cấu trúc này và hỗ trợ
cho việc hình thành các cấu trúc giàu năng lượng như ATP trong quá trình quang
hợp và phosphoril hóa. Kali ảnh hưởng trước tiên đến việc tăng cường hydrat hóa
các cấu trúc keo của huyết tương, nâng cao khả năng phân tán của chúng nhờ đó
giúp cây giữ nước tốt, tăng khả năng chống hạn, tăng cường tính chống rét và khả
năng kháng các bệnh do nấm và vi khuẩn. Ngoài ra, kali giúp cây tăng cường khả
năng tổng hợp các hợp chất cao phân tử như cellulose, hemicellulose, các hợp chất
peptid v.v.. nhờ đó giúp cho các cây họ hòa thảo cứng cáp, chống đổ ngã tốt. Kali
giúp cho cây tăng cường tổng hợp và tích lũy hàng loạt các vitamin, có vai trò
quan trọng trong đời sống thực vật.
Trong mối quan hệ đất - phân bón, kali đóng một vai trò quan trọng trong sự
sinh trưởng và phát triển của cây. Thiếu kali sẽ gây ảnh hưởng đến quá trình trao
đổi chất trong cây, làm suy yếu hoạt động của hàng loạt các men, giảm quá trình

trao đổi các hợp chất carbon và protein, đồng thời tăng chi phí đường cho quá
trình hô hấp, gây lép hạt, làm giảm tỷ lệ nảy mầm và sức sống hạt giống.Về hình
thái, các lá trưởng thành sẽ vàng sớm bắt đầu từ bìa lá, sau đó bìa lá khô, đầu lá có
đốm vàng hoặc bạc, có triệu chứng rách bìa lá dẫn đến giảm hiệu suất quang hợp.
Đây là những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến năng suất và chất lượng nông sản bị
sụt giảm.
Nghiên cứu về vai trò của kali đối với cây trồng thể hiện rất khác nhau tùy
theo từng loại đất. Hiệu lực cao nhất thường thấy trên đất xám bạc màu và trên đất
cát biển. Đối với một số loại cây lấy hạt như ngô hiệu lực của kali khá cao, năng
suất tăng từ 23 - 36% và hiệu lực của kali trung bình đạt từ 15 - 20 kg K2O. Đối
với lúa vùng ĐBSCL hiệu lực của kali trung bình đạt 4,6 - 5,5 kg thóc/kg kali. Đối
với cây công nghiệp ngắn ngày, kết quả khảo nghiệm của Tô Văn Thống (1994)
với cây đậu tương trên đất bạc màu cho thấy khi bón đơn thuần kali đã làm tăng
năng suất khoảng 45% so với không bón, hiệu suất kali đạt từ 5,8 - 15 kg đậu/kg
K2O. Với cây lạc (đặc biệt là trên chân đất bạc màu, đất cát biển) hiệu suất sử
dụng kali từ 2,3 đến 8,2 kg lạc vỏ khô/kg K2O bón vào.

Quang Thị Chi 3052809

Trang 12


Luận văn tốt nghiệp ngành CNSH
Như vậy đối với cây trồng, kali đóng vai trò quan trọng trong việc hình
thành năng suất và chất lượng sản phẩm. Nhưng hiện nay, phần lớn kali chỉ được
sử dụng ở các tỉnh đồng bằng và các vùng thâm canh cao.

5. Địa điểm thu mẫu
Thứ nhất khi thu mẫu đất mang về thí nghiệm, nên chọn những nơi đất xám
bạc màu, ở vùng đất đỏ bazan hay những vùng đất phèn mặn. Bởi vì, ở những nơi

này thường hàm lượng kali cố định trong đất cao.
Thứ hai là chọn đất xung quanh rễ cây ở những vùng đất trên. Để sống được
thì cây cần phải hấp thu kali, nhưng hầu như lượng kali trong các loại đất này đều
là kali cố định nên cây không hấp thu được do đó khi cây sống được thì trong đất
nơi đó có khả năng có sự tồn tại các dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan kali bị cố
định.

6. Vi khuẩn chuyển hóa kali
Do có rất ít nghiên cứu về vi khuẩn có khả năng chuyển hóa kali từ dạng khó
tan sang dạng dễ tan, nên chỉ có dòng vi khuẩn được quan tâm: Bacillus
mucilaginosus.
Vi khuẩn Bacillus mucilaginosus là vi khuẩn có hình que, nhày (Avakyan et
al., 1986), được tìm ra dựa trên những phân tích genotyp và kiểu hình. Bacillus
mucilaginosus là vi khuẩn Gram âm, có kích thước lớn, có hình que dài và dày.
Bào tử tương đối lớn, hình elip, bề mặt dày có màu đỏ hơi tối bên trong có màu đỏ
nhẹ. Khi quan sát bằng mắt, Bacillus mucilaginosus có những đặc tính sau: Xuất
hiện khắp trên bề mặt môi trường nuôi cấy, có khuẩn lạc hình tròn. Khuẩn lạc ban
đầu không màu, nhưng sau 5-6 ngày phía trong có màu hơi đục ngoài rìa trong
suốt. Các loại vi khuẩn Bacillus mucilaginosus khác nhau có khả năng chuyển hóa
khác nhau trên cùng điều kiện môi trường. Bacillus mucilaginosus sau khi vào
môi trường có khoáng chứa kali, chúng sẽ xuyên thủng, hòa tan các lá sét bao
quanh phóng thích các K+ giúp cho cây trồng hấp thu dễ dàng. Chúng cải thiện
nhanh chóng hàm lượng kali trong đất, hàm lượng kali được chuyển hóa tăng lên
33-34%. Hiện nay, phân bón vi sinh chứa kali được áp dụng trên hơn 30 loại cây

Quang Thị Chi 3052809

Trang 13

Luận văn tốt nghiệp ngành CNSH
trồng (cà chua, thuốc lá, dưa chuột, hồ tiêu, lúa mì,…) tại hơn 20 tỉnh và các
huyện ở Trung Quốc.

7. Các nghiên cứu về vi khuẩn hòa tan kali
Badr et al., (2006) đã nghiên cứu về sự hòa tan kali và phospho bởi vi khuẩn
silicate và ứng dụng lên sự tăng trưởng của cây lúa miến. Sau đó, Badr đã nhận
thấy hiệu quả của sự kết hợp vi khuẩn silicate và hợp chất hữu cơ hòa tan kali
trong khoáng tràng thạch (fenspat) lên sự phát triển cây cà chua.
Han và Lee (2006) đã nghiên cứu hiệu quả kết hợp giữa vi khuẩn hòa tan
kali và vi khuẩn phospho lên sự hấp thu và tăng trưởng của cây hồ tiêu và cây
dưa chuột.
Sugumaran và Janarthanam (2007) đã nghiên cứu khả năng hòa tan các
khoáng chứa kali bằng vi khuẩn và ứng dụng lên cây trồng.

Quang Thị Chi 3052809

Trang 14


Luận văn tốt nghiệp ngành CNSH

Chương 3: Phương tiện – phương pháp
1. Địa điểm và thời gian:
a. Địa điểm:
Tại phòng thí nghiệm vi sinh vật thuộc Viện Công nghệ Sinh học, Trường
Đại Học Cần Thơ.
b. Thời gian:
Từ tháng 2/2009 đến tháng 6/2009

2. Vật liệu thí nghiệm:
Các mẫu đất được thu thập từ những vùng xung quanh rễ cây ở một số tỉnh
như: Bến Tre, Cần Thơ, Đồng Nai, Lâm Đồng, Vĩnh Long.

3. Phương tiện:
Thiết bị và dụng cụ: Sử dụng các thiết bị và dụng cụ nghiên cứu có tại Viện
Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học.
a. Thiết bị, dụng cụ phân lập vi khuẩn
 Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Đức)
 Tủ cấy vi sinh vật (Pháp)
 Tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức)
 Kính hiển vi Olympus CHT (Nhật)
 Kính hiển vi Olympus BH- 2 (Nhật)
 Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức)
 Bộ micropipet Gibson P10, P20, P100, P200, P1000 (Đức)
 Cân điện tử Sartorius (Đức)
 Đĩa petri; ống nghiệm; bình tam giác 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml,
2000ml.
 Kính lúp, que cấy, lam, la men, que thuỷ tinh, cốc đựng dung dịch, chai
lọ thuỷ tinh...
b. Một số thiết bị dùng để nhận diện và trữ vi sinh vật
 Tủ lạnh -40C Akira (Việt Nam)
Quang Thị Chi 3052809

Trang 15


Luận văn tốt nghiệp ngành CNSH
 Máy chụp ảnh kỹ thuật số
 Máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu

4. Hóa chất:
 Glucose
 Amonium sulphate
 Dinatrium hydrogen phosphate
 Magnesium sulphate
 Kaolinite
 Nước cất vô trùng
 Cồn 96%, cồn 70%

5. Phương pháp nghiên cứu:
a. Môi trường phân lập có bổ sung Kao linite ( Lin Qi-mei et al., 2002):
 Glucose

: 10 g/l

 Amonium sulphate:

: 1 g/l

 Dinatrium hydrogen phosphate:

: 0,1 g/l

 Magnesium sulphate

: 0,2 g/l

 Agar

: 20 g/l

 Kaolinite

: 0,2 g/l

 pH 7
b. Chuẩn bị môi trường phân lập:
Cho 10g glucose, 1g ammonium sulphate, 0,2g magneium sulphate, 0,1g
dinatrium phosphate, 1000ml H2O vào cốc thủy tinh khuấy tan, sau đó đo pH, và
điều chỉnh cho pH = 7 bằng dung dịch NaOH (nếu pH của dung dịch môi trường
nhỏ hơn 7), và dung dịch CH3COOH (khi pH dung dịch môi trường lớn hơn 7).
Môi trường phân lập sau khi điều chỉnh pH xong cho vào bình tam giác có dung
tích 2000ml, tiếp theo cho thêm 20g agar và đậy lại bằng nút gòn sau đó đem khử
trùng trong nồi khử trùng nhiệt ướt ở 121 0C trong 20 phút. Môi trường nuôi cấy
sau khi khử trùng xong được bổ sung thêm 0,2g Kaolinite và phân phối đều vào

Quang Thị Chi 3052809

Trang 16


Luận văn tốt nghiệp ngành CNSH
các đĩa Petri đã được khử trùng bên trong tủ cấy vô trùng (khoảng 20ml môi
trường cho mỗi đĩa), để yên cho môi trường đặc lại.
c. Phân lập vi khuẩn:
 Thu mẫu:
Dùng dao xén lấy vùng đất xung quanh rễ cây ở những nơi đất xám bạc
màu, đất cát, đất đỏ bazan (chú ý khi lấy đất phải loại bỏ lớp đất bề mặt vì lớp đất
này rất dễ bi nhiễm nấm), cho vào bao nylon mang về phòng thí nghiệm để khô ở

nhiệt độ phòng. Nếu chưa có điều kiện phân lập thì trữ mẫu ở những nơi thoáng
mát, nhưng phải tiến hành phân lập trong vòng thời gian 1 tuần sau khi thu mẫu.
 Phân lập:
Cân 1g mẫu đất cho vào bình tam giác với 99ml nước cất đã được khử
trùng, lắc trên máy lắc 2 giờ với vận tốc 200 rpm. Dùng micropipet hút 0,1ml
dung dịch mẫu trải điều trên đĩa Petri có môi trường đã được chuẩn bị sẳn. Phơi
khô dưới ngọn lửa đèn cồn, sau đó mang đĩa Petri ủ trong tủ ủ ở 300C. Sau 24-48
giờ kiểm tra thấy khuẩn lạc mọc trên bề mặt môi trường, tiếp tục cấy chuyền sang
môi trường mới cho đến khi các khuẩn lạc xuất hiện trên đường cấy rời nhau. Sau
đó, kiểm tra độ ròng bằng cách:
Quan sát dưới kính hiển vi bằng phương pháp giọt ép ở vật kính X40 (độ
phóng đại 400 lần) thực hiện như sau:
Nhỏ 1 giọt nước cất (khoảng 20 l) đã được khử trùng lên kính mang vật.
Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn đến khi nóng đỏ và để nguội.
Dùng đầu kim cấy lấy một ít mẫu đã được cấy trử trong ống nghiệm chấm
vào giọt nước cất trên kính mang vật (trong điều kiện vô trùng).
Lấy kính đậy vật đậy lên giọt nước cất bằng cách để một cạnh của kính đậy
vật tiếp xúc với kính mang vật một góc 450 hạ kính đậy vật xuống từ từ sao cho
không có bọt khí trong mẫu vật.

Quang Thị Chi 3052809

Trang 17


Luận văn tốt nghiệp ngành CNSH
Tiến hành quan sát dưới kính hiển vi.
 Nuôi vi sinh vật tạo giống cấp 1:
Sau khi kiểm tra độ ròng của từng dòng vi sinh vật, tiến hành nuôi giống
cấp 1: hơ lửa kim cấy cho đến khi nóng đỏ, chấm lên bề mặt môi trường agar cho

nguội, rồi chấm lên khuẩn lạc chứa trong đĩa petri hoặc trong ống nghiệm, chuyển
kim cấy sang bình tam giác nhỏ có chứa 100ml môi trường lỏng (các bước pha
môi trường lỏng giống như cách pha môi trường đặc nhưng chỉ khác là không cho
thêm agar vào), nghiêng lắc nhẹ cho vi sinh vật từ kim cấy rớt ra và hòa lẫn vào
môi trường (tiến hành trong điều kiện vô trùng) thu được giống cấp 1 và để lên
máy lắc.
Các thí nghiệm tiến hành như sau:
Hút 1,8ml mẫu vào tuyp 2ml (mỗi dòng vi khuẩn hút 7 tuyp), đem 6 tuyp
đem ly tâm sau đó đem đi phân tích. Tuyp còn lại không ly tâm mà tiến hành pha
loãng nhỏ giọt đếm sống mật số vi khuẩn.
Đồng thời chuẩn bị mẫu đối chứng, là mẫu chỉ có môi trường không chủng
vi khuẩn.

6. Các chỉ tiêu phân tích:
a. Đo kali hòa tan
 Nguyên lí:
Kali trong dung dịch được xác định bằng quang kế ngọn lửa tại bước sóng
767nm hoặc bằng kính lọc tương ứng.
Nếu kali trong dung dịch thấp, thì kết quả đo sẽ bị ảnh hưởng của các ion
khác đặc biệt là Ca2+, để khắc phục hiện tượng này bằng cách cho thêm Al(NO3)3
và độ nhạy được tăng thêm khi cho CsCl, khoảng đo kali trên quang kế ngọn lửa
tốt nhất đến 40-50 ppm.

Quang Thị Chi 3052809

Trang 18


Luận văn tốt nghiệp ngành CNSH
 Tiến hành:

Ly tâm mẫu cần phân tích 12000 vòng trong 5 phút.
Hút 10ml dung dịch sau khi ly tâm cho vào ống nghiệm.
Do không có phương tiện và hóa chất phù hợp nên dung dịch mẫu sau khi
cho vào ống nghiệm được gởi phân tích ở phòng phân tích hóa lí và phì nhiêu đất
thuộc Bộ môn Khoa học đất & Quản lí đất đai, Khoa Nông nghiệp & Sinh học
ứng dụng, trường Đại Học Cần Thơ.
b. Đếm mật số vi khuẩn.
Mật số vi khuẩn được đếm bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt (Drop
plate count). Cứ 3 ngày đếm một lần, đếm vào các ngày thứ 3, 6, 9, 12 trong quá
trình nuôi giống cấp 1.
Phương pháp đếm mật số vi khuẩn: (Hình 3.1)

Hình 3.1: Mô tả phương pháp đếm mật số vi khuẩn
Pha loãng dung dịch nuôi giống cấp 1 đạt đến độ pha loãng 103, 10 4 lần,
đếm vi khuẩn bằng phương pháp nhỏ giọt đếm sống. Chuẩn bị môi trường đặc

Quang Thị Chi 3052809

Trang 19


Luận văn tốt nghiệp ngành CNSH
trên đĩa petri, chia đĩa thành 3 phần mỗi phần nhỏ 1 độ pha loãng với 5 lần lặp lại
(mỗi giọt 10l).
Mang đĩa vào ủ trong tủ. Quan sát kết quả sau 48 giờ hoặc 72 giờ ủ ở 300C.
Đếm số khuẩn lạc ở độ pha loãng cho kết quả có thể đếm được.
Số vi khuẩn trong 1ml mẫu:
Số khuẩn lạc trong 1ml mẫu = skltb*độ pha loãng*10 2
(skltb: Số khuẩn lạc trung bình trong 10 µl mẫu; 10 2: Đơn vị đổi từ l sang ml)

Quang Thị Chi 3052809

Trang 20


Luận văn tốt nghiệp ngành CNSH

Chương 4: Kết quả -thảo luận
Kết quả phân lâp được 16 dòng vi khuẩn có khả năng sống trên môi trường
có bổ sung Kaolinite, trong đó có 5 dòng ở Cần Thơ (chiếm 31,25%), Đồng Nai 5
dòng (31,25%), Bến Tre 3 dòng (18,75%), Vĩnh Long 2 dòng (12,5%), Lâm Đồng
1 dòng (6,25%). Sau đó, tiến hành phân tích xác định khả năng hòa tan kali (Bảng
4.1).
Bảng 4.1: Đặc điểm khuẩn lạc
Tên
STT mẫu

Đặt điểm
khuẩn lạc

Dạng
bìa

Vị trí

Địa điểm

phân lập

thu mẫu

1

1A

Vàng, tròn, mô

Nguyên

Đất vùng rễ Q.Bình Thủy-CT

2

1B

Trắng, tròn, mô

Nguyên

Đất vùng rễ Q.Bình Thủy-CT

3

1D

Trắng, tròn, lài

Nguyên

Đất vùng rễ Q.Bình Thủy-CT

4

ĐL

Trắng đục, tròn, lài

Nguyên

Rễ Dã Quỳ

5

N5

Trắng, tròn, lài

Nguyên

Đất vùng rễ Long Thành-ĐN

6

MC1 Trắng đục, tròn, mô

Nguyên

Đất vùng rễ Mõ Cày-BT

7

MC2 Trắng đục, tròn, mô

Nguyên

Đất vùng rễ Mõ Cày-BT

8

MC4 Hồng nhạt, tròn, mô

Nguyên

Đất vùng rễ Mõ Cày-BT

9

5.1

Vàng nhạt, tròn, mô

Nguyên

Đất vùng rễ Q.Ninh Kiều-CT

10

5.3

Trắng đục, tròn, mô

Nguyên

Đất vùng rễ Q.Ninh Kiều-CT

11

L3

Trắng, tròn, lài

Nguyên

Đất vùng rễ Trảng Bom-ĐN

12

L4

Trắng đục, tròn, mô

Nguyên

Đất vùng rễ Trảng Bom-ĐN

13

L5

Trắng, tròn, mô

Nguyên

Đất vùng rễ Trảng Bom-ĐN

14

L6

Trắng, tròn, lài

Nguyên

Đất vùng rễ Trảng Bom-ĐN

15

VL1

Trắng đục, tròn,mô

Nguyên

Đất vùng rễ Vũng Liêm- VL

16

VL8

Trắng, tròn, mô

Nguyên

Đất vùng rễ Vũng Liêm- VL

Quang Thị Chi 3052809

Trang 21

Đà Lạt-LĐ


Luận văn tốt nghiệp ngành CNSH
Khi quan sát các khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập thu được kết
quả như sau:Tất cả các khuẩn lạc đều có dạng tròn, bìa nguyên, về màu sắc có 4
dạng trong đó có 8 dòng (màu trắng), 6 dòng (màu trắng đục), còn lại 2 dòng
(màu vàng) và 1 dòng (màu hồng),về độ nổi các khuẩn lạc đều mọc nổi trên môi
trường có hai dạng lài và mô như vậy các dòng vi khuẩn trên đều là vi khuẩn hiếu
khí (Hình 4.1 và 4.2). Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu về vi khuẩn
hoà tan kali của Avakyan et al., (1986).

Hình 4.1& 4.2: Các khuẩn lạc của vi khuẩn hòa tan kali trên môi trường Kaolinite

Hình dạng tế bào vi khuẩn phân lập được có dạng chủ yếu là hình que,
chúng có khả năng di chuyển trong môi trường lỏng (Bảng 4.2). Như vậy kết quả
cũng phù hợp với một số nghiên cứu về vi khuẩn hòa tan kali là vi khuẩn hình que
(Avakyan et al., 1986).

Quang Thị Chi 3052809

Trang 22


Luận văn tốt nghiệp ngành CNSH
Bảng 4.2: Hình dạng và sự chuyển động của tế bào vi khuẩn hòa tan kali

STT Tên
mẫu

Đặc điểm tế bào

Chuyển
động

Vị trí
phân lập

Địa điểm thu
mẫu

1

1A

Que dài, lớn

nhanh

Đất vùng rễ

Q.Bình Thủy-CT

2

1B

Que ngắn, nhỏ

chậm

Đất vùng rễ

Q.Bình Thủy-CT

3

1D

Que ngắn, nhỏ

nhanh

Đất vùng rễ

Q.Bình Thủy-CT

4

ĐL

Que ngắn, nhỏ

nhanh

Rễ Dã Quỳ

Đà Lạt-LĐ

5

N5

Que ngắn, lớn

chậm

Đất vùng rễ

Long Thành- ĐN

6

MC1 Que dài, lớn

chậm

Đất vùng rễ

Mõ Cày-BT

7

MC2 Que dài, lớn

chậm

Đất vùng rễ

Mõ Cày-BT

8

MC4 Que ngắn, lớn

chậm

Đất vùng rễ

Mõ Cày-BT

9

5.1

Que ngắn, nhỏ

nhanh

Đất vùng rễ

Q.Ninh Kiều -CT

10

5.3

Que ngắn, nhỏ

nhanh

Đất vùng rễ

Q.Ninh Kiều -CT

11

L3

Que ngắn, nhỏ

nhanh

Đất vùng rễ

Trảng Bom-ĐN

12

L4

Que ngắn, lớn

nhanh

Đất vùng rễ

Trảng Bom-ĐN

13

L5

Que ngắn, nhỏ

chậm

Đất vùng rễ

Trảng Bom-ĐN

14

L6

Que ngắn, lớn

nhanh

Đất vùng rễ

Trảng Bom-ĐN

15

VL1

Que ngắn, lớn

nhanh

Đất vùng rễ

Vũng Liêm- VL

16

VL8

Que ngắn, lớn

nhanh

Đất vùng rễ

Vũng Liêm- VL

1. Khả năng hòa tan kali của một số dòng vi khuẩn
Do các dòng vi khuẩn khác nhau nên khả năng hòa tan kali ở mỗi dòng đều
có sự khác nhau (Bảng 4.3):

Quang Thị Chi 3052809

Trang 23