Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase từ nấm mốc aspergillus oryzae

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

PHẠM HOÀNG THÁI

KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN
KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME AMYLASE TỪ
NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Mã ngành: 08

Giáo viên hướng dẫn

LÝ NGUYỄN BÌNH

Cần Thơ, 2011


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Tên đề tài

KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN
KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME AMYLASE TỪ
NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE

Giáo viên hướng dẫn

Sinh viên thực hiện

TS. Lý Nguyễn Bình

Phạm Hoàng Thái
MSSV: 2071771

`

Lớp: CNTP K33
Cần Thơ, 2011


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã tận tình dạy
dỗ và truyền đạt những kiến thức quý báu suốt bốn năm đại học.
Xin gửi lòng biết ơn đến Thầy Lý Nguyễn Bình và Chị Lâm Mộng Thúy đã nhiệt tình hướng
dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành bài luận văn này.
Chân thành cảm ơn sự đoàn kết và hỗ trợ của các bạn lớp Công nghệ Thực phẩm khoá 33
trong suốt bốn năm học và trong quá trình thực hiện luận văn.
Cảm ơn Thầy Cô và các bạn đã quan tâm, đóng góp ý kiến để bài luận văn hoàn chỉnh hơn.
Chân thành cảm ơn!
Phạm Hoàng Thái

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

i


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

TÓM LƯỢC
Đề tài thực hiện nghiên cứu “Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng
hợp enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus oryzae” sử dụng kết quả nghiên cứu của
Chiêm Thị Bích Vân (2008) về các điều kiện tối ưu để tổng hợp enzyme amylase có hoạt
tính cao.
-

Nhiệt độ: 30oC

-

pH: 5,0

-

Độ ẩm môi trường: 55%

-

Thời gian nuôi: 50 giờ

Đề tài tiếp tục khảo sát thêm yếu tố nguồn dinh dưỡng và hàm lựợng bổ sung như nguồn
carbon: glucose, fructose, lactose; nguồn nitơ: NaNO3, NH4NO3, NH4H2PO4; nguồn
khoáng: KCl, CaCl2, MgSO4.7H2O; Hàm lượng kết hợp các nguồn NH4NO3 và CaCl2
thích hợp nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase từ Aspergillus oryzae.
Quá trình nghiên cứu cho thấy khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase tăng lên khi bổ
sung các nguồn dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy. Cụ thể như sau:
-

Nguồn carbon từ lactose với hàm lượng 5%

-

Nguồn nitơ vô cơ từ NH4NO3 với hàm lượng 0,3%

-

Nguồn khoáng CaCl2 0,3% hoặc MgSO4 0,1%

-

Hàm lượng kết hợp 0,5% NH4NO3 và 0,3% CaCl2 là thích hợp.

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

ii


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ ....................................................................................................................... i
TÓM LƯỢC ........................................................................................................................ii
MỤC LỤC ..........................................................................................................................iii
DANH SÁCH HÌNH............................................................................................................ v
DANH SÁCH BẢNG.......................................................................................................... vi
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU ................................................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề ...................................................................................................................... 1
1.2 Mục đích nghiên cứu ..................................................................................................... 1
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ............................................................................. 3
2.1 Hệ enzyme amylase....................................................................................................... 3
2.1.1 Amylase có trong canh trường nấm mốc Aspergillus............................................. 3
2.1.2 Hoạt độ enzyme amylase....................................................................................... 6
2.2 Nấm mốc Aspergillus oryzae .......................................................................................... 8
2.2.1 Đặc điểm chung .................................................................................................... 8
2.2.2 Nguồn nấm mốc và điều kiện sinh trưởng, phát triển............................................. 8
2.3 Sinh tổng hợp enzyme amylase từ nấm mốc................................................................. 9
2.3.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt ............................................................................. 10
2.3.2 Môi trường nuôi cấy cám gạo và trấu .................................................................. 11
2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme cảm ứng .................................. 12
2.4.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon.............................................................................. 12
2.4.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ .................................................................................. 13
2.4.3 Ảnh hưởng của nguồn khoáng............................................................................. 14
2.4.4 Ảnh hưởng của pH nguyên liệu ........................................................................... 14
2.4.5 Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường nuôi cấy......................................................... 15
2.4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ ...................................................................................... 15
2.4.7 Thời gian nuôi cấy .............................................................................................. 15
2.5 Ứng dụng chế phẩm enzyme amylase ......................................................................... 15

2.5.1 Một số chế phẩm enzyme thương mại ................................................................. 15
2.5.2 Enzyme amylase trong công nghiệp thực phẩm ................................................... 16
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ............................ 18
3.1 Phương tiện thí nghiệm ............................................................................................... 18
3.1.1 Địa điểm và thời gian.......................................................................................... 18
3.1.2 Nguyên liệu ........................................................................................................ 18
3.1.3 Thiết bị và dụng cụ ............................................................................................. 18
3.1.4 Hóa chất và môi trường....................................................................................... 18
3.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 19
3.2.1 Phương pháp thí nghiệm ..................................................................................... 19
3.2.2 Phương pháp phân tích........................................................................................ 19
3.3. Nội dung và bố trí thí nghiệm .................................................................................... 19

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

iii


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon (đường) bổ sung riêng lẻ đến
hoạt tính enzyme amylase được tổng hợp bởi Asp.oryzae............................................ 19
3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ bổ sung riêng lẻ đến hoạt
tính enzyme amylase được tổng hợp bởi Asp.oryzae ................................................... 21
3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn khoáng bổ sung riêng lẻ đến hoạt
tính enzyme amylase được tổng hợp bởi Asp.oryzae ................................................... 22
3.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung kết hợp nguồn nitơ và khoáng
đến khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase ............................................................... 24

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN............................................................................ 27
4.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon (đường) bổ sung riêng lẻ đến hoạt tính enzyme amylase
được tổng hợp bởi Asp. oryzae ............................................................................................ 27
4.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ bổ sung riêng lẻ đến hoạt tính enzyme amylase được
tổng hợp bởi Asp.oryzae ...................................................................................................... 28
4.3 Ảnh hưởng của nguồn khoáng bổ sung riêng lẻ đến hoạt tính enzyme amylase được tổng
hợp bời Asp.oryzae.............................................................................................................. 29
4.4 Ảnh hưởng nguồn nitơ và khoáng bổ sung kết hợp đến hoạt tính enzyme amylase được
tổng hợp bời Asp.oryzae ...................................................................................................... 31
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................................... 33
5.1 Kết luận........................................................................................................................ 33
5.2 Kiến nghị...................................................................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 34
PHỤC LỤC A. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH............................................................... vii
PHỤ LỤC B. CÁC KẾT QUẢ THỐNG KÊ .....................................................................ix

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

iv


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH HÌNH
Hình 1. Nấm mốc Apsergillus .................................................................................... 9
Hinh 2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 ............................................................................. 20
Hình 3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 ............................................................................. 22
Hình 4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 ............................................................................. 23

Hình 5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 4 ............................................................................. 25
Hình 6. Một số mẫu nấm mốc nuôi cấy trong các thí nghiệm ................................... 26
Hình 7. Dịch trích enzyme thô ................................................................................. 32

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

v


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1. Các chủng nấm mốc Aspergillus có sinh enzyme amylase ......................... 9
Bảng 2. Ảnh hưởng của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo amylase
của Asp. oryzae nuôi bằng phương pháp bề mặt ................................................... 10
Bảng 3. Thành phần hóa học trung bình của cám.................................................. 11
Bảng 4. Sinh tổng hợp enzyme của nấm mốc phụ thuộc vào các chất cảm ứng..... 12
Bảng 5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh tổng hợp các enzyme amylase......... 14
Bảng 6. Các chế phẩm α-amylase vi sinh vật dùng trong sản xuất bia................... 16
Bảng 7. Bố trí nghiệm thức thí nghiệm 4 .............................................................. 24
Bảng 8. Hoạt tính enzyme amylase theo nguồn carbon bổ sung ........................... 27
Bảng 9. Hoạt tính enzyme amylase theo nguồn nitơ bổ sung ................................ 28
Bảng 10. Hoạt tính enzyme amylase theo nguồn khoáng bổ sung ......................... 30
Bảng 11. Hoạt tính enzyme amylase theo nguồn nitơ và khoáng bổ sung kết hợp . 31

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

vi

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề

Mốc màu hoa cau mà nhân dân ta thường dùng để làm tương là một loài nấm sợi có
tên khoa học là Aspergillus oryzae. Đây cũng chính là loài mà người Nhật dùng để
đường hóa gạo khi làm rượu Sake. Những nghiên cứu sớm nhất về loài nấm này do
một nhà khoa học Nhật Bản tên là Jokichi Takamine vào năm 1894. Chính vì thế
enzyme từ Aspergillus oryzae tên là taka-diastatic.
Thời đó để đường hóa tinh bột lúa mì và ngô ở phương Tây người ta dùng mầm đại
mạch (malt). Hoạt tính taka-diastatic cao hơn nhiều so với trong mầm đại mạch. Hoạt
tính taka-diastatic làm cho quá trình đường hóa rút ngắn lại và giá thành rẻ hơn rõ rệt.
Các nghiên cứu vào đầu những năm 1940 đã xác định sự có mặt của glucoamylase
(hay taka-diastatic) trong các chủng Aspergillus.
Ngày nay, nấm sợi Aspergillus oryzae đã được chọn lọc để có các chủng sinh amylase
có hoạt tính cao. Bộ gen di truyền của Aspergillus oryzae đã được phân tích và biết
vào năm 2001. Ngoài amylase nấm này có thể dùng trong công nghiệp để sản xuất
nhiều loại enzyme khác nhau, lipase, hemicellulase, cellulase, oxydoreductase,
phytase, pectinesterase…
Trong lĩnh vực thực phẩm amylase từ nấm mốc Asp.oryzae được sử dụng rộng rãi để
đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu bia, bánh mì, xirô,…Các enzyme có độ tinh
sạch cao, tính chất phù hợp có triển vọng trong công nghiệp dược phẩm và hóa chất
tinh khiết.
Cho tới nay đã có nhiều nghiên cứu enzyme amylase từ Aspergillus oryzae được công
bố nhưng vẫn tồn tại nhiều vấn đề chưa thỏa mãn. Một trong những động lực thúc đẩy

sự phát triển của ngành công nghiệp enzyme nói chung là kiến thức có được từ nghiên
cứu các vấn đề: Nguồn nguyên liệu để thu nhận enzyme, cơ chế điều hòa sinh tổng
hợp enzyme và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp để thu được enzyme
có hoạt tính cao.
1.2 Mục đích nghiên cứu
Ứng dụng kết quả từ những nghiên cứu trước về các yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến khả
năng sinh tổng hợp enzyme amylase của nấm mốc Aspergillus oryzae và củng cố, bổ
sung thêm những hiểu biết về ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng trong canh trường
nuôi cấy nấm mốc. Cụ thể như sau:
- Xác định nguồn carbon bổ sung và hàm lượng thích hợp cho việc sinh tổng hợp
enzyme amylase
- Xác định nguồn nitơ vô cơ và hàm lượng thích hợp cho việc sinh tổng hợp
enzyme amylase
- Xác định nguồn muối khoáng và hàm lượng thích hợp cho việc sinh tổng hợp
enzyme amylase

Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng

1


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

-

Trường Đại học Cần Thơ

Xác định được hàm lượng bổ sung kết hợp các nguồn nitơ vô cơ và nguồn
khoáng (xác định ở trên) cho việc sinh tổng hợp enzyme amylase.

Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng

2


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
Amylase là một trong những hệ enzyme quan trọng trong ngành công nghệ sinh học
hiện nay do có những ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm, dược phẩm và công nghệ
lên men...
Enzyme amylase có nhiều trong dịch tiêu hóa động vật, hạt nảy mầm thực vật và canh
trường vi sinh vật: vi khuẩn, nấm mốc, nấm men. Ngày nay, do ưu thế về nhiều mặt vi
sinh vật đã trở thành nguồn thu enzyme chủ yếu.
Để thu enzyme amylase người ta thường dùng các giống nấm sợi Aspergillus,
Rhizopus và một số loài của Mucor, Neurospora...
2.1 Hệ enzyme amylase
Enzyme amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân có sự tham gia của nước (hydrolase),
xúc tác sự phân giải các liên kết glucoside trong mạch polysaccharide của tinh bột và
glycogen. Enzyme amylase chia làm hai nhóm, α-1,4-glucanase và α-1,6- glucanase
trong đó α-amylase, β-amylase, γ-amylase, dextrinase, maltase, pullulanase…là những
enzyme phổ biến.
2.1.1 Amylase có trong canh trường nấm mốc Aspergillus
2.1.1.1 α-Amylase (EC 3.2.1.1)
α-Amylase có khả năng phân cắt liên kết α-1,4 glycoside trong mạch amylose và
amylopectin. α-Amylase phân cắt bên trong mạch polysaccharide một cách ngẫu
nhiên, không theo thứ tự nào nên gọi là endoenzyme. Dưới tác dụng của enzyme αamylase, tinh bột có thể chuyển hóa dần thành dextrin phân tử thấp, maltotetrose,
maltose và glucose, làm giảm nhanh độ nhớt dung dịch hồ tinh bột, có tác dụng dịch

hóa.
Một số đặc điểm hóa học và hóa lý của enzyme α-amylase
- Trung tâm hoạt động chứa nhóm – COOH và NH3
- Dễ tan trong nước, dung dịch muối và cồn loãng.
- Protein của amylase có tính acid yếu và tính chất của globulin. Điểm đẳng điện trong
khoảng pH 4,2 - 4,7
- Phân tử lượng 45 – 50 kDa
- Là một metaloenzyme, chứa từ 6-30 nguyên tử gram Calci/mole. Calci đảm bảo tính
xúc tác enzyme α-amylase, làm bền trước tác nhân gây biến tính như nhiệt độ, pH và
sự phân giải protease.
- Bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng Cu2+, Hg2+, Fe3+

Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng

3


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

α-Amylase của Asp.oryzae có phần phi protein là polysaccharide gồm 8 mole maltose,
1 mole glucose, 1 mole hexoamine trên 1 mole enzyme (Akabori, 1965)1. α-Amylase
từ nấm mốc vừa có khả năng dextin hóa vừa có khả năng đường hóa lớn tạo ra
maltose và glucose. Khả năng dextrin hóa của chế phẩm α-amylase từ Asp.oryzae cao
hơn khả năng đường hóa 1,75 lần (Lifsitx và Baznitsenko, 1967)1. Tỉ lệ đường
glucose: maltose = 1: 3,79 cho α-amylase nấm sợi và 1: 5 cho vi khuẩn (Hanrahan và
Caldwell, 1953)1. Khi dùng nồng độ α-amylase nấm mốc tương đối lớn có thể đường
hóa đến glucose và maltose đạt 84 - 87% tinh bột. Vận tốc thủy phân của α-amylase từ
Asp.oryzae ở giai đoạn đầu thấp hơn amylase từ vi khuẩn 25%.

pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm enzyme αamylase từ Asp.oryzae khoảng 6,0 - 6,2.
α-Amylase của nấm sợi Asp.oryzae bền acid hơn α-amylase của malt và vi khuẩn Bac.
subtillis. Ở pH 3,6 và nhiệt độ 0oC hoạt lực α-amylase của nấm sợi hầu như không
giảm, amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15-30 phút, α-amylase của vi khuẩn
bị vô hoạt 50% (Fenilxova và Rmoshinoi, 1989)1
Trong dung dịch α-amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH 5-5,5, α-amylase dextrin hóa
của nấm sợi đen chịu được pH từ 2,5-2,8. Ở nhiệt độ 0oC và pH 2,5 nó chỉ bị vô hoạt
hoàn toàn sau 1 giờ.
α-Amylase của nấm sợi rất nhạy đối với tác động của nhiệt. Nhiệt độ tối thích ở 50oC
và bị mất hoạt lực ở 70oC (Kozima, 1991)1 và gần như vô hoạt ở 75 oC.
Trong dung dịch đệm pH 4,7, α-amylase của Asp.oryzae rất nhạy với nhiệt độ cao. Ở
nhiệt độ 40oC trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22 - 29%, hoạt lực
đường hóa còn 27 - 85%. Còn ở nhiệt độ 50oC trong 2 giờ α-amylase của nấm này bị
vô hoạt hoàn toàn (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2004)
2.1.1.2 Glucoamylase (EC 3.2.1.3)
Glucoamylase thủy phân liên kết α-1,4 glycoside tách lần lượt các gốc glucose từ đầu
không khử trong phân tử amylose và thủy phân liên kết α-1,4 và α-1,6 glycoside trong
phân tử amylopectin, glycogen. Do đó, glucoamylase là enzyme ngoại phân
(exoenzyme). Phần lớn sản phẩm thủy phân bởi glucoamylase chứa glucose.
Glucoamylase được tách ra lần đầu tiên từ Asp. awamori (Katihara, Kurushima,
1966)1. Sau đó nó được tìm thấy trong Rhizopus delemar, Asp.niger, Asp.oryzae và
mô động vật. Glucoamylase còn có tên gọi khác là: γ-amylase, amyloglucosidase,
taka- amylase Bac, matulase…

1

Được trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng (2004)

Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng

4


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

Glucoamylase thủy phân cơ chất có cấu tạo phân nhánh, phân tử lớn với vận tốc
nhanh hơn các cơ chất không phân nhánh và phân tử thấp.
Theo khả năng thủy phân tinh bột, glucoamylase được chia thành hai kiểu: kiểu
Rhizopus delemar và kiểu Asp. niger. Glucoamylase của Asp.oryzae thuộc kiểu Asp.
niger
Sơ đồ thủy phân glucid bởi enzyme như sau
Rh. delemar
Tinh bột hay oligosaccharide

100% glucose

(Có liên kết nhánh)
Asp. niger
Tinh bột hay oligosaccharide

80-85% glucose + oligosaccharide

Glucoamylase có pH tối thích khoảng 3,5 - 5,5 và bền acid hơn so với α-amylase do
được ổn định bởi ion H+ chứ không phải Ca2+. pH hoạt động tối thích của glucoamylse
còn thay đổi theo nhiệt độ và thời gian tác dụng . Glucoamylse của Rh.delemar có
hiệu lực cao nhất 4,7 - 5,0 và nhiệt độ 55 - 60oC, nhưng khi hạ nhiệt độ 40oC thì pH
tối thích là 4,5. Chế phẩm glucoamylase từ Endomycopsis có pH tối thích 5,4 - 5,6 với
thời gian tác dụng 30 phút. Nếu tăng thời gian tác dụng lên thì pH mở rộng 4,7 - 5,6

(Azepoba, 1971)1.
Theo khả năng bền acid, glucoamylse được chia thành hai loại: Glucoamylse acid và
glucoamylase trung tính. Nếu nấm sợi sinh trưởng trong môi trường acid hơn thì sinh
ra glucoamylase acid nhiều hơn và trong môi trường gần trung tính hơn thì
glucoamylase trung tính nhiều hơn. Nhiệt độ hoạt động tối thích của loại bền acid là
50oC (Barker và Fleetwood, 1957)1, của loại trung tính thấp hơn 50oC.
Phân từ lượng glucoamylase từ 33 – 97 kDa
Glucoamylase bị kìm hãm bởi sufuahydryl do chúng liên kết với nhóm –SH trong
trung tâm hoạt động của enzyme.
2.1.1.3 Dextrinase (EC 3.2.1.10)
Enzyme dextrinase thủy phân các liên kết α-1,6 glucoside trong isomaltose, panose,
dextrin giới hạn và tạo sản phẩm là các đường lên men được. Các loài nấm sợi Asp.
awamori, Asp.oryzae, Asp.usamii sinh tổng hợp enzyme này mạnh hơn cả

1

Được trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng (2004)

Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng

5


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

(Karpukhina và Xoxfenov, 1977; Pankratov và Kirxanov, 1969; Rukhlideva và
Goriatreva, 1967)1. Các dextrinase hoạt động tối thích ở nhiệt độ 40oC và pH 5,1.
2.1.1.4 Maltase (EC 3.2.1.20) Nhiều nấm sợi sinh enzyme này, nó có khả năng thủy

phân maltose thành glucose nhưng không thủy phân được tinh bột. Khi nghiên cứu
tính chất của maltase tách từ canh trường bề mặt nấm mốc Asp.oryzae, các nhà nghiên
cứu Nhật cho biết rằng maltase và glucozyltransferase là một enzyme, vừa có khả
năng thủy phân liên kết α-1,4 glycoside trong các glucopyranose vừa có khả năng
chuyển các gốc glucosise sang đường và rượu.
2.1.1.5 Transglucosyldase (EC 2.4.1.3)
Enzyme transglucosyldase có hoạt tính transferase lẫn hoạt tính thủy phân.
Transglucosyldase thực hiện việc chuyển các gốc glucosyl sang các nhóm mono, di và
oligosaccharide, xúc tác tạo thành các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside. Rodzevit và
Butova (1965)1 tìm thấy trong canh trường nấm sợi Asp.niger, Asp.oryzae và Asp.
awamori có glucosyltransferase, đồng thời cho biết rằng enzyme này xúc tác sự tổng
hợp các oligosaccharide từ các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside từ maltose. Sự có mặt
của transglucosyldase trong các chế phẩm amylase là không mong muốn.
Glucoamylse xúc tiến thủy phân tinh bột , còn transglucosyldase lại tổng hợp các
isosaccharide từ các sản phẩm thủy phân này, làm giảm mức độ thủy phân sâu sắc tinh
bột, làm dịch thủy phân có vi đắng. Transglucosyldase của nấm sợi bị vô hoạt hoàn
toàn ở pH 1,9 - 2,0 sau 24 giờ.
2.1.2 Hoạt độ enzyme amylase
Trong enzyme học, người ta không định lượng enzyme một cách trực tiếp mà xác định
gián tiếp thông qua mức độ hoạt động (hoạt độ) của enzyme. Bởi vì, khi có mặt của
enzyme thì sự hoạt động của nó được biểu hiện ra ở chỗ nó làm thay đổi các tính chất
vật lý, hóa lý cũng như tính chất hóa học của hỗn hợp phản ứng. Theo dõi những biến
đổi đó có thể biết được chính xác mức độ hoạt động của enzyme thông qua xác định
lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng. (Lê Ngọc
Tú, 2004)
Để xác định hoạt độ của các enzyme amylase có thể dùng một trong các phương pháp
sau
Đo sự biến thiên độ nhớt của dung dịch bằng nhớt kế khi cho amylase tác dụng lên hồ
tinh bột, khi đó các mạch phân tử cơ chất bị cắt ngắn, độ nhớt của dung dịch giảm
dần.

1

Được trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng (2004)

Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng

6


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

Đo mật độ quang của dung dịch khi thực hiện phản ứng màu với iod. Khi có amylase
thì các sản phẩm phân giải của tinh bột sẽ cho màu khác nhau với iod.
Đo lượng đường maltose hoặc glucose tạo thành sau khi cho enzyme tác dụng lên cơ
chất.
Hệ enzyme amylase có các hoạt độ đặc trưng sau
Hoạt độ của enzyme α- amylase theo Rukhliadeva1 dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột
bởi enzyme có trong dịch chế phẩm nghiên cứu tới các dextrin có phân tử lượng khác
nhau. Đo cường độ màu tạo thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với
iod bằng máy so màu quang phổ sẽ tính được hoạt độ của enzyme. Đơn vị hoạt độ của
α- amylase là lượng enzyme chuyển hóa được một gam tinh bột tan thành dextrin có
phân tử lượng khác nhau ở 30 oC trong một giờ ở pH 4,7 (α- amylase từ nấm mốc).
Hoạt độ glucoamylase đặc trưng cho khả năng chế phẩm thủy phân tinh bột đến
glucose. Muốn xác định được cần đo được lượng glucose tạo thành. Đơn vị hoạt độ
của glucoamylase là lượng chế phẩm enzyme khi tác dụng lên tinh bột ở 30oC và pH
tối thích trong 1 giờ tạo ra 1mg glucose (xác định bằng phương pháp ZikhetarBleyer) hay cũng trong những điều kiện nhiệt độ và pH tương tự làm giải phóng được
1 micromol glucose (xác định bằng phương pháp glucooxydase).

Hoạt độ đường hóa phản ánh khả năng của các enzyme amylase đường hóa tinh bột
đến các đường khử. Đơn vị hoạt độ đường hóa là lượng chế phẩm enzyme trong 1 giờ
ở nhiệt độ 30oC và pH thích hợp làm phân giải được 1 gam tinh bột thành đường khử
khi mức độ thủy phân cơ chất không vượt 30%.
Hoạt độ maltose đặc trưng cho khả năng thủy phân maltose tới glucose của chế phẩm
enzyme. Đơn vị hoạt độ maltose là lượng chế phẩm enzyme phân giải được 1 gam
maltose tới glucose trong vòng 1 giờ ở 30oC, độ thủy phân maltose trong phản ứng
này không vượt quá 30%. (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2004)
Đơn vị hoạt độ
Đơn vị enzyme quốc tế (UI) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa
được micromol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 UI = 1µmol cơ chất (10-6) mol/phút
Katal (Kat) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa được 1 mol cơ chất
sau 1 giây ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 Kat = 1mol/ giây
1 UI = 10-6/60 Kat 16.67 nKat (nano Katal)
1

Được trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng (2004)

Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng

7


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

Hoạt độ riêng của chế phẩm enzyme là số đơn vị UI (hoặc số đơn vị Katal ứng với 1

mililite dung dịch (nếu là dung dịch) hoặc là 1 miligram protein ( nếu là bột khô của
chế phẩm). Ví dụ một dung dịch enzyme chứa 10 UI (hoặc 166.7 nKatal) trong một
ml ( hoặc mg protein). Nếu chế phẩm enzyme đã tinh sạch, hoat độ được biểu thị bằng
số UI hoặc Katal trên một mg protein. Khi đã biết khối lượng phân tử của enzyme thì
có thể tính hoạt độ riêng phân tử
Hoạt độ riêng phân tử là số phân tử cơ chất chuyển hóa bởi một phân tử enzyme trong
một đơn vị thời gian.
Khi xác định hoạt độ enzyme cần chú ý những điểm sau:
Nồng độ cơ chất trong phản ứng phải ở một giới hạn thích hợp vừa đủ để bão hòa
enzyme nhưng không quá cao đến mức kìm hãm enzyme. Với những enzyme cần có
chất hoạt hóa hoặc chất làm bền thì phải cho các chất này vào enzyme trước khi cho
cơ chất vào hỗn hợp phản ứng. Xác định hoạt độ cần tiến hành ở pH thích hợp và cố
định. Nhưng cần chú ý là pH có thể thay đổi khá nhiều tùy thuộc vào cơ chất và thành
phần dung dịch đệm, lực ion của dung dịch đệm (thường trong phạm vi từ 0,01-0,1).
Nhiệt độ dùng để xác định hoạt độ cần phải thấp hơn nhiệt độ tối ưu của enzyme để
phòng tác dụng kìm hãm enzyme ở nhiệt độ cao.
Thời gian xác định hoạt độ thường từ 5-30 phút. Trong một số trường hợp có thể kéo
dài 24 giờ nếu hoạt độ enzyme quá thấp. Trong trường hợp đó có thể thêm các chất
tiêu diệt vi sinh vật vào dung dịch và tránh dùng dung dịch đệm thuận lợi cho sự phát
triển vi sinh vật (Lê Thanh Mai và cộng sự, 2009)
2.2 Nấm mốc Aspergillus oryzae
2.2.1 Đặc điểm chung
Apergillus oryzae thuộc giống Aspergillus, họ Aspegillaceae, bộ cúc khuẩn
Plectascales, lớp nang khuẩn Ascomycetes, ngành nấm. Apergillus là nấm mốc sinh
sản vô tính bằng cách tạo than quả hoặc cuống bào tử đính. Bào tử đính là tập hợp
những khuẩn ti cao, xuất phát từ một tế bào lớn. Các nang quả phình to phía bên trên,
chỗ phình to có dạng hình cầu, hình bầu dục, hình chùy được gọi là túi định. Túi định
có vô vàn những mầm nhỏ gọi là thể bình mọc ra khắp mọi hướng, ở phần cuối các
mầm này là các bào tử đính. Cơ sở phân loài nấm mốc thuộc giống Asperillus là đặc
điểm cấu tạo, màu sắc của cuốn bào tử đính. Asp.oryzae có bào tử màu vàng hoa cau

(Lê Xuân Phương, 2001).
2.2.2 Nguồn nấm mốc và điều kiện sinh trưởng, phát triển
Asp. oryzae sinh ra nhiều enzyme thủy phân ngoại bào (amylase, protease,
pectinase,…), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa bột,
gạo đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu,… chúng mọc và phát
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng

8


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen, vàng,… do các bào tử già có màu sắc. Các
bào tử này, dễ bị cuốn theo gió (Nguyễn Đức Lượng, 2001).
Trong tự nhiên, Aspergillus oryzae có trong không khí, có thể có trên vỏ trái cam sành
Tam Bình (Đỗ Thị Tuyết Nhung, 2005). Trong thực tế Asp. oryzae được phân lập từ
đất bởi Nguyễn Văn Phùng, từ giày da bởi Đặng Hồng Nhiên, từ thóc gạo, lạc nhân
bởi Bùi Xuân Đồng (2004).
Nấm mốc Asp. oryzae sinh trưởng ở điều kiện độ ẩm 45 - 55%, pH môi trường 4,5 6,5 độ ẩm không khí 85-95%, nhiệt độ nuôi 27 - 30 oC.

Hình 1. Nấm mốc Aspergillus
(Nguồn: />
2.3 Sinh tổng hợp enzyme amylase từ nấm mốc
Nấm mốc Aspergillus được coi là những vi sinh vật sung mãn trong sản xuất các
enzyme ngoại bào. Hiệu xuất sinh tổng hợp có thể tăng lên nhờ thay đổi điều kiện
nuôi và thành phần dinh dưỡng của môi trường (Hoàng Kim Anh và cộng sự, 2005)
Bảng 1. Các chủng nấm mốc Aspergillus có sinh enzyme amylase
Aspergillus sp.

-amylase

Glucoamylase

A.awamori

+

+

A.flavus

+

A.fumimatus

+

A.kawachi

+

A.niger

+

+

A.oryzae

+

+

A.usamii

+

A.candidus

+

A.saitri

+

A.terreus

+

(Nguồn: Hoàng Kim Anh et al., 2005)

Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng

9


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt
Theo phương pháp này giống vi sinh vật hiếu khí sau khi cấy sẽ phát triển trên bề mặt
và dần dần lan xuống phía dưới theo các kẽ hở giữa các cấu tử thành phần môi trường
và giữ ở nhiệt độ thích hợp. Thời gian của quá trình này ngắn và sản phẩm thu được ít
lẫn các sản phẩm chuyển hóa trung gian và do đó dễ chiết tách và tinh chế. Nuôi cấy
nấm mốc theo phương pháp bề mặt để sản xuất enzyme thường dùng môi trường rắn,
là các nguyên liệu tự nhiên: cám mì, cám gạo, ngô mảnh, đậu tương…
Độ ẩm môi trường rắn khoảng 60% thích hợp cho nấm mốc nôi cấy bề mặt trên khay
hở. Nếu độ ẩm trên 60% vi khuẩn dễ phát triển, dễ gây tạp nhiễm, khó thông khí, còn
nếu thấp hơn 50% thì môi trường khô nhanh, sinh bào tử mạnh và giảm hoạt tính
enzyme, muốn vậy độ ẩm phòng nuôi phải từ 90 - 100% (Nguyễn Đức Lượng và cộng
sự, 2004).
Bảng 2. Ảnh hưởng của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo amylase của
Asp. oryzae nuôi bằng phương pháp bề mặt
20 giờ
Phương án thí
nghiệm

Độ ẩm

34 giờ
Độ ẩm

%

Hoạt độ
amylase *

Khay để hở

27,8

Khay đậy nắp

46,4

42 giờ
Độ ẩm

%

Hoạt độ
amylase *

%

Hoạt độ
amylase *

15,0

23,8

18,0

22,0

20,5

20,4

42.4

32,9

42,4

36,7

(Nguồn:Nguyễn Đức Lượng và cộng sự , 2004)
Ghi chú: (*) đv/g canh trường khô

Môi trường được rải mỏng ra các khay đã được thanh trùng với bề dày khoảng 2 - 2,5
cm và để nguội khoảng 30 oC mới tiến hành cấy giống. Nhiệt độ thích hợp với đa số
nấm mốc khoảng 30 - 32 oC. Nếu nhiệt độ thấp hơn 24oC nấm mốc phát triển chậm,
sinh bào tử yếu, thời gian nuôi kéo dài dẫn đến giảm khả năng sinh tổng hợp enzyme.
Việc tạo thành α- amylase ở nấm mốc Asp. oryzae không bị kìm hãm ở nhiệt độ
40 - 45 oC trong khoảng từ 10 -12 giờ. Thời gian nuôi cấy nấm mốc khoảng 30 - 36
giờ. Nấm mốc Asp.oryzae và Asp.awamori trên môi trường cám để sản xuất amylase
khoảng 36 - 40 giờ. Nhiều chủng Asperillus sinh enzyme cao nhất lúc mới tạo bào tử
nhưng cũng có trường hợp vào lúc đã sinh nhiều bào tử.
Quá trình nuôi cấy nấm mốc trên bề mặt môi trường rắn chia làm 3 thời kỳ
Khoảng 10 - 14 giờ đầu, bào tử trương nở bắt đầu nảy mầm, thời kỳ này chưa hình
thành enzyme. Giống rất nhạy cảm với nhiệt độ, ở những giờ này thể tích buồng nuôi
cần giữ 29 - 31oC.

Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng

10


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

14-18 giờ tiếp theo, mốc phát triển nhanh hô hấp mạnh. Sợi nấm có thể quan sát bằng
mắt thường, lúc đầu là lớp lông tơ màu trắng, xám và ngày càng rõ, làm môi trường
kết bánh lại. Các chất dinh dưỡng tiêu hao nhanh để phục vụ cho quá trình trao đổi
chất trong tế bào và giống hô hấp mạnh tỏa ra môi trường chung quanh 80 - 90
Kcal/giờ, làm nhiệt độ môi trường có thể tăng lên từ 37 - 40oC hoặc hơn nữa. Nhiệt độ
ở giai đoạn này cần giữ ở 28 - 29oC và độ ẩm trong phòng khoảng 100%.
Thời kỳ thứ ba kéo dài trong khoảng từ 10 - 20 giờ. Thời gian này các quá trình trao
đổi chất vẫn tiếp tục nhưng yếu dần, lượng nhiệt tạo ra giảm và việc tạo thành enzyme
vẫn tiếp tục giữ nhiệt độ buồng nuôi khoảng 30oC.
Tùy thuộc đặc tính sinh lý của từng nấm mốc, thời gian nuôi cấy có thể kết thúc tại
thời điểm mà lượng enzyme được tạo thành tối đa.
Môi trường sau khi nuôi cấy được sấy khô xuống độ ẩm 12%, nghiền nhỏ, đựng trong
các bao polyetylen hoặc giấy chống ẩm. Sản phẩm này là chế phẩm enzyme thô, tiếng
Nhật gọi “Koji” có nghĩa là “hoa mốc” có thể dùng trực tiếp đường hóa trong công
nghiệp rượu bia…hoặc được dung làm nguyên liệu để chiết tách ra những chế phẩm
enzyme tinh khiết.
Trong nước chiết các môi trường rắn sau khi nuôi cấy nấm mốc thường chứa một
lượng lớn các phân tử thấp. Phần lớn các enzyme dễ hòa tan trong nước, cho nên rất
dễ tách chúng từ những tế bào gốc đã trưởng thành, những tế bào này hầu như đã
ngừng quá trình trao đổi chất, độ thẫm thấu của hệ sợi tăng, enzyme dễ tiết ra môi
trường và dễ hòa tan vào nước.
2.3.2 Môi trường nuôi cấy cám gạo và trấu
Trong các nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên, cám gạo được sử dụng nhiều trong nuôi

cấy vi sinh vật, thích hợp nhất là nấm sợi vì trong cám chứa đầy đủ các hợp chất cần
thiết cho sự phát triển (bảng 2).
Bảng 3. Thành phần hóa học trung bình của cám
Thành phần

Khối lượng

Đơn vị tính

Protein

12,2

%

Lipid

22,7

%

Glucid

40,3

%

Cellulose

6,3

%

Tro

6,5

%

Calci

30,0

mg/100g

Phosphor

4,6

mg/100g

Sắt

14,0

mg/100g

Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng

11

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Vitamin B1

0,96

Trường Đại học Cần Thơ

mg/100g

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Trong thành phần của cám chứa nhiều tinh bột, khi thanh trùng, tinh bột bị hồ hóa và
trở nên kết dính, ngăn cản sự chuyển vận oxy có trong khối môi trường. Nhằm làm
tăng độ xốp, trấu thường được cho vào với lượng khoảng 20 - 25%. Trấu tạo nên
những khoảng trống để không khí có thể lưu thông trong lòng môi trường. Vi sinh vật
phát triển ở giữa pha rắn và pha khí của môi trường. Trong trường hợp này vi sinh vật
có khả năng phát triển hẳn trong lòng môi trường nhưng nó vẫn hoàn toàn mang ý
nghĩa của quá trình nuôi cấy bề mặt.
2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme cảm ứng
Quá trình sinh tổng hợp được gọi là cảm ứng, nếu như nó xảy ra ở mức độ đáng kể khi
môi trường có cơ chất đặc hiệu của enzyme này hoặc các chất trao đổi có cấu trúc
tương tự cơ chất. Các enzyme thuộc loại này gọi là enzyme cảm ứng. Các cơ chất kích
thích quá trình tổng hợp này được gọi là các chất cảm ứng.
Như vậy, có chất cảm ứng trong môi trường nuôi cấy là điều kiện hết sức cần thiết để
thu được những enzyme mong muốn. Trong công nghiệp sản xuất enzyme cần phải
lựa chọn những chất cảm ứng thích hợp và xác định nồng độ tối ưu của nó trong môi
trường để có hiệu quả sinh tổng hợp cao nhất.

2.4.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon
Tinh bột là chất cảm ứng tốt đối với enzyme α-amylase. Song nấm mốc Asp.oryzae có
thể sinh ra enzyme này khi có mặt trong môi trường các chất cảm ứng khác như
maltose, isomaltose và panose. Như vậy, chất cảm ứng của enzyme α-amylase ở
Asp.oryzae là những hợp chất có nối α-1,4 glycoside cũng như các olidosaccharide có
mối liên kết α-1,6 (Tonomurs et al., 1961)12
Bảng 4. Sinh tổng hợp enzyme của nấm mốc phụ thuộc vào các chất cảm ứng
Nấm mốc

Enzyme

Chất cảm ứng

Asp.oryzae

α-amylase

Asp.oryzae

α-amylase

Tinh bột
Maltose
Maltose
Isomaltose
Panose
NaNO3
Peptone
Protein đậu nành
Pectin

Asp.niger

2

protease

Tăng hoạt lực
enzyme (%)
100
200
100
176
176
2
100
125
100

Được trích dẫn bởi Lương Đức Phẩm (1998)

Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng

12


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Asp.niger

pectinase

Trường Đại học Cần Thơ

Pectin và lactose

250

(Nguồn: Lương Đức Phẩm, 1998)

Nấm mốc có thể đồng hóa được 75 hợp chất không chứa nitơ như carbonhydrate, rượu
đa nguyên tử và nhiều acid hữu cơ... Carbonhydrate như saccharose, fructose, glucose
có trong môi trường làm cho nấm mốc phát triển mạnh, nhưng hiệu suất sinh tổng hợp
enzyme thấp. Nấm mốc đồng hóa kém glalactose nhưng đối với lactose giống phát
triển yếu nhưng hoạt lực α-amylase lại cao.
Hiệu suất sinh tổng hợp amylase trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau với các
nguồn carbon được thể hiện như sau:
- Đối với α-amylase: Tinh bột > dextrin > maltose > glucose > saccharose > galactose
> arabinose.
- Đối với oligo-1,6-glucosidase: Tinh bột > dextrin > maltose > sucrose > glucose >
lactose > galactose > arabinose.
- Đối với α- 1,4- amyloseglucosidase: Tinh bột, dexrin > maltose, sucrose, glucose,
lactose, arabinose > galactose.
Trong nuôi cấy bề mặt dùng cám làm môi trường, người ta không cần phải bổ sung
thêm tinh bột. (Lương Đức Phẩm, 1998)
2.4.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Khi chuẩn bị môi trường dinh dưỡng để nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase người ta
dùng muối vô cơ. NaNO3 là nguồn nitơ dinh dưỡng để nuôi nhiều loại nấm sợi sinh
amylase. Hàm lượng thường sử dụng là 0,91% NaNO3 và NH4NO3 có hiệu quả hơn
các loại muối khác (KNO3, Mg(NO3)2, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4) khi nuôi Aspergillus

oryzae-3-9-15 trên môi trường bột ngô (Fenikxova và Dvatxatova, 1960)1 chủng này
tạo α-amylase hoạt động khi có mặt (NH4)2HPO4 và NH4NO3 ngoài ra còn có các
chủng của nấm sợi Asp.oryzae 153 lại tổng hợp mạnh mẽ amylase khi có (NH4)2SO4.
Cho nguồn nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích sinh tổng hợp amylse này
và ức chế tổng hợp amylse khác. Theo mức độ tiêu thụ muối môi trường bị acid hóa,
quá trình chuyển dịch mạnh về phía tổng hợp glucoamylse và ức chế tổng hợp αamylase. Fenikxova1 và cộng tác viên đã tiến hành thí nghiệm với NH4H2PO4 và thấy
rằng sinh tổng hợp α-amylase giảm di 10 lần mà sự tạo thành glucoamylase hầu như
không ảnh hưởng.

1

Được trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng (2004)

Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng

13


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

Bảng 5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh tổng hợp các enzyme amylase
Nguồn nitơ
NaNO3
NaNO3
NH4NO3
NH4NO3
NH4 H2PO4

Liều lượng muối,
% theo nitơ
0,3
0,15
0,15
0,3
0,3

Hoạt độ enzyme sau 6 ngày nuôi U/100 ml
α-amylase
Glucoamylase
145
8000
26
3300
98
4100
45
4900
5,5
8000

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng có ý nghĩa lớn đối với sinh tổng hợp
enzyme amylase chỉ khi nào trong môi trường có đủ lượng carbon và nitơ cần thiết
mới tích lũy được enzyme cực lớn. sự thiếu hụt của cấu tử này không thể bù đắp được
sự dư thừa cấu tử kia. Hàm lượng carbon trong môi trường 10 - 40 lần hàm lượng
nitơ.
2.4.3 Ảnh hưởng của nguồn khoáng

Các nguyên tố đa vi lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp enzyme amylase của
vi sinh vật. Mg2+ ảnh hưởng tới độ bền nhiệt của enzyme. Thiếu MgSO4 ức chế hoàn
toàn sự tổng hợp α-amylase còn hàm lượng glucoamylase giảm xuống hang chục lần
(Fenikxova và Muxaeva, 1967)1. Nồng độ tối ưu của muối này trong tổng hợp αamylase và glucoamylase là 0,05%. Thiếu muối này không ảnh hưởng mấy đến sự tạo
thành oligo-1,6-glucosidase (Silova, 1967)1.
Phosphor cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất và coenzyme
(andenosinephosphate, thiamine). Phosphor ảnh hưởng trực tiếp đến sinh sản của nấm
sợi, tăng cường sinh tổng hợp enzyme amylase. Các muối phosphate thường dùng với
nồng độ cao tới 1,5 M. Hoạt độ α-amylase và oligo-1,6- glucosidase tăng cao khi có
0,1% KH2PO4, còn hoạt độ glucoamylase tăng cực lớn khi có 0,2% muối này.
Ca2+ cần cho sự ổn định hoạt động bảo vệ α-amylase khỏi tác dụng của protease,
muốn tích lũy nhiều α-amylase cần có lượng Ca2+ trong môi trường là 0,01-0,05%
(Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2004).
2.4.4 Ảnh hưởng của pH nguyên liệu
Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt pH môi trường ảnh hưởng ít, do môi trường
có dung lượng đệm cao và hàm ẩm thấp, pH không thay đổi mấy trong quá trình nuôi.
Tuy nhiên, pH ban đầu của môi trường cũng có ảnh hưởng không nhỏ tới sự phát triển
của nấm mốc và sự tạo enzyme. pH thích hợp cho Asp. oryzae là môi trường acid yếu
khoảng 4,5 - 6,5. Trong nuôi cấy bề mặt môi trường đặc rất khó tạo sự đồng đều về
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng

14


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

pH, việc ổn định pH trong suốt quá trình phát triển của nấm sợi lại càng khó khăn
hơn.Tuy nhiên, môi trường bán rắn là môi trường tĩnh nếu thay đổi pH ở một vùng

nào đó ít khi ảnh hưởng đến toàn bộ khối môi trường.
2.4.5 Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường nuôi cấy
Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi trường là 55 - 60% và phải
giữ cho môi trường có độ ẩm đó trong quá trình nuôi. Độ ẩm mà tăng quá 60 - 70% sẽ
làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50 - 55% thì kìm hãm sinh trưởng và phát triển
của vi sinh vật cũng như sự tạo amylase.
2.4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ nuôi cũng là một yếu tố hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng của chủng
nấm mốc này và sự tạo thành các enzyme amylase. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát
triển và hình thành emzyme là 28 - 32 oC. Nhiệt độ do nấm mốc tỏa ra môi trường có
thể nóng lên 40 oC hoặc hơn. Do vậy, cần giữ cho nhiệt độ môi trường không xuống
dưới 27oC và không cao hơn 36oC. Toàn bộ chu kỳ sinh trưởng của nấm mốc cám có
thể chia thành hai thời kỳ. Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử trong 11 giờ
đầu. Trong thời kỳ này cần phải cung cấp nhiệt độ cho phòng nuôi không hơn 23 30oC. Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi (có thể đạt từ 4 - 18 giờ).
2.4.7 Thời gian nuôi cấy
Hầu hết các chủng nấm mốc Asp. oryzae có hoạt động cực đại của amylase ở khoảng
giờ thứ 30 – 38, rồi sau đó là cực đại của protease ở giờ thứ 36 - 42. Một số chủng có
hai cực đại của enzyme, ví dụ: cực đại của enzyme amylase ở giờ thứ 36 và giờ thứ
60. Do đó, thời gian nuôi mốc có thể kéo dài từ 60 - 72 giờ. Thời gian nuôi để có
lượng amylase cực lớn thường được xác định bằng thực nghiệm. Sự tạo bào tử là hiện
tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt lực của enzyme. Đối với Asp.
oryzae, sự tạo hoạt lực tối đa thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh bào tử.
2.5 Ứng dụng chế phẩm enzyme amylase
2.5.1 Một số chế phẩm enzyme thương mại
2.5.1.1 Fungamyl 800L
Enzyme α-amylase từ nấm mốc xúc tác chuyển hóa tinh bột và các dextrin thành chủ
yếu là đường maltose, được dung để sản xuất xiro maltose nồng độ cao 40 - 60%
maltose (2 -7% glucose) hay siro có độ chuyển hóa cao DE = 60 - 70; 35 - 40%
glucose; 30 - 37% maltose.
Chế phẩm enzyme này có nhiệt độ tối ưu khoảng 60-65oC. Sản phẩm nhận được sau

khi thủy phân chứa nhiều maltose. Enzyme có thể chịu được pH xuống tới 4,5 và
không bị ảnh hưởng gì nếu thêm ion Ca2+.

Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng

15


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

2.5.1.2 AMG 300L
Enzyme glucoamylase xúc tác thủy phân dextrin thành đường glucose.
2.5.1.3 Promozyme 200L
Là chế phẩm chứa chủ yếu enzyme phân nhánh pullulanase thích hợp cho việc phân
giải các mạch nhánh của tinh bột sau khi dịch hóa, được sử dụng kết hợp với
glucoamylase trong sản xuất đường dextrin hay với Fungamyl trong sản xuất đường
maltose. Thường liều lượng thích hợp là 0,25 - 3 kg/tấn tinh bột khô. Nhiệt độ tối
thích từ 57,5 - 62,5 oC tương ứng với pH tối thích từ 4,5 - 5,5.
2.5.1.4 Ban 240L
Chế phẩm chứa chủ yếu enzyme α-amylase thường được sử dụng dịnh hóa tinh bột
thành dextrin ở nhiệt độ 90oC.
2.5.1.5 Super 240L
Là chế phẩm enzyme được sản xuất từ nấm mốc Aspergillus chứa glucoamylase, αamylase và protease. Chế phẩm ở dạng lỏng màu nâu, d = 1,25 g/ml, hoạt tính 240
AGU/ml.
Bảng 6. Các chế phẩm α-amylase vi sinh vật dùng trong sản xuất bia
(Ca2+

Nguồn chế phẩm

Sản phẩm phản ứng

Nhiệt
độ (oC)

Fungamyl
Asp.oryzae

Chủ yếu là maltose

55 - 60

4,5 - 6

Ceremix 2X L
B.amyloliquefaciens

Dextrin hòa tan

60 - 80

5-7

Tăng khả năng
250 - 500 lọc dịch
đường

85 - 100

6-7

50 - 150

Oligosaccharide
Termamyl loại L
B. Licheniformis

Dextrin hòa tan,
oligosaccharide

pH

ppm)

50

Áp dụng
Nâng cao khả
năng lên men

Làm loãng
dịch hồ hóa

(Nguồn: Đặng Thị Thu và cộng sự, 2004)

2.5.2 Enzyme amylase trong Công nghiệp Thực phẩm
2.5.2.1 Trong sản xuất rượu
Ngày nay chế phẩm amylase của nấm mốc đã hoàn toàn thay thế malt và đem lại một
số ưu điểm

- Tiết kiệm nguyên liệu sản xuất
- Tăng hiệu suất rượu, do khả năng thủy phân sâu của phức hệ enzyme nấm mốc.
- Thời gian sản xuất chế phẩm giảm

Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng

16


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

- Giảm diện tích kho bãi, năng lượng, lao động…
- Chế phẩm sử dụng ở dạng thô, không phải tinh chế
Nguồn nấm mốc thường sử dụng là Asp.oryzae, Asp.awamori, Asp.usamii. Để đường
hóa hoàn toàn tinh bột có trong nguyên liệu, lượng chế phẩm enzyme phải chiếm
khoảng 6 - 6,5% lượng tinh bột. Trong sản xuất rượu vai trò glucoamylase quan trọng
hơn α-amylase.
2.5.2.2 Trong sản xuất bia
Trong sản xuất bia ngày nay người ta thay thế 25 - 50% malt bằng đại mạch loại 2, 3
và ngô tách béo…và dùng enzyme amylase từ Asp.oryzae để đường hóa. Khi dùng
50% nguyên liệu thay thế này thì cho khoảng 1% canh trường Asp.oryzae khô và acid
lactic để tạo pH cần thiết cho enzyme hoạt động.
2.5.2.3 Trong sản suất bánh mì
Trong sản xuất bánh mì, người ta sử dụng α -amylase từ nấm mốc vì enzyme từ nguồn
này có nhiệt độ vô hoạt thấp khoảng 70oC, có thể dùng với lượng lớn mà không bị
dextrin hóa khi nướng và hoạt độ cao đường hóa nhanh chóng (amylase của vi khuẩn
bị vô hoạt ở 80 - 90oC, làm giảm chất lượng bánh). Lượng dùng của chế phẩm từ
0,002 - 0,003%, khoảng từ 20 - 30g chế phẩm khô cho một tấn tinh bột sẽ làm thay

đổi hoàn toàn chất lượng bánh mì: Hương vị, màu sắc, thể tích riêng, độ xốp tăng lên
một cách rõ rệt…(Lê Ngọc Tú và cộng sự, 2004)

Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng

17