Ảnh hưởng của dòng nấm mốc aspergillus niger đến khả năng sinh pectin methylesterase hoạt tính cao

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN THỊ THANH THÚY
MSSV: 2071841

Ả NH H Ư Ở N G C Ủ A D Ò NG A S P E R GI L L US NI GE R
Đ Ế N K H Ả N Ă N G SI N H P E C T I N
M E T H Y L E SE T E R A SE H O Ạ T T Í N H C A O

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Mã ngành: 08

Giáo viên hướng dẫn
Ths. Trần Thanh Trúc

Cần Thơ, 2010


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

LỜI CAM ĐOAN

Luận văn đính kèm theo đây, với đề tài “Ảnh hưởng của dòng nấm mốc
Aspergillus niger đến khả năng sinh pectin methylesterase hoạt tính cao” do
sinh viên Nguyễn Thị Thanh Thúy thực hiện và báo cáo đã được hội đồng chấm
luận văn thông qua.
Giáo viên hướng dẫn

Cần Thơ, ngày ….. tháng ….. năm 2010.
Chủ tịch hội đồng

Ngành Công nghệ thực phẩm

i


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

LỜI CẢM TẠ

Tôi chân thành cảm ơn quý Thầy cô, gia đình và bạn bè đã tận tình hướng dẫn,
truyền đạt kiến thức, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện
đề tài luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn:
PGs.Ts Nguyễn Văn Mười và Thạc sĩ Trần Thanh Trúc, Bộ môn Công Nghệ
Thực Phẩm, khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ đã
tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ, hỗ trợ dụng cụ thí nghiệm cho tôi
trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp này.
Quý thầy cô Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông nghiệp và Sinh học
ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình giúp đỡ và động viên tôi trong
suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Chân thành cảm ơn gia đình đã động viên tôi học tập thật tốt, cảm ơn bạn bè và đặc
biệt xin gởi lời cảm ơn chân thành đến anh Lân, chị Hảo, chị Trân, chị Trinh, chị
Linh và chị Hồng đã giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn trong suốt quá trình tôi học
tập và thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp này.

Cần Thơ, ngày 4 tháng 12 năm 2010
Sinh viên thực hiện

NGUYỄN THỊ THANH THÚY

Ngành Công nghệ thực phẩm

ii


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

TÓM TẮT

Aspergillus niger là nấm mốc có khả năng sinh enzyme pectin methylesterase (PME) được
ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống. Khảo sát khả năng sinh pectinase
của các dòng nấm mốc được tiến hành dựa trên vòng phân giải pectin thông qua thuốc thử
Lugol, đã chọn ra được 10/52 dòng có đường kính trung bình vòng phân giải pectin ≥20
mm (H4 = 20 mm, T2 = 20,5 mm, Sa2 = 21,17 mm, G2 = 21,46 mm, X3 = 21,83 mm, Sa3=
22,33 mm, T1= 22,38 mm, N1 = 23,67 mm, R4 = 23,83 mm, SO2 = 24,33 mm). Các dòng
Aspergillus niger này được lên men rắn trên môi trường giàu pectin từ bã táo và vỏ cam,
sử dụng phương pháp chuẩn độ điện thế nhằm xác định chủng Aspergillus niger có khả
năng sinh tổng hợp PME hoạt tính cao nhất. Kết quả là chọn được 4 chủng có khả năng
sinh PME hoạt tính cao là R4 = 20,6 U/mL; T2 = 20,67 U/mL; T1 = 20,91 U/mL; So2 =
21,64 U/mL. Khi kết hợp lần lượt 2 chủng nấm mốc từ 4 chủng Aspergillus niger có hoạt
tính cao đã được tuyển chọn, kết quả cho thấy sự cạnh tranh của hai chủng nấm mốc chưa
đạt được hiệu quả trong việc thúc đẩy sự sinh tổng hợp PME.

Từ khóa: Aspergillus niger, pectin methylesterase, hoạt tính.

Ngành Công nghệ thực phẩm

iii


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... i
LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................... ii
TÓM TẮT .................................................................................................................... iii
MỤC LỤC.................................................................................................................... iv
DANH SÁCH HÌNH.................................................................................................... vi
DANH SÁCH BẢNG .................................................................................................. vii
TỪ VIẾT TẮT…………………………………………………………………………viii
CHƯƠNG 1

ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................... 1

1.1

TỔNG QUAN ................................................................................................... 1

1.2

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU............................................................................. 2

CHƯƠNG 2
2.1

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .................................................................. 3

NẤM MỐC ....................................................................................................... 3

2.1.1

Tổng quan về nấm mốc............................................................................... 3

2.1.2

Sinh sản của nấm mốc ................................................................................ 4

2.1.3

Một số nấm mốc thường gặp ...................................................................... 6

2.2

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ASPERGILLUS NIGER ...................................... 6

2.2.1

Giới thiệu ................................................................................................... 6

2.2.2

Vị trí phân loại của Aspergillus niger ......................................................... 8

2.2.3

Đặc điểm sinh hóa ...................................................................................... 8

2.3

ENZYME PECTIN METHYLESTERASE (PME) ........................................ 8

2.3.1

Tổng quan về PME ..................................................................................... 8

2.3.2

Ứng dụng của PME .................................................................................. 10

2.3.3

PME từ Aspergillus niger ......................................................................... 10

2.4

MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN.................................................. 11

CHƯƠNG 3
3.1

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 12

PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM ................................................................... 12

3.1.1

Địa điểm, thời gian ................................................................................... 12

3.1.2

Thiết bị, hóa chất ..................................................................................... 12

3.2

PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .................................................................. 13

Ngành Công nghệ thực phẩm

iv


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

3.2.1

Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu .......................................... 13

3.2.2

Phương pháp bố trí thí nghiệm ................................................................. 14

3.2.3

Phương pháp thu thập và sử lý số liệu ...................................................... 16

CHƯƠNG 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 17

4.1
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH PECTINASE CỦA CÁC CHỦNG THUỘC
LOÀI A.NIGER ......................................................................................................... 17
4.2
TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG A.NIGER CÓ KHẢ NĂNG SINH PME
CAO... ........................................................................................................................ 21
4.3
KHẢO SÁT VIỆC KẾT HỢP CÁC CHỦNG NẤM MỐC A.NIGER ĐẾN
KHẢ NĂNG SINH PME HOẠT TÍNH CAO .......................................................... 22
CHƯƠNG 5

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................ 24

4.3

KẾT LUẬN .................................................................................................... 24

4.4

ĐỀ NGHỊ ........................................................................................................ 24

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 25
PHỤ CHƯƠNG ......................................................................................................... viii

Ngành Công nghệ thực phẩm

v


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH HÌNH
Hình 1: Aspergillus niger .................................................................................................. 7
Hình 2: Bào tử Aspergillus niger ...................................................................................... 7
Hình 3: Sự phân cắt bắt đầu từ nhóm carboxyl tự do .......................................................... 9
Hình 4: Sơ đồ thủy phân pectin của PME .......................................................................... 9
Hình 5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ........................................................................ 14
Hình 6: Mặt trên vòng phân giải pectin của chủng nấm SO2 ............................................ 20
Hình 7: Mặt dưới vòng phân giải pectin của chủng nấm SO2 .......................................... 20
Hình 8: Mặt trên và mặt dưới vòng phân giải pectin của nấm mốc A.niger....................... 20
Hình 9 : Mẫu đối chứng nước .......................................................................................... 21
Hình 10 : Mẫu đối chứng A.niger .................................................................................... 21

Ngành Công nghệ thực phẩm

vi

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu trong nghiên cứu .......................... 13
Bảng 2: Đường kính vòng phân giải pectin của các chủng A.niger ................................... 17
Bảng 3: Sự thay đổi hoạt tính PME (U/mL) sinh tổng hợp từ các chủng A.niger đặc hiệu
với pectinase ................................................................................................................... 21
Bảng 4: Sự thay đổi hoạt tính PME (U/mL) sinh tổng hợp từ việc kết hợp các chủng
A.niger ............................................................................................................................ 22

Ngành Công nghệ thực phẩm

vii


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

TỪ VIẾT TẮT

A.niger

Aspergillus niger

PDA

Potato Dextrose Agar

PME

Pectin methylesterase

U

Đơn vị đo hoạt tính enzyme

PG

Polygalacturonase

Ngành Công nghệ thực phẩm

viii


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

CHƯƠNG 1

Trường Đại học Cần Thơ

ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 TỔNG QUAN
Hầu hết các nguyên liệu sử dụng trong công nghệ thực phẩm thực tế chúng là các vật
thể sống, do đó trong quá trình bảo quản hoặc chế biến chúng thành các sản phẩm thực

phẩm sẽ xảy ra hàng loạt các quá trình biến đổi sinh hóa, mà các quá trình này được
xúc tác tự nhiên bởi enzyme bản thể hoặc do nhà công nghệ đưa vào để đạt mục đích
đặt ra. Vì vậy, có thể nói enzyme đóng vai trò chủ chốt trong các quá trình chế biến và
bảo quản thực phẩm.
Việc nghiên cứu enzyme bắt đầu từ năm 1833, khi Payen và Persoz tách được diatase
từ malt. Song từ những năm đầu thế kỷ XX đến nay, việc nghiên cứu, sản xuất và ứng
dụng enzyme mới thực sự phát triển mạnh mẽ. Công nghệ sản xuất enzyme đã mang
lại nhiều lợi ích cho các ngành công nghiệp. Trong số đó, công nghiệp thực phẩm là
một trong những lĩnh vực có lượng tiêu thụ enzyme nhiều nhất.
Enyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein. Enzyme có nguồn gốc từ động
vật và thực vật còn rất hạn chế. Do đó, người ta nghiên cứu việc sử dụng các enzyme
có nguồn gốc từ vi sinh vật để ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác nhau đặc
biệt là ngành công nghệ thực phẩm.
Việc tổng hợp enzyme từ vi sinh vật có những ưu thế sau:
- Nguyên liệu rẻ tiền: đa số vi sinh vật sản xuất enzyme có khả năng phát triển trên các
môi trường đơn giản, rẻ tiền như phế liệu, phụ phẩm của các ngành sản xuất.
- Sản xuất nhanh: vi sinh vật sản xuất enzyme với tốc độ cực kỳ nhanh, trong một thời
gian ngắn có thể sản xuất ra một lượng lớn chế phẩm enzyme.
- Dễ công nghiệp hóa: việc sản xuất enzyme có thể sản xuất với một lượng lớn, đồng
thời việc thu hồi chế phẩm cũng tương đối dễ dàng.
- Có hoạt tính cao: enzyme được tổng hợp từ vi sinh vật có hoạt tính khá cao so với
enzyme từ động vật và một số thực vật.
Hiện nay, việc sản xuất các loại chế phẩm enzyme đã và đang phát triển mạnh mẽ trên
quy mô công nghiệp. Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme được bán trên thị
trường thế giới, các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết
theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Đặc biệt, việc ly trích và ứng dụng PME
trong quá trình chế biến thực phẩm đã được phát triển khá rộng rãi ở nhiều quốc gia
(Duvetter, 2007), tuy nhiên khả năng sử dụng của enzyme này vẫn chưa được quan
tâm ở Việt Nam.

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 1


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Hiện không có PME thương mại được sản xuất ở nước ta, việc nhập khẩu PME được
ly trích và tinh chế ở nước ngoài thường có giá cao. Chính vì thế, nghiên cứu ly trích
PME trong điều kiện hiện tại ở nước ta là một trong những việc mang tính cấp thiết và
cần có được sự quan tâm đúng mức.
Pectinase có thể được sản xuất từ rất nhiều loại nấm mốc, nhưng Aspergillus là nguồn
chủ yếu (Polizeli et al., 1991). Nghiên cứu ly trích enzyme từ Aspergillus đã được thực
hiện trên rất nhiều cơ chất khác nhau theo phương pháp lên men trạng thái rắn hay lên
men lỏng (Schmitz, 2002). Tuy nhiên, việc tìm ra chủng nấm mốc thích hợp để sản
xuất ra PME có hiệu suất và hoạt tính cao là điều đặc biệt quan trọng.
Trên cơ sở đó, tiến hành nghiên cứu “Ảnh hưởng của dòng nấm mốc Aspergillus
niger đến khả năng sinh PME hoạt tính cao”. Việc nghiên cứu sản xuất PME từ vi
sinh vật giúp cải tiến được quy trình chế biến, nâng cao chất lượng sản phẩm, đồng
thời hạ giá thành chế phẩm enzyme, tạo điều kiện để mở rộng sử dụng enzyme trong
thực tế sản xuất ở Việt Nam.
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Mục tiêu chủ yếu của đề tài là tìm ra chủng nấm mốc A.niger có khả năng sinh PME
hoạt tính cao.
Từ mục tiêu nghiên cứu trên, đề tài tiến hành khảo sát các nội dung sau:
-

Khảo sát khả năng sinh pectinase của các chủng thuộc loài Aspergillus niger.

-

Tuyển chọn các chủng Aspergillus niger có khả năng sinh PME cao.

- Khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp các chủng Aspergillus niger đến khả năng
sinh PME hoạt tính cao.

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 2


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

CHƯƠNG 2

Trường Đại học Cần Thơ

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 NẤM MỐC
2.1.1 Tổng quan về nấm mốc
Nấm mốc là nhóm chung của các cơ thể có nhân thật (Eukaryote), thuộc vi nấm. Phần
lớn nấm có cấu tạo khuẩn ty (sợi nấm). Nấm thường phát triển trên bề mặt cơ chất
thành các dạng lông tơ, mạng nhện hoặc sợi bông, một số tạo thành màng hoặc lớp
mỏng. Nhiều loài có ý nghĩa công nghiệp, được dùng trong sản xuất acid hữu cơ,
enzyme, chất kháng sinh, vitamin, một số dạng tương, chao, nước chấm, phomát …
(Magnuson và Lasure, 2004).
Nấm mốc không có diệp lục nên chúng chỉ sống được nhờ có hệ sợi bám vào các chất

hữu cơ. Hệ sợi của nấm mốc có một số ăn sâu vào cơ chất gọi là khuẩn ty cơ chất hay
khuẩn ty dinh dưỡng, một số mọc ra ngoài bề mặt cơ chất gọi là khuẩn ty khí sinh.
Những khuẩn ty khí sinh là những lông tơ màu trắng, mọc thành một lớp sợi mềm và
dần dần sẽ có một số sợi phát triển thành cơ quan sinh sản đặc biệt mang bào tử. Màu
sắc của bào tử sẽ đặc trưng cho màu sắc của nấm mốc khi già. Nấm mốc có cấu tạo
hình sợi phân nhánh, tạo thành một hệ sợi chằng chịt phát triển rất nhanh gọi là khuẩn
ty thể hay hệ sợi nấm. Nấm mốc cũng có 2 loại khuẩn ty với chiều ngang của khuẩn ty
thay đổi từ 3  10 m, bao gồm khuẩn ty ký sinh mọc trên bề mặt môi trường, từ đây
sinh ra những cơ quan sinh sản. Khuẩn ty cơ chất mọc sâu vào môi trường. Khuẩn lạc
của nấm mốc cũng có nhiều màu sắc như khuẩn lạc xạ khuẩn. Khuẩn lạc nấm mốc
khác với xạ khuẩn ở chỗ nó phát triển nhanh hơn, thường to hơn xạ khuẩn nhiều lần.
Dạng xốp hơn do kích thích khuẩn ty to hơn. Thông thường khuẩn lạc sau 3 ngày phát
triển có kích thước 5  10 mm, trong khi đó khuẩn lạc xạ khuẩn chỉ khoảng 0,5  2
mm.
Đa số nấm mốc có cấu tạo đa bào, tạo thành những tổ chức khác nhau như sợi khí sinh,
sợi cơ chất. Sợi cơ chất của nấm mốc không đơn giản như ở xạ khuẩn mà phức tạp
hơn. Có những loài có sợi cơ chất giống như rễ chùm ở thực vật gọi là rễ giả, ví dụ
như ở Aspergillus niger.
Nấm mốc phổ biến trong tự nhiên, chúng mọc trên cơ chất dinh dưỡng và tạo thành
lớp lông mượt có màu sắc khác nhau và làm thay đổi rất nhiều thành phần hoá học của
cơ chất và thải ra sản phẩm trao đổi chất. Ngoài ra, cơ chất còn mang mùi mốc rất khó
chịu và đôi khi sản phẩm trao đổi chất của nấm mốc là những độc chất Mycotoxin đối
với người cũng như động vật. Điểm đặc biệt là nấm mốc có thể mọc ở cơ chất có độ
ẩm thấp (khoảng 15%), điều này được thấy rõ ở quả khô, bánh mì, giấy, đồ da và vải

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 3

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

sợi. Mốc còn phát triển được ở các hàng thực phẩm có môi trường acid như hoa quả,
dưa muối chua, phomát.
(Nguyễn Lân Dũng, 1983).
2.1.2 Sinh sản của nấm mốc
Nấm mốc có khả năng sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính bằng nhiều cách khác
nhau. Trong sinh sản vô tính cách đơn giản nhất là bằng mẫu sợi. Một đoạn sợi nấm
rơi vào cơ chất mới gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành hệ sợi nấm mới. Trong
nuôi cấy chìm sợi nấm bị chia thành từng mẫu ngắn và khi cấy truyền vào dịch nuôi
cấy mới thì những mẫu sợi này sẽ phát triển. Người ta gọi các mẫu sợi trong nuôi cấy
bề sâu (lên men chìm) là các bào tử chìm.
Ngoài sinh sản mẫu sợi, nấm mốc còn sinh sản bằng bào tử đốt (Oidi), bào tử (Spora),
bào tử đính (Conidia). Sinh sản bằng bào tử là một hình thức sinh sản vô tính phổ biến
ở nấm mốc. Bào tử nấm mốc là cơ quan sinh sản chứ không phải là dạng tồn tại bảo vệ
như ở vi khuẩn. Bào tử nấm mốc hình thành theo nhiều cách. Một trong những cách đó
là bào tử hình thành trong các túi (gọi là bào tử nang), khi chín thì bào tử được giải
phóng ra ngoài và theo gió bay đi rất xa, gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành khuẩn ty
mới. Một cách tạo thành bào tử tương đối phổ biến ở nấm mốc là một số khuẩn ty khí
sinh hình thành một dạng tế bào đặc biệt hình chai, đầu các tế bào này sinh ra bào tử
(các bào tử kiểu này gọi là bào tử đính). Màu sắc của bào tử đính thường đặc trưng cho
nấm mốc ở tuổi trưởng thành. Nấm mốc sinh sản vô tính thể hiện qua hai dạng:
- Đoạn khuẩn ty: từng đoạn khuẩn ty ở dạng dinh dưỡng có thể phát triển thành một
cá thể mới hoàn chỉnh, đây là dạng sinh sản vô tính điển hình của nhóm nấm sợi.
- Tạo bào tử: nhiều loại bào tử khác nhau của dạng sinh sản vô tính trong nhiều loại
nấm. Bào tử có dạng khác nhau (bầu dục, thoi …), kích thước và màu sắc (cam, vàng,
nâu …), và sự sắp xếp bào tử khác nhau trong một cấu trúc gọi là cuống bào tử
(Sporophores).

Theo Bùi Xuân Đồng (2004), trong số các dạng bào tử thì bào tử trần (conidium) là
phổ biến nhất, chúng được nhìn thấy rõ nhất ở hai giống nấm mốc là Aspergillus và
Penicillium.
- Dựa vào đặc điểm màu sắc, bào tử trần được phân biệt thành hai dạng: dạng không
màu (không màu và có màu hơi trắng, vàng tươi, lục xanh…) và dạng có màu (các
màu sẫm).
- Kích thước các bào tử trần thay đổi từ 1, 2 đến vài chục µm, nhưng cũng thể dài tới
khoảng 80  100 µm. Người ta phân biệt bào tử trần lớn, bào tử trần nhỏ, có bào tử lớn
hình lưỡi liềm nhiều vách ngang và bào tử nhỏ hình cầu, hình trứng, hình hạt chanh,
không ngăn vách hoặc có vách ngang.
Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 4


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

- Giá bào tử trần là các nhánh sợi nấm phân hóa hình thái ít hay nhiều, có khả năng
trực tiếp sinh bào tử trần, hoặc phát sinh các nhánh có khả năng này. Các giá bào tử
trần mọc riêng rẽ hoặc mọc thành cụm từ hai đến nhiều chiếc trên sợi nấm. Các giá
bào tử trần ở từng cụm có thể hoàn toàn tách rời nhau, hoặc dính liền.
(Bùi Xuân Đồng, 2004).
(ii) Khuẩn lạc của nấm mốc
Khi một bào tử nấm mốc gặp điều kiện môi trường thuận lợi sẽ phát triển thành hệ sợi
nấm. Tùy theo cơ chất rắn, lỏng hay mềm, hệ sợi nấm phát triển thành các dạng khác
nhau. Trên các vật thể rắn như gỗ, thủy tinh… hệ sợi nấm lan rộng, mỏng, thưa và
xốp, điển hình như sự phát triển nấm trên các mặt kính dụng cụ quang học. Những loại
nấm ưa khí như nhiều loài của các chi Aspergillus, Penicilium… phát triển hệ sợi nấm

trên mặt chất lỏng, chỉ một phần hệ sợi nấm chìm trong chất lỏng. Trên khối môi
trường mềm như thạch, hệ sợi nấm thường có dạng ổn định nhất. Tùy thành phần môi
trường, dạng hệ sợi nấm này thường có những đặc điểm sinh trưởng, hình thái, cấu tạo
đặc trưng của mỗi loài, thậm chí mỗi chủng nấm.
Thông thường một khuẩn lạc nấm mốc có dạng hình tròn, tuy nhiên trên môi trường
thạch của đĩa petri, một số loài nấm mốc tăng trưởng mạnh theo cả ba chiều, nên dạng
khuẩn lạc không rõ rệt (trường hợp nhiều loài thuộc chi Mucor, Rhizopus…). Tốc độ
tăng trưởng của các loài nấm mốc thường được tính bằng đường kính và đôi khi cả
chiều dày của khuẩn lạc. Khuẩn lạc của một số loài còn đặc trưng bởi màu sắc của sợi
nấm, của bào tử và các bộ phận mang các bào tử đó. Bề mặt khuẩn lạc có thể mượt
nhẵn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp…. Mặt khuẩn lạc thường phẳng
nhưng một số loài như Penicilium, mặt khuẩn lạc có những vết khía xuyên tâm, hoặc
thấp dần từ trung tâm ra mép, hoặc lồi lõm không đều. Mép khuẩn lạc thường cấu tạo
bởi các sợi nấm cơ chất (địa sinh), thường mỏng hơn phần bên trong, trong nhiều
trường hợp, đặc biệt khi khối sợi nấm khá dày (gồm cả sợi nấm địa sinh và sợi nấm
khí sinh), có thể thấy rõ ranh giới giữa các mép và phần bên trong khuẩn lạc.
Ngoài ra, các đặc điểm hình thái khác như sự có mặt của các bó sợi, bó giá, các thể
quả, hạch nấm, các giọt tiết, các sắc tố hòa tan … làm cho khuẩn lạc của một số nấm
mốc có tính đặc trưng loài. Khuẩn lạc có tính chất hình thái đặc trưng loài đối với
nhiều nấm mốc. Tất cả các đặc điểm hình thái nói trên của khuẩn lạc, ở hầu hết các
loài nấm mốc thay đổi nhiều hay ít theo điều kiện môi trường, trước hết vào thành
phần môi trường nuôi cấy, pH, nhiệt độ nuôi cấy, độ ẩm.
(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2002; Bùi Xuân Đồng, 2004)

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 5


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

2.1.3 Một số nấm mốc thường gặp
(i)

Mucor

Nấm mốc Mucor có khuẩn ty đơn bào phân nhánh mạnh, sinh bào tử nang. Mucor mọc
ở các hạt, thức ăn gia súc, thực phẩm bị ẩm,... thành một lớp lông tơ màu xanh. Một số
loài Mucor có khả năng lên men rượu và oxy hóa. Chúng được dùng trong sản xuất
acid hữu cơ, rượu và chế phẩm enzyme.
(ii) Rhizopus
Trên khuẩn ty Rhizopus hình thành những nút, từ đây sẽ mọc những rễ cắm sâu vào cơ
chất và mọc những cuống sinh bào tử nang. Trong bào tử nang có chứa nhiều bào tử
hình trứng, vỏ bào tử có nhiều nếp nhăn.
Cuống sinh bào tử nang phình rỗng dần ở cuối. Đặc điểm này đặc trưng cho giống
Rhizopus. Bào tử nang lúc đầu trắng toát, khi chín thì hoàn toàn đen. Trường hợp mốc
phát triển mạnh ta thấy dày đặc những đốm đen.
(iii) Aspergillus
Thuộc giống Aspergillus có tới hơn 200 loài. Khuẩn ty có vách ngăn. Trên đầu tế bào
hình chai mọc các cuống sinh bào tử đính. Các loài bào tử đính xòe ra như những bông
hoa cúc và mang màu sắc đặc trưng cho từng loài (màu hoa cau, màu xanh lục, màu
đen...). Một số loài trong giống này có nhiều ứng dụng thực tế: mốc vàng – A.oryzea,
A.flavus; mốc đen – A.niger, A.awamori, A.usami. Chúng sinh ra nhiều enzyme:
amylase, protease, pectinase,... và được ứng dụng trong sản xuất tương, nước chấm,
rượu, đường mật,... A.niger còn dùng chủ yếu trong sản xuất acid citric.
(iv) Penicillium
Khuẩn ty có vách ngăn và phân nhánh. Một số đầu sợi lại chia thành các nhánh và từ
các nhánh này mới mọc ra các cuống đính bào tử. Toàn bộ nhánh sinh bào tử đính có

hình dáng giống cái chổi. Bào tử đính có hình cầu và khi chín có màu xanh hoặc
trắng... Nhưng các mốc Penicillium thường gặp có màu xanh và người ta cũng thường
gọi mốc này là mốc xanh.
Giống Penicillium có nhiều loài được dùng trong sản xuất chất kháng sinh như:
penicillin (Penicillium notatum) và nhiều loài được dùng để làm chín phomat.
(Nguồn: Bùi Xuân Đồng, 2004)
2.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ASPERGILLUS NIGER
2.2.1 Giới thiệu
Aspergillus niger thường gọi là mốc đen. Sợi mốc trắng nhưng đính bào tử màu đen.
Từ cuống đầu tiên mọc tiếp 2  4 nhánh cuống nhỏ rồi tiếp đến các đính bào tử.
Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 6


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Loại nấm mốc này thường thấy trong quá trình thu hoạch và bảo quản các loại thực
phẩm như đậu phộng, bắp, táo, cà chua, lê, và dưa (Samson và van Reenen-Hoekstra,
1988).
A.niger thường được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp để sản xuất enzyme (như
galactosidases, lipases, protease, hemicellulase, cellulases và pectinases) và acid
hữu cơ. Ngay từ năm 1917, A.niger đã được sử dụng để sản xuất acid citric (Raper và
Fennel, 1965). Ngày nay, acid citric được sản xuất từ A.niger với sản lượng khoảng
700.000 ÷ 1.000.000 tấn/năm. Khoảng 70% acid citric sản xuất được sử dụng trong
các loại thực phẩm và sản phẩm bia, phần còn lại thường được ứng dụng trong ngành
dược.

Hình 1: Aspergillus niger
( />
Hình 2: Bào tử Aspergillus niger
(Nguồn:)

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 7


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

2.2.2 Vị trí phân loại của Aspergillus niger
Loài Aspergillus niger có vị trí phân loại như sau:
Giới nấm (Fungi)
Ngành phụ nấm bất toàn Deuteromycotina
Lớp Deuteromycetes
Bộ Moniliales
Họ Moniliaceae
Chi Aspergillus
Loài Aspergillus niger
(Klich, 2002; Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010)
2.2.3 Đặc điểm sinh hóa
A.niger là nấm mốc sinh sản vô tính bằng cách tạo thân quả hoặc cuốn bào tử đính. Hệ
sợi nấm gồm các sợi ngăn vách, phân nhánh, màu trắng. Bộ máy mang bào tử trần phát
triển từ một tế bào có đường kính lớn hơn, màng dầy hơn các đoạn lân cận của sợi nấm
gọi là tế bào chân (foot cell). Giá bào tử trần phát triển từ tế bào chân, như là một
nhánh của sợi nấm, gần thẳng góc với tế bào chân và thường ở trên mặt cơ chất. Giá

bào tử trần không có nhánh, không có hoặc có ít vách ngăn ngang, có phần đỉnh to ra
thành bọng hình chùy gọi là bọng đỉnh giá. Bọng đỉnh giá mang các thể bình, các thể
bình này xếp thành hình tia sát nhau trên toàn bộ bề mặt bọng.
Thể bình của A.niger có 2 tầng (thể bình cấp một và thể bình cấp hai). Thể bình cấp
một (cũng gọi là cuống thể bình, metula) mang một cụm gồm 2  3 thể bình cấp hai
(gọi là thể bình, phialide) ở gần phần đỉnh.
Các bào tử trần được tạo thành nối tiếp nhau trong miệng thể bình thành chuỗi hướng
gốc (bào tử ở ngay miệng thể bình là bào tử non nhất, càng xa miệng thể bình bào tử
càng già), không phân nhánh. Bào tử trần không vách ngăn, nhẵn ở mặt ngoài. Tất cả
các chuỗi bào tử trần tạo thành từ các thể bình của một bọng đỉnh giá hợp thành khối
bào tử trần đỉnh bọng (conidial head). Khối bào tử trần đỉnh bọng hình tia tỏa tròn, khi
gặp điều kiện thuận lợi chúng sẽ phát tán và phát triển thành hệ sợi nấm mới (Bùi
Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn, 2000).
2.3 ENZYME PECTIN METHYLESTERASE (PME)
2.3.1 Tổng quan về PME
Pectin methylesterase (PME) thuộc nhóm enzyme pectinase, nhóm enzyme có khả
năng xúc tác sự thủy phân pectin. PME còn được gọi là pectin esterase (PE) và được

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 8


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

đánh số trong hệ thống phân loại EC.3.1.1.11. PME cắt pectin tại vị trí các nhóm
cacborxyl methyl hóa (-COOCH3) của đơn vị galactose nằm kề đơn vị có nhóm
cacboxyl tự do (hình 3). Hiệu suất thủy phân có thể đạt đến 98% tạo ra sản phẩm là

acid pectinic, acid pectic và methanol (hình 4)
Pectine esterase

O

OH

OH

O

OH

O

O
O

OH

OH

OH

OH

COOCH3

COOH

O

O

O
O

COOCH3

COOCH3

COOCH3

O

O

OH
OH

OH

Pectine esterase

O

OH
OH

OH

O
OH

OH

O

O
O

OH

COOH

COOH

O

O

O
O

COOH

COOH

COOH

OH

O

O

OH
OH

OH

Hình 3: Sự phân cắt bắt đầu từ nhóm carboxyl tự do
(Nguồn: Johansson et al.., 2002)

Hình 4: Sơ đồ thủy phân pectin của PME
(Nguồn: Reinikainen, 2004)

Các pectin đã bị khử ester hóa sẽ tạo gel khi có sự hiện diện của ion Ca2+ (Micheli,
2001) làm cho thành của tế bào thực vật trở nên cứng chắc. Trong khi đó, sự thủy phân

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 9


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

ngẫu nhiên các enzyme polygalacturonase và pectate lyase sẽ hoạt động và khử mạch

polymer của pectin. Điều này cho thấy tiềm năng rất lớn của PME trong việc cải thiện
chất lượng sản phẩm chế biến có nguồn gốc thực vật (Van Buren, 1979).
2.3.2 Ứng dụng của PME
Trong sản xuất rượu vang và nước quả trong, PME khi bổ sung vào sẽ phân cắt nhóm
methyl của pectin tạo điều kiện cho enzyme polygalacturonase (PG) hoạt động phân
cắt pectin thành các đoạn ngắn, đồng thời làm giảm độ nhớt đối với những nguyên liệu
giàu pectin như bưởi, cam, dâu… nhờ đó làm tăng hiệu suất thu hồi dịch quả.
PME còn là enzyme hỗ trợ cho quá trình lắng trong dịch quả khi được sử dụng cùng
với sự hiện diện của ion Ca2+ có trong nguyên liệu (hoặc bổ sung) dẫn đến sự tạo thành
phức hợp calcium pectate, mạng gel này như cái lưới kéo các phân tử gây đục. Cũng
nhờ vào tác động hình thành calcium pectate do PME phân cắt nhóm methyl của
pectin, tạo điều kiện cho pectin liên kết với ion Ca2+, nhờ đó giúp cấu trúc của rau quả
được duy trì, tạo tính giòn và độ cứng chắc của sản phẩm, tăng giá trị cảm quan cho
sản phẩm (Baker và Wicker, 1996).
2.3.3 PME từ Aspergillus niger
Nhờ vào khả năng ứng dụng hiệu quả và rộng rãi trên nhiều lĩnh vực, việc sản xuất
PME được chú trọng, trong đó PME có nguồn gốc từ vi sinh vật, mà chủ yếu từ nấm
mốc Aspergillus spp. được quan tâm nhiều nhất. Aspergillus cũng được xác nhận là
loại nấm mốc có khả năng sinh PE hiệu suất cao và hoạt tính mạnh nhất, khi so sánh
với các loài khác như Penicillium, Rhizopuz, Fusarium (Rombouts và Pilnik, 1980).
Không những được chú trọng do hiệu quả sản xuất cao, giá thành hạ, hoạt tính tốt,
enzyme từ Aspergillus niger cũng được Viện nghiên cứu thực phẩm và thuốc của Mỹ
(FDA) chứng nhận sản phẩm an toàn (GRAS).
Về đặc điểm sinh lý, PME từ A.niger có giá trị pH tối thích 4,5 – khá phù hợp với hầu
hết các sản phẩm rau quả nên được ưa chuộng sử dụng. Trong khi hầu hết các PME từ
nấm mốc thường thủy phân nhóm methyl ester của pectin một cách ngẫu nhiên, PME
nấm mốc từ A. niger lại khử ester hóa với cơ chế ngẫu nhiên “có trật tự” theo từng
block (Limberg et al., 2000; Massiot et al., 1997; Ralet et al., 2003), điều này góp
phần hạn chế được sự thủy phân tự do, thúc đẩy sự khử ester do enzyme
polygalacturonase và pectate lyase, dẫn đến sự khử polymer pectin của các PME

nguồn gốc vi khuẩn khác. Hay nói cách, A.niger PME có pH acid nên có sự duy trì gia
tăng hoạt tính khi chế biến ở điều kiện pH 4,5. Thêm vào đó nhờ vào khả năng có thể
phân cắt ngẫu nhiên “có trật tự” theo từng block nên hiệu quả tác động của PME từ
A.niger đối với việc phân cắt mạch pectin của thành tế bào trở nên nhanh chóng
(Sajjaanantakul và Pitifer, 1991; Duvetter, 2007).

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 10


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

2.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN
A.niger được sử dụng phổ biến trong công nghệ thực phẩm trong nhiều thập kỷ qua và
không có tác động xấu đến sức khỏe con người. Chính vì thế, việc nghiên cứu phân lập
A.niger ứng dụng trong điều chế acid citric hay các enzyme đã được tiến hành từ rất
lâu (Raper và Fennel, 1965; Magnuson và Lasure; Kashyap et al.,2001). Mặc dù vậy,
nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc thích hợp cho việc sản xuất chủng
loại enzyme chuyên biệt còn chưa được quan tâm.
Gần đây, Khan et al. (2003) cũng đã xác nhận tầm quan trọng của việc phân lập và
tuyển chọn chủng A.niger phù hợp cho việc sản xuất xylanase. Theo đó, với 104 chủng
A.niger được phân lập từ đất, khả năng sinh xylanase cũng thay đổi khác nhau, trong
đó, chỉ có 18 chủng sinh xylanase với hoạt tính 100 ÷ 150 U/ml, 7 chủng cho hoạt tính
xylanase từ 150 ÷ 200 U/ml và 3 chủng A.niger có khả năng thu nhận xylanase với
hoạt tính từ 200 ÷ 250 U/ml.
Rogaiza Al-Gasgari (2002) đã tiến hành phân lập các chủng nấm mốc có trong 26 loại
nước quả ở Saudi Arabia và sử dụng các nấm mốc sau phân lập lên men sinh

pectinase. Kết quả cho thấy, A.niger có mặt ở hầu hết các nguồn phân lập và có mật số
cao ở các loại cam hay nước quả hỗn hợp, tuy nhiên không tìm thấy loại nấm mốc này
trên hai mẫu nước táo và một mẫu nước xoài. Đồng thời khi so sánh khả năng sinh
pectinase của A.niger và các nấm mốc khác, pectinase từ A.niger cũng được xác nhận
là nhóm có khả năng sinh pectinase hoạt tính cao.
Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn A.niger có khả năng sinh pectinase cao từ một số
phụ phẩm nông sản (cà phê, vỏ bưởi, chanh,…) của Lê Thị Thanh Hương và Nguyễn
Thùy Châu (2005) cũng cho thấy, với 80 mẫu nguyên liệu, chỉ phân lập được 50 chủng
A.niger, trong đó chỉ có 4 chủng sinh pectinase hoạt tính cao, tập trung ở A.niger trên
vỏ bưởi và chanh. Đồng thời, khi so sánh khả năng sinh PME của A.niger và các nấm
mốc khác, nghiên cứu của Rogaiza Al – Gasgari (2002), PME của A.niger cũng được
xác nhận có hoạt tính mạnh hơn.
Dựa trên các nghiên cứu có liên quan đã được khảo sát, có thể nhận thấy, việc chọn
đối tượng nghiên cứu là các chủng A.niger để kết hợp các chủng nấm mốc lại với nhau
cho quá trình lên men sinh enzyme PME có hoạt tính cao là một hướng đi phù hợp, có
tính cấp thiết.

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 11


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

CHƯƠNG 3

Trường Đại học Cần Thơ

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM
3.1.1 Địa điểm, thời gian
Các thí nghiệm được thực hiện trong phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ thực phẩm,
khoa Nông nghiệp và sinh học ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ.
Thời gian: Từ 8/2010 đến 12/2010.
3.1.2 Thiết bị, hóa chất
Thiết bị, dụng cụ

(i)
-

Máy đo pH (HANA pH 212, Trung Quốc)

-

Máy lắc ống nghiệm IKA, Đức

-

Tủ ủ Sanyo

-

Tủ cấy

-

Máy ép trái cây

-

Tủ sấy mẫu

-

Thiết bị gia nhiệt, thanh trùng

-

Ống nghiệm có nắp, đũa và que cấy, đĩa petri, bình tam giác 250 mL.

-

Đĩa petri

-

Một số dụng cụ và thiết bị khác.

(ii) Hóa chất
-

Cồn 70 o

-

Cồn 96 o

-

NaOH 0,1N (Merck)

-

Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA, Merck)

-

NaH2PO4.2H2O (Merck)

-

Acid citric (Merck)

-

Pectin táo DE = 75% (Sigma)

-

Một số hóa chất dùng trong phân tích

(iii)

Nguyên liệu

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 12

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

- Bã từ táo ta (Ziziphus nummularia) được tách loại nước (bằng cơ học) ở 60  1°C
đến khi độ ẩm còn khoảng 6  1% (Joshi et al., 2006).
- Môi trường vỏ cam sành (Citrus nobilis var typica Hassk): cam sành rửa sạch, lấy
phần vỏ cam sành tươi, gọt bỏ phần vỏ xanh bên ngoài, cắt nhỏ, điều chỉnh đến độ ẩm
75%.
(iv) Chủng nấm mốc
52 chủng nấm mốc Aspergillus niger được phân lập từ vỏ các loại quả họ citrus và táo
ta. Các chủng này đã được xác định đặc tính hình thể theo khóa phân loại của Klich
(2002) và kiểm định bằng cách chạy PCR, giải trình tự gen 28s rRNA (Dương Đỗ
Thành Lân, 2010; Nguyễn Thị Kiều Linh, 2010; Lê Vương Hải Nguyệt, 2010).
Trong đó:
8 dòng có nguồn gốc từ vỏ táo Red Delicious (R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 và R8)
6 dòng có nguồn gốc từ vỏ táo ta (T1, T2, T3,T4, T5 và T6)
5 dòng có nguồn gốc từ quả bưởi da xanh (X1, X2, X3, X4 và X5)
3 dòng có nguồn gốc từ vỏ quả chanh núm (N1, N2, N3)
8 dòng có nguồn gốc từ vỏ quả chanh giấy (G1, G2, G3, G4, G5, G6, G7 và G8)
4 dòng có nguồn gốc từ vỏ quả hạnh (H1, H2, H3 và H4)
3 dòng có nguồn gốc từ vỏ quả cam sành (SA1, SA2 và SA3)
4 dòng có nguồn gốc từ vỏ quả cam soàn (SO1, SO2, SO3, và SO4)
6 dòng có nguồn gốc từ vỏ quả chanh mật (M1, M2, M3, M4, M5 và M6)
5 dòng có nguồn gốc từ thịt và vỏ quả sung (S1, S2, S3, S4 và S5)

3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.2.1 Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu
Các chỉ tiêu, phương pháp phân tích, phân lập sử dụng trong nghiên cứu được tổng

hợp ở bảng 1.
Bảng 1: Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu trong nghiên cứu

Thông số/chỉ tiêu

Phương pháp

Xác định khả năng
sinh pectinase

Sử dụng môi trường pectin 0,5% và agar 2% (Khairnar et al., 2009),
đo kích thước vòng pectin bằng thuốc thử Lugol (iodine 2%) sau
thời gian ủ 48 giờ (30 ± 2ºC): Kích thước vòng ≥ 20mm: pectinase
cao (H), 15 ÷ 20mm: trung bình (M), 8 ÷ 15mm: yếu (W)

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 13


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Tuyển chọn dòng
A.niger sinh PME
hoạt tính cao

Cấy các chủng A.niger có vòng phân giải pectin ≥ 20 mm lên môi
trường lên men rắn, sử dụng cơ chất giàu pectin gồm bã táo và cam

sành (Trần Thanh Trúc et al., 2010)

Phương pháp xác
định hoạt tính PME

Phương pháp chuẩn độ pH (theo Crelier et al., 1995; trích dẫn bởi
Duvetter, 2007), sử dụng pectin táo (DE 75%) trong NaCl 0,12M
làm cơ chất phản ứng, chuẩn độ bằng NaOH 0,01N.

3.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm
(i) Quy trình bố trí thí nghiệm tổng quát

Chủng nấm mốc A.niger

Tạo huyền phù A.niger

Đổ vào lỗ giữa thạch agar – pectin

Ủ 48 giờ, ở nhiệt độ 30 ±2°C

Đo đường kính vòng phân giải pectin

Chọn lựa chủng có khả năng sinh pectinase cao  Thí nghiệm 1

Lên men rắn trên môi trường bả táo + vỏ cam

Xác định hoạt tính PME

Tuyển chọn chủng A.niger phù hợp  Thí nghiệm 2


Lên men rắn trên môi trường bả táo + vỏ cam

Xác định hoạt tính PME  Thí nghiệm 3
Hình 5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

(ii) Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng sinh pectinase của các chủng thuộc loài A.niger
- Mục đích: Chọn sơ bộ các chủng A.niger có khả năng sinh pectinase từ các chủng
nấm mốc ban đầu.
-

Môi trường: Môi trường thạch pectin.

-

Phương pháp: Đo vòng phân giải pectin.

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 14


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Nguyên tắc của phương pháp: hoạt tính pectinase được đánh giá trên cơ sở mức độ
thủy phân pectin dưới tác dụng xúc tác enzyme thông qua độ lớn của vòng phân giải
pectin bằng dung dịch chỉ thị Lugol 2%.
-

Cách tiến hành

Môi trường thạch pectin sau khi đun tan được phân phối vào các đĩa petri, dùng khoan
nút đục lỗ trên đĩa thạch.
Hút vào mỗi lỗ 0,1ml dịch nuôi cấy nấm, nuôi ở nhiệt độ 30  2 oC.
Sau 48h, nhỏ dung dịch Lugol lên mặt thạch, sau đó xác định hoạt độ pectinase bằng
cách đo vòng phân giải pectin trên môi trường.
-

Kết quả thu nhận

Các chủng A.niger có khả năng sinh pectinase cao nhất dựa theo đường kính vòng
phân giải.
(iv) Thí nghiệm 2: Tuyển chọn các chủng A.niger có khả năng sinh PME cao
- Mục đích: Chọn lựa các chủng A.niger có khả năng sinh PME cho hiệu suất và hoạt
tính cao.
- Môi trường: Môi trường bã táo khô và cam sành (tỉ lệ 3:1, độ ẩm môi trường 60%).
- Cách tiến hành
Từ các chủng A.niger có khả năng sinh pectinase cao, lên men rắn trong môi trường
giàu pectin từ bã táo và cam sành (Trần Thanh Trúc et al.,2010) ở nhiệt độ phòng với
thời gian ủ 96 giờ.
Cho 5g cơ chất vào các bình tam giác 250ml, bổ sung dung dịch đệm citrate –
phosphate (pH 4,5) đến pH 3,5, độ ẩm môi trường 60%, thanh trùng ở 121 oC trong 15
phút. Làm mát các bình tam giác sau khi thanh trùng, kế tiếp cho 2 ml dịch huyền phù
bào tử A.niger vào mỗi bình (khoảng 107 bào tử/ml) và ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 96 giờ
ủ (4 ngày), trích lấy dịch chứa enzyme PME bằng dung dịch đệm citrate – phosphate
pH 4,5. Xác định hoạt tính PME theo phương pháp chuẩn độ điện thế.
- Kết quả thu nhận
Xác định được chủng nấm mốc có khả năng sinh PME hoạt tính cao.
(v) Thí nghiệm 3: Khảo sát việc kết hợp các chủng nấm mốc A.niger đến khả năng

sinh PME hoạt tính cao
- Mục đích: khảo sát khả năng cạnh tranh của việc kết hợp các chủng A.niger có khả
năng sinh PME cho hiệu suất và hoạt tính cao.
- Môi trường: Môi trường bã táo khô và cam sành (tỉ lệ 3 : 1, độ ẩm môi trường 60%).
Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 15


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

- Cách tiến hành
Từ các chủng A.niger có khả năng sinh pectinase cao, lên men rắn trong môi trường
giàu pectin từ bã táo và cam sành (Trần Thanh Trúc et al.,2010) ở nhiệt độ phòng với
thời gian ủ 96 giờ.
Cho 5 g cơ chất vào các bình tam giác 250 mL, bổ sung dung dịch đệm citrate –
phosphate (pH 4,5) đến pH 3,5, độ ẩm môi trường 60%, thanh trùng ở 121 oC trong 15
phút. Làm mát các bình tam giác sau khi thanh trùng, kế tiếp cho 2 mL dịch huyền phù
bào tử A.niger vào mỗi bình (khoảng 107 bào tử/mL), đối với các chủng kết hợp thì lấy
mỗi chủng 1 mL cho vào mỗi bình và ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 96 giờ ủ (4 ngày), trích
lấy dịch chứa enzyme PME bằng dung dịch đệm citrate – phosphate pH 4,5. Xác định
hoạt tính PME theo phương pháp chuẩn độ điện thế.
- Kết quả thu nhận
Xác định được chủng nấm mốc có khả năng sinh PME hoạt tính cao.
3.2.3 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu
Các chủng nấm mốc A.niger được xác định hoạt tính sinh enzyme, số liệu được thu
thập và thống kê, phân tích phương sai (ANOVA) theo kiểm định LSD để kết luận về
sự sai khác giữa trung bình các nghiệm thức, sử dụng phần mềm Statgraphic 3.1.

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 16