Khảo sát sự hình thành và phát triển của mô sẹo từ lát cắt mô dâu tằm trắng (morus alba l ) trên môi trường MS rắn và lỏng

MỤC LỤC
MỤC LỤC .................................................................................................................................. i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................................... iv
DANH MỤC CÁC B ẢNG ........................................................................................................ v
DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................................... vi
TĨM TẮT .................................................................................................................................. 1

CHƢƠNG I ...................................................................................................................... 2
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 2
I. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI ................................................................................................ 2
II. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI .......................................................................................... 3
III. KHÁCH THỂ NGHIÊN CỨU ................................................................................... 3
IV. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................................... 3
V. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ....................................................................................... 3
CHƢƠNG II ..................................................................................................................... 4
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................................ 4
I. CÂY DÂU TẰM ........................................................................................................... 4
1.1 Vị trí phân loại............................................................................................................ 4
1.2 Đặc điểm hình thái ..................................................................................................... 4
1.3 Thành phần hóa học ................................................................................................... 5
1.4 Điều kiện tự nhiên và một số đặc điểm nông học ...................................................... 6
1.4.1 Ánh sáng .................................................................................................................. 6
1.4.2 Nhiệt độ ................................................................................................................... 7
1.4.3 Nƣớc ........................................................................................................................ 7
1.4.4 Đất ........................................................................................................................... 7
1.4.5 Khơng khí ................................................................................................................ 7
1.4.6 Dịch bệnh và sâu hại ............................................................................................... 8
1.5 Giá trị kinh tế và y dƣợc ............................................................................................. 8
II. NUÔI CẤY MÔ VÀ MỘT SỐ KẾT QUẢ NHIÊN CỨU TRÊN CÂY DÂU TẰM 8
2.1 Lƣợc sử phát triển của công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật ....................................... 8
i

2.2 Những phƣơng pháp nuôi cấy mô .............................................................................. 9
2.2.1 Phƣơng pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào TCL (Thin Cell Layer) ............................ 9
2.2.2 Nuôi cấy mô sẹo: ................................................................................................... 10
2.2.3 Phƣơng pháp nuối cấy tế bào trong môi trƣờng lỏng lắc ...................................... 11
2.3 Ảnh hƣởng của chất điều hoà sinh trƣởng thực vật ................................................. 12
2.4 Một số nghiên cứu nuôi cấy mô trên cây dâu tằm .................................................. 13
2.4.1 Các nghiên cứu nuôi cấy mô dâu tằm trên thế giới ............................................... 13
2.4.2 Các nghiên cứu về dâu tằm trong nƣớc................................................................. 15
CHƢƠNG III .................................................................................................................. 16
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .................................................................................. 16
I. VẬT LIỆU .................................................................................................................. 16
1.1 Vật liệu tạo mô sẹo trên môi trƣờng rắn .................................................................. 16
1.2 Vật liệu tạo dịch huyền phù tế bào ........................................................................... 16
II. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ ......................................................................................... 16
III. MÔI TRƢỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ....................................................... 16
IV PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................ 17
4.1 Khảo sát quy trình khử trùng mẫu ............................................................................ 17
4. 2. Tạo cây con in vitro bằng phƣơng pháp đánh thức chồi ngủ ................................. 19
4. 3. Khảo sát ảnh hƣởng của hormon sinh trƣởng lên sự tạo thành mô sẹo từ cắt lát
mỏng cây dâu tằm trên môi trƣờng MS rắn ................................................................... 20
4.3.1 Ảnh hƣởng BA và 2, 4 – D lên sự tạo mô sẹo ................................................... 20
4. 3.2. Ảnh hƣởng của BA và NAA lên sự tạo mô sẹo .................................................. 22
4.3.3. Khảo sát sự tăng trƣởng mô sẹo trên môi trƣờng rắn .......................................... 23
4.4 Khảo sát mơi trƣờng lỏng, lắc thích hợp để ni dịch huyền phù tế bào ................ 24
4.4.1. Tạo dịch huyền phù tế bào ................................................................................... 25
4.4.2 Kiểm tra khả năng sống của tế bào trong dịch huyền phù bằng phƣơng pháp
nhuộm TTC .................................................................................................................... 25
4.4.3 Khảo sát ảnh hƣởng của thể tích dịch huyền phù ban đầu đến sự tăng trƣởng của

tế bào .............................................................................................................................. 25

ii


4.4.4 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ saccharose đến sự tăng trƣởng của dịch huyền
phù tế bào ....................................................................................................................... 26
4.4.5 Khảo sát ảnh hƣởng của vitamin đến sự tăng trƣởng của dịch huyền phù tế bào 27
4.4.6 Xác định đƣờng cong tăng sinh trƣởng của dịch huyền phù tế bào dâu tằm ........ 27
4.4.6 Thử nghiệm tạo dịch huyền phù tế bào trực tiếp từ lát mỏng tế bào .................... 29
4.5. Xử lý số liệu ............................................................................................................ 30
CHƢƠNG IV ................................................................................................................. 31
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ......................................................................................... 31
I. QUI TRÌNH KHỬ MẪU ............................................................................................ 31
II. SỰ TẠO CÂY CON IN VITRO BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH THỨC CHỒI
NGỦ ............................................................................................................................... 32
III. SỰ TẠO THÀNH VÀ TĂNG TRƢỞNG MÔ SẸO TRÊN MÔI TRƢỜNG RẮN 34
IV. KHẢO SÁT MƠI TRƢỜNG LỎNG THÍCH HỢP ĐỂ NI DỊCH HUYỀN PHÙ
TẾ BÀO ……………………………………………………………………………..40
4.1. Sự hình thành cuả dịch huyền phù tế bào ............................................................... 40
4.2 Kiểm tra khả năng sống của tế bào trong dịch huyền phù tế bào bằng phƣơng pháp
nhuộm TTC .................................................................................................................... 42
4.3 Ảnh hƣởng của thế tích tế bào ban đầu đến sự tăng trƣởng của dịch huyền phù tế
bào ................................................................................................................................. 43
4.3. Ảnh hƣởng của saccharose lên sự tăng trƣởng của dịch huyền phù tế bào ............ 44
4.4. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng vitamin tổng lên sự tăng trƣởng của dịch huyền phù tế
bào .................................................................................................................................. 46
4.3 Khảo sát sự sinh trƣởng của dịch huyền phù tế bào trong môi trƣờng lỏng lắc ...... 47
3.6. Thử nghiệm tạo dịch huyền phù tế bào trực tiếp từ lát mỏng tế bào ...................... 49
CHƢƠNG 4 .................................................................................................................... 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................ 51
I. KẾT LUẬN ................................................................................................................. 51
1.1 Quy trình khử trùng mẫu .......................................................................................... 51
1.2 Nhân giống dâu tằm in vitro từ chồi bên.................................................................. 51

iii


1.3 Ảnh hƣởng của hormon sinh trƣởng lên sự tạo mô sẹo từ cắt lát mỏng thân non dâu
tằm .................................................................................................................................. 51
1.4 Tạo dịch huyền phù tế bào ....................................................................................... 51
1.5 Thể tích tế bào lắng ban đầu để thích hợp cho sự tăng trƣởng của dịch huyền phù 52
1.6 Nồng độ đƣờng saccharose thích hợp cho dịch huyền phù tế bào tăng trƣởng ....... 52
1.7 Thể tích vitamin tổng trong mơi trƣờng MS lỏng thích hợp cho dịch huyền phù tế
bào tăng trƣởng............................................................................................................... 52
1.8 Xác định đƣờng cong tăng trƣởng của dịch huyền phù tế bào ................................ 52
1.9. Tạo dịch huyền phù tế bào trực tiếp từ lát cắt mỏng tế bào ............................................... 52

II. KIẾN NGHỊ ............................................................................................................... 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 54
PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 57

iv


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BA

: Benzyladenin

NAA

: Naphthaleneacetic acid

KIN

: Kinetin

2,4 – D

: 2,4 – Dichlorophenoxyacetic acid

IAA

: Indoleacetic acid

IBA

: Indolebutyric acid

MS

: Murashinge and Skoog, 1962

TCL

: Thin Cell Layer

v

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Ca(OCl) 2 và thời gian lắc mẫu lên quá
trình khử trùng ................................................................................................................ 19
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng BA và NAA khác nhau lên sự tạo cây con bằng phƣơng pháp
đánh thức chồi ngủ ......................................................................................................... 20
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của BA và 2, 4 - D khác nhau lên sự tạo sẹo.............................. 21
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của BA và NAA khác nhau lên sự tạo sẹo ................................. 23
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của BA và NAA khác nhau lên tăng trƣởng mô sẹo ................. 24
Bảng 3.7. Khảo sát ảnh hƣởng của thể tích ban đầu lên sự tăng trƣởng của dịch huyền
phù tế bào ....................................................................................................................... 25
Bảng 3.8 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ saccharose lên sự tăng trƣởng của dịch
huyền phù tế bào............................................................................................................. 26
Bảng 3.9 Khảo sát ảnh hƣởng của vitamin lên sự tăng trƣởng của dịch huyền phù tế
bào .................................................................................................................................. 27
Bảng 4.1. Kết quả ảnh hƣởng của nồng độ Ca(OCl)2 và thời gian lắc mẫu lên quá
trình khử trùng mẫu ........................................................................................................ 31
Bảng 4.2 Kết quả tạo chồi in vitro bằng phƣơng pháp đánh thức chồi ngủ ở tuần 04 .. 33
Bảng 4.3 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA và 2, 4 – D lên sự tạo mô sẹo
và chỉ số tăng trƣởng của mô sẹo từ ngày 14- ngày 21 .................................................. 37
Bảng 4.4. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA và NAA lên sự tạo mô sẹo và
chỉ số tăng trƣởng của mô sẹo từ ngày 14- ngày 21 ...................................................... 37
Bảng 4.7. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thế tích tế bào lắng ban đầu lên sự tăng
trƣởng của dịch huyền phù tế bào .................................................................................. 43
Bảng 4.8: Kết quả ảnh hƣởng của saccharose lên sự tăng trƣởng của dịch huyền phù
tế bào .............................................................................................................................. 45
Bảng 4.9: Kết quả ảnh hƣởng của vitamin lên sự tăng trƣởng của dịch huyền phù tế
bào .................................................................................................................................. 47
Bảng 4.10. Kết quả khảo sát sự sinh trƣởng của tế bào mô sẹo ..................................... 48

vi


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Cành Dâu tằm Morus alba L. ........................................................................... 4
Hình 2.2: Hình dạng hoa của dâu tằm .............................................................................. 5
Hình 2.3: Quả và hạt dâu tằm ........................................................................................... 5
Hình 3.1. Sơ đồ quy trình khử trùng mẫu ...................................................................... 18
Hình 3.2: Buồng đếm tế bào Neubauer và nguyên tắc đếm trong một ơ lớn có thể tích
0.1 mm3........................................................................................................................... 29
Hình 4.1. Kết quả khử trùng trên các nghiệm thức ........................................................ 32
Hình 4.2 Kết quả tạo chồi in vitro bằng phƣơng pháp đánh thức chồi ngủ ................... 34
Hình 4.3. Lát cắt ngang thân cây dâu tằm ...................................................................... 35
Hình 4.4. Hai loại mơ sẹo cây dâu tằm sau 2 tuần nuôi cấy .......................................... 36
Hình 4.6:Sự tăng sinh của mơ sẹo trên mơi trƣờng T5 ................................................. 39
Hình 4.7. Mơ sẹo hóa nâu sau 4 tuần ni cấy .............................................................. 40
Hình 4.8. Dịch huyền phù tế bào (ảnh chụp từ đáy của bình thủy tinh 100 ml) ............ 41
Hình 4.9. Màu sắc dịch ni cấy thay đổi qua các ngày ................................................ 41
Hình 4.10: Các tế bào trong dịch huyền phù dƣới kính hiển vi ..................................... 42
Hình 4.11: Tế bào trong dịch huyền phù đƣợc nhuộm TTC (mũi tên chỉ tế bào đang phân
chia)…………………………………………………………………………...……………..43

Hình 4.12: Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của thể tích tế bào lắng ban đầu đến sự tăng
trƣởng của dịch huyền phù ............................................................................................. 44
Hình 4.13: Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ saccharose đến sự tăng trƣởng của
dịch huyền phù ............................................................................................................... 45
Hình 4.14:Tế bào trong mơi trƣờng có nồng độ saccharose 40 g/l đang ở trạng thái co
nguyên sinh..................................................................................................................... 46
Hình 4.15. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của thể tích vitamin đến sự tăng trƣởng của dịch

huyền phù ....................................................................................................................... 47
Hình 4.16: Đồ thị biểu diễn tăng trƣởng số lƣợng tế bào của dịch huyền phù tế bào ... 49
Hình 4.17. Tế bào trong dịch huyền phù bắt màu hồng với thuốc nhuộm TTC cấy ..... 50

vii


TĨM TẮT
Dâu tằm chứa nhiều chất có giá trị về mặt y học nhƣ acid hữu cơ, flavonoid, tanin,
pectin, chlorophyl, coumarin, acid amin, cellulose, anthocyan, đƣờng, vitamin B1, vitamin C,
vitamin D…và nhiều hợp chất có giá trị khác vẫn đang tiếp tục đƣợc nghiên cứu và cô lập.
Những nghiên cứu trên cây dâu tằm đang ngày càng đƣợc mở rộng trên nhiều lĩnh vực đặc
biệt là Y học. Việc tạo nguồn nguyên liệu in vitro khởi đầu để phục vụ cho nghiên cứu là rất
cần thiết. Đề tài “KHẢO SÁT SỰ HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN CỦA MƠ SẸO TỪ
LÁT CẮT MÔ DÂU TẰM TRẮNG (Morus alba L.) TRÊN MÔI TRƢỜNG MS RẮN
VÀ LỎNG” nhằm mục đích tìm ra mơi trƣờng thích hợp cho việc hình thành và phát triển mô
sẹo từ lát cắt mỏng dâu tằm trắng Morus alba L. cung cấp nguyên liệu khởi đầu in vitro cho
các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo trên dâu tằm.
Mơi trƣờng MS rắn có bổ sung 2,0 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA thích hợp cho tạo chồi. Số
lƣợng chồi trung bình khoảng 1,97 chồi. Mơi trƣờng thích hợp cho tạo mơ sẹo, tăng trƣởng
của mô sẹo là MS rắn bổ sung 0,5 mg/l BA và nồng độ 1,0 mg/l NAA. Tỉ lệ % tạo sẹo trung
bình của mẫu là 86%, chỉ số tăng trƣởng trung bình của mơ sẹo là 1,96 và đƣờng kính và độ
dày trung bình của mơ sẹo tƣơng ứng khoảng 12,54 mm và 10,79 mm. Mô sẹo phải đƣợc cấy
chuyền sau 04 tuần nuôi cấy chuyền. Dịch huyền phù tế bào đƣợc tạo từ 3g mô sẹo và 27 ml
môi trƣờng MS lỏng tăng trƣởng cực đại vào khoảng ngày ni cấy thứ 10. Nồng độ thích hợp
của saccharose và vitamin trong môi trƣờng MS lỏng cho tăng trƣởng của dịch huyền phù
tƣơng ứng là 30,0 g và 10 ml. Tỉ lệ thể tích tế bào lắng ban đầu và thể tích của mơi trƣờng
thích hợp cho sự tăng trƣởng của dịch huyền phù tế bào là 2:15. Dịch huyền phù cũng có thể
tạo trực tiếp bằng cách cấy lát cắt mỏng tế bào trong môi trƣờng MS lỏng có bổ sung 0,5 mg/l
BA và nồng độ 1,0 mg/l NAA.

Nhƣ vậy, mơi trƣờng MS rắn có bổ sung 2,0 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA thích hợp cho tạo
chồi dâu tằm trắng. Mơi trƣờng thích hợp cho tạo mô sẹo, tăng trƣởng của mô sẹo là MS rắn,
lỏng bổ sung 0,5 mg/l BA, 1mg/l NAA, 30 g /l sucrose và 10 ml/l. Mô sẹo phải đƣợc cấy
chuyền sau 4 tuần nuôi cấy và dịch huyền phù tế bào đƣợc cấy chuyền khoảng ngày nuôi cấy
thứ 10 với tỉ lệ thể tích tế bào lắng ban đầu và thể tích của mơi trƣờng là 2:15.

1


CHƢƠNG I

MỞ ĐẦU
I. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Dâu tằm trắng (Morus alba L.) thuộc họ Moraceae. Dâu tằm từ lâu đã trở thành lồi cây
có giá trị cao về nhiều mặt. Nghề trồng dâu và chế biến các sản phẩm từ tơ tằm đã có từ lâu
đời tại Việt Nam. Đó là một nghề truyền thống quan trọng nhất là ở các vùng nông thôn. Trồng
dâu nuôi tằm đem lại hiệu quả kinh tế cao hơn nhiều so với các cây trồng khác, vì sản phẩm dâu

tằm có giá trị cao, vịng quay lứa tằm ngắn chỉ có 20 ngày. Cây dâu tằm có thể trồng đƣợc ở
những vùng có điều kiện đất đai xấu và khí hậu khắc nghiệt. Trồng dâu tằm không chỉ đáp
ứng thu nhập quanh năm mà nó cịn giải quyết nhiều lao động nhàn rỗi tại nơng thơn, là cây xóa
đói giảm nghèo. Mặt khác, trồng cây dâu tằm còn làm tăng độ che phủ xanh trên các bãi đất
hoang tham gia vào điều hòa tiểu khí hậu.
Dâu tằm cịn có nhiều cơng dụng quan trọng trong y học. Trong Đông y, dâu tằm đƣợc
gọi là tang ngọc vì tồn thân cây, vỏ, lá, trái dâu và đến cả con sâu đục ruột cây cũng đƣợc
dùng chế tác thuốc. Quả dâu chín (Tang thầm) vị ngọt pha chua, tính mát, ăn tƣơi hay ngâm
rƣợu dùng bồi bổ gan, thận, dƣỡng kinh mạch, trừ cảm mạo, phong hàn, chữa bệnh đái tháo
đƣờng, thiếu máu, trị mất ngủ... Lá dâu (Tang diệp) chữa ra mồ hôi trộm, đau họng, ho, nhức
đầu bốc hỏa, làm sáng mắt. Cành dâu (Tang chi) chữa các chứng đau khớp, co quắp tay chân,
đau nhức tứ chi, phù ở tứ chi, hạ huyết áp, lợi tiểu…Rƣợu dâu để lâu năm giúp giảm ho có

đờm xanh, hạ cơn suyễn. Các loại ký sinh trên cây dâu nhƣ tầm gửi (Tang ký sinh), tổ bọ ngựa
(Tang phiêu tiêu), sâu dâu, mộc nhĩ cây dâu… khơng có bộ phận nào khơng đƣợc dùng làm
thuốc (Đỗ Tất Lợi, 2004). Mỗi bộ phận khác nhau đều là vị thuốc tuyệt vời cho sức khỏe.
Ngoài ra, cây dâu tằm còn đƣợc sử dụng nhiều trong lĩnh vực làm đẹp.
Những nghiên cứu trên dâu tằm cho thấy sở dĩ cây có đƣợc những cơng dụng tuyệt vời
trên là do chúng có chứa nhiều chất có giá trị về mặt y học nhƣ acid hữu cơ, flavonoid, tanin,
pectin, chlorophyl, coumarin, acid amin, cellulose, anthocyan, đƣờng, vitamin B1, vitamin C,
vitamin D…và nhiều hợp chất khác vẫn đang tiếp tục đƣợc nghiên cứu và cô lập. Những
nghiên cứu trên cây dâu tằm đang ngày càng đƣợc mở rộng trên nhiều lĩnh vực đặc biệt là Y
học. Để tiếp tục thực hiện các nghiên cứu xung quanh cây dâu tằm, cần tạo ra nhiều nguồn
nguyên liệu khởi đầu in vitro phục vụ cho nghiên cứu. Đề tài “KHẢO SÁT SỰ HÌNH

2


THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN CỦA MÔ SẸO TỪ LÁT CẮT MÔ DÂU TẰM TRẮNG
(Morus alba L.) TRÊN MÔI TRƢỜNG MS RẮN VÀ LỎNG” đƣợc thực hiện nhằm tìm ra
mơi trƣờng thích hợp cho việc hình thành và phát triển mơ sẹo từ lát cắt mỏng dâu tằm trắng
Morus alba L. cung cấp nguyên liệu khởi đầu in vitro cho các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo
trên dâu tằm.
II. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI
Mục đích đề tài là tìm ra mơi trƣờng MS lỏng, rắn thích hợp cho việc hình thành và
sinh trƣởng của mô sẹo từ lát cắt mỏng cây dâu tằm trắng Morus alba L.
III. KHÁCH THỂ NGHIÊN CỨU
Cây dâu tằm trắng (Morus alba L.).
IV. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Môi trƣờng thích hợp cho sự hình thành và phát triển mô sẹo từ lát cắt mỏng của bộ phận
của cây dâu tằm trắng (Morus alba L.).
V. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Định danh dâu tằm thu ngồi mơi trƣờng.

- Khử trùng nguyên liệu.
- Tạo cây dâu tằm con in vitro.
- Khảo sát quy trình tạo sẹo từ lát cắt mỏng mơ cây dâu tằm trắng trong môi trƣờng rắn và
lỏng.
- Khảo sát sự sinh trƣởng của tế bào mô sẹo trong môi trƣờng rắn và lỏng.
- Thu nhận sinh khối mô sẹo

3


CHƢƠNG II

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I. CÂY DÂU TẰM
1.1. Vị trí phân loại
Cây dâu tằm thuộc:
Ngành: Spermatophyta
Lớp: Angiospermae
Lớp phụ: Dicotyledoneae
Bộ: Urticales
Họ: Moraceae
Chi: Morus
Lồi: Alba
Tên khoa học: Morus alba L.

Hình 2.1. Cành Dâu tằm Morus alba L.
(Nguyễn Văn Long và CS., 2004)
1.2. Đặc điểm hình thái
Cây dâu là một cây có thể cao tới 15m, nhƣng do thƣờng xuyên hái lá nên chỉ cao 2– 3m.
Thân, cành và cành con gọi chung là thân dâu tằm. Ngoài chức năng cơ bản là vận chuyển và

dự trữ chất dinh dƣỡng, thân cành còn nhƣ là một cái khung để duy trì các cơ quan của cây.
Cây dâu tằm là loại cây có khả năng chịu đốn tỉa, nếu đốn tỉa thƣờng xuyên, hợp lý, sẽ kích
thích thân cành phát triển. Tuy nhiên, khả năng này còn phụ thuộc giống dâu tằm, tuổi cây và
điều kiện chăm sóc.
Lá dài 8–15cm, mọc so le, có phiến xoan hình tim. Phiến lá nguyên hoặc xẻ thùy, nhọn ở
chóp lá và có các khía răng cƣa ở mép lá. Có 3 gân rõ rệt tỏa ra từ cuốn lá.
Hoa đơn tính, khác gốc. Hoa đực mọc thành bơng, có 4 lá đài, 4 nhị (có khi 3). Hoa cái
cũng mọc thành bơng hoặc thành hình khối cầu, có 4 lá đài. Hoa nở vào mùa xuân và thụ phấn
nhờ gió (hình 2.2).

4


Hình 2.2. Hình dạng hoa của dâu tằm
a) Cụm hoa cái – b) Hoa cái dưới kính hiển vi
c) Cụm hoa đực – d) Hoa đực dưới kính hiển vi
Quả bế bao bọc trong các lá đài, mọng nƣớc thành một quả phức (quả kép) màu đỏ, sau
đen sẫm (Đỗ Tất Lợi, 2004). Hạt dâu tằm có màu vàng, vàng sáng hoặc trái xoan dẹt (hình
2.3).

Hình 2.3. Quả và hạt dâu tằm
Rễ ăn sâu, lan rộng 2–3m và phân bố đều ở nhiều tầng đất 10–30 cm. Sự sinh trƣởng của
rễ ở trong đất tƣơng quan với sự sinh trƣởng của thân, lá ở trên mặt đất và tuân theo một tỉ lệ
nhất định (tỉ lệ T/R). Cây cao tán rộng thì bộ rễ ăn sâu và rộng hơn cây thấp tán nhỏ. Nhìn
chung, sự phân bố theo chiều rộng của rễ bằng 1,5 lần chiều rộng của tán lá, còn sự phân bố
của rễ theo chiều sâu tuỳ thuộc vào giống dâu, tuổi cây, tính chất đất (Nguyễn Kim Khánh,
2009 và Nguyễn Văn Long, 2004).
1.3. Thành phần hóa học
Thân cây dâu chứa nhiều loại acid amin: phenylalanine; leucin; valin; tyrosin; prolin;
alanin; acid glutamic; glycin; serin; arginin; acid aspartic; cystin; threonin; sarcosin; acid 4–

5


aminobutanoic; acid pipecolic và acid 5–hydroxypipecolic. Gỗ chứa morin; dihydromorin;
dihydrokaempferol; 2,4,4',6 – tetra – hydroxybenzophenon (Duke, 1983).
Lá dâu chứa nhiều ascorbic acid; α–caroten; vitamin B1; acid folic; acid folinic; vitamin
D và những thành phần dễ bay hơi trong lá gồm n–butanol; valeraldehyd; hexaldehyd;
etylmetylceton; hexylmetylceton; butylamin; acid acetic; acid propionic; acid isobutyric. Lá
dâu non có chứa calcium malat, acid succinic, acid tartaric, các tannins, adenine (Duke, 1983).
Ngoài ra, từ lá Dâu tằm cô lập đƣợc rutin, acid gallic, quercetin, kaemferol, quercitrin,
catechin (Leena et al, 2003) và mulberrofuran (Hano et al., 1989).
Quả dâu chứa thiamin, riboflavin, acid nicotinic và ascorbic acid (Duke, 1983).
Rễ dâu có chứa morusin, cyclomorusin; kuwanon A, kuwanon B, kuwanon C, albanol A,
albanol B (Taro et al, 1978); chalcomoracin (Mitsuo et al, 1980);

mulberrofuran I,

mulberrofuran S, mulberrofuran P (Yoshio, 1989); các loại flavonoid (Jiang et al, 2003);
kuwanon G (Park et al, 2003); artonin E, licoricidin, licochancol A, licorisoflavan A (Taro,
1978); neocyclomorusin, kuwanon E (Mai Đình Trị, 2010); mulberrosid A và steppogenin–
4’–O – β – D – glucosid (Mi Z, 2009).
1.4. Điều kiện tự nhiên và một số đặc điểm nông học
Cây dâu tằm cũng nhƣ các cây trồng khác sống trong điều kiện tự nhiên, chịu sự tác động
tổng hợp của các yếu tố môi trƣờng nhƣ ánh sáng, nhiệt độ, khơng khí, đất và nƣớc. Tuỳ theo
thời kỳ sinh trƣởng, phát triển của cây dâu tằm, ảnh hƣởng của các yếu tố mơi trƣờng tới
chúng có khác nhau. Nghiên cứu tác động của các yếu tố sinh thái tới cây dâu tằm giúp chúng
ta đề ra những giải pháp kỹ thuật trồng và chăm sóc dâu tằm. Một số yếu tố sinh thái tác động
đến sinh trƣởng của cây dâu tằm theo Nguyễn Văn Long và Cộng sự (2004) nhƣ sau:
1.4.1. Ánh sáng

Ánh sáng có liên quan chặt chẽ với năng suất và chất lƣợng lá dâu tằm. Trong điều kiện
chiếu sáng đầy đủ, cây dâu tằm sinh trƣởng tốt, cành khoẻ và mập, lá dày, có màu xanh đậm,
năng suất và chất lƣợng lá cao. Ngƣợc lại, trong điều kiện chiếu sáng không đầy đủ, cành
nhánh thƣờng mềm, lá mỏng, màu xanh nhạt, hàm lƣợng nƣớc trong lá cao, chất khô giảm,
dinh dƣỡng trong lá thấp. Ở 30C, với ngày nắng, cƣờng độ quang hợp của cây dâu tằm là
2mg chất khô/100cm2 lá 1giờ. Ngày trời râm, cƣờng độ quang hợp chỉ bằng 50% ngày nắng
còn ngày mƣa chỉ bằng 30% ngày nắng. Ngoài ra, khả năng tiếp nhận ánh sáng của cây dâu
tằm còn phụ thuộc vào cấu trúc tán lá. Vì vậy, trong kỹ thuật trồng dâu tằm cần có biện pháp

6


kỹ chăm sóc đốn tỉa hợp lý để giúp cho cây dâu có bộ khung tán phù hợp nhằm tăng khả năng
sử dụng ánh sáng mặt trời.
1.4.2. Nhiệt độ
Nhiệt độ là yếu tố sinh thái tác động tƣơng đối mạnh đến quá trình sinh trƣởng của cây
dâu tằm bởi lẽ các hoạt động sinh lý của cây dâu nhƣ quang hợp, hô hấp, trao đổi chất… đều
thay đổi theo nhiệt độ. Khoảng nhiệt độ thích hợp cho cây dâu tằm sinh trƣởng là 25– 30C.
Nhiệt độ cao hơn 40C sẽ kìm hãm sự sinh trƣởng của cây và ở nhiệt độ dƣới 12C thì cây
dâu tằm ngừng sinh trƣởng.
1.4.3. Nƣớc
Nƣớc rất cần thiết cho việc hấp thụ, hoà tan, vận chuyển dinh dƣỡng, quang hợp, trao đổi
chất…Hàm lƣợng nƣớc trong cây dâu tằm chiếm khoảng 60%. Tuy nhiên, đối với các bộ
phận khác nhau thì tỷ lệ nƣớc có khác nhau: ở lá tỷ lệ nƣớc là 75–82%, ở cành là 58– 61%, ở
rễ là 54–59%. Để tổng hợp đƣợc 1 gam chất khô cây dâu tằm cần hút 280–400ml nƣớc.
Độ ẩm đất thích hợp cho q trình sinh trƣởng của cây dâu tằm là 70 – 80%. Hàm lƣợng
nƣớc trong đất nếu quá cao hoặc quá thấp đều làm cây cằn cỗi, không phát triển đƣợc và dễ
nhiễm bệnh.. Nếu trong đất chứa quá nhiều nƣớc, cây dâu tằm có chất lƣợng lá thấp. Ni tằm
bằng loại lá này, tằm dễ bị bệnh. Đất có mực nƣớc ngầm cao hoặc úng ngập, thiếu khơng khí
sẽ ảnh hƣởng đến hơ hấp của rễ và tiêu hao dinh dƣỡng của cây. Nhiều nƣớc trong đất sẽ thiếu

oxy, các vi sinh vật háo khí giảm cịn vi sinh vật yếm khí tăng lên, sản sinh một số chất khử
làm rễ bị ngộ độc, cây sinh trƣởng kém.
1.4.4. Đất
Cây dâu tằm thích ứng với nhiều loại đất: Đất cát, đất thịt, đất sét, đất chua mặn… và có
khả năng sinh trƣởng đƣợc ở độ pH đất là 4,5 – 9. Loại đất thích hợp nhất cho cây dâu tằm
sinh trƣởng và phát triển là đất cát pha và đất thịt nhẹ có độ pH khoảng từ 6,5 – 7.
1.4.5. Khơng khí
Oxy và cacbonic trong khơng khí là những yếu tố khơng thể thiếu cho quá trình sinh
trƣởng và phát triển của cây dâu tằm. Cacbonic trong khơng khí là ngun liệu cần thiết cho
quá trình quang hợp, hàm lƣợng cacbonic tăng trong phạm vi 0,03 – 0,1% thì cƣờng độ quang
hợp của lá tăng dẫn đến năng suất lá tăng. Qua nghiên cứu cho thấy cứ 100cm2 lá dâu trong 1
giờ sản sinh ra 10 gam chất khơ thì cần 15mg CO2. Vƣờn dâu đảm bảo thơng thống hoặc tăng

7


cƣờng bón phân hữu cơ sẽ làm tăng hàm lƣợng CO2 tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình
quang hợp của cây.
1.4.6. Dịch bệnh và sâu hại
Dịch bệnh và sâu hại gây ra những tổn thất nặng nề cho năng suất và chất lƣợng cây dâu
tằm. Nguyên nhân gây bệnh thƣờng do nấm ký sinh. Cây dâu tằm thƣờng gặp phải một số
dịch bệnh sau:
+ Bệnh xoăn lá
+ Bệnh bạc thau
+ Bệnh rỉ sắt
+ Bệnh dán cao dâu
Bên cạnh đó, thiệt hại do côn trùng gây ra cũng nghiêm trọng nhƣ dịch bệnh. Sâu
đục thân, sâu róm, rệp phấn hại lá dâu, sâu cuốn lá… là những sâu hại phổ biến gây bệnh ở
cây dâu tằm.
1.5. Giá trị kinh tế và y dƣợc

Nghề trồng dâu nuôi tằm nƣớc ta đã có lịch sử vài ngàn năm nay và cho đến hiện giờ, nó
vẫn là một nghề truyền thống khơng hề bị mai một. Phát triển nghề trồng dâu, nuôi tằm có
nhiều ý nghĩa về kinh tế, văn hố, xã hội và môi trƣờng.
Cây dâu tằm là một cây thuốc quý. Trong Đông y, dâu tằm đƣợc sử dụng nhiều trong các
bài thuốc vì hầu hết tất cả các bộ phận của cây dâu tằm đều mang các công dụng chữa bệnh:
- Cành dâu tằm có tác dụng chữa đau nhức, chân tay co quắp…
- Quả dâu tằm có tác dụng bổ thận, nuôi máu… dùng chữa bệnh tiêu tai ù, huyết
hƣ…ngồi ra cịn giúp sáng mắt, giúp cho sự tiêu hóa, chữa kém ngủ, râu tóc sớm bạc.
- Lá dâu tằm chữa sốt, giúp ra mồ hôi, cảm mạo, cao huyết áp…
- Vỏ rễ làm thuốc lợi tiểu tiện, chữa ho lâu ngày, hen, ho có đờm, chữa sốt, chữa cao
huyết áp…(Đỗ Tất Lợi, 2004).
II. NUÔI CẤY MÔ VÀ MỘT SỐ KẾT QUẢ NHIÊN CỨU TRÊN CÂY DÂU TẰM
2.1. Lƣợc sử phát triển của công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật
1665 Robert Hook quan sát đƣợc tế bào sống dƣới kính hiển vi và đƣa ra khái niệm tế
bào.
1838 Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xƣớng học thuyết tế bào.
1904 Hannig tiến hành các thí nghiệm ni cấy phơi thực vật đầu tiên.

8


1924 Hình thành mơ sẹo từ rễ cà rốt trong mơi trƣờng có acid lactic.
1934 Kogl lần đầu tiên xác định đƣợc vai trò của IAA, 1 hoocmon thực vật đầu tiên có
khả năng kích thích sự tăng trƣởng và phân chia tế bào.
1939 Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời
gian dài từ mô thƣợng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá.
1946 Sự tạo cây đầu tiên từ đỉnh chồi ở Lupinus và Tropaeolum.
1951 Nitsch lần đầu tiên nghiên cứu nuôi cấy noãn tách rời in vitro. Skoog nghiên cứu sử
dụng các hố chất điều hồ sinh trƣởng và phát sinh cơ quan.
1953 Tulecke lần đầu tiên thành công trong nuôi cấy bao phấn và tạo mô sẹo đơn bội từ

hạt phấn Ginkgo biloba.
1959 Tulecke và Nickell thử nghiệm sản xuất sinh khối thực vật quy mô lớn (134 L)
bằng nuôi cấy chìm.
1962 Murashige và Skoog phát minh mơi trƣờng ni cấy mô tế bào thực vật – môi
trƣờng MS.
1969 Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy tế bào dịch lỏng (huyền phù) của Hapopappus
gracilis.
1983 Công ty Mitsui Petrochemicals lần đầu tiên đã sản xuất chất trao đổi thứ cấp trên
quy mô công nghiệp bằng nuôi cấy tế bào dịch lỏng Lithospermum spp.
1985 Flores và Filner lần đầu tiên sản xuất chất trao đổi thứ cấp từ nhân nuôi rễ tơ ở
Hyoscyamus muticus. Những rễ này sản xuất nhiều hoạt chất hyoscyamine hơn cây tự nhiên
(Trần Văn Minh, 2007).
2.2. Những phƣơng pháp nuôi cấy mô
2.2.1. Phƣơng pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào TCL (Thin Cell Layer)
Phƣơng pháp cấy lát mỏng tế bào (TCL) (Jaime, 2003), có nguồn gốc cách đây gần 30
năm với việc khảo sát sự sinh trƣởng phát triển ở hoa, rễ, cành và phôi soma trên cây thuốc lá.
Từ đó, TCLs đã đƣợc sử dụng thành cơng trong nhân giống nhiều lồi thực vật, cây cảnh.
Ni cấy lát mỏng tế bào là một phƣơng pháp cho nhiều ƣu thế hơn các phƣơng pháp nhân
giống in vitro truyền thống khác.
Lớp mỏng tế bào là những mẫu cấy có kích thƣớc nhỏ, đƣợc cắt ra từ các cơ quan thực
vật nhƣ thân, lá, rễ, hoa, các bộ phận của hoa…Có hai loại lớp mỏng tế bào:

9


+ Nếu cắt theo chiều dọc (lTCL: longitudinal thin cell layer) ta đƣợc mẫu cấy chỉ bao
gồm 1 loại tế bào nhƣ lớp đơn của tế bào biểu bì hoặc một vài lớp của tế bào vỏ.
+ Nếu cắt theo chiều ngang ( tTCL: transverse thin cell layer) ta đƣợc mẫu cấy bao
gồm nhiều loại tế bào nhƣ biểu mô, vỏ, vùng thƣợng tầng, mô mạch cũng nhƣ nhu mô…
Sự phát triển và biệt hóa của các tế bào thực vật đều bị chi phối bởi chƣơng trình điều

khiển sự biệt hóa và phát sinh hình thái của cơ thể thực vật. Nếu cắt mô thành những lớp
mỏng chừng vài lớp tế bào và đặt vào môi trƣờng nuôi cấy thích hợp thì chúng có thể thốt
khỏi sự ức chế và có khả năng phát sinh hình thái một cách độc lập thơng qua sự tái lập trình
các thơng tin di truyền trong tế bào.
Đặc điểm mỏng của lớp tế bào nuôi cấy giúp hạn chế sự tƣơng tác giữa các lớp tế bào lân
cận, làm giảm sự phân cực của tế bào, nhanh chóng tạo ra một chƣơng trình biệt hóa và đồng
nhất các mơ. Vị trí lát cắt, loại cơ quan hay kích thƣớc mơ khác nhau cũng có thể làm thay đổi
chƣơng trình biệt hóa của tế bào khi nuôi cấy trên cùng một loại môi trƣờng.
Nuôi cấy lớp mỏng tế bào có nhiều ƣu thế và đƣợc ứng dụng thành cơng trên nhiều lồi
cây khác nhau nhƣ African violet (Saintpaulia ionantha); thu hải đƣờng (Begonia rex), hoa
cúc (Dendranthema x grandiflora)… Phƣơng pháp này còn đƣợc ứng dụng trong các nghiên
cứu sinh lý học, mô học, cũng nhƣ trong nghiên cứu kiểu gen của sự tạo hình hoa, chồi và
phôi sinh dƣỡng. Phƣơng pháp này cũng rất hữu hiệu trong nghiên cứu sự phát sinh cơ quan in
vitro của các loài cây thân gỗ nhƣ tre (Bambusa spp.), khoai mì (Manihot esculenta), cây
thơng (Pinus radiate)…(Đỗ Đăng Giáp và cộng sự, 2009 và Tan Nhat Duong và cộng sự,
2003)
2.2.2. Nuôi cấy mô sẹo
Mô sẹo (Dƣơng Công Kiên, 2002) là một khối tế bào vơ tổ chức, hình thành từ các mơ
và cơ quan phân hố dƣới các điều kiện đặc biệt (có vết thƣơng, xử lí các chất điều hoà sinh
trƣởng thực vật…). Các tế bào hoặc các mô thuộc cơ quan này phải chịu một sự phản phân
hố trƣớc lần phân chia đầu tiên. Nếu đƣợc ni cấy trong điều kiện thích hợp, khối mơ sẹo có
khả năng phát triển thành cây con hồn chỉnh. Ni cấy mô sẹo là khâu rất quan trọng trong
nuôi cấy mô tế bào. Mô sẹo là nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác nhƣ:
phân hố mơ và tế bào, chọn dịng tế bào, ni cấy tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy
phôi soma, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học…
Đối với những thực vật khó trồng bằng các phƣơng pháp bình thƣờng và khơng có khả năng
nhân giống thơng qua ni cấy đỉnh sinh trƣởng thì ngƣời ta thƣờng sử dụng phƣơng pháp

10

nuôi cấy mô sẹo. Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống nhƣ cây mẹ. Từ một cụm tế bào mơ
sẹo ban đầu có thể tái sinh một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, tuy nhiên,
mức độ biến dị tế bào soma lại cao hơn.
2.2.3. Phƣơng pháp nuối cấy tế bào trong môi trƣờng lỏng lắc (nuôi cấy dịch treo tế bào)
Dịch huyền phù đƣợc tạo ra do sự nuôi cấy một mảnh mô sẹo khơng có khả năng biệt
hóa, trong mơi trƣờng lỏng và đƣợc chuyển động trong suốt thời gian nuôi cấy. Ta cũng có thể
ni cấy mảnh mơ đã biệt hóa, khi đó thời gian ni cấy sẽ kéo dài hơn và những tế bào nuôi
cấy sẽ ở trạng thái tự do (tế bào đơn). Tuy nhiên, khơng có dịch huyền phù nào chỉ có những
tế bào đơn. Các cụm tế bào gồm các tế bào có kích thƣớc khác nhau, ngồi ra cịn có các tế
bào đang phân chia và những tế bào chết.
Danh từ xốp (friability) dùng để chỉ những tế bào tách rời nhau sau khi phân chia. Mức
độ tách rời tế bào phụ thuộc khả năng tạo nhiều tế bào xốp và đƣợc điều khiển bởi môi trƣờng.
Tăng tỉ lệ cytokinin/ auxin sẽ sản xuất nhiều tế bào xốp.
Những tế bào trải qua q trình ni cấy và sinh trƣởng trong dịch huyền phù gọi là dòng
tế bào. Dịng tế bào có những đặc điểm sau:
- Khả năng tách tế bào cao.
- Phát sinh hình thái đồng nhất.
- Nhân to và tế bào chất đậm đặc.
- Nhiều hạt tinh bột.
- Có những dẫn liệu tạo cơ quan.
- Có khả năng nhân đơi trong 24 – 72 giờ.
- Mất tính tồn năng.
- Tăng mức đa bội thể.
Ni cấy tế bào thực vật trong điều kiện in vitro để sản xuất các chất tự nhiên có một số
ƣu điểm sau:
- Các tế bào thực vật có thể đƣợc ni cấy trong các điều kiện nhân tạo mà không phụ
thuộc vào thời tiết và địa lý. Không cần phải vận chuyển và bảo quản một số lƣợng lớn các
nguyên liệu thơ.
- Có thể kiểm sốt chất lƣợng và hiệu suất của sản phẩm bằng cách loại bỏ các trở ngại

trong quá trình sản xuất thực vật, nhƣ là chất lƣợng của nguyên liệu thô và sự đồng nhất giữa
các lô sản xuất.

11


- Một số sản phẩm trao đổi chất có thể đƣợc sản xuất từ ni cấy dịch huyền phù có chất
lƣợng cao hơn trong cây hoàn chỉnh.
- Một số sản phẩm trao đổi chất có thể đƣợc sản xuất từ ni cấy dịch huyền phù có chất
lƣợng cao hơn trong cây hồn chỉnh.
Chúng ta có thể sử dụng kinh nghiệm và kiến thức từ nuôi cấy vi sinh vật để áp dụng cho
nuôi cấy tế bào thực vật. Tuy nhiên, vì tế bào thực vật và vi sinh vật vẫn có các đặc điểm khác
nhau, nên cần phải cải biến và điều chỉnh các điều kiện ni cấy để tìm đƣợc các yêu cầu đặc
thù cho nuôi cấy tế bào thực vật (Lê Văn Hoàng, 2008).
2.3. Ảnh hƣởng của chất điều hoà sinh trƣởng thực vật
Thực vật cần các chất hữu cơ nhƣ protein, gluxid, lipid,…để cấu tạo nên tế bào, mô, và
cung cấp năng lƣợng cho hoạt động sống. Bên cạnh đó, chúng cịn cần các chất có hoạt tính
sinh lý nhƣ vitamin, enzyme và các hormone. Trong đó, hormone có một vai trị rất quan trọng
trong việc điều chỉnh các quá trình sinh trƣởng, phát triển và các hoạt động sinh lý khác của
thực vật.
Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật là những chất hữu cơ (bao gồm các hợp chất tự
nhiên và nhân tạo) khi sử dụng ở nồng độ thấp có tác dụng điều tiết (kích thích hay ức chế)
q trình sinh trƣởng và phát triển của thực vật. Chính vì vậy, chúng có vai trị hết sức quan
trọng trong ni cấy mơ. Ngày nay, sáu nhóm chất điều hồ sinh trƣởng thực vật đã đƣợc
công nhận (Dƣơng Công Kiên, 2002). Trong nuôi cấy mô thực vật, các chất điều hòa sinh
trƣởng thƣờng đƣợc sử dụng là:
- Auxin có tác dụng nhiều mặt lên các quá trình sinh trƣởng của cây: hoạt động của tầng
phát sinh, hiện tƣợng ƣu thế ngọn, tính hƣớng của thực vật, sự sinh trƣởng của quả, tạo quả
khơng hạt, kích thích sự tạo thành rễ hoặc phối hợp với cytokinin để kích thích tạo mơ sẹo.
Auxin thƣờng sử dụng trong ni cấy mơ là NAA, IBA, IAA.

- Cytokinin có hiệu quả sinh lý đặc trƣng nhất là kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ,
ảnh hƣởng rõ rệt lên sự phân hóa cơ quan thực vật, đặc biệt là phân hóa chồi. Cytokinin làm
yếu hiện tƣợng ƣu thế ngọn, làm phân cành nhiều. Ngồi ra, cytokinin cịn có khả năng kìm
hãm sự hóa già của các cơ quan và trong một số trƣờng hợp còn ảnh hƣởng lên sự nảy mầm
của hạt và củ. Cytokinin thƣờng sử dụng trong nuôi cấy mô là BA, kinetin hoặc nƣớc dừa.
- Giberellin có tác dụng kích thích sự kéo dài lóng do sự phân chia của tế bào thân và
kích thích sự tăng trƣởng lá ở nồng độ cao. Ngoài ra, chúng cịn kích thích sự nảy mầm của
hạt, củ, kích thích sự ra hoa.

12


- Acid abscisic là một chất ức chế sinh trƣởng rất mạnh. Acid abscisic có vai trị điều
chỉnh sự rụng (do kích thích sự xuất hiện và nhanh chóng hình thành tầng rời ở cuống, sự ngủ
nghỉ, sự đóng mở khí khổng và sự hóa già của cây. Axit absxisic cịn đƣợc xem nhƣ là
homone của stress vì nó đƣợc hình thành mạnh khi cây gặp điều kiện bất lợi của môi trƣờng
(Nguyễn Minh Chơn, 2004).
2.4. Một số nghiên cứu nuôi cấy mô trên cây dâu tằm
2.4.1. Các nghiên cứu nuôi cấy mô dâu tằm trên thế giới
Nhân giống in vitro từ đốt và đỉnh ngọn Morus alba L. trên mơi trƣờng MS có bổ sung
Kn và BAP. Tần số nảy chồi là 80% và 70% tƣơng ứng cho chồi bên và chồi ngọn. Trên mơi
tƣờng MS có bổ sung BAP (2,0 mg) và NAA (0,2 mg). Khoảng 80% chồi ni cấy trên mơi
trƣờng MS có bổ sung 1,0 mg NAA mọc rễ. Những cây có rễ tốt chuyển sang đất có tỉ lệ sống
sót là 70% (Anis et al, 2003).
Nhân giống in vitro Morus alba L. từ chồi đỉnh và đốt trên mơi trƣờng MS có bổ sung
cytokinin. Nghiên cứu này cho thấy rằng tác dụng của cytokinin BA là tốt hơn Kn đối với sự
hình thành chồi bên. Mơi trƣờng MS có bổ sung 1,0 mg/l là tốt nhất cho mẫu cấy phát triển
với chồi bên có chiều dài trung bình là 5,46+/-0,2 cm. Sự tạo rễ và số lƣợng rễ chịu ảnh hƣởng
mạnh bởi auxin và loại auxin. 100% chồi tạo rễ trên mơi trƣờng MS có bổ sung 0,5 mg/l IBA
(Habib, 2003).

Nuôi cấy mô Morus alba L. tạo rễ tơ trong môi trƣờng cơ bản cho cây gỗ bổ sung
hormone sinh trƣởng nhờ chủng Agrobacterium tumefaciens C58Cl. Môi trƣờng lý tƣởng cho
tạo chồi là môi trƣờng ni cấy mơi cho cây gỗ có bổ sung IBA 1,0 mg/l, NAA 0,1mg/l. Rễ tơ
xuất hiện sau khi nhiễm 10 ngày và tần số xuất hiện rễ tơ của mẫu cấy từ thân khoảng 92 %
sau 30 ngày. Xác định trong rễ tơ sau khi nuôi cấy 50 ngày trong mơi trƣờng ½ MS lỏng có bổ
sung 0,05 mg/l IBA. Kết quả cho thấy rằng hàm lƣợng quercetin tăng 8,5 lần (Xiangyun et al,
2010).
Nghiên cứu những ảnh hƣởng của auxins, cytokinins và nitrogen lên sự tạo rutin từ mô
sẹo và rễ bên của Morus alba L. (Lee, 2010). Trong các lồi của Morus, Morus alba L. có
hàm lƣợng rutin cao nhất khoảng 242 μg/g mô tƣơi. Auxin nhƣ 2,4D, IAA và NAA làm tăng
cƣờng khả năng phát triển của mô sẹo và rễ bất định, tăng hàm lƣợng protein và rutin.
Cytokinin nhƣ BA thì ngƣợc lại là giảm sự tạo rễ bất định và hàm lƣợng rutin. Mô sẹo ni
cấy trong mơi trƣờng lỏng có IAA sẽ tạo nhiều rutin hơn là khơng có IAA. Tuy nhiên, sự tiết
rutin vào mơi trƣờng thì ít hơn khi khơng có IAA. Hơn nữa, tỉ lệ Auxin/Nitơ cũng ảnh hƣởng

13


lớn đến sự tạo rutin và tiết rutin. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lƣợng rutin cao nhất đƣợc
tạo ra khi rễ bất định sinh trƣởng trong môi trƣờng MS có tỉ lệ Auxin/Nitỏ là 34/66 bổ sung
IAA 0,5 mg/l.
Cây con đƣợc tạo ra từ nuôi cấy mô sẹo của Morus alba L. (Bhau, 2001). Để tạo mô sẹo,
các mẫu cấy từ lá, lóng và cuống lá của Morus alba L. đƣợc ni trong mơi trƣờng MS có bổ
sung 2,4 D và BA. Sự tạo mô sẹo phụ thuộc vào phần nào của cây đƣợc sử dụng và các chất
điều hòa sinh trƣởng. Theo nghiên cứu này, lá là ngun liệu tốt nhất cho sự hình thành mơ
sẹo trong môi trƣờng MS kết hợp 1 mg/l 1 2,4-D and 0,5 mg/l BA (95-100%). Mơ sẹo hình
thành chồi trên mơi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l BA. Nếu bổ sung thêm 0,1 mg l−1 2,3,5triiodobenzoic acid (TIBA) làm tăng cƣờng biệt hóa chồi của mơ sẹo. Chồi sau đó đƣợc kích
thích tạo rễ trên mơi trƣờng MS chứa 0,5 mg/l indole-3-butyric acid (IBA) or αnaphthaleneacetic acid (NAA).
Nuôi cấy Morus alba L. in vitro trong điều kiện chiếu tia UV-B có cƣờng độ và thời
lƣợng thích hợp làm tăng cƣờng sự tổng hợp các chất trao đổi chất thứ cấp ở Morus alba L. Lá

của cây in vitro sau đó đƣợc chiết rút bằng MeOH. Cao MeOH đƣợc phân tích bằng sắc ký
HPLC. Kết quả cho thấy hàm lƣợng chalcomoracin và moracin N trong lá tăng. Hàm lƣợng
chalcomoracin và moracin N trong 10 g lá khô là 8,18 mg và 3,52 mg (Gu et al., 2010).
Nuôi cấy mô Morus alba L. nhằm tăng cƣờng sản xuất phytoestrogen. Trong nghiên cứu
này tác giả đã thiết lập mơi trƣờng MS có bổ sung đƣờng, phytagel, auxin và cytiokinine để
tạo mô sẹo và phát triển mô sẹo từ thân, lá và cuốn lá của Morus alba L.. Kết quả cho thấy, sự
tạo mô sẹo và phát triển mô sẹo tốt nhất trong môi trƣờng MS bổ sung 2% sucrose và 0,3%
phytagel, NAA 1g/l và BAP 0,5 g/l ủ trong tối ở 25± 2 oC. Mơ sẹo sau đó đƣợc dùng để xác
định hoạt tính phytoestrogen trong sự so sánh với mô từ cây trƣởng thành. Kết quả cho thấy
hàm lƣợng của phytoestrogen trong mô nuôi cây cao hơn trong mô lấy từ cây trƣởng thành
ngoài thiên nhiên (Bakshi, 2009).
Một nghiên cứu khác cho thấy tế bào cố định của Morus bombycis K. tăng cƣờng tạo
rutin và γ - amino butyric acid (GABA). Đặc biệt là tế bào cố định sẽ sản xuất rutin và GABA
cao trong mơi trƣờng MS có bổ sung 2,4 D 1 mg/l và KN 0,1 mg/l, rutin (8,2 µg/g mơ sẹo) và
GABA (305 µg/g mơ sẹo) và đồng thời tiết một lƣợng lớn ra môi trƣờng (Han, 2011).
Nhƣ vậy, nuôi cây mô Morus tạo mô sẹo làm nguyên liệu nghiên cứu cho các mục đích
khác nhau đã đƣợc thực hiện nhiều trên thế giới. Tuy nhiên, các nghiên cứu chƣa đề cập đến

14


việc sử dụng phƣơng pháp lát mỏng trong nuôi cấy mơ Morus. Đây là một phƣơng pháp có
nhiều ƣu thế cho sự hình thành và phát triển mơ sẹo (Jame, 2003).
2.4.2. Các nghiên cứu về dâu tằm trong nƣớc
Cây dâu tằm đƣợc nhân dân ta biết đến và sử dụng từ lâu. Dâu tằm sử dụng để chữa bệnh
trong các bài thuốc dân gian. Các nghiên cứu về kỹ thuật trồng, chăm sóc và chọn giống cây
dâu tằm đã đƣợc thực hiện nhằm nâng cao năng suất cây dâu tằm trong ngành cơng nghiệp
trồng dâu ni tằm. Bên cạnh đó, nghiên cứu về đánh giá khả năng sử dụng cây dâu tằm làm
thức ăn cho gia súc nhai lại ở miền Trung, Việt Nam mang lại nhiều lợi ích trong việc sử dụng
cây dâu vào nông nghiệp.

Gần đây Việt Nam cũng đã bƣớc đầu nghiên cứu thành phần hóa học cây dâu tằm nhằm
tìm ra các chất có ích nhƣ: “Khảo sát thành phần hoá học của rễ cây dâu tằm Morus alba L.
của Nguyễn Kim Khánh, “Nghiên cứu một số hoạt chất từ lá cây dâu tằm Morus alba để ứng
dụng tạo chế phẩm kháng oxy hóa của Mai Đình Trị, “Nghiên cứu sản xuất sản phẩm bột
uống liền từ dịch trích ly lá dâu tằm (morus alba L.) Việt Nam” của Hoàng Thị Lệ Hằng …
Hiện tại vẫn chƣa có cơng trình trong nƣớc về ni cấy mơ dâu tằm đƣợc công bố.

15


CHƢƠNG III

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
I. VẬT LIỆU
Cây dâu tằm trắng (Morus alba L.) đƣợc thu nhận ngoài tự nhiên ở nhiều địa điểm khác
nhau ở quận 7. thành phố Hồ Chí Minh: chùa Kiều Đàm, đƣờng Trần Xuân Soạn và đƣờng Lê
Đức Thọ phƣờng 6 quận Gò Vấp, thành phố Hồ Chí Minh. Các mẫu cây đƣợc định danh là
cùng một loài Morus alba L. bởi Tiến sĩ Phạm Văn Ngọt , trƣờng Đại học Sƣ phạm, TPHCM
(phụ lục 10).
1.1. Vật liệu tạo mô sẹo trên môi trƣờng rắn
Thân non cây dâu tằm trắng (Morus alba L.) được cắt thành từng lát mỏng dày khoảng 34 mm.
1.2. Vật liệu tạo dịch huyền phù tế bào
Mô sẹo cây dâu tằm (Morus alba L.) từ môi trƣờng MS rắn sau tuần thứ 3 chuyển vào
môi trƣờng lỏng để nuôi cấy tạo dịch huyền phù tế bào.
Ngoài ra, dịch huyền phù tế bào cũng đƣợc thử nghiệm tạo trực tiếp từ lát mỏng tế bào
cành non cây dâu tằm trên môi trƣờng MS lỏng.
II. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ
Thiết bị: Cân phân tích, máy đo pH, bếp điện, tủ cấy vơ trùng, tủ sấy, tủ lạnh để trữ hóa
chất, nồi hấp autoclave, máy cất nƣớc, máy lắc.
Dụng cụ: chai thủy tinh 100ml; bình tam giác (250ml, 500ml); cốc thủy tinh (100ml,

250ml, 500ml, 1000ml); bình định mức (20ml, 100ml, 250ml, 500ml); đĩa petri; ống đong;
pipetman; đũa thủy tinh; dao cấy; kẹp dài 25 – 30cm; đèn cồn; bình xịt cồn; bơng gịn khơng
thấm và các dụng cụ khác.
III. MÔI TRƢỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NI CẤY
Mơi trƣờng ni cấy là mơi trƣờng MS (Murashige and Skoog, 1962) (phụ lục 2), bổ
sung 30 g/l saccharose, 10 g/l agar (khi sử dụng môi trƣờng rắn), pH = 5,9 (đƣợc điều chỉnh
bằng NaOH 2% hay HCl 2%). Môi trƣờng đƣợc hấp khử trùng bằng nồi hấp khử trùng
(autoclave) ở 1210C, 1atm, trong 20 phút. Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật sử dụng là
BA, 2,4-D và NAA.

16


Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 22 ± 2oC, ẩm độ 70% ± 2oC, cƣờng độ và thời gian chiếu
sáng 2800 ± 200 lux, 16 giờ/ngày.
Khi khảo sát yếu tố môi trƣờng nuôi cấy tác động lên sự tăng trƣởng của tế bào, chỉ yếu
tố đƣợc khảo sát thay đổi còn các yếu tố khác đƣợc giữ nguyên.
IV. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
4.1. Khảo sát quy trình khử trùng mẫu
Khử trùng mẫu trƣớc khi đƣa vào mơi trƣờng ni cấy có vai trò rất quan trọng. Mẫu đƣợc
khử trùng tốt sẽ cho tỉ lệ tái sinh cao, mức độ nhiễm khuẩn, nhiễm nấm thấp. Đây là các yếu tố
quan trọng quyết định sự thành cơng của quy trình ni cấy mơ.
 Mục đích thí nghiệm
Tìm ra quy trình khử trùng tốt nhất để tạo ra nguồn mẫu vô trùng nhằm phục vụ cho các
thí nghiệm tiếp theo.
 Hóa chất được dùng trong khử trùng mẫu
Xà phòng lifebouy, cồn 70o, dung dịch Ca(OCl)2 nồng độ 2%, 5%, 10% và nƣớc cất vô
trùng.
 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo 09 nghiệm thức kí hiệu từ K1 đến K9. Mỗi nghiệm thức

đƣợc thực hiện trong 03 đĩa petri, mỗi đĩa chứa 10 mẫu. Mỗi nghiệm thức đƣợc lập lại 03 lần.
Trong các nghiệm thức, thời gian khử trùng với xà phòng lifebouy và cồn 70o là không
thay đổi; nồng độ Ca(OCl)2 và thời gian lắc mẫu khác nhau (bảng 3.1). Quy trình khử trùng
chung đƣợc thực hiện theo sơ đồ sau (hình 3.1):

17


Cành
non của
Morus
alba L.
cắt
thành
từng
đoạn 3
–4
mm.

Rửa
dƣới vịi
nƣớc
trong 30
phút

Rửa
mẫu
bằng
nƣớc cất
vơ trùng

3 lần
cho sạch
xà
phịng
trong tủ
cấy vơ
trùng

Ngâm
lắc mẫu
trong
xà
phịng
Liefboy
trong
15 phút

Rửa sạch
mẫu với
nƣớc cất
vơ trùng
4, 5 lần
trong tủ
cấy vô
trùng

Ngâm lắc
mẫu
trong
dụng dịch

Ca(Ocl)2
với các
nồng độ
và thời
gian khác
nhau

Ngâm
lắc mẫu
trong
cồn 70°
trong 1
phút
trong tủ
cấy vơ
trùng

Rửa mẫu
bằng nƣớc
cất vơ
trùng 3 lần
cho sạch
xà phịng
trong tủ
cấy vơ
trùng

Hình 3.1: Sơ đồ quy trình khử trùng mẫu
Sau khi khử trùng, mẫu đƣợc cắt ngang thành những lát mỏng có kích thƣớc khoảng 0.51 ml cấy vào mơi trƣờng .
Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ mẫu nhiễm, tỉ lệ mẫu chết, tỉ lệ mẫu sạch khỏe.

18