Nghiên cứu một số yếu tố môi trường ảnh hưởng tới khả năng sinh cellulase từ một số chủng nấm mốc được phân lập ở vĩnh p

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH- KTNN
_______***_______

LÊ THỊ MINH PHƢƠNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI
TRƢỜNG ẢNH HƢỞNG TỚI KHẢ NĂNG
SINH CELLULASE TỪ MỘT SỐ CHỦNG
NẤM MỐC ĐƢỢC PHÂN LẬP Ở VĨNH
PHÚC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS. Phƣơng Phú Công

HÀ NỘI - 2010


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới giảng viên - TS. Phương Phú Công
đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, giúp đỡ, tạo điều kiện để em thực hiện và
hoàn thành tốt luận văn này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong bộ môn Vi
sinh vật.
Đồng thời em xin cảm ơn Ban giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, khoa

Sinh – KTNN, phòng thí nghiệm vi sinh, thư viện đã tạo điều kiện giúp đỡ để
em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp.
Ngoài ra, em xin cảm ơn sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, gia đình
trong suốt quá trình làm đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2010
Sinh viên
Lê Thị Minh Phương

Lê Thị Minh Phương

K32D – Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết
quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong khóa luận là hoàn toàn trung
thực và không trùng với kết quả của tác giả khác.
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2010
Tác giả
Lê Thị Minh Phương

Lê Thị Minh Phương

K32D – Sinh - KTNN

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

CMC

: Carboxylmethyl cellulose

M3

: Mẫu 3

M6-1

: Mẫu 6-1

M5-3

: Mẫu 5-3

Cx

: Endoglucanase

C1

: Exoglucanase

CBH

: Celobiohydrolase

SSA

: Vùng bề mặt đặc hiệu (SSA) của cellulose

Lê Thị Minh Phương

K32D – Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

DANH MỤC HÌNH TRONG LUẬN VĂN

Hình 1.1. Cấu trúc lập thể của phân tử cellulose ........................................... 4
Hình 1.2. Cấu trúc của cellulose .................................................................. 5
Hình 1.3. Sơ đồ quá trình thủy phân cellulose theo Erickson,1973 ................ 9
Hình 3.1. Khả năng sinh cellulase của một số chủng nấm mốc được phân
lập............................................................................................................ 27
Hình 3.2. Đặc điểm hình thái của chủng M3 và M6-1 ................................. 29
Hình 3.3. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh cellulase........................... 30
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính cellulase........................... 32
Hình 3.5. Khả năng sinh cellulase của chủng M3 và M6-1 ở 250C và
300C ......................................................................................................... 33

Hình 3.6. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính cellulase.......................... 34
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase ............... 35
Hình 3.8. Khả năng sinh cellulase của chủng Penicillium M3 và
Aspergillus M6-1 trên nguồn nitơ là NaNO3 ...............................................................................36

Lê Thị Minh Phương

K32D – Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

DANH MỤC BẢNG BIỂU TRONG LUẬN VĂN
Bảng 1.1. Các thành phần chính của ligno – cellulose và các enzyme
phân giải của nấm ....................................................................................... 3
Bảng 1.2. Hàm lượng cellulose trong một số nguyên liệu ............................ 6
Bảng 3.1. Các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose................. 26
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính cellulase .................................. 30
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính cellulase .......................... 31
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase .... 33
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase............... 35

Lê Thị Minh Phương

K32D – Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC
Lời cảm ơn.
Lời cam đoan.
Danh mục từ viết tắt.
Danh mục hình trong luận văn.
Danh mục bảng biểu trong luận văn.
Mở đầu
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cellulose.............................................................................................. 3
1.2. Hệ thống cellulase ................................................................................ 7
1.3. Cơ chế phân giải cellulose .................................................................... 8
1.4. Ứng dụng của cellulase....................................................................... 11
1.5. Các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose ............................................. 15
1.5.1. Nấm sợi .......................................................................................... 15
1.5.2. Vi khuẩn ......................................................................................... 16
1.6. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật .... 17
1.6.1. Giống vi sinh vật ............................................................................. 17
1.6.2. Nguồn dinh dưỡng........................................................................... 18
1.6.3. Điều kiện nuôi cấy........................................................................... 19
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và vi sinh vật .................................................................. 21
2.1.1. Nguyên liệu..................................................................................... 21
2.1.2. Môi trường...................................................................................... 21
2.1.2.1. Môi trường bảo quản và giữ giống................................................. 21
2.1.2.2. Môi trường nuôi cấy ..................................................................... 21
2.1.2.3. Môi trường thử hoạt tính enzyme .................................................. 22
2.1.3. Hóa chất- thiết bị ............................................................................. 23

Lê Thị Minh Phương

K32D – Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

2.1.3.1. Hóa chất....................................................................................... 23
2.1.3.2. Thiết bị ........................................................................................ 23
2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 23
2.2.1. Phương pháp vi sinh ........................................................................ 23
2.2.2. Phương pháp hóa sinh...................................................................... 24
2.2.2.1. Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp cấy chấm điểm ....... 24
2.2.2.2. Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp khuếch tán trên
môi trường thạch (William, 1983) ............................................................. 24
2.2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến hoạt tính của
cellulase ................................................................................................... 25
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose .......... 26
3.2. Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh
cellulase của chủng M3 và M6-1 ............................................................... 30
3.2.1. Anh hưởng của pH đến khả năng sinh cellulase ................................ 30
3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase......................... 31
3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase .......... 33
3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase..................... 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Lê Thị Minh Phương

K32D – Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Vi sinh vật đóng vai trò vô cùng quan trọng trong tự nhiên cũng như
trong cuộc sống của con người. Nó tham gia vào tất cả các vòng tuần hoàn vật
chất trong tự nhiên, là khâu quan trọng trong chuỗi, lưới thức ăn của các hệ
sinh thái, có vai trò quan trọng trong quá trình tự làm sạch các môi trường tự
nhiên.
Vi sinh vật tham gia vào quá trình phân hủy cellulose – một hợp chất
hữu cơ có khá nhiều trong đất, thành phần chính cấu tạo nên cơ thể thực vật.
Ở cây Bông cellulose chiếm 90% trọng lượng khô, ở các loài cây gỗ khác
cellulose chiếm 40-50%. Có nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải
cellulose như: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, niêm vi khuẩn…Nhưng đáng
chú ý nhất là nấm mốc. Phân bố ở khắp nơi, có khả năng sinh cellulase là
phức hệ enzyme rất quan trọng trong quá trình phân giải cellulose tự nhiên và
được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: công nghiệp chế biến thực
phẩm, công nghiệp dược phẩm, công nghệ môi trường… Đặc biệt cellulase
còn được sử dụng có hiệu quả trong chăn nuôi, là một trong số các enzyme
thường được bổ sung vào thức ăn gia súc nhằm phân giải các chất dinh dưỡng
của thức ăn giúp cho con vật tiêu hóa được tốt hơn.
Tuy nhiên ở Việt Nam chế phẩm enzyme thường phải nhập khẩu với

giá thành cao nên việc nghiên cứu và sản xuất chế phẩm enzyme để ứng dụng
trong chăn nuôi là vấn đề rất cần thiết.
Từ những lý do trên tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu một số yếu tố môi
trƣờng ảnh hƣởng tới khả năng sinh cellulase từ một số chủng nấm mốc
đƣợc phân lập ở Vĩnh Phúc”.

Lê Thị Minh Phƣơng

1

K32D Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

2. Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu của đề tài “Nghiên cứu một số yếu tố môi trƣờng ảnh
hƣởng tới khả năng sinh cellulase của một số chủng nấm mốc đƣợc phân
lập ở Vĩnh Phúc’’ nhằm tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy của một số chủng
nấm mốc để sinh cellulase nhiều nhất.
3. Nội dung của đề tài
- Phân lập, tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng sinh
cellulase ở huyện Yên Lạc, thành phố Vĩnh Yên, Xuân Hòa (Vĩnh Phúc).
- Thử hoạt tính cellulase của một số chủng nấm mốc phân lập được.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng
sinh tổng hợp cellulase của một số chủng nấm mốc.
+ Anh hưởng của pH đến khả năng sinh cellulase.
+ Anh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase.

+ Anh hưởng của thời gian đến khả năng sinh cellulase.
+Anh hưởng của nguồn nitoden khả năng sinh cellulase.
4. Ý nghĩa của đề tài
4.1. Ý nghĩa lý luận
Nghiên cứu nhằm đi sâu, tìm hiểu hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hoá
của một số chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Hi vọng các chủng nấm mốc được lựa chọn sẽ tạo cellulase nhiều nhất
và được ứng dụng trong phân giải phế thải công nghiệp thực phẩm bổ sung
vào thức ăn gia súc, công nghiệp môi trường…Thủy phân cellulose tạo cơ
chất lên men để thu các sản phẩm cuối cùng khác nhau.

Lê Thị Minh Phƣơng

2

K32D Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Cellulose
Thành phần chất khô chủ yếu của thực vật là cellulose, hemicellulose
và lignin. Các thành phần này thường có tỉ lệ không giống nhau ở các loại cây
khác nhau. Chúng phối hợp tạo nên cấu trúc và quyết định tính chất hóa học
và cơ lí của nguyên liệu có nguồn gốc thực vật. Các hợp phần này thường đi

liền với nhau, do đó người ta thường gọi là ligno – cellulose (Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Các thành phần chính của ligno - cellulose và các enzyme
phân giải của nấm (Fengel và Wegener, 1989; Eaton và Hale, 1993)
Cellulose

Hemicellulose Lignin

% sinh khối

40 – 50

25 – 40

Đơn phân tử

D – anhydrogluco Xylose

Coniferyl alcohol

pyranose

Mannose

ρ – counmaryl alcohol

Hexoses

Sinapyl alcohol

20 – 35

và các Pentose
Cấu trúc đa

β – o – 4 liên kết

β1 – o – 4 liên Khử hydro trùng hợp

phân tử

mạch thẳng

kết mạch

thành chất không kết

thẳng với các

tinh

mạch nhánh
thay thế
Các enzyme

Endoglucanlase

Endoxylanase

Lignin peroxidase

chính liên quan

(E. C. 3.2.1.4)

(E.C. 3.2.1.8)

(E.C. 1.11.1.7)

Lê Thị Minh Phƣơng

3

K32D Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

đến phân giải

Cellobiohydrolase và hydrolases

Mn phụ thuộc vào

(E.C. 3.2.1.91)

peroxidase (E.C.

khác

β - glucosidase

1.11.1.7)
Laccase (E.C.1.10.3.2)

Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật. Tổng lượng của
chúng chiếm tới 50% tổng số hydratcacbon trên Trái Đất. Về cấu trúc hóa học
của cellulose là một polyme mạch thẳng do các D-gluco-pyranose liên kết với
nhau bằng liên kết β-1,4glucozid. Các đơn phân glucose trong cellulose có
cấu hình dạng ghế, quay một góc 1800 so với phân tử trước nó. Các nhóm
hydroxyl này đều nằm trên mặt phẳng nằm ngang.

Hình 1.1. Cấu trúc lập thể của phân tử cellulose
Mức độ trùng hợp của cellulose tự nhiên có thể đạt tới 10.000 đến
14.000 gốc đường. Nhờ có phương pháp phân tích bằng tia rơnghen, người ta
đã biết trong tế bào thực vật cellulose có cấu tạo dạng sợi. Đơn vị nhỏ nhất
hay dạng sợi sơ cấp là chuỗi thẳng, bao gồm các gốc D-glucopyranose, đường
kính ≈ 3nm. Các sợi sơ cấp này liên kết với nhau bởi mối liên kết hydro hoặc
lực Vandervan hợp thành vi sợi, đường kính ≈ 10nm ÷ 40nm. Những vi sợi
này hợp thành những vi sợi lớn vững chắc có thể quan sát được dưới kính
hiển vi quang học. Mỗi sợi vi cấp lại được bao bọc bởi lớp lignin và

Lê Thị Minh Phƣơng

4

K32D Sinh - KTNN

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

hemicellulose. Chính nhờ sự liên kết chặt chẽ giữa cellulose, hemicellulose và
lignin đã làm cho cellulose vững chắc và khó phân giải hơn (Hình 1.2).

Hình 1.2. Cấu trúc của cellulose
Cấu trúc của cellulose không đồng nhất và thường có 2 vùng:
- Vùng kết tinh có cấu trúc trật tự cao nên bền vững với tác động bên
ngoài.
- Vùng vô định hình do cấu trúc không chặt chẽ nên kém bền vững hơn.
Vùng vô định của cellulose có thể hấp thụ nước và trương lên. Trong
khi đó các mạng lưới liên kết hydro ở vùng kết tinh lại ngăn cản sự trương
này, nên enzyme chỉ tác động lên bề mặt các sợi.
Mặc dù với những phương pháp hiện có chưa đủ để xác định chính xác
cấu tạo của cellulose nhưng có thể thấy có rất nhiều kiểu gián đoạn và kết
thúc chuỗi, các bề mặt dị dạng và các vùng xoắn hoặc phân nhánh dọc theo
các vi sợi. Trong quá trình sinh tổng hợp cellulose rõ ràng là không có sự
khống chế chặt chẽ nào để cho mọi sợi đều có chiều dài như nhau. Các sợi

Lê Thị Minh Phƣơng

5

K32D Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

riêng biệt có thể nằm trong nhiều vùng kết tinh, dẫn đến xảy ra nhiều chuỗi
kết thúc bất ngờ ngay trong vùng có độ kết tinh cao.
Cellulose tự nhiên không tan trong nước, axit hay kiềm loãng và nhiều
dung môi hữu cơ khác. Chỉ có axit hay kiềm nung nóng mới có tác dụng thủy
phân cellulose. Dưới tác dụng của axit, các liên kết glucozid sẽ bị phá hủy dần
tạo thành các sản phẩm thủy phân không hòa tan có độ bền cơ học kém và
cuối cùng nếu thủy phân hoàn toàn sẽ thu được D-glucose. Dung dịch kiềm
làm trương phồng cellulose và hòa tan một phần cellulose mạch ngắn. Trong
tự nhiên có nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh enzyme thủy phân được
cellulose như: vi khuẩn, xạ khuẩn, niêm vi khuẩn, nấm mốc…
Cellulose được tổng hợp hàng năm với khối lượng lớn. Sinh khối thực
vật của Trái Đất là 1800 tỷ tấn, thì cellulose chiếm tới 720 tỷ tấn. Khối lượng
cellulose khổng lồ này ngoài việc chứa trong quần thể thực vật chủ yếu còn có
trong động vật và vi sinh vật nhưng với số lượng rất nhỏ. Số liệu thống kê
trong bảng 1.2 cho thấy hàm lượng cellulose trong một số nguyên liệu.
Bảng 1.2. Hàm lƣợng cellulose trong một số nguyên liệu
Nguyên liệu
Kiều mạch

Cellulose

Nguyên liệu

Cellulose

42,8

Vỏ hạt

60

Vỏ đậu tương

51

Bông

91

Mía

34

Gỗ thông

41

Cây trưởng thành

42

Giấy báo

40÷80

Bã sắn

Rơm

56,6

Thân ngô

36

Trấu lúa mì

Cỏ

28

Trấu lúa mạch

44
30,5
34

Trong các phế liệu cellulose thường có mặt trong các dạng sau:
- Phế liệu nông nghiệp: rơm rạ, vỏ lạc, vỏ trấu, lõi thân cây ngô…
Lê Thị Minh Phƣơng

6

K32D Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

- Phế liệu công nghiệp thực phẩm: vỏ và xơ quả, bã mía, bã cà phê, bã
sắn…
- Phế liệu trong công nghiệp chế biến gỗ: rễ cây, mùn cưa, gỗ vụn…
- Các chất thải sinh hoạt: rác, giấy báo, bao bì…
1.2. Hệ thống cellulase
Để có thể phân giải được cellulose tự nhiên cần phải có sự hiệp trợ của
các enzyme trong phức hệ cellulase. Phức hệ cellulase bao gồm 3 loại enzyme
chủ yếu:
- Endoglucanase (EC.3.2.1.4

β-Dglucan

glucanolhydrolase

hay

Carboxymethylcellulase viết tắt là CMCase): có khả năng cắt đứt cellulose
các liên kết bên trong phân tử cellulose làm giảm nhanh chiều dài chuỗi
nhưng đường khử tăng chậm do chúng thủy phân liên kết β-1,4glucozid một
cách tùy tiện trong mạch cellulose và giải phóng cellulodextrin, cellobiose.
Enzyme này phân giải mạnh mẽ các cellulose hòa tan nhất là dạng cellulose
vô định hình nhưng hoạt động rất yếu ở vùng kết tinh. Enzyme này được cho
là enzyme C x. Chính nhờ sự cắt trước của endoglucanase đã tạo ra các đầu
không khử, tạo điều kiện dễ dàng cho cellobiohydrolase do đó mà thủy phân
hoàn toàn được cellulose kết tinh.
- Exoglucanase (EC.3.2.1.91. 1,4 β- glucan – celobiohydrolase viết tắt
là CBH). Enzyme này xúc tác tách liên tiếp các phân tử cellobiose từ đầu khử
(CBHI) và đầu không khử (CBHII) của chuỗi cellulose. Ngày nay nó được coi

là enzyme chủ đạo phân giải cellulose, bởi nó có khả năng phân cắt cellulose
ở cả vùng kết tinh. Hoạt tính của enzyme này rất mạnh khi tác động lên vùng
vô định hình và cellulose đã bị phân giải một phần bởi endoglucanase. Bởi
vậy, khi kết hợp endoglucanase với exoglucanase hoạt tính phân giải cellulose
tăng rõ rệt.

Lê Thị Minh Phƣơng

7

K32D Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

CBH tác động rất kém lên CMC, nhưng có thể cắt được CMC khi nó đã
bị trương lên một phần. Các sợi bông có cấu trúc chắc chắn bởi các mối tương
tác hydro và mức độ polyme hóa cao (>10000 glucose) thì CBH phân giải
cũng chậm, bởi vì bông cũng có một ít đầu khử tự do. Tuy nhiên CBH có thể
cắt tốt nhất Avicel, một loại cellulose có các mối liên kết hydro chắc chắn,
song mức độ polyme hóa thấp (<200 gốc glucose).
- β- 1,4 glucosidase (EC.3.2.1.21 β-1,4 glucosedase hay cellobiase): là
enzyme rất đặc hiệu, có khả năng thủy phân cellobiose hay các
cellooligosacarit hòa tan trong nước giải phóng glucose. Enzyme này có hoạt
tính cực đại trên cellobiose và có hoạt tính giảm dần theo chiều dài của chuỗi
cellulodextrin. Chức năng của β-1,4 glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy
các chất cảm ứng của cellulase.
1.3. Cơ chế phân giải cellulose

Reese và các cộng sự lần đầu tiên đưa ra cơ chế phân giải vào năm
1952 như sau:
Cellulose
tự nhiên

C1

Cellulose
hoạt động

Đường
hòa tan

Cx

Cellobise
Glucose

Theo tác giả này thì enzyme C 1 (tương ứng với exoglucanase) là “tiền
nhân tố thủy phân” hay là enzyme không đặc hiệu, làm biến dạng cellulose tự
nhiên thành chuỗi cellulose hoạt động có mạch ngắn hơn, sau đó enzyme C x
(tương ứng với endoglucanase) tiếp tục phân cắt, giải phóng các đường hòa
tan cellodextrin và cellobiose, cuối cùng cellobiose bị cắt tạo thành glucose
dưới tác dụng của cellobiase.
Erickson và cộng sự, 1973 lại có quan điểm khác, thể hiện trên một sơ
đồ phức tạp hơn nhiều về quá trình thủy phân cellulose (Hình 1.3).

Lê Thị Minh Phƣơng

8

K32D Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Hình 1.3. Sơ đồ quá trình thủy phân cellulose theo Erickson, 1973
Đầu tiên, endoglucanase tấn công vào các vùng vô định hình trên bề
mặt cellulose, cắt đứt các liên kết β-1,4 glucozid để tạo ra các đầu mạch tự do.
Tiếp đó, dưới tác dụng của exoglucanase từ phía cực kín (phía không có tính
khử), cellulose bị cắt thành các cellodextrin, sau đó cùng với sự hiệp trợ của
exoglucanase phân cắt các cellulose tạo ra cellobiose và glucose. Cuối cùng
β-1,4 glucosidase thủy phân một phần cellodextrin và cellobiose thành
glucose.
Năm 1997, Tuula T.T, đã đưa ra một sơ đồ khác về cấu tạo của
cellulose và tác động của cellulase. Theo ông cellulose là một polyme tự
nhiên cho nên sự kết tinh của nó cũng không hoàn hảo. Các vùng vô định
hình xen kẽ với các vùng kết tinh một cách ngẫu nhiên. Các vùng vô định
hình có thể ở trên bề mặt sợi cellulose hoặc ở ngay sát dưới vùng kết tinh
hoàn hảo nhất. Các loại cellobiohydrolase (CBH) sẽ tấn công vào các vùng
kết tinh và các mạch bị cắt dở dang có các đầu khử hoặc không khử (CBHI
tấn công vào đầu khử còn CBHII tấn công vào đầu không khử) lần lượt tách

Lê Thị Minh Phƣơng

9

K32D Sinh - KTNN

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

các cellobiose ra khỏi chuỗi polyme. Khả năng làm giảm mức polyme hóa của
exoglucanase chậm song hàm lượng đường khử lại tạo ra nhiều. Trong khi đó
endoglucanase phân cách mạch polyme tùy tiện, không theo trật tự nào, tạo ra
các chuỗi oligosaccarit ngắn, dẫn đến giảm nhanh mức polyme hóa của
cellulose. Trong quá trình cắt gẫy mạch polyme, endoglucanase tạo ra các đầu
khử và không khử tự do, tạo cơ hội cho CBH phân cắt thành cellobiose. Bởi
vậy, khi có tổ hợp endo- exoglucanase quá trình phân giải cellulose mạnh lên
nhiều.
Tính chất và cấu trúc cũng như những thay đổi của cơ chất trong quá
trình thủy phân đều tác động đến vận tốc phân cắt của enzyme. Hiệu ứng này
đã được nghiên cứu trên quan điểm cơ chế phản ứng. Các kết quả quan trọng
thu được như sau:
1. Chỉ số kết tinh của cellulose kết tinh cục bộ tăng trong quá trình
phản ứng và sự giảm đáng kế của vận tốc phản ứng phần lớn là do sự biến đổi
cấu trúc của cơ chất cellulose.
2. Độ kết tinh của cellulose toàn phần vô định hình ví dụ: cellulose đã
xử lí axit photphoric thay đổi không đáng kể và vận tốc cao được duy trì trong
quá trình thủy phân.
3. Vùng bề mặt đặc hiệu (SSA) của cellulose kết tinh cục bộ giảm đáng
kể trong quá trình thủy phân, trong khi đó SSA của cellulose tái sinh thay đổi
không đáng kể.
4. Trị số độ polyme hóa của cellulose có độ kết tinh cao gần như không
thay đổi, còn của cellulose tái sinh vô định hình thì thay đổi rõ rệt.
5. Tổng hợp các yếu tố cấu trúc, sự hấp phụ của cellulase, sự kìm hãm

của sản phẩm và sự vô hoạt của cellulase, tất cả đều có ảnh hưởng quan trọng
đến vận tốc thủy phân cellulose.

Lê Thị Minh Phƣơng

10

K32D Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Nói chung, cho đến nay chưa có giả thuyết nào giải thích được thật đầy
đủ và thỏa đáng về cơ chế tác động của cellulase. Tuy nhiên, công nghệ và
giải pháp thiết bị để chuyển hóa cellulose bằng con đường công nghệ sinh học
thì hiện nay nhiều nước trên thế giới đã đưa vào triển khai ở quy mô công
nghệ và đã thu được nhiều kết quả rực rỡ.
1.4. Ứng dụng của cellulase
Nguồn cơ chất để cellulase phân giải là vô cùng phong phú và đa dạng
trong tự nhiên cũng như trong đời sống sinh hoạt.
Hàng ngày, một lượng lớn chất thải lignocellulose từ nông nghiệp,
công nghiệp, đô thị luôn chồng chất hoặc sử dụng chúng một cách kém hiệu
quả do giá thành của qui trình xử lí rác thải rất cao. Điều này trở thành vấn đề
quan trọng hàng đầu đối với sinh thái, công nghiệp hóa học và công nghệ sinh
học. Hơn nữa, đây còn là vấn đề kinh tế đáng quan tâm trong việc phát triển
qui trình tái sử dụng cho hiệu quả và lợi dụng chất thải cellulose như là nguồn
cơ chất rẻ tiền.
Cellulase là phức hệ enzyme rất quan trọng và được ứng dụng rộng rãi

trong nhiều lĩnh vực. Trong hiện tại và tương lai người ta sử dụng cellulase
cho 2 mục đích chính:
- Dùng cellulase trực tiếp trong phân giải phế thải của công nghiệp thực
phẩm bổ sung vào thức ăn gia súc và trong công nghệ môi trường.
- Thủy phân cellulose tạo cơ chất lên men để thu các sản phẩm cuối
cùng khác nhau.
Các lĩnh vực chính ứng dụng cellulase bao gồm:
- Công nghiệp chế biến thực phẩm:
+ Cải thiện độ tiêu hóa thức ăn.
+ Chiết rút các chất gây vị, dầu, dịch ép protein từ rau quả.
+ Cải thiện độ hòa tan của các nguyên liệu trong công nghệ lên men.

Lê Thị Minh Phƣơng

11

K32D Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

+ Chế biến thạch từ rau câu.
+ Sản xuất rượu và một số axit hữu cơ.
- Công nghiệp dược phẩm:
+ Chế biến các chất tự tiêu hóa, loại bỏ các sợi không mong muốn.
- Sản xuất thức ăn gia súc:
+ Cải thiện độ tiêu hóa rơm, cỏ làm thức ăn gia súc.
+ Sản xuất thức ăn giàu protein.

- Công nghệ môi trường [14]:
+ Ứng dụng trong xử lí phế liệu sau thu hoạch, xử lí rác đô thị, phân
hủy thành phân bón hữu cơ.
+ Phân hủy các chất tồn lưu.
- Công nghệ lên men:
+ Cung cấp cơ chất cho tổng hợp khí metan, glyxerin, axit citric, axit
lactic, vitamin, protein đơn bào, chất kháng sinh, các chất có hoạt tính sinh
học khác.
Ngoài ra, trong giao thông vận tải, từ sinh khối lignocellulose sản xuất
ra etanol là nhiên liệu tuyệt vời cho động cơ đốt trong và nó có thể thay thế
cho nhiên liệu hóa thạch để giảm bớt sự ô nhiễm môi trường và sự nóng lên
toàn cầu (Philippidis và Smith, 1995).
Trong công nghiệp dệt may, người ta thấy nếu dùng cellulase ở liều
thấp để xử lí bông sẽ làm bông trắng và mịn màng hơn, do nó loại bỏ được
các sợi tơ và hạt trên mặt sợi bông làm cho sợi phẳng, bóng mượt và mềm.
Hoặc có thể dùng cellulase (các loại cellulase trung tính) để mài vải quần áo
bò thay thế cho mài bằng đá bọt để tạo ra những điểm “bạc” tự nhiên của
quần áo bò. Điều này có ý nghĩa rất lớn đối với ngành công nghiệp mài vải bò
vì khi xử lí bằng cellulase làm cho vải bò bền hơn nhiều, nó không phá cấu

Lê Thị Minh Phƣơng

12

K32D Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

trúc của vải mạnh như đá mài, hơn nữa khối lượng mài một mẻ tăng lên 50%
do đã loại bỏ 50% thể tích đá bọt phải bổ sung vào vải ở thùng mài.
Trong công nghiệp sản xuất bột giấy, giấy sử dụng cellulase để tẩy mực
trên các giấy phế thải thay thế dùng Cl hoặc ClO2 gây ô nhiễm môi trường.
Để làm sạch, trắng giấy người ta sử dụng chủ yếu là loại hemicellulase,
xylanase từ Sporotricchum pulverulentum, S. dimorphosphorum, cellulase từ
A. niger hoặc từ Phanerochaeta chrysosporium, hoặc mannase từ T. reesei.
Cellulase thường được dùng ở (0,001÷0,1%), cellulase (0,05÷0,5%),
cellobiase (0,005÷0,015%).
Trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa. Tác dụng của cellulase
trong chất tẩy rửa chủ yếu là loại bỏ các sợi hỏng, làm cho vải trở nên mịn
đẹp, mềm sáng màu hơn. Cellulase thường được sử dụng kết hợp với lipase
(loại bỏ mỡ) và protease (loại bỏ protein). Các enzyme này dùng cho chất giặt
đều là các enzyme trung tính hoặc kiềm.
Cellulase còn được sử dụng có hiệu quả để phá vỡ thành tế bào thực vật
trong kỹ nghệ lai ghép tế bào trần - một công nghệ lai tế bào giữa các loài
hoặc thậm chí giữa các chi khác nhau tạo giống cây trồng mới trong nông
nghiệp.
*Ứng dụng của cellulase trong chăn nuôi
Trong chăn nuôi, một trong những biện pháp nâng cao năng suất vật
nuôi là nâng cao hiệu suất sử dụng các chất dinh dưỡng của thức ăn ở mức
cao nhất. Để giải quyết nhiệm vụ này, người ta có thể dùng chế phẩm enzyme
bổ sung khẩu phần thức ăn của vật nuôi. Các enzyme này cùng với các
enzyme có sẵn trong đường tiêu hóa sẽ phân giải các chất dinh dưỡng của
thức ăn, giúp cho con vật tiêu hóa được tốt hơn.
Cellulase là một trong số các enzyme thường được bổ sung vào thức ăn
chăn nuôi gia súc. Tuy nhiên, người ta không bổ sung riêng chế phẩm enzyme

Lê Thị Minh Phƣơng

13

K32D Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

này mà thường bổ sung cùng với các enzyme khác như: amylase, protease,
xylanase… tạo ra một dạng chế phẩm chứa nhiều loại enzyme (multienzyme).
Việc bổ sung nhiều loại enzyme giúp vật nuôi phân giải được nhiều loại cơ
chất, vật nuôi sẽ hấp thụ tốt hơn các nguồn thức ăn khác nhau.
Khi động vật ở giai đoạn còn non, hệ enzyme tiêu hóa của chúng chưa
hoàn chỉnh, chủ yếu ở động vật ăn bột và ăn cỏ. Sử dụng enzyme trong chăn
nuôi, người ta thấy lợn con theo ổ tăng trọng 20% và giảm thức ăn 6÷14%.
Thí nghiệm trên lợn 1÷3 tuần tuổi thì lợn tăng trọng 8÷40%, tăng khả năng sử
dụng thức ăn từ 10÷18% [6].
Người ta cũng đã dùng enzyme bổ sung vào thức ăn của trâu bò. Quá
trình tiêu hóa thức ăn trong dạ cỏ của trâu bò được gắn liền với hoạt động
enzyme của các vi sinh vật sống nhờ ở đấy. Vì vậy, bổ sung vào thức ăn
những chế phẩm enzyme để nâng cao khả năng tiêu hóa là điều rất cần thiết.
Dùng các chế phẩm có hoạt tính amylase, protease, cellulase… đều thu được
kết quả tốt, kết quả tăng trọng của trâu bò có thể đạt tới 12÷17%, có khi còn
cao hơn [13], [14].
Trên thế giới người ta đã sử dụng thức ăn gia súc có chứa các enzyme
tiêu hóa từ đầu những năm 1990. Hiện nay, hằng năm người ta sản xuất
khoảng 30 triệu tấn thức ăn gia súc có bổ sung chế phẩm enzyme. Chiếm
khoảng 5% trong tổng số 600 triệu tấn thức ăn gia súc được sản xuất.

Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về cellulase ứng dụng trong thức
ăn chăn nuôi như: GS. Nguyễn Lân Dũng (1991) đã lên men xốp sắn với
Aspergillus henebergii, Aspergillus niger dùng làm thức ăn cho gà, lợn, bò…
kết quả thấy có nhiều triển vọng [4]. Chu Thị Thanh Bình và cs (2002) đã ứng
dụng các chủng nấm men trong chế biến bã thải hoa quả giầu cellulose làm
thức ăn gia súc...[1]. Gần đây, đã có nghiên cứu thử nghiệm về sự ảnh hưởng
của enzyme thương mại: phytase hoặc tổ hợp các enzyme (amylase, protease,

Lê Thị Minh Phƣơng

14

K32D Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

xylanase, cellulase…) đến khả năng tăng trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn
của lợn con cai sữa. Kết quả thử nghiệm cho thấy khi trong thức ăn có bổ
sung chế phẩm phytase và tổ hợp các enzyme thì tăng trọng hơn so với đối
chứng tương ứng là: 13,3% và 32%. Nếu sử dụng phối hợp cả hai chế phẩm
này thì tăng trọng hơn so với đối chứng là 50% .
Như vậy, hiệu quả của việc bổ sung enzyme vào thức ăn chăn nuôi là rõ
ràng làm tăng tỷ lệ tiêu hóa cho vật nuôi và giảm chi phí. Tuy nhiên, hiện nay
ở Việt Nam chế phẩm enzyme thường phải nhập khẩu với giá thành cao nên
nghiên cứu và sản xuất chế phẩm enzyme là vấn đề rất cần thiết.
1.5. Các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose
Sinh tổng hợp cellulase là quá trình phức tạp chịu sự điều khiển của bộ

máy di truyền, sự hoạt hóa của các chất cảm ứng, và sự kiềm chế của các chất
trao đổi và các sản phẩm cuối cùng.
1.5.1. Nấm sợi
Theo Carle-Urioste và cs cơ chế cảm ứng của cellulose đến sinh tổng
hợp cellulase ở nấm sợi T. reesei dựa trên sự có mặt một lượng nhỏ cellulase
sẵn có trong nấm. Lượng cellulase cơ sở này phân giải các oligosaccarit đã bị
tách khỏi cellulose và có thể xâm nhập vào tế bào, mở đầu cho việc tổng hợp
cellulase.
Khi nghiên cứu sinh tổng hợp endoglucanase từ Nectria catalinenesis
người ta thấy chất cảm ứng tốt nhất CMC-Na.
Các kết quả của Hrmova và cs cho thấy rằng các disaccarit trong tự
nhiên cấu tạo bởi glucose và xylose, có vai trò quan trọng trong điều hòa sinh
tổng hợp cellulase của nấm sợi Aspergillus terreus. Chất cảm ứng tốt nhất là
2-O-beta-D-glucopyranosyl D-Xylose (Glcbeta 1-2Xyl), Sophorose và 2-Obeta-D-glucopyranosyl D-Xylose (Xylbeta 1-2Xyl) hoặc các đồng phân của
chúng cũng là những chất cảm ứng tốt. Loewenberg và cs khi nghiên cứu

Lê Thị Minh Phƣơng

15

K32D Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

cellulase của nấm sợi Trichoderma cũng có kết luận rằng: chỉ một lượng nhỏ
sophorose cũng gây lên sự tổng hợp cellulase. Bổ sung nhiều lần với một
lượng nhỏ sophorose sẽ tốt hơn là một lần với lượng lớn.

Sorbose một loại đường không khử và không phải là sản phẩm của quá
trình thủy phân cellulose cũng có vai trò điều hòa sinh tổng hợp và giải phóng
cellulase.
Lactose là chất cảm ứng hòa tan cho phức hệ enzyme cellulase của
Trichoderma lignorum. Tween-80 (0,1%) có ảnh hưởng tốt đến sinh tổng hợp
cellulase của Aspergillus terreus.
Nhiều sản phẩm trung gian của chu trình Krebs (axit citric, succinic …)
là những chất ức chế của quá trình sinh tổng hợp cellulase. Alcol phenethylic
(PEA) là chất kìm hãm sinh trưởng và kích thích sinh tổng hợp cellulase của
Myrothecium verucaria. Một số hợp chất hóa học khác có cấu trúc tương tự
PEA như alcol benzylic, propylic, aceton cũng có tác dụng thúc đẩy sinh tổng
hợp cellulase. PEA tác động đến tế bào chất và thành tế bào, nơi xảy ra quá
trình sinh tổng hợp cellulase.
Các chủng nấm sợi có khả năng phân giải cellulose thường thuộc các
chi:

alternaria,

Aspergillus,

Chaetomium,

Coprinus,

Myrothecium.

Penicillium, Rhizopus, Trichoderma…
1.5.2. Vi khuẩn
Bacilus subtilis tổng hợp CMC-ase tốt nhất trên môi trường có chứa
chất cảm ứng là D (+) raffinose 0,2%. Các chất kìm hãm là glucose và

cellobiose. Sinh tổng hợp CMC-ase của Acetivibrio cellulolyticus được cảm
ứng bởi cellulose, cellobiose và salicin b ị kìm hãm nhưng không hoàn toàn
bởi glucose. Hoạt tính exoglucannase được tăng cường nếu nuôi cấy trên poly
beta-glucozid polyme tan hay không tan và bị kìm hãm bởi sự tăng thêm
cellobiose.

Lê Thị Minh Phƣơng

16

K32D Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Đối với cellulomonas cellobiose, cellulose và sophorose ở nồng độ thấp
cũng gây cảm ứng sinh tổng hợp cellulase. Quá trình sinh tổng hợp cellulase
phụ thuộc vào mối quan hệ phức tạp giữa kìm hãm dị hóa, ức chế và cảm ứng.
Vi khuẩn cũng có khả năng phân giải cellulose nhưng không mạnh
bằng nấm sợi do lượng enzyme tiết ra môi trường ít hơn và thành phần
enzyme cũng không đầy đủ. Khác với các loại cellulase từ nấm mốc, phần lớn
các cellulase từ vi khuẩn đều là các enzyme gắn kết với tế bào sinh chúng chứ
không phải là enzyme ngoại bào. Quá trình phân giải của các enzyme này sẽ
làm bào mòn bề mặt của sợi cellulose.
Các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose thường thuộc các
chi sau:

Angiococus, Bacillus, Cellfalcicula, Cellulomonas, Cellvibrio,

Clostridium, Pseudomonas...
Ngoài ra, xạ khuẩn cũng là đối tượng phân giải cellulose mạnh như:
Steptomyces,

Thermoactinomyces,

Micromonospora,

Steptosporagium,

Nocacdia.
* Thông thường trong phòng thí nghiệm để thử hoạt tính enzyme ban
đầu của vi sinh vật: C x (Endoglucanase) – dùng CMC (cellulose hòa tan,
Cacboxyl Methyl Cellulosse), C 1(exoglucanase) – dùng Avicel (cellulose kết
tinh), giấy lọc, có khi sử dụng bông (cellulose tự nhiên), β-glucosidase – dùng
cellobiose (cellulose mạch ngắn). Ở vi sinh vật sự hình thành đồng thời C1 và
Cx với tỉ lệ khác nhau tùy theo loài vi sinh vật, ví dụ Trichoderma reesei có
hoạt tính C1 rất mạnh trong khi tạo Cx ít hơn so với một số loại nấm khác.
1.6. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật
1.6.1. Giống vi sinh vật
Như chúng ta đã biết, có nhiều nhân tố ảnh hưởng đến sự tạo thành
enzyme và hoạt tính của nó trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật. Đặc tính sinh

Lê Thị Minh Phƣơng

17

K32D Sinh - KTNN