Nghiên cứu tác dụng dược lý thực nghiệm trên sỏi tiết niệu và phân lập chất có hoạt tính của cây ý dĩ (coix lachryma jobi l )

NGHBÊN CỨU TÁC DỤNG DƯỢC LÝ THựC NGHỆM TRÊN SỎI TIÉT NIỆU
VÀ PHÂN LẬP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH CỦA Ý DĨ
{Coix lachryma - jobì L.)
Pham Đức Vinh*. Trần Thúy Ngần^, Đỗ Thị Yấn^
Đào Hồng Hạnh^, Nguyễn Thị Đông^
HDKH: TS. Nguyễn Quỳnh Chi'*, TS. Nguyễn Thùy Dương'
' bộ môn Dược lực, ^Sinh viên K62, K63

^Trường Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương
''Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội
Từ khóa: acid p-coumaric, carvci oxalat, Coix lachryma -jobỉ L„ sỏi tiết niệu, Ỷ dĩ
Tóm tắt
Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục đích đánh giá tác dụng ức chế
hình thành sỏi canxi oxalat in vitro và in vivo của dịch chiết nước toàn phần và
phân lập hoạt chất có tác dụng của thân Ỷ d ĩ (Coix lachryma-jobi L.). Dịch chiết
nước Ỷ d ĩ có tác dụng ức chế phụ thuộc nồng độ đổi với sự hình thành sỏi canxi
oxalat, đồng thời làm tăng tỷ lệ COD/COM trên mô hĩnh ỉn vitro sử dụng đĩa 96
giếng. Trên chuột cống trắng giống đực được gây sỏi tiết niệu bằng cách bố sung
ethylen glycol 0,75% trong nước uổng hàng ngày, dịch chiết nước Ỷ d ĩ 2,52 g/kg
thể hiện tác dụng làm giảm sổ lượng sỏi lắng đọng tại thận so với lô chứng bệnh
sau 28 ngày điều trị. Từ phãn đoạn cỏ tác dụng ức chế sỏi mạnh nhất, phân đoạn
ethyl acetat, đã phân lập được acid p-coumaric, thể hiện tác dụng ức chế sỏi in
vitro mạnh hơn so với natri citrat với giá trị ICịo là 2,35 mM. Các kêt quả này tạo

cơ sở cho việc phát triển Ỷ dĩ thành dược liệu tiềm năng trong điều trị sỏi tiết niệu.
Đặt vấn đề
Sỏi tiết niệu là một bệnh lý khá phổ biến, ảnh hưởng đến khoảng 12% dân
số toàn cầu. Cùng với sự phát triển của y học hiện đại, những kỹ thuật ngoại khoa
mới đã được áp dụng trong điều trị để loại bỏ sỏi khỏi đường tiết niệu, tuy nhiên
những phương pháp này có thể gây tai biến và tỷ lệ tái phát cao [3], Thêm vào
đó, hiện nay vẫn chưa có một thuốc hóa dược nào thực sự hiệu quả để điều trị sỏi

tiết niệu, đặc biệt là trong dự phòng tái phát sỏi. Vì vậy, xu hướng sử dụng các
thuốc có nguồn gốc từ dược liệu trong điều trị sỏi tiết niệu đang ngày càng được
quan tâm. Ý dĩ {Coix ỉachryma-jobi L.) là loài cây bản địa ở Việt Nam được sử
dụng từ lâu trong y học cổ truyền với tác dụng bồi bổ cơ thể, lợi tiểu, ừị phù
thũng, tê thấp, tiểu tiện ra sỏi [ 1 ] nhưng chưa được nghiên cứu theo định hướng
tác dụng điều trị sỏi tiết niệu. Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện với hai mục
tiêu: (1) Đánh giá tác dụng ức chế sỏi tiết niệu in vitro và in vivo của dịch chiết


toàn phần thân Ý dĩ; (2) Phân lập hoạt chất có tác dụng ức chế sỏi tiết niệu từ
thân Ý dĩ.
Nguyen liệu và phương pháp nghiên cứu
Nguyên liệu
Dược liệu
Thân cây ý dĩ, được thu hái tại Từ Liêm, Hà Nội vào tháng 10 năm 2011.
Mau dược liệu đã được Bùi Hồng Quang - Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật
định tên khoa học là Coix lachryma-Jobi L., họ lúa (Poaceae). Dịch chiết toàn
phần thu được bằng phương pháp sắc với dung môi là nước, cô đặc đến dạng cao
lỏng 1:1. Các phân đoạn dịch chiết thu được bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng
với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, chloroform, ethylacetat.
Hóa chất và động vật
Tất cả các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích.
Chuột cống trắng giống đực, chủng Wistar, khối lưọng 180 ± 20 g do Học viện
Quân Y cung cấp, được nuôi trong điều kiện tiêu chuẩn.
Phương pháp nghiên cứu
Đánh giá tác dụng ức chế tinh thể canxi oxalat in vitro của thân Ỷ dĩ
Đánh giá tác dụng ức chế hình thành tinh thể canxi oxalat in vitro của dịch
chiết toàn phần Ý dĩ trên đĩa 96 giếng Costar 3596 (Corning, Mỹ) theo phưoTig
pháp được mô tả bởi Gohel và Wong [4], Trên mỗi đĩa 96 giếng gồm có: các
giếng chứng, các giếng natri citrat và các giếng thử được cho tương ứng 160 ỊXÌ

đung dịch nước tiểu nhân tạo, 2 0 ịiì dung môi pha mẫu hoặc natri citrat hoặc
dung dịch thử. Tinh thể canxi oxalat được tạo thành khi thêm 20 /xl dung dịch
acid oxalic 0,04 N vào tất cả các giếng. Đo mật độ quang (OD) trên hệ thống
máy ELISA ở bước sóng 620 nm tại thời điểm 30 phút sau phản ứng. Tính tỷ lệ
ức chế (%ƯC) và quan sát hình ảnh tinh thể trong các giếng dưới kính hiển vi soi
ngược vào thời điểm kết thúc thí nghiệm.
Đánh giá tác dụng ức chế sỏi canxi oxaỉat in vivo của thân Ỷ d ĩ
Đánh giá tác dụng ức chế hình thành sỏi canxi oxalat của dịch chiết toàn
phần thân Ý dĩ ở mức liều 2,52 g/kg trên chuột cống trắng với mô hình gây sỏi
thực nghiệm được mô tả bởi Karadi VR và cộng sự [6 ]. Tác nhân gây sỏi là
ethyl en glycol, bổ sung trong nước uống hàng ngày của chuột ở nồng độ 0,75%
trong vòng 28 ngày. Quan sát tiêu bản mô bệnh học thận dưới kính hiển vi phân
cực, mồi tiêu bản được quan sát trên 10 vi trường khác nhau (x40), tính số đám
sỏi trung bình/vi trưÒTig.
Phân lập hoạt chất có tác dụng


Đánh giá khả năng ức chế hình thành tinh thể canxi oxalat của các phân
đoạn dịch chiết Ý dĩ trên đĩa 96 giếng. Phân đoạn có tác dụng ức chế sự hình
thành tinh thể canxi oxalat mạnh nhất được lựa chọn để phân lập chất, sử dụng
phương pháp sắc ký cột và phương pháp kết tinh lại. cấu ừúc hóa học của chất
phân lập được xác định bằng phổ khối (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân
(NMR). Tác dụng ức chế tinh thể canxi oxalat của chất đã phân lập được đánh
giá bằng phương pháp in vitro.
X ử lý số liệu
Số liệu được lưu trữ và xử lý bằng phần mềm SPSS 16.0. Tiến hành kiểm
chuẩn trước khi xử lý số liệu theo các phương pháp thống kê y học. Sự khác biệt
được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
Kết quả
Tác dụng ức chế tinh thể canxi oxalat in vitro của dịch chiết toàn phần Ý dĩ

Dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ (YD) được đánh giá tác dụng ức chế tinh
thể canxi oxalat in vitro ở các mức độ pha loãng khác nhau: 1/1, 1/4, 1/16, 1/64.
Bảng 3.1. Tác dụng ức chế hình thành túứi thể canxi oxalat của dịch chiết nước Ý dĩ
Chú-ng
(n=8)
AOD

%ư'c

0,31 ± 0,03

Citrat lOmM
(n=8)

Y D l/4

Y D l/1

Y D l/6 4

Y D l/1 6

(n=8)

(n=8)

(n=8)

(n=8)
0,21 ± 0,02"*

33,1%

0,17 ±0,01**

0,29 ± 0,02’

0,26± 0,02’*

0,23 ± 0,02’*

45,2%

4,9%

15,0%

26,1%

*
p < 0,05 so với chứng; ** p < 0,01 so với chứng
Dịch chiết toàn phần Ý dĩ bắt đầu thể hiện tác dụng ức chế sự hình thành
tinh thể canxi oxalat ở độ pha loãng >1/64, tác dụng ức chế này tăng dần theo
nồng độ. Tác dụng ức chế của dịch chiết Ý dĩ tương tự chứng dương natri ciừat
nhưng yếu hon so với natri citrat ở tất cả các nồng độ thử. Khi có mặt dịch chiết
Ý dĩ, các tinh thể canxi oxalat có xu hướng chuyển tìr dạng COM sang dạng
COD. So vói các giếng có mặt naừi citrat, mật độ sỏi tại các giếng có mặt dịch
chiết Ý dĩ dày hơn nhưng tỷ lệ COD/COM cao hơn và kích thước tinh thể COD
cũng nhỏ hơn.

' •• . ù'/-

^

a
b
c
Hình 1. Hình ảnh tinh thể canxi oxalat tạo thành trong điều kiện không có chất
thử (a), có natri citrat (b), có dịch chiết ý dĩ 1/1 (c) (x40)


Tác dụng ức chế sỏi canxi oxalat in vỉvo của dịch chiấ toàn phần Ỷ dĩ
Sau 4 tuần sử dụng hóa chất gây sỏi, sự hình thành sỏi tại thận được nhận
thấy rõ ở hầu hết các chuột thuộc lô chứng bệnh so với lô chứng thưòng. Dịch
chiết nước Ý dĩ ở mửc liều 2,52 g/kg thể hiện tác dụng ức chế hình thành sỏi
thận, làm giảm rõ rệt sổ lượng các đám sỏi lắng đọng tại thận so với lô chứng
bệnh. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa số lượng sỏi của lô Ý dĩ và
lô chứng dương natri citrat.

+
Chứng
bệnh

C liứng
tb ư ờ n ạ

N n tn ciu at
2.52g.1vg

I
Ýílĩ

2.52 g/kg

Hình 2. Số lượng các đám sỏi trên tiêu bản mô bệnh học thận của các lô (n=8 )
*
p < 0 ,0 1 so với lô chứng thường, **p < 0 ,0 1 so với lô chứng bệnh
Trên hình ảnh tiêu bản mô thận, không quan sát thấy sự lắng đọng sỏi tại
thận của lô chứng thường. Lô chứng bệnh có nhiều đáni sỏi kết tập cả ở vùng nhu
mô (bao gồm vùng vỏ và vùng tủy) và vùng nhú ứiận. Lô chứng dương natri
citrat và lô ý dĩ chỉ có một vài đám sỏi nhỏ nằm rải rác ở các vùng này.
;
ị
■ '- - '. ¿ s
k. "
'*

*•

,

’
* ' , m

..... 1

2a

2b

2c

2d

Hình 3, Hình ảnh tiêu bản mô bệnh học thận dưód kính hiển vi phân cực (H&E, X40)
a: chứng thưòng, b: chứng bệnh, c: chứng dưomg, d: Ý dĩ;
1 : vùng nhu mô, 2 : vùng nhú
Kết quả phân lập hoạt chất


Lựa chọn phân đoạn ức chế tinh thể canxi oxalat mạnh nhất
Ba phân đoạn (PĐ) của dịch chiết Ý dĩ là n-hexan, chloroform, ethyl
acetat được đánh giá tác dụng ức chế sự hình thành tinh thể canxi oxalat ở nồng
độ 0 ,1 mg/ml trong cồn tuyệt đối để tìm phân đoạn có tác dụng ức chế mạnh
nhất.
Bảng 2. Tác dụng ức chế tinh ứiể canxi oxalat của các phân đoạn dịch chiết Ý dĩ

AOD

%ưc

PĐ chloroform

PĐ ethyl acetat

Chứng

PĐ n-hexan

(n=8)

(n=8)

(n=8)

(n=8)

0,34 ± 0,03

0,35 ± 0,04

0,29 ± 0,04

12,8%

10,3%

25,6%

0,39±0,04

* p < 0,05 so với chứng
Trong ba phân đoạn n-hexan, chloroform, ethyl acetat, chỉ có phân đoạn
ethyl acetat có tác dụng ức chế tinh thể canxi oxalat rõ rệt, với tỷ lệ ức chế tại
thời điểm 30 phút là 25,6%. Do đó, phân đoạn ethyl acetat được lựa chọn để phân
lập chất.
Phân lập chất từ phân đoạn ethyl acetat
Sau khi chiết xuất phân đoạn từ 1 kg dược liệu khô ban đầu thu được 2,7 g
cắn ethyl acetat, đem phân lập trên sắc ký cột silica gel (cỡ hạt 40 - 60 Ịj,m,
Merck) với hệ dung môi là n-hexan: ethyl acetat (1:1) thu được 3 phân đoạn kí
hiệu là EAl, EA2, EA3, trong đó, phân đoạn EAl cho thấy có một vết chất chính
trên sắc ký đồ. Tinh chế EAl bằng phương pháp kết tinh lại thu được 24 mg tinh

thể hình kim màu trắng, ký hiệu YOl.
Phổ khối (MS) của chất YOl có pic ion phân tử ở m/z 163 [M-H]'. Khối
lưọfng phân tử của YOl là 164 tưoTig ứng với công thức phân tử CgHgOa- Dựa trên
dữ liệu phổ IH-NMR, phổ 13C-NMR, phổ HMBC cho phép kết luận YOl là acid
(£)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-propenoic hay acid p-coumaric.
IH - NMR (500 MHz, MeOD) ô (ppm): 6,30 (IH, d, / = 16 Hz, H3); 6,82 (2H,
dd,
8,5 Hz; 2Hz, H3’, H5’); 7,45 (2H, dd, / = 8,5 Hz; 2Hz, m \ H 6 ’), 7,61
(IH, d, J = 16 Hz, H2). 13C - NMR (125 MHz, MeOD) ỗ (ppm): 115,6 (C2);
116,8 (C3’, C5’); 127,2 (cr), 131,1 (C2 ’, C 6 ’); 146,7 (C3); 161,1 (C4’), 171,0
(Cl).

Hình 4. Công thức cấu tạo của acid (£)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-propenoic
Đánh giá tác dụng ức chế tinh thể canxi oxalat in vitro của acidp-coumaric


Acid p-coumaric pha trong cồn tuyệt đối ở các nồng độ từ 0 , 2 - 1 0 mM
được đánh giá tác dụng ức chế hình thành tinh thể canxi oxalat in vỉtro trên đĩa
96 giếng. Kết quả được thể hiện ở hình 3.5.
-> IC 5 0 = 2,35 (1,47 - 3,10) mM
- > I C 5 o= 9 , 6 1

(8,29-11,16) mM

►-acid p-coiixiimic

Hình 5, Tác dụng ức chế hình tinh thể canxi oxalat của acid p-coumaric và naừi citrat
ở nồng độ thấp (<0,5 mM), acid p-coumaric không thể hiện tác dụng ức
chế hình thành tinh thể canxi oxalat tạo thành, ở nồng độ cao hơn (> ImM), acid
p-coumaric thể hiện tác dụng ức chế sự hình thành tinh thể rõ rệt, tác dụng ức chế

này tăng dần theo nồng độ. Phần trăm ức chế tối đa đạt được là 72,0% ở nồng độ
10 mM. Tác dụng ức chế hình thành tinh thể canxi oxalat của acid p-coumaric
mạnh hơn chứng dương natri citrat, với giá trị IC 50 là 2,35 mM (khoảng tin cậy
95%: 1,47 - 3,10) so với 9,61 mM (khoảng tin cậy 95%: 8,29 - 11,16) của natri
citrat.
Bàn luận
Canxi oxalat là thành phần phổ biến nhất của sỏi tiết niệu, chiếm khoảng
80% các trưòng họp sỏi tiết niệu nói chung. Quá trình hình thành sỏi canxi oxalat
trong cơ thể trải qua 5 giai đoạn chính, bao gồm: quá bão hòa nước tiểu, tạo nhân
tinh thể, sự lớn lên của các tinh thể, kết tập các tinh thể và gắn tinh thể vào tế bào
biểu mô ống thận [2], Trên cơ sở đó, chúng tôi đã áp dụng các mô hình in vitro
và ỉn vivo phù họfp để đánh giá tác dụng ức chế hình thành sỏi canxi oxalat của Ý
dĩ. Trên mô hình in vỉtro sử dụng đĩa 96 giếng, Ý dĩ đã thể hiện tác dụng ức chế
sự hình thành tinh thể canxi oxalat tăng dần theo nồng độ, đồng thời làm tăng số
lượng tinh thể COD, giảm số lưọng tinh thể COM. Điều này có thể giảm nguy cơ
lắng đọng sỏi tại thận do COM là dạng tinh thể dễ kết tập, dễ gắn với tế bào biểu
mô ống thận, do đó khó đào thải hơn tinh thể COD [1], Khi so sánh với một số
nghiên cứu khác trên thế giới [4, 7], phương pháp in vitro được áp dụng trong
nghiên cứu này có hạn chế là chưa đánh giá được tác dụng của Ý dĩ lên từng giai
đoạn của quá trình hình thành tinh thể canxi oxalat trong nước tiểu. Tuy nhiên,
kết quả in vitro trong nghiên cứu này chỉ mang tính sàng lọc, tạo cơ sở để tiếp tục
nghiên cứu tác dụng của thuốc trên động vật thực nghiệm. Gây sỏi trên chuột


cống trắng bằng ethylen glycol là mô hình đã được áp dụng rộng rãi trên thế giới
để đánh giá tác dụng của các thuốc điều trị sỏi tiết niệu [6 ]. ở Việt Nam, đây là
lần đầu tiên mô hình này được triển khai và áp dụng. Dịch chiết Ý dĩ ở mức liều
2,52 g/kg đã thể hiện tác dụng ức chế sự hình thành sỏi tại thận sau 28 ngày điều
trị tưcmg tự chứng dương natri citrat. Tuy nhiên, trong khi natri citrat làm tăng
đáng kể thể tích và pH nước tiểu, Ý dĩ ở mức liều nghiên cứu không làm thay đổi

các thông số này khi so sánh với lô chứng bệnh (số liệu không thể hiện trong
phần kết quả). Điều này cho thấy tác dụng ức chế hình thành sỏi tiết niệu của Ý
dĩ ở liều nghiên cứu không liên quan đến tác dụng lợi tiểu đã được đề cập trong y
văn [2], Như vậy, tác dụng của Ý dĩ có thể theo một số cơ chế sau; ức chế các
giai đoạn tạo nhân, lớn lên và kết tập tinh thể; thay đổi dạng tinh thể hoặc ức chế
sự gắn của tinh thể vào tế bào biểu mô ống thận. Từ phân đoạn ethyl acetat là
phân đoạn có tác dụng ức chế hình thành tinh thể canxi oxalat mạnh nhất, đã
phân lập được acid p-coumaric, một acid hữu cơ có mặt khá phổ biến trong thực
vật và cũng đã được phân lập từ hạt Ý dĩ [2]. Một số nghiên cứu về tác dụng sinh
học của acid p-coumaric cho thấy chất này có tác dụng chống dị ứng, chống oxy
hóa, chống ung thư [5, 8 ] nhưng chưa được đánh giá tác dụng trên sỏi tiết niệu
trong các nghiên cứu đã công bố. Theo kết quả nghiên cứu này, acid p-coumaric
có tác dụng ức chế mạnh sự hình thành tinh thể canxi oxalat và tác dụng này phụ
thuộc nồng độ. Như vậy có thể sơ bộ kết luận acid p-coumaric là một thành phần
có tác dụng ức chế sự hình thành tinh thể canxi oxalat của thân Ý dĩ. Tuy nhiên,
đây mới chỉ là những nghiên cứu bước đầu, để phát triển Ý dĩ trở thành dược liệu
tiềm năng trong điều trị và dự phòng sỏi tiết niệu, cần cỏ phương pháp chuẩn hóa
dược liệu và đánh giá hiệu quả thông qua thử lâm sàng.
Kết luận
Dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ thể hiện tác dụng ức chế hình thành sỏi tiết
niệu cả in vitro và in vivo. In vitro, tác dụng của Ý dĩ tăng dần theo nồng độ với
tác dụng ức chế tối đa đạt 33,1% ở dịch chiết 1/1; in vivo, Ý dĩ đường uống mức
liều 2,52 g/kg làm giảm sự lắng đọng sỏi tại thận gây ra bởi ethylen glycol tương
tự chứng dưomg natri citrat. Đã phân lập được acid p-coumaric có tác dụng ức
chế hình thành tinh thể canxi oxalat in vitro phụ thuộc nồng độ với giá trị IC50 là
2,35 mM.


Tài liệu tham khảo
1. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học,

tr.844-846.
2. Chen H.J., et al.(2010), Mast cell dependent allergic responses are inhibited by
ethanolic extract of adlay testa, Journal o f Agricultural and Food Chemistry,
58(4), pp. 2596-2601.
3. Coe Fredric L., et al. Pathology and treatment of kidney stone, Medical
progress, vol 327, pp. 1141-1150.
4. Gohel
Wong s.p. (2006), Chinese herbal medicines and their efficacy
in treating renal stones, Urology Research, 34, pp. 365-372.
5. Jaganathan KS, et al. (2013), Events associated with apoptotic effect of pCoumaric acid in HCT-15 colon cancer cells, World Journal Gastroenterol
21, pp.7726-7734.
6. Karadi VR, et al (2006), Effect of Moringa oleífera Lam. root-wood on
ethylene glycol induced urolithiasis in rats, Journal o f Ethnopharmacology,
105, pp. 306-311.
7. M. Beghalia, et al. (2008), Inhibition of canxium oxalate monohydrate crystal
growth using Algerian medicinal plants, Journal o f medicinal plants
research, pp. 66-70.
8. Takahashi H., et al.(1999), Coumaroyl triterpenes from Casuarina
equisetifolia, Phytochemmistry, 51, pp. 543-550.