Nghiên cứu tạo và bước đầu đánh giá thời gian tuần hoàn trong máu của liposom doxorubicin gắn polyethylen glycol

Nghiên cứu tạo và bước đấu đánh giá
thời gian tuần hoàn trong máu của
iỉposom doxorubicin gắn
Ịjolyethylen glycol
B ù i Bá M ỉ n h \ N g u y ê n T h ị Lập^

^Học Viện Quân K, ^TrườngĐợi họcDượcHàNộỉ

SUMMARY
The present study demonstrated that a sterically stabilized liposomes, nanoscaled PEG conjugate o f DSPE modified doxorubicin
liposomes can be prepared by lipid film hydration method and pH gradient technique. The results from evaluation o f particle size,
morphology and physicochemical properties of desired products showed the obtained products were almost acceptably homogenous
and stableJhe average size o f the majority o f liposomes is around 135 nm and 124 nmfor liposomal doxorubicin without PEG and
liposomal doxorubicin conjugated PEG, respectively. The liposomal efficiency o f Dox loading was rather good, reached from 82 to
90%. Especially, the results showed some o f the benefits associated with the use o f PEG modified liposomes, such as increased blood
levels and enhanced circulation lifetime,

ĩừkhỏa: liposom doxorubicin, polyethylen glycol, thời gian tuân hoàn trong máu.
&ậ t vấn dế
Một trong những nhược điểm lớn nhất khi sửdụng
các chế phẩm liposom là nhanh chóng bị thải trừ khỏi
vòng tuần hoàn do sựtóm bắt của các tế bào thuộc hệ
thực bào đơn nhân (MPS). Gán các polyme thân nước,
đặc biệt là polỵethylen glycol (PEG) là một biện pháp
hiệu quả để khắc phục nhược điểm này. Sự tăng thời
gian tuẩn hoàn của liposom gán PEG mang lại nhiểu
lợi ích: giảm sự rò rỉ thuốc trong tuán hoàn, giảm các
tác dụng không mong muổn của thuốc, làm tăng cơ
hội thoát mạch vào khoảng gian bào của liposom,
tăng sự tích lũy của các thuốc chống ung thư tại khối
u và tăng hiệu quả điểu trị [2,4], Những năm gẩn đây,

nhiều nghiên cứu trong nước sử dụng liposom làm
chất mang doxorubicin (Dox) và đâ đạt được nhiều kết
quả đáng khích lệ. Tuy nhiên, hẩu hết các nghiên cứu
chỉ dừng lại ở việc chế tạo liposoni từ nguyên liệu là

phospholipid và cholesterol, chưa có nghiên cứu nào
sử dụng các dẫn chất polyme để làm tăng thời gian
tuẩn hoàn của liposom Dox. Do đó, chúng tôi tiến hành
nghiên cứu tạo liposom Dox gắn PEG và bước đẩu
đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm tới thời gian tuẩn
hoàn trong máu.
Nguyên liệu, thiết bị và phương pháp nghiên cứu
Nguyên liệu và thiết bị
Nguyên vật liệu
Phospholipid lòng đỏ trứng đã hydrogen hóa
[1], Cholesterol (Merck, Đức), 1,2-dioctadecanoylsn-glycero-3-hosphoethanolamineamonipolyethy
lene glycol 2000 (DSPE-PEG^o^-NHj) cung cấp bởi
Laysanbio (Mỹ), doxorubicin được cung cấp bởi
Merck (Đức). Các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân
tích.


Thiết bị
Màng polycarbonat kích thước lỗ lọc 0,4 |jm và
0,08 um (Sigma-Aidrich, Mỹ). Túi thẩm tích MVVCO:
12000 • 14000 Da (Spectrum Labs - Mỹ). Máy
Emulsiílex - C5 (Canada). Máy đo quang phổ huỳnh
quang Shimadzu RF1501 (Nhật Bản). Máy cất quay
BUCHI R-210 (Thụy Sỹ). Kính hiển vi điện tử truyền
qua (TEM) JEOL 1010 (Nhật Bản).

Nơi nghiên cứu
- Phương pháp sửdụng thiết bị đẩy, ép qua màng
được tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học, Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Phương pháp quang phổ huỳnh quang sửdụng
máy Shimadzu RF1501 (Nhật Bản) được tiến hành tại
Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc
gia Hà Nội.
- Chụp và phân tích hình ảnh TEM được tiến hành
tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
- Các nghiên cứu khác được tiến hành tại Bộ môn Hóa
sinh, Bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội,

Phưtfng pháp nghiện cứu
Tạo liposom doxorubicin gắn polyethỵlen glycol
Tạo các tiểu phân liposom Dox gần PEG theo
phương pháp của Li, et. al., [8] được cải tiến, rnô tả
tóm tắt như sau: phospholipid trứng đã hydro hóa,
cholesterol và DSPE PEGj^^g-NH^ (tỷ lẹ mol 1,85:1:0,15
tương ứng) được hòa tan vào 15 ml cloroform, cất
quay chân không ở nhiệt độ 50°c Hỵdrat hóa màng
mỏng thu được bằng dung dịch đệm citrat 300 mM,
pH 4 ở 50°c trong 2 giờ. Hỗn dịch liposorn rhu được
đẩy qua màng polycarbonat kích thước lỗ 0,40 i-im
8 lẩn và 0,08 |.im 10 lần bằng thiết bị Emulsiflex-C5
(Canada). Dox được đưa vào liposom bằng phương
pháp chênh lệch pH, Liposom Dox (không gắn PEG)
đtíợc tạo thành bằng phương pháp tLíơng tự, với
nguyên liệu ban đẩu là phospholipid trứng đã hydro
hóa và cholesterol (tỷ lệ mol 2:1 tương ứng).

Đánh giá Uposom tạo thành
Kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân
và thế zetơ: Xác định bằng thiết bị Zetasizer ZS90
(Anh) sau khi pha loãng hỗn dịch 200 lẩn bằng dung
dịch NaCI 0,9% đã lọc qua màng lọc 0,2 |jni.

Hình thái của lìposom tạo thành: Chụp mẫu
liposom bằng kính hiển vi điện tửtruỵển qua (TEM).
Đưa mẫu sau khi xử lý lên lưới đổng có phủ màng
collodion-carhon. Cố định mẫu, rửa mẫu và nhuộm
bằng dung dịch Iirani acetat 1%. Quan sát dưới kính
hiển vi điện tử truyển qua JEOL với điện áp 80 kv.
Hiệu suâtlìposom hóa Dox: Định lượng Dox trong
hệ liposom trước và sau khi thẩm tích loại Dox tự do
(không được liposom hóa). Hiệu suất liposom hóa
được xác định theo công thức: H (%) Cs/ Ct X ] 00%
(C,và c lẩn lượt ià nồng độ doxorubicin toàn phần
trước và sau khi thẩm tích loại Dox tự do).
Định lượng Dox toàn phân tronq hệ liposom: Lấy
125 mI dịch liposom, pha loãng với dung dịch NaCI
0,9% thành 1 ml. Thêm vào 9 ml dung dịch ĩriton X •
100 1%, ủ hỗn hợp ở 60°c trong 1 giờ, Định lượng Dox
bằng phương pháp quang phổ hấp thụ khả kiến ở
\ = 480 nrn. Mẫu trắng là dung dịch gồm 1 ml dung
dịch NaCl 0,9% và 9 ml dung dịch Triton X - 100 1%.
Nghiên cứu ảnh hưởng của sự qắn PEG tên bể
một liposom tới thời gian tuồn hoàn trong máu của
liposom doxmuhkin
Tiến hành theo phương pháp của Gabizon, et.
al., [2] có cải tiến và đã được thẩm định. Chuột nhất

trắng dòng Swiss, BALC 57/6, giống đực, có khối
lượng từ 22 - 27 g do Viện Vệ sinh Dịch tễTrung ương
cung cấp. ctiia ngẫu nhiên thành 4 nhótn, mỗi nhóm
3 con: 3 nhóm đẩu được tiêm tĩnh mạch đuôi tương
ứng với liểu 10 mg Dox/kg trong thể tích tiêm 10
ml/kg: nhóm 1 (tiêm Dox dạnq tự do đâ được pha
trong nước muối sinh lý), nhóm 2 (tiêm liposorn Dox
không gắn PEG), nhóm 3 (tiêm liposom Dox gắn
PEG) và nhóm 4 là nhóm trắng (tiêm lOml/kg nước
muối sinh lý). Sau khi tiêm, tại các khoảng thời ginn
5 phút (0,083 giờ), 4 giờ, 24 giờ, máu chuột được lấy
từ hốc mất vào ống chứa heparin, ly tâm ở 4°c, 3000
vòng/phút trong 10 phút để lấy huyết tương. Hút
100 |jl huyết tương, thêm 2,4 ml isopropanol acid
hóa (HCI 0,075 N trong isopropanol 90% (tt/tt)). Sau
24 giờ, li tâm ở 4000 vòng/phút trong 20 phút, thu
lấy phẩn dịch rổi định lượng Dox toàn phẩn trong
huyết tương được bằng phươnq pháp quang phổ
huỳnh quang ở bước sóng kích thích 471 nm, bước
sóng phát xạ 554 nm.Từ mật độ huỳnh quang thu
được, nồng độ tương đương Dox sẽ được xác định


dựa vào đường chuẩn xây dựng từ các dung dịch
Dox đã biết trước nồng độ.
Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý bằng phẩn mểm Microsoft
office Excel 2007 để tính giá trị trung bình và độ lệch
chuẩn SD. Sử dụng kiểm định t-test để đánh giá sự
khác nhau giữa các kết quả. Sự khác biệt là có ý nghĩa

thống kê khi p < 0,05.

Bông 2 ThẽMũ và độ di chuyển củo cácmâu liposom
Thế Zeta (mV)

0 Ộdi chuyển ([jm.cm/v.s)

Liposom

-32,6

-2,553

PEG-liposom

- 10,1

-0,7921

Liposom Dox

-40,1

-3,140

PEG-liposom Dox

- 8,88

-0,6963

Mẫu liposom
Trước khỉ tải Dox

Sau khi tải Dox

Kết quả nghiên cứu
Đành giá đặc tính của các tiểu phân liposom
Dox tạo thành
Kích thước tiểu phân trung bình và phân bố kích
thước tiểu phân của liposom Dox (không gắn PEG)
và PEG-liposom Dox (gắn PEG) tạo thành trước và
sau khi tải Dox được trình bày trong bảng 1.

Kết quả chụp TEM (hình 1) cho thấy liposom tạo
ra có hình tròn, kích thước tương đối đổng nhất.

Bàng ĩ. Kích thước tiểuphân và chìsỗđaplìân tán (PD!) của cácmâu liposom
Mẫu liposom

PDI

KTTB theo đường kính(nm)

Liposom

0,074

108,9

PEG-liposom

0,081

100,6

Liposom Dox

0,110

135,8

PEG-liposom Dox

0,179

124,9

Trước khi tải Dox

Sdu khi tải Dox

KĨĨB: Kích thước trung bình

Kết quả bảng 1 cho thấy các liposom trước khi
tải Dox không có sự khác biệt đáng kể về kích thước
lẫn chỉ số PDI giữa liposom gắn và không gắn PEG.
Đa số các liposom tạo thành có kích thước khoảng
100 nm. Sau quá trình tải Dox, kích thước trung bình
của 2 mẫu liposom tăng lên và đạt kích thước tiểu

phân trung bình khoảng 130 nm. Chỉ số đa phân tán
(PDI) < 0,3 cho thấy hệ liposom tạo thành tương đối
đồng nhất.
Kết quả thế Zeta thu được trong bảng 2 của các
liposom không gắn PEG (trước và sau tải Dox) có giá
trị tuyệt đối > 30 mV cho thấy khả năng ổn định của
hệ là khá cao. Thế Zeta của liposom gắn PEG thấp,
tương ứng với -10,1 mV (trước khi tải thuốc) và - 8,88
mV (sau khi tải Dox). So với liposom không gắn PEG,
liposom gắn PEG di chuyển chậm hơn.

Print Nag: 24I00X •
4:41:41 |Í04/27^U
TKHMođà: iBaging

nm

■■

H V « Ì O .e k V

m r#€t UềỆĩ tlOOOx

Hinh 1. Hình ảnh chụp TEMCỈIQlìposom doxoíubicin gân PE6ở độphóng đọi 12.000 lán

Tiếp theo, bảng 3 thể hiện hiệu suất liposom hóa
Dox của 2 dạng chế phẩm gắn và không gắn PEG.
Kết quả cho thấy hiệu suất liposom hóa của PEG liposom Dox thu được là tương đối cao (82,54%),
không khác nhiều so với dạng liposom Dox không
gắnPEG (89,60%).

Bỏng ì Hiệu suấtlìposoiĩì hóo CỦQmẫu cácmẫu liposoíĩì
Hiêu suất
(%)

Trước loại
Doxtựdo

Sau loại
Doxtựdo

Nồng độ (mg/
ml)

Nồng độ
(mg/mí)

Liposom Dox

1,894

1,697

89,60

PEG-liposom Dox

1,901

1,569

82,54

Mẫu liposom


Ảnh hưởng của gắn PEG lên bề mặt liposom tới
thời gian tuần hoàn của liposom trong máu
Nồng độ tương đương Dox trong huyết tương
chuột nhắt tại các thời điểm 5 phút, 4 giờ và 24 giờ
sau tiêm tĩnh mạch đuôi chuột được trình bày trong
bảng 4.
Bảng 4. Nông độ tương đương Doxtrong huyét tương chuộtnhát tại cácthời điếíii 5phứt
(0,083 giờ), 4 giờ, 24 giờsau khi tiêm tĩnh mạch đuôi.

Thời điểm
(giờ)

Nổng độ tương đương doxorubicin trung
bình ([ig/ml huyết tương) ± SD (n = 3)
Doxtựdo

Liposom
Dox

PEG-liposom Dox

0,083

13,79 ±1,33

133,73 ±
10,98

152,49 ±
14,06

4

5,09 ±1,98

64,24 ±

112,06 ±

5,42

8,41

24

-

8,64 ±

51,61 ±

0,56

3,51

p

p ,,< 0 ,0 5
p;:;p;;;>o;o5

p ^,< 0 ,0 5
p;;;p;;;P3.,<0,05

(-.Không pháthiện được)

Kết quả cho thấy nồng độ tương đương Dox của
dạng Dox tự do thấp hơn nhiểu so với dạng liposom
Dox (gắn và không gắn PEG), kể cả thời điểm đẩu
tiên (5 phút). Liposom gắn PEG cho nổng độ tương
đương Dox cao nhất ở cả 3 thời điểm khảo sát. Nồng
độ tương đương Dox trong huyết tương giữa 2 chế
phẩm liposom khác biệt rõ rệt theo thời gian: tại thời
điểm 4 giờ, dạng liposom Dox gắn PEG cao hơn gấp
2 lẩn so với dạng liposom không gắn PEG và đến 24
giờ, sự khác biệt này lên tới gẩn 6 lắn.
Bàn luận
Về đặc tính cùa các tiểu phân liposom Dox tạo
thành
Kích thước tiểu phân là một yếu tố quan trọng,
không chỉ ảnh hưởng tới thời gian tuẩn hoàn của
liposom trong máu mà còn ảnh hưởng tới khả năng
tích lũy của liposom tại khối u. Nghiên cứu trước cho

thấy liposom gắn PEG có kích thước 100 - 200 nm có
thời gian tuẩn hoàn dài nhất, trong khi các liposom
có kích thước > 200 nm hoặc < 70 nm nhanh chóng
bị thải trừ [3]. Do đó, nghiên cứu này lựa chọn màng

đẩy cuối cùng với kích thước lỗ lọc là 80 nm để tạo
ra các liposom có kích thước khoảng 100 nm. PEGLiposom Dox tạo thành có kích thước trung bình
124,9 nm của sản phẩm thu được trong nghiên cứu
này (bảng 1) là tương đối phù hợp để đạt được hiệu
quả tuần hoàn kéo dài.
Kết quả ở bảng 2 cho thấy, so với liposom không
gắn PEG, liposom gắn PEG di chuyển chậm hơn
và giá trị tuyệt đối của thế Zeta do đó cũng giảm.
Nguyên nhân của sự giảm thế Zeta có thể do sự có
mặt của chuỗi PEGtrên bể mặt liposom đã làm giảm
sự di chuyển của liposom trong điện trường và làm
giảm thế Zeta [4]. Ngoài ra, thế Zeta còn giảm do
gắn các phân tử polyme lên bể mặt liposom làm di
chuyển mặt phẳng trượt ra xa bề mặt liposom [5].
Tuy nhiên, sự giảm thế Zeta không làm giảm điện
tích trên bể mặt của liposom [6]. Do đó, thê' Zeta
trong trường hợp của liposom gắn PEG không giúp
dự đoán được sự ổn định của hệ. Mặt khác, kết hợp
với kểt quả chụp TEM (hình 1) cho thấy liposom tạo
ra tương đối đổng nhất và kích thước phù hợp với
kết quả đo kích thước tiểu phân và phân bố kích
thước tiểu phân.
Hiệu suất liposom hóa doxorubicin đạt được
(bảng 3) chỉ đạt hơn 80%. Điều này có thể khi thẩm
tách loại thuốc tự do trong khoảng thời gian dài (24

giờ) ở nhiệt độ phòng làm cho thuốc trong liposom
bị rò rỉ, dẫn đến giảm hiệu suất. Để khắc phục có thể
sử dụng thiết bị lọc tiếp tuyến hoặc phương pháp
sắc ký lọc gel để làm giảm thời gian tiếp xúc với nhiệt
độ cao của liposom.
vể ảnh hường PEG bề mặt liposom tới thời gian
tuần hoàn của Hposom
Khảo sát nổng độ Dox trong huyết tương cho
thấy nổng độ tương đương Dox của dạng Dox tự do
thấp hơn nhiều so với Dox trong các dạng liposom
ngay từthời điểm đáu (5 phút). Điều này phản ánh sự
thay đổi vể đặc tính phân bố của thuốc khi sử dụng
liposom làm hệ mang thuốc: Dox tự do sau khi tiêm
tĩnh mạch phân bố nhanh chóng vào các tổ chức,
dẫn đến nổng độ Dox trong máu thấp, làm tăng độc
tính tại các mô bình thường. Mặt khác, liposom Dox
cho nổng độ tương đương Dox trong huyết tương
cao hơn một cách có ý nghĩa thống kê ở cả 3 thời
điểm khảo sát. Do đó, độc tính của Dox trên các mô


bình thường sẽ giảm đi khi sử dụng liposom làm hệ
mang thuốc.
Mặc dù chưa tách riêng được liposom trong huyết
tương để định lượng nổng độ thuốc trong liposom
nhưng sự phân bố và chuyển hóa nhanh chóng của
Dox tự do cũng là cơ sở cho thấy phẩn lớn Dox trong
huyết tương tổn tại ở dạng trong liposom. Kết quả
này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đó [2,7].
Hơn nữa, trong nghiên cứu của Gabizon và cộng sự

(1994) đã không phát hiện được lượng đáng kể nào
các dẫn chất chuyển hóa của Dox trong trong huyết
tướng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
[2]. Do vậy, nồng độ tương đương Dox trong huyết
tương của nhóm chuột tiêm liposom doxorubicin
gắn PEG cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm
chuột tiêm liposom doxorubicin không gắn PEG tại

các thời điểm xa (4 giờ, 24 giờ) phẩn nào chứng minh
khả năng của PEG kéo dài thời gian tuắn hoàn trong
máu của liposom.
Kết luận
Nghiên cứu đã tạo được liposom Dox gắn PEG
tương đối đồng nhất, có kích thước trung bình
khoảng 130 nm và hiệu suất liposom hóa khoảng
82%. Thông qua việc khảo sát nổng độ doxorubicin
trong huyết tương sau khi tiêm tĩnh mạch đuôi
chuột, kết quả nghiên cứu cho thấy gắn PEG lên
bể mặt liposom có khả năng kéo dài thời gian tuẩn
hoàn của liposom trong máu, làm tăng nồng độ Dox
trong huyết tương lên khoảng 6 lẩn sau 24 giờ tiêm
tĩnh mạch.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.Nguyễn Thị Lập và cs (2010), Nghiên cứu chiết xuất phospholipid từ lòng đỏ trứng bằng phương pháp sử dụng co^ ở trạng thái siêu
tới hạn làm nguyên liệu chế tạo liposom, Tợp chí Dược học, 487, tr. 35-37.
2.Alberto A. Gabizon (1992), Selective tumor localization and improved therapeutic Index of anthracyclines encapsulated in long-circulating liposomes, Cancer Research, 52(4), pp. 891-896.
B.David c Litzinger, et al. (1994), Effect of liposome size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic poly (ethylene
glycol)-containing liposomes, Biochimica etBiophysica Acta (BBA)-Biomembrones, 1190(1), pp. 99-107.
4.Federico Perche, Vladimir p Torchilin (2013), Recent trends in multifunctional liposomal nanocarriers for enhanced tumor targeting,

Journal of Drug De//Very.8(9):1509-1528.
5.KostasKostarelos, Andrew D Miller (2005), What role can chemistry play in cationic liposome-based gene therapy research today?,

Advances in genetics, 53, pp. 69-118.
6.MC

Woodle, et al. (1992), Sterically stabilized liposomes. Reduction in electrophoretic mobility but not electrostatic surface potential

Biophysicaljournal, 61 (4), pp. 902-910.
7.Ruey-Long Hong, et al. (1999), Direct comparison of liposomal doxorubicin with or without polyethylene glycol coating in C-26 tumorbearing mice is surface coating with polyethylene glycol beneficial?, Clinical cancer research, 5(11), pp. 3645-3652.
8.

XueMing Li, et al. (2009), Targeted delivery of doxorubicin using stealth liposomes modified with transferrin, internationaljournai of

pharmaceutics, 373(1), pp. 116-123.