Bước đầu nghiên cứu tổng hợp l dopa từ l tyrosin

Bước đẩu nghiên cứu tổng hợp L-dopa
từ L-tyrosin
Phạm Thị Hiền, Nguyễn Đình Luyện, Thái Nguyễn Hùng Thu
Trường Đại học Dược Hà Hội
SUM M ARY
L-d o p a (LD) is a k ey d ru g in th e tre a tm e n t o f P a rk in so n 's d isease. LD w a s o b ta in e d via a fo u r-step p a th w a y : (i) E sté rifica tio n o f
L-tyrosin w ith m e th a n o l to p ro d u c e L-tyrosin m eth y l e ste r (2); (ii) A cy la tio n o f 2 in p yrid in g a v e 0,N -diơ cetyl-L-tyro sin m eth y l ester
(3); (Hi) A rra n g e m e n t rea ctio n o f 3, ca ta ly sts A lC lj to p ro d u c e L-ß-(3-acetyl-4-hydroxyphenyl)-N -acetylalanin (4); (iv) O xida tio n
a n d h y d ro ly sis 4 a ffo rd e d L-d o p a . The stru c tu re o f th e p ro d u c ts a n d in term ed ia tes w a s d e m o n stra te d b y th e m e th o d o f in fra red
sp e ctro sco p y, m a ss sp e c tro m e try a n d p ro to n n u cle a r m a g n e tic re so n a n c e sp e ctro sco p y. S o m e co n d itio n s in flu e n cin g th e y ie ld o f the
p ro c e ss w ere in vestig a te d .

Từ khóa: L-d op a, lev o d o p a , 3 ,4-d ihydro xyp hen yl-L-a la n in , L-tyrosine, P arkinso n.

đây là các kết quả tổng hợp và xác định cấu trúc LD.

Đặt vấn đề

Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Parkinson là bệnh lý thường gặp ở người già trên
60 tuổi. Tỷ lệ mắc bệnh gia tăng theo sự tăng của

Nguyên liệu: L-tyrosin được tách ra từ dịch thủy

tuổi thọ trung bình trên thế giới. L-dopa (LD) là tiến
thuốc chuyển hóa của dopamin, thay thế dopamin

phân các nguổn keratin khác nhau (nguyên liệu đạt

trong điểu trị các hội chứng suy tháp ở bệnh nhân bị

chuẩn nguyên liệu theo tiêu chuẩn Dược điển Anh

Parkinson nên LD được xem là thuốc chủ chốt trong

2007).

điểu trị bệnh Parkinson. ưu điểm của L-dopa là bổ
sung dopamin kịp thời và đúng cơ chế bệnh sinh. Do
vậy nhu cẩu sử dụng LD ngày càng cao. Tuy nhiên
đến nay chưa thấy có cơ sở nào nghiên cứu tổng hợp

Hóa chất: Aceton, HCI, H^so^, ethanol tuyệt
đối, ether dáu hỏa, ethyl acetat, methanol, NaOH,
ninhydrin, pyridin (tinh khiết hóa học - Trung Quốc);

dược chất này trong nước.
Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu tổng hợp

anhydrid acetic, hydrogen peroxyd, natri carbonat
khan, nhôm clorid khan, nitrobenzen (for synthesis
- Merck - Đức); giấy chỉ thị vạn năng, nước cất (tiêu

sừng...). Nguồn keratin này rất sẵn có ở Việt Nam và

chuẩn cơ sở - Việt Nam).
Phương pháp nghiên cứu:
Tổng hợp L-dopa từ L-tyrosin thông qua bốn

là chê' phẩm của các ngành công nghiệp khác. Sau

giai đoạn như sơ đồ sau [5], [1 ], [2]:

LD từ L-tyrosin (là sản phẩm thu được từ quá trình
thủy phân các nguồn keratin khác nhau: tóc, móng,

COOH
MeOH/ H2SO4

COOMe
Ac20 /pyridjn

NH2

HO
(1)

70-80°C/12h

HO'

^

10-40°c/4h AcO'
(3 )

AlCls/nitrobenzen
110-125“C/4-6h
COOH
HO'

NHAc

H202/Na0 H


ầ.
- Sử dụng các phương pháp hóa học, vật lý, hóa lý
để tách và tinh chế các chất trung gian và sản phẩm
tạo thành.

acetic vào hỗn hợp trên cho đến khi nguyên liệu 2
tan hết. Trong suốt quá trình phản ứng duy trì nhiệt
độ thích hợp, khuấy tiếp. Khi phản ứng kết thúc,

- Kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm và theo dõi
phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (bản mỏng Silicagel

thêm vào hỗn hợp phản ứng 100 ml ethyl acetat và
chiết loại pyridin bằng dung dịch H C I1M (3 lẩn, mỗi

dung môi khai triển n-butanol:acid acetic:
nước=9:2:2,5), xác định hệ số dịch chuyển (Rf).

dịch sản phẩm, cất thu hổi dung môi đến khi thu

lần 70 ml). Cuối cùng rửa bằng nước, thu được dung

- Xác định cấu trúc các chất trung gian và sản

được cắn dạng siro. Thêm ethyl acetat và khuấy cho

phẩm bằng phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy
đo phổ hổng ngoại Perkin Elmer (Mỹ); phổ khối

tan hoàn toàn, sau đó thêm ether dẩu hỏa, khuấy

lượng (ESI-MS) được ghi trên máy khối phổ Agilent

thu được kết tủa. Lọc, sấy thu được 6,32 g tủa thô 3.
Hiệu suất phản ứng 75,5%.

6310 lon Trap (Đức), LC-MSD-Trap-SL (Đức), và máy

Để tìm được các điểu kiện tốt nhất cho phản ứng

đo phổ khối lượng phân giải cao FT-ICR-MS-Varian

tổng hợp 0,N-diacetyl-L-tyrosin methyl ester với

910MS (Đức); phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
{'H-NMR) được ghi trên máy Brucker AV-500MHZ

hiệu suất cao nhất, tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh

(Mỹ).
- Xử lý kết quả, sổ liệu nghiên cứu bằng phẩn
mểm Excel.
Kết quả nghiên cứu

hưởng đến quy trình: Dung mòi thực hiện phản ứng
(pyridin, dd NaOH 30%, dd Na2C03
thời gian phản
ứng, nhiệt độ phản ứng và tỷ lệ mol các chất tham
gia phản ứng. Hiệu suất phản ứng tốt nhất (76,88%)
với dung môi phản ứng là pyridin; tỷ lệ mol ACjO:
ester 2 = 2,25:1; phản ứng ở nhiệt độ 25°c trong thời
gian 4 giờ.

Tổng hạp L-tỵrosin methyl ester (2)
Thực hiện phản ứng ester hóa giữa 15 g (0,083
mol) L-tyrosin (1) và 400 ml methanol, xúc tác HjSO^
đặc. Đun hổi lưu hỗn hợp trong 12 giờ. Theo dõi
phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng. Sau phản ứng, hỗn

Tủa thô 3 được kết tinh lại trong hỗn hợpethanol/
nước sôi ( 1 / 1 ).
Hợp chất 3 có t“ : 105 - 107“C;

= 0,88; IR (KBr,

em '): 3256 (-NH amid), 1745 (-C=0 ester), 1633

hợp phản ứng để nguội ở nhiệt độ phòng, cất thu

(-c=0 amid), 1558 (-C=C- thơm); ESI-MS (m/z): 301,6
([M+Na]+).

hổi dung môi. cắn thu được hòa tan trong nước,
làm lạnh và điều chỉnh pH về 8 - 9 bằng dung dịch

Tổng hỢp L-lĩ-(3-acetyl-4-hydroxypbenỵl)-Nacetylalanin (4)

Na^COj bão hòa, xuất hiện tủa. Lọc, thu được tủa thô
2. Khối lượng sản phẩm (m) thu được là 12,46 g. Hiệu
suất 77,1 %.

Cho vào bình cầu khô 3 g (10,75 mmol) nguyên
liệu 3 và 36 ml nitrobenzen. Khuấy cho tan hết, thêm

Tinh chế tủa thô 2 : Hòa tan trong dung dịch HO
IM , làm lạnh và điểu chỉnh pH vể 8 - 9 bằng dung
dịch Na^COj bão hòa, xuất hiện tủa. Lọc, rửa thu
được sản phẩm 2 .
Sản phẩm 2 có t“ : 134-ISÓ^C; Rf = 0,45; IR(KBr,
em ’); 3208 (-NH^, vùng 3100-3010 (-C-H thơm),
2833 (H3C-), 1731 (-c=0 ester).

3,6 g (26,96 mmol) AICI3 khan, hỗn hợp được đun hổi
lưu trong khoảng 4 giờ ở nhiệt độ 125- 130“C. Trong
quá trình đun có kiểm tra sản phẩm tạo thành bằng
sắc ký lớp mỏng.
Thử nghiệm phương pháp tinh chế sản phẩm 4
theo các phương pháp sau:
a,

Phương pháp của các tác giả L Bernardi và

cộng sự (1970) [1]: Sau khi phản ứng kết thúc làm

Tổng hợp 0,N-diacetyl-L-tỵrosin methyl ester

lạnh bình cầu và thêm nước. Thêm tiếp dần dẩn

Cho 18 ml pyridin vào bình cầu 2 cổ dung tích

tách nitrobenzen bằng cất kéo hơi nước. Nhôm

(3)

Na^CO^ khan vào hỗn dịch trên, khuấy. Sau đó

100 ml, làm mát bên ngoài bằng nước đá. Nghiến

hydroxyd dạng gel được lọc nóng và dạng đóng

nhỏ 5,85 g (30 mmol) 2 cho vào dung môi đả chuẩn

bánh được hấp thụ vào nước vài lẩn, rửa với HCI.

bị ở trên. Sau đó nhỏ từ từ 7,1 ml (75 mmol) anhydrid

Dịch lọc và nước rửa được chiết với ethyl acetat. cất


thu hổi dung môi dịch chiết ethyl acetat, để kết tinh

đặc (với tỷ lệ 2:1). Hỗn hợp phản ứng được đun hói

thu được 4. Phương pháp này khó loại nitrobenzen,

lưu ở 1 1 8°c trong vòng 2 giờ. cất loại bỏ bớt acid và
thêm 10 phẩn nước sôi. Dung dịch được thêm 0,1 g

khó lọc loại AKOH)^ dạng keo và không kết tinh

Na^SjOj và 1 g than hoạt để tẩy màu trong vòng 30
được sản phẩm.
b,
Tinh chế theo phương pháp của tác giả H. phút. Lọc loại bỏ than hoạt. Làm lạnh dịch lọc ở 0°c
Bretscheneider và cộng sự (1973) [5]: Hỗn hợp phản

và đưa về pH 5,5 bằng dung dịch NaOH 2N thu được

ứng được làm lạnh đến nhiệt độ phòng, thêm hỗn

LD. Tủa thô được lọc và rửa sạch với nước lạnh, sau
đó với aceton. Sản phẩm được sấy khô trong chân

hợp nước đá và acid HCI đặc. Lớp nitrobenzen được
tách ra. Pha nước được rửa sạch bằng ethyl acetat.

không.
Tinh chế tủa thô: Hòa tan tủa thô trong hỗn hợp

Cô đặc pha nước, để lạnh trong 12 giờ tủa rắn xuất
hiện. Lọc thu sản phẩm. Phương pháp này dễ loại

của nước và acid HCI32%, thêm 1 g than hoạt để tẩy

nitrobenzen và nhôm clorid hơn. Tuy nhiên, sản

màu, lọc nóng để loại than hoạt, thu lấy dịch lọc. Làm

phẩm 4 chưa tinh khiết. Không kết tinh được.
Cải tiến các phương pháp trên thu được phương

lạnh dịch lọc ở 5°c và đưa về pH 5,5 bằng dung dich

pháp kết tinh như sau; Chiết hỗn hợp sau phản ứng 2
lẩn bằng ethyl acetat. Thu lấy dịch chiết pha hữu cơ.
Chiết pha hữu cơ thu được hai lẩn bằng NaOH 2N.
Thu lấy dịch chiết pha nước. Loại nitrobenzen thừa
bằng ether dầu hỏa. Dịch chiết được làm lạnh về 5°c

NaOH 2N thu được tinh thể màu trắng. Lọc thu lấy
tinh thể và rửa sạch với nước lạnh, sau đó với aceton
rổi sấy khô trong chân không thu được 0,9 g sản
phẩm tinh khiết. Hiệu suất 80,6%.
Sản phẩm có f

: 275 - 276"C; R, = 0,45; IR (KBr,

và sau đó điểu chỉnh vế pH =1 bằng acid HCI đậc thu

em '): dải hấp thụ từ3600-3000 (-0H phenol và -NHj),
3076 (-CH thơm), 1730 (-C=0 acid), 1570 (-C-C-

được tủa. Sấy khô tủa thu được 1,25 g hợp chất 4.

thơm), 1254 (-C-0- phenol);

Hiệu suất 43,87%.
Hợp chất 4 có t° :1 4 6 -1 4 8 “C ;R = 0,61; IR (KBr,
em ’): 3355 (-NH amid), 1726 (-C=0 ester), 1641
(-c=0 amid), 1554 (-C=C- thơm); ESI-MS (m/z): 263,9

ESI-MS (m/z): 198 ([M+H]+); Công thức phân tử
dựkiến:C,H„NO^.
’ H-NMR (500MHz, DP+CF3CO OD) ô (ppm): 6,65
(1H, d (J=8,0), H-C3,); 6,57 (1H, d (J=1,5),

6,49

([M-H]-);
’ H-NMR (500MHz, DMSO) ô (ppm); 11,82 (1H,

(1H, dd (J=8,0; 1,5), H-C^,); 4,04 (1H, dd (J=7,0; 5,5),
H - g ; 3,00 ( 1 H, dd (J=14,5; 5,0),
2,87 (1H, dd

s, H-0); 8,19 (1H, d (J=8,0), H-N); 7,75 (1H, d (J=2,0),
H-C,,); 7,39 (1H, dd (J=8,0; 2,0), H-C^,); 6,87 (1H, d
(J=7,5), H-C^,); 4,39 (1H, m, H-C-COOH); 3,02 (1H, dd

(J= H 5 ; 11,5) H < 3).
Các giá trị ỗ (ppm) của D-dopa trên phổ ’H-NMR
lẩn lượt là 6,99 (d,J=8,0); 6,93 (s); 6,83 (d, J=8,0); 4,43

(J=13,5; 4,5), H.-Cp; 2,82 (1H, m, H < 3); 2,62 (3H, s,

H3C-C0 -Ar), 1,78 (3H, s, HjC-CO-NH).
Tổng hợp L-dopa (LD)
Hòa tan nguyên liệu 1,5 g (5,56 mmol) 4 trong 13

(dd, J=7,2; 5,6); 3,32 (dd, J=14,4; 5,6) và 3,20 (dd,
J=14,4; 7,2) [3]. Từ các dữ liệu của phổ IR, phổ khối
lượng và phổ proton cùng với các giá trị tài liệu tham
khảo cho phép để xuất hợp chất LD là acid (S)-2-

ml dung dịch NaOH 1N. Thêm từ từ 4 ml dung dịch

amino-3-(3,4-dihydroxyphenỵl) propanoic.

7,1%, phản ứng được duy trì ở nhiệt độ phòng
trong vòng 24 giờ. Hỗn hợp phản ứng được acid hóa

Bàn luận

bằng 2,16 ml acid HC11N, sau đó được cất đến kiệt.
Chất rắn được hoà tan với aceton nóng, phần muối

-

Về phản ứng tạo diacyl 3 từL-tyrosin methyl ester

vô cơ không tan được lọc qua phễu lọc thủy tinh.

(2): Nhiệt độ phản ứng và tỷ lệ mol các chất tham gia

Dịch lọc được cất đến kiệt một lần nữa thu được hợp

phản ứng ảnh hưởng nhiểu đến hiệu suất phản ứng:

chất trung gian 5.

Nhiệt độ phản ứng phù hợp nhất khoảng 25°c.

Khảo sát lựa chọn tác nhân thủy phân amid 5

Có thể là do ở nhiệt độ thấp hơn nhưo - 5°c chỉ xảy ra

chọn được quy trình như sau: Sản phẩm trung gian 5

phản ứng N-acyl hóa do khả năng phản ứng acyl của

được hòa tan trong hỗn hợp acid acetic băng và HCI

nhóm -OH phenol yếu hơn ở nhiệt độ thấp. Khi nâng


dẩn nhiệt độ thì khả năng phản ứng acỵl của nhóm
-OH phenol cũng tăng lên và xảy ra đổng thời phản
ứng 0-acyl hóa và N-acyl hóa.
Tỷ lệ mol anhydrid acetic: L-tyrosin methyl ester
= 2,25:1 thì hiệu suất phản ứng là lớn nhất. Nguyên
nhân có thể là do phản ứng diacyl nên tỷ lệ mol tối
thiểu là 2:1, khi tăng tỷ lệ mol lên 2,25:1 thì hiệu suất
tăng lên nhưng nếu tăng thêm nữa thì có thể xảy ra
phản ứng triaq^l tạo sản phẩm phụ làm giảm hiệu
suất.

-

Vê phản ứng chuyển vị Fries

nhôm. Việc loại phức hợp này ảnh hưởng lớn đến sự
kết tinh của sản phẩm. Chỉ cán lẫn lượng nhỏ nhôm
thì sản phẩm không kết tinh được. Dựa trên đặc tính
này, chúng tôi đã thay đổi phương pháp kết tinh để
loại hết lượng nhôm còn dư lẫn trong sản phẩm.
Về phản ứng thủy phân từ 4 đến LD: khi sử dụng
tác nhân là HBr 48% thì phản ứng xảy ra mãnh liệt,
gây ra khó khăn khi tinh chế sản phẩm. Vì vậy chúng
tôi đã tiến hành thay thế HBr bằng hỗn hợp add HCl
đặc: acid acetic băng (tỷ lệ 1 :2). Kết quả cho thấy
phản ứng tốt, hiệu suất cao và sản phẩm dễ tinh chế.

AlClj là một acid Lewis có vai trò xúc tác cho
phản ứng. Một trong những điểu kiện để acid Lewis

Kết luận

phát huy tác dụng là phản ứng phải thực hiện dưới
điểu kiện khan nước. Sự hiện diện của một lượng
nhỏ nước làm ngưng phản ứng do acid Lewis sẽ tác

Đâ tổng hợp được L-dopa từ L-tỵrosin có nguồn
gốc trong nước (đạt tiêu chuẩn nguyên liệu làm

dụng ngay lập tức với nước và bị phân hủy. Vì vậy,

thuốc theo chuyên luận Dược điển Anh 2007). cấu

phản ứng cẩn được thực hiện trong môi trường khan
nước, dung môi sửdụng là nitrobenzen, xúc tác AICI3

trúc của sản phẩm và các chất trung gian được
chứng minh bằng cách đo phổ hổng ngoại, phổ khối

khan, hóa chất và thiết bị cẩn được làm khô trước khi
phản ứng [4],

yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng acyl hóa L-tyrosin

Trong phản ứng, có thể tạo ra phức hợp của

lượng và phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton. Các
methyl ester đã được khảo sát.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bernardi L , Golfredo 0 . (1973), Process fo r the preparation o fL-d op a., Th e Unites States Patent and Trad em ark O ffice,

u s 3717673.

2. Brady w . T. (1957), Th e synthesis o f 0-m ethyl-N -acetyl-L-tyrosine, California Institute o f Technology.
3. Chen F. Y., Uang B. J. (2001), "Enantioselective Synthesis o f (R)-3-(3,4-D ihydroxyphenyl) alanine from tert-Butyl Glycinate", The Jo u rn a l
o f O rganic Chem istry, 65(10), pp. 3650-3552.
4. Ogata Y. Tab uch i H. {1964), "A study on th e m echanism o f Fries reaction", Tetrahedron, 20(7), pp. 1661 -1566.
5. B retschneider H. Hohenlohe-O ehringen K., Kaiser A., W ölcke u ., (1973), "Eine neue Synthese des 3-[3,4-Dihydroxy-phenyl]-L-alanins
(L-DOPA) aus L-Tyrosin", Helvetica chim ica acta, 56(8), pp. 2857-2860.