Nghiên cứu tạo và bước đầu đánh giá thời gian tuần hoàn trong máu của liposom doxorubicin gắn polyethylen glycol

Nghiên cứu tạo và bước đẩu đánh giá
thời gian tuần hoàn trong máu của
liposom doxorubỉcin gắn
polyethylen glycol
Bùi Bá Minh', Nguyễn Thị Lập^
'Wớf Viện Quân Y, ^Trường Đại học Dược Hà Nội

SUMMARY
The present study demonstrated that a sterically stabilized liposomes, nanoscaled PEG conjugate ofDSPE modified doxorubicin
liposomes can be prepared by lipid film hydration method and pH gradient technique. The results from evaluation o f particle size,
morphology and physicochemical properties o f desired products showed the obtained products were almost acceptably homogenous
and stable.The average size o f the majority o f liposomes is around 135 nm and 124 nmfor liposomal doxorubicin without PEG and
liposomal doxorubicin conjugated PEG, respectively. The liposomal efficiency o f Dox loading was rather good, reached from 82 to
90%. Especially, the results showed some o f the benefits associated with the use o f PEG modified liposomes, such as increased blood
levels and enhanced circulation lifetime.
Từ khóa: liposom doxorubicin, polyethylen glycol, thời gian tuần hoàn trong máu.

Đặt Vấn đề
Một trong những nhược điểm lớn nhất khi sử dụng
các chê' phẩm liposom là nhanh chóng bị thải trừ khỏi
vòng tuần hoàn do sự tóm bắt của các tế bào thuộc hệ
thực bào đơn nhân (MPS). Gắn các polyme thân nước,

phospholipid và cholesterol, chưa có nghiên cứu nào
sử dụng các dẫn chất polyme để làm tăng thời gian
tuẩn hoàn của liposom Dox. Do đó, chúng tôi tiến hành
nghiên cứu tạo liposom Dox gắn PEG và bước đầu
đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm tới thời gian tuần
hoàn trong máu.

đặc biệt là polyethylen glycol (PEG) là một biện pháp

hiệu quả để khắc phục nhược điểm này. Sự tăng thời

Nguyên liệu, th iế t bị v à phương p h á p ng hiên cứu

gian tuẩn hoàn của liposom gắn PEG mang lại nhiều
lợi ích: giảm sự rò rỉ thuốc trong tuần hoàn, giảm các

Nguyên Uệu và thiết bị

tác dụng không mong muốn của thuốc, làm tăng cơ

Nguyên vật liệu

hội thoát mạch vào khoảng gian bào của liposom,

Phospholipid lòng đỏ trứng đã hỵdrogen hóa

tăng sự tích lũy của các thuốc chống ung thư tại khối

[1], Cholesterol (Merck, Đức), 1,2-dioctadecanoyl-

u và tăng hiệu quả điều trị [2,4]. Những năm gắn đây,

sn-glycero-3-hosphoethanolamineamonipolyethy

nhiểu nghiên cứu trong nước sử dụng liposom làm

lene glycol 2000 (DSPE-PEGj„^„-NHj cung cấp bởi

chất mang doxorubicin (Dox) và đã đạt được nhiều kết

Laysanbio (Mỹ), doxorubicin được cung cấp bởi

quả đáng khích lệ. Tuy nhiên, hẩu hết các nghiên cứu

Merck (Đức). Các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân
tích.

chỉ dừng lại ở việc chế tạo liposom từ nguyên liệu là


A
Thiết bị
Màng polycarbonat kích thước lỗ lọc 0,4 um và
0,08 |am (Sigma-Aldrich, Mỹ). Túi thẩm tích MWCO:
12000 - 14000 Da (Spectrum Labs - Mỹ). Máy

Hình thái của liposom tạo thành: Chụp mẫu
liposom bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM).
Đưa mẫu sau khi xử lý lên lưới đóng có phủ màng
collodion-carbon. cố định mẫu, rửa mẫu và nhuộm

Emulsiílex - C5 (Canada). Máy đo quang phổ huỳnh
quang Shimadzu RF1501 (Nhật Bản). Máy cất quay
BUCHI R-210 (Thụy Sỹ). Kính hiển vi điện tử truyền

bằng dung dịch urani acetat 1%. Quan sát dưới kính

qua (TEM) JEOL 1010 (Nhật Bản)

hệ liposom trước và sau khi thẩm tích loại Dox tự do
(không được liposom hóa). Hiệu suất liposom hóa

Nơi nghiên cứu
- Phương pháp sửdụng thiết bị đẩy, ép qua màng
được tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học, Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Phương pháp quang phổ huỳnh quang sửdụng
máy Shimadzu RF1501 (Nhật Bản) được tiến hành tại
Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc
gia Hà Nội.
- Chụp và phân tích hình ảnh TEM được tiến hành
tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
- Các nghiên cứu khác được tiến hành tại Bộ môn Hóa
sinh, Bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội.

hiển vi điện tửtruyển qua JEOL với điện áp 80 kv.
Hiệu suất Hposom hóa Dox; Định lượng Dox trong

được xác định theo công thức: H (%) = Cs/ Ct X 100%
(CịVà c lần lượt là nổng độ doxorubicin toàn phẩn
trước và sau khi thẩm tích loại Dox tự do).
Định lượng Dox toàn phân trong hệ liposom: Lấy
125 nl dịch liposom, pha loãng với dung dịch NaCI
0,9% thành 1 ml. Thêm vào 9 ml dung dịch Triton X 1001 %, ủ hỗn hợp ở 60°c trong 1 giờ. Định lượng Dox
bằng phương pháp quang phổ hấp thụ khả kiến ở
Ầ

:=480 nm. Mẫu trắng là dung dịch gồm 1 ml dung

dịch NaCI 0,9% và 9 ml dung dịch Triton X -1001 %.
Nghiên cứu ảnh hưởng của sự gắn PEG lên bề
mặt liposom tới thời gian tuần hoàn trong máu của
liposom doxorubicin

Phương pháp nghiên cứu
Tạo liposom doxorubicin gắn polyethylen glycol
Tạo các tiểu phân liposom Dox gắn PEG theo

Tiến hành theo phương pháp của Gabizon, et.
al., [2] có cải tiến và đã được thẩm định. Chuột nhắt
trắng dòng Swiss, BALC 57/6, giống đực, có khối
lượng từ 22 - 27 g do Viện Vệ sinh Dịch tễTrung ương

phương pháp của Li, et. al., [8] được cải tiến, mô tả
tóm tắt như sau: phospholipid trứng đã hydro hóa,

cung cấp. Chia ngẫu nhiên thành 4 nhóm, mỗi nhóm

cholesterol và DSPE-PEG^^i^/NH^Ítỷlệ mol 1,85:1:0,15
tương ứng) được hòa tan vào 15 ml cloroform, cất

ứng với liểu 10 mg Dox/kg trong thể tích tiêm 10
ml/kg: nhóm 1 (tiêm Dox dạng tự do đã được pha
trong nước muối sinh iý), nhóm 2 (tiêm liposom Dox

quay chân không ở nhiệt độ 50“C. Hydrat hóa màng
mỏng thu được bằng dung dịch đệm citrat 300 mM,
pH 4 ở 50°c trong 2 giờ. Hỗn dịch liposom thu được
đẩy qua màng polycarbonat kích thước lỗ 0,40 |am

8 lẩn và 0,08 |aim 10 lần bằng thiết bị Emulsiflex-C5

3 con: 3 nhóm đầu được tiêm tĩnh mạch đuôi tương

không gắn PEG), nhóm 3 (tiêm liposom Dox gắn
PEG) và nhóm 4 ià nhóm trắng (tiêm lOml/kg nước
muối sinh lý). Sau khi tiêm, tại các khoảng thời gian
5 phút (0,083 giờ), 4 giờ, 24 giờ, máu chuột được lấy

(Canada). Dox được đưa vào liposom bằng phương
pháp chênh lệch pH. Liposom Dox (không gắn PEG)

từ hốc mắt vào ống chứa heparin, ly tâm ở 4°c, 3000

được tạo thành bằng phương pháp tương tự, với

100 ụl huyết tương, thêm 2,4 ml isopropanol acid

vòng/phút trong 10 phút để lấy huyết tương. Hút

nguyên liệu ban đầu là phospholipid trứng đã hydro

hóa (HCI 0,075 N trong isopropanol 90% (tt/tt)). Sau

hóa và cholesterol (tỷ lệ mol 2:1 tương ứng).

24 giờ, li tâm ở 4000 vòng/phút .rong 20 phút, thu

Đánh giá liposom tạo thành

lấy phẩn dịch rồi định lượng Dox toàn phần trong

Kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân

huyết tương được bằng phương pháp quang phổ

và thế zeta: Xác định bằng thiết bị Zetasizer ZS90

huỳnh quang ở bước sóng kích thích 471 nm, bước

(Anh) sau khi pha loãng hỗn dịch 200 lẩn bằng dung

sóng phát xạ 554 nm.Từ mật độ huỳnh quang thu

dịch NaCI 0,9% đã lọc qua màng lọc 0,2 um.

được, nồng độ tương đương Dox sẽ được xác định


dựa vào đường chuẩn xây dựng từ các dung dịch
Dox đã biết trước nồng độ.

Bâng 2. ĩhéZeta và độ di chuyền cùa cóc mâu liposom
Mẫu liposom

Phương pháp xử lý số liệu

Thế Zeta (mV)

Độ di chuyển {|im.cm/v.s)

Trước khi tải Dox

Các số liệu được xử lý bằng phán mểm Microsoft
office Excel 2007 để tính giá trị trung bình và độ lệch

Liposom

-32,6

-2,553

chuẩn SD. Sử dụng kiểm định t-test để đánh giá sự

PEG-liposom

-10,1

-0,7921

khác nhau giữa các kết quả. Sự khác biệt là có ý nghĩa
thống kê khi p < 0,05.

Sau khi tải Dox
Liposom Dox

-40,1

-3,140

PE6-liposom Dox

-8,88

-0,6963

Kết quả nghiên cứu
Kết quả chụp TEM (hình 1) cho thấy liposom tạo
Đánh giá đặc tinh của các tiểu phân liposom
Dox tạo thành

ra có hình tròn, kích thước tương đỗi đổng nhất.

Kích thước tiểu phân trung bình và phân bố kích
thước tiểu phân của liposom Dox (không gắn PEG)
và PEG-liposom Dox (gắn PEG) tạo thành trước và
sau khi tải Dox được trình bày trong bảng 1.
Bảng l Kích thước tiếu phân và chì số đa phân tán (PDI) CÙQ các máu liỊxsom
Mẫu liposom

PDI

KTTB theo đường kính (nm)

Liposom

0,074

108,9

PEG-liposom

0,081

100,6

Trước khi tải Dox

Sau khi tải Dox
Liposom Dox

0,110

135,8

PEG-liposom Dox

0,179

124,9

KĨTB: Kích thước trung bình

N«3: 24100X 9
4:49:43 P04/27/U

Print

■■

KV*«O.OkV
Dir«cl Mag: laooox

TUMMode: laagỉng

Kết quả bảng 1 cho thấy các liposom trước khi
tải Dox không có sự khác biệt đáng kể về kích thước
lẫn chỉ số PDI giữa liposom gắn và không gắn PEG.

soo nm

Hình l Hmh ánh chụp TEM của liposom doxorubiơn gân PEŨ ở độ phóng đợi 12.000 lân

Tiếp theo, bảng 3 thể hiện hiệu suất liposom hóa
Dox của 2 dạng chế phẩm gắn và không gắn PEG.

Đa số các liposom tạo thành có kích thước khoảng
100 nm. Sau quá trình tải Dox, kích thước trung bình

Kết quả cho thấy hiệu suất liposom hóa của PEG -

của 2 mẫu liposom tăng lên và đạt kích thước tiểu

liposom Dox thu được là tương đối cao (82,54%),

phân trung bình khoảng 130 nm. Chỉ số đa phân tán

không khác nhiều so với dạng liposom Dox không

(PDI) < 0,3 cho thấy hệ liposom tạo thành tương đối

gắn PEG (89,60%).

đồng nhất.

Bàng 3. Hiệu suát liposom hóơ cũũ mâu các mâu liposom

Kết quả thế Zeta thu được trong bảng 2 của các

Trước loại
Doxtựdo

Sau loại
Doxtựdo

Nóng độ (mg/
ml)

Nóng độ
(mg/mí)

Liposom Dox

1,894

1,697

89,60

PEG-liposom Dox

1,901

1,569

82,54

liposom không gắn PEG (trước và sau tải Dox) có giá
trị tuyệt đối > 30 mV cho thấy khả năng ổn định của

Hiêu suất
(%)

Mẫu liposom

hệ là khá cao. Thế Zeta của liposom gắn PEG thấp,
tương ứng với -10,1 mV (trước khi tải thuốc) và - 8,88
mV (sau khi tải Dox). So với liposom không gắn PEG,
liposom gắn PEG di chuyển chậm hơn.


Ảnh hưởng của gắn PEG /én bề mặt liposom tới
thời gian tuồn hoàn của liposom trong máu
Nồng độ tương đương Dox trong huyết tương
chuột nhắt tại các thời điểm 5 phút, 4 giờ và 24 giờ

đẩy cuối cùng với kích thước lỗ lọc là 80 nm để tạo
ra các liposom có kích thước khoảng 100 nm. PEGLiposom Dox tạo thành có kích thước trung bình
124,9 nm của sản phẩm thu được trong nghiên cứu

sau tiêm tĩnh mạch đuôi chuột được trình bày trong

này (bảng 1 ) là tương đối phù hợp để đạt được hiệu

bảng 4.

quả tuẩn hoàn kéo dài.

Bàng 4. Hông độ tương đương Dox trong huỵết tương chuột nhát rọi các thời điểiTì 5phút
(0,083 giờ), 4 giờ, 24 giờsũu khi tiêm tĩnh m ứ ì đuôi.

Kết quả ở bảng 2 cho thấy, so với liposom không
gắn PEG, liposom gắn PEG di chuyển chậm hơn

Thời điểm
(giờ)

và giá trị tuỵêt đối của thế Zeta do đó cũng giảm.

Nóng độ tương đương doxorubicin trung
bình (ụg/ml huyết tương) ± SD (n = 3)

Nguyên nhân của sự giảm thế Zeta có thể do sự có
mặt của chuỗi PEG trên bể mặt liposom đã làm giảm

Doxtựdo

Liposom
Dox

PEG-liposom Dox

sự di chuyển của liposom trong điện trường và làm
giảm thế Zeta [4], Ngoài ra, thế Zeta còn giảm do

0,083

13,79 ±1,33

5,09 + 1,98

24

133,73 ±
10,98

152,491
14,06

p,,<0,05
p;,<0,05
p; >0,05

64,24 ±
5,42

112,06 ±
8,41

p,,<0,05
p;;<0,05
p ; <0,05

8,64 ±
0,56

51,61 ±
3,51

p„< 0,05

(-: Không phát hiện được)

gắn các phân tử polyme lên bề mặt liposom làm di
chuyển mặt phẳng trưcrt ra xa bể mặt liposom [5].
Tuy nhiên, sự giảm thế Zeta không làm giảm điện
tích trên bể mặt của liposom [6]. Do đó, thế Zeta
trong trường hợp của liposom gắn PEG không giúp
dự đoán được sự ổn định của hệ. Mặt khác, kết hợp
với kết quả chụp TEM (hình 1) cho thấy liposom tạo
ra tương đối đổng nhất và kích thước phù hợp với
kết quả đo kích thước tiểu phân và phân bố kích

dạng Dox tự do thấp hơn nhiều so với dạng liposom

thước tiểu phân.
Hiệu suất iiposom hóa doxorubicin đạt được

Dox (gắn và không gắn PEG), kể cả thời điểm đẩu

tiên (5 phút). Liposom gắn PEG cho nồng độ tương

(bảng 3) chỉ đạt hơn 80%. Điểu này có thể khi thẩm
tách loại thuốc tự do trong khoảng thời gian dài (24

đương Dox cao nhất ở cả 3 thời điểm khảo sát. Nồng
độ tương đương Dox trong huyết tương giữa 2 chê'

giờ) ở nhiệt độ phòng làm cho thuốc trong liposom

phẩm liposom khác biệt rõ rệt theo thời gian; tại thời
điểm 4 giờ, dạng liposom Dox gắn PEG cao hơn gấp
2 lẩn so với dạng liposom không gắn PEG và đến 24

sử dụng thiết bị lọc tiếp tuyến hoặc phương pháp
sắc ký lọc gel để làm giảm thời gian tiếp xúc với nhiệt
độ cao của liposom.
Về ảnh hưởng PEG bề mật liposom tới thời gian

Kết quả cho thấy nồng độ tương đương Dox của

giờ, sự khác biệt này lên tới gắn 6 lần.
Bàn luận

về đặc tính của các tiểu phân Hposom Dox tạo
thành
Kích thước tiểu phân là một yếu tố quan trọng,

bị rò rỉ, dẫn đến giảm hiệu suất. Để khắc phục có thể

tuần hoàn cùa liposom
Khảo sát nồng độ Dox trong huyết tương cho
thấy nổng độ tương đương Dox của dạng Dox tự do
thấp hơn nhiểu so với Dox trong các dạng liposom
ngay từ thời điểm đẩu (5 phút). Điểu này phản ánh sự
thay đổi vể đặc tính phân bố của thuốc khi sử dụng

không chỉ ảnh hưởng tới thời gian tuần hoàn của

liposom làm hệ mang thuốc: Dox tự do sau khi tiêm

liposom trong máu mà còn ảnh hưởng tới khả năng

tĩnh mạch phân bố nhanh chóng vào các tổ chức,

tích lũy của liposom tại khối u. Nghiên cứu trước cho

dẫn đến nồng độ Dox trong máu thấp, làm tăng độc

thấy liposom gắn PEG có kích thước 100 - 200 nm có

tính tại các mô bình thường. Mặt khác, liposom Dox

thời gian tuẩn hoàn dài nhất, trong khi các liposom

cho nổng độ tương đương Dox trong huyết tương

có kích thước > 200 nm hoặc < 70 nm nhanh chóng

cao hơn một cách có ý nghĩa thống kê ở cả 3 thời

bị thải trừ [3]. Do đó, nghiên cứu này lựa chọn màng

điểm khảo sát. Do đó, độc tính của Dox trên các mô


bình thường sẽ giảm đi khi sử dụng liposom làm hệ

các thời điểm xa (4 giờ, 24 giờ) phán nào chứng minh

mang thuốc.

khả năng của PEG kéo dài thời gian tuần hoàn trong
máu của liposom.

Mặc dù chưa tách riêng được liposom trong huyết
tương để định lượng nổng độ thuốc trong liposom
nhưng sự phân bố và chuyển hóa nhanh chóng của

Kết luận

Doxtựdocũng là cơ sở cho thấy phẩn lớn Dox trong
huyết tương tồn tại ở dạng trong liposom. Kết quả

Nghiên cứu đã tạo được liposom Dox gắn PEG

này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đó [2,7],

tương đối đồng nhất, có kích thước trung bình

Hơn nữa, trong nghiên cứu của Gabizon và cộng sự
(1994) đã không phát hiện được lượng đáng kể nào

khoảng 130 nm và hiệu suất liposom hóa khoảng
82%. Thông qua việc khảo sát nổng độ doxorubicin

các dẫn chất chuyển hóa của Dox trong trong huyết

trong huyết tương sau khi tiêm tĩnh mạch đuôi

tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
[2]. Do vậy, nồng độ tương đương Dox trong huyết

chuột, kết quả nghiên cứu cho thấy gắn PEG lên

tương của nhóm chuột tiêm liposom doxorubicin

bể mặt liposom có khả năng kéo dài thời gian tuần
hoàn của liposom trong máu, làm tăng nồng độ Dox

gắn PEG cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm
chuột tiêm liposom doxorubicin không gắn PEG tại

trong huyết tương lên khoảng 6 lẩn sau 24 giờ tiêm
tĩnh mạch.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.Nguyễn Thị Lập và c s (2010), Nghiên cứu chiết xuất phospholipid từ lòng đỏ trứng bằng phương pháp sử dụng co^ởtrạng thái siêu
tới hạn làm nguyên liệu chế tạo liposom, Tạp chí Dược học, 4S7,tr. 35-37.
2.Alberto A. Gabizon (1992), Selective tumor localization and improved therapeutic index of anthracyclines encapsulated in long-circu­

lating liposomes, Cancer Research, 52(4), pp. 891-896.
3.David

c Litzinger, et al. {1994), Effect of liposome size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic poly (ethylene

glycolj-containing liposomes, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 1190(1), pp. 99-107.
4.Federico Perche, Vladimir p Torchilin (2013), Recent trends in multifunctional liposomal nanocarriers for enhanced tumor targeting.
Journal o f Drug Delivery.8{9)-A 509-1528.
5.KostasKostarelos, Andrew D Miller (2005), What role can chemistry play in cationic liposome-based gene therapy research today?,
Advances in genetics, 53, pp. 69-118.
5.MC Woodle, et al. (1992), Sterically stabilized liposomes. Reduction in electrophoretic mobility but not electrostatic surface potential,
Biophysicaljournal, 61 (4), pp. 902-910.
7.Ruey-Long Hong, et al. (1999), Direct comparison of liposomal doxorubicin with or without polyethylene glycol coating in C-26 tumorbearing mice is surface coating with polyethylene glycol beneficial?, Clinical cancer research, 5(11), pp. 3645-3652.
8.

XueMing Li, et al. (2009), Targeted delivery of doxorubicin using stealth liposomes modified with transferrin, Internationaljournal of

pharmaceutics, 373(1), pp. 116-123.