Nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (Theobroma cacao L.) chuyển gen

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-----------------------------

HÀ HỒNG HẠNH

NGHIÊN CỨU TÁI SINH IN VITRO
VÀ TẠO CÂY CA CAO (Theobroma cacao L.)
CHUYỂN GEN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2015


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

----------------------------

HÀ HỒNG HẠNH

NGHIÊN CỨU TÁI SINH IN VITRO
VÀ TẠO CÂY CA CAO (Theobroma cacao L.) CHUYỂN GEN
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. TS LÊ THỊ THU HIỀN
2. PGS.TS NÔNG VĂN HẢI

HÀ NỘI - 2015


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa
học của TS. Lê Thị Thu Hiền và PGS. TS. Nông Văn Hải.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được
công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các
đồng tác giả khác. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày tháng năm 2015
Tác giả luận án

Hà Hồng Hạnh

i


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Thị Thu Hiền - Phó Viện trưởng
Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trưởng
phòng Đa dạng sinh học hệ gen là người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu cũng như thực hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Nông Văn Hải - Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ
gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp
đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo và các cán bộ thuộc Viện Nghiên cứu

hệ gen, đặc biệt là tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng Đa dạng sinh học hệ gen đã luôn
quan tâm và giúp đỡ, góp ý cho tôi thực hiện và hoàn thành bản luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. Chu Hoàng Hà và các cán bộ Phòng Công
nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được thực hiện một số thí
nghiệm tại Phòng. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo, Phòng Quản lý tổng hợp,
Th.S. Bùi Hải Hà, Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi về mọi mặt, hỗ trợ tôi thực hiện các thủ tục cần thiết để tôi có thể hoàn thành
chương trình học tập và nghiên cứu của Nghiên cứu sinh.
Tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và người thân đã ở bên tôi,
chăm sóc, động viên giúp tôi yên tâm học tập và nghiên cứu. Tôi cũng gửi lời cảm ơn
tới các bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, khích lệ tôi thực hiện luận án.
Luận án được thực hiện trong khuôn khổ đề tài: “Nghiên cứu tái sinh in vitro và
tạo cây ca cao (Theobroma cacao L.) chuyển gen” thuộc Chương trình Trọng điểm
phát triển và ứng dụng Công nghệ sinh học trong lĩnh vực Nông nghiệp và Phát triển
nông thôn đến năm 2020 do Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn quản lý. Tôi xin
trân trọng cảm ơn sự trợ giúp quý báu của các chuyên viên Vụ Khoa học Công nghệ và
Môi trường, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.
Tác giả luận án

ii


MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................................... III
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... VI
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................VIII
DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT .......................................................... IX
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 4

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CA CAO ............................................................ 4
1.1.1 Nguồn gốc và vị trí phân loại ca cao .............................................................. 4
1.1.2 Đặc điểm hình thái của cây ca cao ..................................................................... 5
1.1.3 Ý nghĩa kinh tế của cây ca cao ........................................................................ 8
1.1.4 Bệnh do nấm ở cây ca cao.................................................................................. 9
1.1.5 Phát triển cây ca cao ở Việt Nam ................................................................... 11
1.2

NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN VÀ CHỌN TẠO GIỐNG Ở CÂY CA CAO ...... 12

1.2.1 Nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống ca cao theo phương pháp truyền
thống .......................................................................................................................... 12
1.2.2 Chọn tạo giống ca cao sử dụng công nghệ sinh học .................................... 15
1.3 GEN MÃ HÓA CHITINASE ............................................................................... 26
1.3.1 Nguồn gốc và cấu trúc của chitinase tự nhiên ............................................. 26
1.3.2 Chitinase ở một số đối tượng sinh vật .......................................................... 27
1.3.3 Vai trò của gen mã hóa chitinase .................................................................. 29
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ...................................................... 32
2.1

VẬT LIỆU ......................................................................................................... 32

2.1.1 Mẫu thực vật .................................................................................................... 32
2.1.2 Các vector và chủng vi khuẩn .......................................................................... 32
2.13. Hóa chất, thiết bị .............................................................................................. 33
2.2 PHƯƠNG PHÁP .................................................................................................. 34
2.2.1 Các phương pháp liên quan đến tái sinh in vitro cây ca cao ............................ 34

iii

2.2.2 Các phương pháp liên quan đến phân lập gen mã hóa chitinase và thiết kế các
vector chuyển gen thực vật ........................................................................................ 38
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ ............................................................................................. 48
3.1 TÁI SINH IN VITRO MỘT SỐ DÒNG CA CAO NGHIÊN CỨU .................... 48
3.1.1 Thu thập mẫu ................................................................................................... 48
3.1.2 Xác định khả năng tạo mô sẹo từ nhị lép và cánh hoa ở các dòng ca cao ....... 49
3.1.3 Xác định khả năng nhân sinh khối mô sẹo từ nhị lép và cánh hoa ở các dòng ca
cao…………………………………………………………………………………..51
3.1.4 Cảm ứng tạo phôi soma sơ cấp ........................................................................ 53
3.1.5 Cảm ứng tạo phôi soma thứ cấp....................................................................... 55
3.1.6 Tạo cây ca cao in vitro hoàn chỉnh .................................................................. 57
3.1.7 Khả năng thích ứng cây ca cao in vitro ra vườn ươm ...................................... 60
3.1.8 Quy trình tái sinh in vitro cây ca cao ............................................................... 62
3.2. PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA CHITINASE VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU
HIỆN THỰC VẬT ....................................................................................................... 63
3.2.1 Nhân và tạo dòng vùng gen TcChi1_W ........................................................... 63
3.2.2 Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen mã hóa chitinase sử dụng hệ
vector pCB301 ........................................................................................................... 70
3.2.3 Tạo các chủng vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp chứa vector biểu hiện thực
vật đã thiết kế............................................................................................................. 73
3.2.4 Kiểm tra hoạt động của cấu trúc gen chuyển trên cây thuốc lá ....................... 75
3.3 CHUYỂN GEN CHỈ THỊ GUS/GUSPLUS VÀO CÂY CA CAO ....................... 77
3.3.1 Lựa chọn chủng vi khuẩn, vector thích hợp và thời gian lây nhiễm vi khuẩn
cho chuyển gen vào ca cao ........................................................................................ 78
3.3.2 Chuyển gen chỉ thị gus/gusplus vào dòng ca cao TD8 .................................... 80
3.3.3 Phân tích và đánh giá mô, cây chuyển gen ...................................................... 81
3.4 CHUYỂN GEN MÃ HÓA CHITINASE VÀO CÂY CA CAO ............................ 84
3.4.1 Biến nạp gen mã hóa chitinase vào dòng ca cao TD8 ..................................... 84
3.4.2 Kiểm tra cây ca cao chuyển gen bằng các phương pháp sinh học phân tử ...... 87

iv


3.4.3 Quy trình chuyển gen thông qua A. tumefaciens vào dòng ca cao TD8 .......... 89
CHƢƠNG 4: THẢO LUẬN ....................................................................................... 91
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................................... 102
NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .................. 104
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 105
SUMMARY .....................................................................................................................
PHỤ LỤC .........................................................................................................................

v


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Bệnh nấm ở cây ca cao………………………………………………. 10
Hình 2.1. Một số vector sử dụng trong nghiên cứu…………………………….. 32
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm………………………………………………. 34
Hình 2.3. Hoa ca cao……………………………………………………………

35

Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D và TDZ đến tỷ lệ tạo phôi từ nhị lép
ở một số dòng ca cao nghiên cứu…………………………………….. 50
Hình 3.2. Ảnh hưởng của kiểu gen đến tỷ lệ tạo mô sẹo từ nhị lép…………….

51

Hình 3.3. Mô sẹo từ nhị lép và cánh hoa trên môi trường PCG và SCG……….

52

Hình 3.4. Tỷ lệ tạo phôi sơ cấp từ nhị lép và cánh hoa ca cao…………………. 54
Hình 3.5. Tái sinh phôi sơ cấp từ nhị lép và cánh hoa ca cao…………………..

54

Hình 3.6. Tỷ lệ tạo phôi soma thứ cấp từ trục mầm và lá mầm………………...

56

Hình 3.7. Tái sinh phôi soma thứ cấp từ trục mầm và lá mầm của phôi soma sơ
cấp dòng ca cao TD8…………………………………………………. 57
Hình 3.8. Tỷ lệ phôi soma sơ cấp tạo chồi và ra rễ……………………………..

59

Hình 3.9. Tạo chồi và ra rễ từ phôi soma sơ cấp và thứ cấp……………………

59

Hình 3.10. Tỷ lệ cây con sống trên các loại giá thể khác nhau sau 20 ngày…… 60
Hình 3.11. Các cây ca cao in vitro trên môi trường ra cây……………………..

61

Hình 3.12. Quy trình tái sinh in vitro cây ca cao……………………………….. 62
Hình 3.13. Tách chiết DNA tổng số từ lá ca cao dòng TD3……………………

63

Hình 3.14. Sản phẩm nhân vùng gen TcChi1-W và xử lý pJET+TcChi1-W/1,
pJET+TcChi1-W/7 và pJET+TcChi1-W/13 bằng BglII trên gel
agarose 0,8%………………………………………………………….. 65
Hình 3.15. Trình tự nucleotide vùng gen TcChi1-U phân lập từ dòng ca cao
TD3……………………………………………………………………

67

Hình 3.16. So sánh trình tự protein TcChi1 ở ca cao dòng TD3 với một số
trình tự chitinase lớp I của một số loài thực vật khác…………….

69

Hình 3.17. Sản phẩm PCR nhân gen TcChi1 và sản phẩm xử lý BglII và NotI
các plasmid tái tổ hợp pJET+TcChi1 trên gel agarose 0,8%............ 70

vi


Hình 3.18. Sơ đồ thiết kế vector pRTRA+TcChi1………………………………. 71
Hình 3.19. Kết quả thiết kế pRTRA+TcChi1 trên gel agarose 0,8%…………... 72
Hình 3.20. Sơ đồ thiết kế vector pCB301+TcChi1……………………………..

72

Hình 3.21. Sản phẩm xử lý pCB301+TcChi1 bằng HindIII trên gel agarose
0,8%…………………………………………………………………… 73
Hình 3.22. Sản phẩm PCR gen TcChi1 từ pCB301+TcChi1…………………

74

Hình 3.23. Điện di sản phẩm PCR nhân gen TcChi1 từ thuốc lá……………… 75
Hình 3.24. Sản phẩm RT-PCR từ mRNA của các dòng thuốc lá chuyển gen
TcChi1……………………………………………………………..

76

Hình 3.25. Cây thuốc lá chuyển gen…………………………………………….... 77
Hình 3.26. Các mảnh mô ca cao dòng TD8…………………………………….

78

Hình 3.27. Biến nạp gen chỉ thị gus/gusplus vào dòng ca cao TD8……………. 81
Hình 3.28. Biểu hiện gen gus/gusplus trên các mô ca cao chuyển gen………… 82
Hình 3.29. Sản phẩm PCR nhân gen mã hóa nptII từ các dòng ca cao chuyển
gen…………………………………………………………………. 84
Hình 3.30. Tái sinh cây từ phôi soma của dòng ca cao TD8 chuyển gen TcChi1 86
Hình 3.31. Các cây ca cao chuyển gen…………………………………………. 86
Hình 3.32. Sản phẩm PCR nhân gen mã hóa nptII từ các cây ca cao chuyển
gen…………………………………………………………………..

87

Hình 3.33. Sản phẩm PCR nhân một phần đoạn CaMV35S+TcChi1+cmyc+
KDEL+tNOS………………………………………………………. 87
Hình 3.34. Vùng T-DNA của vector pCB301+TcChi1………………………… 89
Hình 3.35. Lai Southern các mẫu ca cao chuyển gen…………………………... 89
Hình 3.36. Quy trình chuyển gen vào cây ca cao………………………………. 90

vii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Nhân mô sẹo sơ cấp trên môi trường SCG…………………………... 52
Bảng 3.2. Nhân mô sẹo thứ cấp trên môi trường SCG……………………….....

56

Bảng 3.3. Tỷ lệ phôi soma thứ cấp tạo chồi và ra rễ……………………………. 58
Bảng 3.4. Lựa chọn chủng vi khuẩn A. tumefaciens và vector biểu hiện thích
hợp cho chuyển gen ca cao………………………………………….. 79
Bảng 3.5. Lựa chọn thời gian lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens thích hợp cho
chuyển gen ca cao…………………………………………………… 80
Bảng 3.6. Khả năng tạo mô sẹo, tạo phôi soma, tạo chồi và ra rễ của các mẫu 82
ca cao biến nạp gen chỉ thị…………………………………………..
Bảng 3.7. Khả năng tạo mô sẹo, tạo phôi soma, tạo chồi và ra rễ của các mẫu
ca cao TD8 biến nạp gen mã hóa chitinase………………………….

viii

85


DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
2,4D

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

AS

Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy acetophenone)

BAP

6-benzylaminopurin

Bar

Bialaphos resistance gene - Gen chịu thuốc trừ cỏ

Bp

Base pair - Cặp base

CaMV

Cauliflower mosaic virus - Virus khảm súp lơ

DEPC

Diethyl pyrocarbonate

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

DKW

Driver and Kuniyuki medium - Môi trường DKW

EDTA

Ethylene diaminne tetra acetic acid

EGFP

Enhanced green fluorescent protein - Protein tăng cường phát
huỳnh quang

ED

Embryo development medium - Môi trường cảm ứng tạo phôi

EDL

Embryo development in light medium - Môi trường chuyển dạng
phôi và tạo cây

gus

β-1,4-glucuronidase

LB

Luria bertani - Môi trường LB nuôi vi khuẩn

IM

Induction medium - Môi trường cảm ứng

MS

Murashige and Skoog medium - Môi trường MS

nptII

Neomycin phosphotransferase II

kb

Kilobase

OD

Optical density - Mật độ quang

PCG

Primary callus growth medium - Môi trường cảm ứng tạo mô sẹo

PCR

Polymerase chain reaction - Phản ứng dây chuyền polymerase

PVPP

Poly vinyl poly pyrolidone

RNA

Ribonucleotic acid

ix


SCG

Secondary callus growth medium - Môi trường nhân mô sẹo

SD

Standard deviation - Độ lệch chuẩn

RD

Root development and maintenance medium - Môi trường hình
thành và phát triển rễ

TDZ

Thidiazuron

YEP

Yeast extract peptone - Môi trường YEP chứa cao nấm men và
thịt bò

X-gluc

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid

x


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết
Ca cao (Theobroma cacao L.) là một trong những cây kinh tế quan trọng,
đem lại lợi nhuận đáng kể cho một số quốc gia trên thế giới. Bột ca cao được
sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo, thực phẩm, mỹ phẩm và
dược phẩm tại nhiều nước. Có nguồn gốc từ vùng Amazon (Nam Mỹ), cây ca
cao phát triển mạnh ở các vùng có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, trong đó có Việt
Nam. Hiện nay, cây ca cao đang được quan tâm để phát triển rộng rãi ở nước ta
vì cây có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau như triền dốc, đất cát, phù sa,
đất nghèo dinh dưỡng. Ngoài ra, ca cao còn là cây chịu bóng mát tốt, nên có
thể trồng xen canh với cây ăn trái, cây lâm nghiệp, phủ xanh đất tốt, thích hợp
với kinh tế hộ gia đình và đặc biệt, thị trường tiêu thụ sản phẩm ca cao là rất
lớn.
Tuy nhiên, tương tự các loài cây trồng khác, phát triển sản xuất ca cao gặp
nhiều khó khăn do giống bị thoái hóa, sự cạnh tranh của các loại cây trồng
khác, kỹ thuật canh tác chưa hiệu quả, sâu và bệnh hại... Riêng bệnh nấm đã
gây sụt giảm khoảng 30% sản lượng ca cao hàng năm trên toàn thế giới. Theo
truyền thống, có rất nhiều loại thuốc trừ sâu hóa học đang được sử dụng để

phòng trừ bệnh hại với chi phí tốn kém, gây ô nhiễm môi trường và gây ảnh
hưởng trực tiếp đến sức khỏe người sản xuất và tiêu dùng, cũng như môi
trường. Để cải thiện tình hình, giúp cho cây ca cao phát triển bền vững, nhiều
chương trình nghiên cứu nhằm nâng cao khả năng chống chịu sâu bệnh và các
tác nhân gây hại khác đã và đang được thực hiện với sự tham gia của nhiều tổ
chức nghiên cứu và thương mại trên thế giới. Bên cạnh công tác chọn tạo giống
theo phương pháp truyền thống, phương pháp chọn tạo giống ứng dụng công
nghệ sinh học như tạo cây chuyển gen là một trong hướng nghiên cứu triển
vọng trong việc tạo các giống ca cao có năng suất cao và chất lượng tốt, có khả
năng kháng sâu bệnh, chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường.
Tại Việt Nam, nhiều dòng ca cao được cấp phép sử dụng rộng rãi được
nhập nội và tuyển chọn từ Malaysia trong Chương trình do Hiệp hội Ca cao


2

Thế giới (The World Cocoa Foundation) hỗ trợ. Chính phủ và nhiều tổ chức
quốc tế rất quan tâm phát triển cây ca cao nhằm đưa Việt Nam vào bản đồ ca
cao thế giới, trở thành quốc gia giàu tiềm năng về cung cấp ca cao. Hiện nay
chưa có nghiên cứu về tái sinh và chuyển gen vào cây ca cao ở Việt Nam. Bên
cạnh những thuận lợi và thành công đã đạt được trong lĩnh vực công nghệ sinh
học, những khó khăn có thể gặp phải trong quá trình nghiên cứu chọn tạo giống
cây trồng, trong đó có cây ca cao bằng công nghệ sinh học ở nước ta là không
nhỏ.
Trên cơ cở lý luận và thực tiễn của hướng nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện
đề tài “Nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (Theobroma cacao L.)
chuyển gen”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Đề tài đặt mục tiêu chung là xây dựng được quy trình tái sinh in vitro và tạo cây
ca cao chuyển gen. Mục tiêu cụ thể:

-

Xây dựng được quy trình tái sinh in vitro ở 1 - 2 dòng ca cao đang được canh tác
ở Việt Nam;

-

Xây dựng được quy trình chuyển gen và tạo được cây ca cao chuyển gen chỉ thị
gus/gusplus và gen kháng nấm.

3. Nội dung nghiên cứu
-

Nghiên cứu thăm dò khả năng tái sinh in vitro của 9 dòng ca cao đang được
canh tác ở Việt Nam;

-

Nghiên cứu đặc điểm của gen mã hóa chitinase (TcChi1) từ cây ca cao ở Việt
Nam và thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen mã hóa chitinase;

-

Nghiên cứu chuyển gen chỉ thị gus/gusplus vào 1 - 2 dòng ca cao ở Việt Nam;

-

Nghiên cứu chuyển gen TcChi1 vào 1 - 2 dòng ca cao ở Việt Nam và phân tích
các dòng ca cao được chuyển gen.

4.
-

Đóng góp mới của luận án
Lần đầu tiên ở Việt Nam, các dòng ca cao thương mại TD1, TD3, TD5, TD7,
TD8, TD9 đã được tái sinh in vitro thành công;


3

-

Gen mã hóa chitinase có hoạt tính kháng nấm đã được phân lập từ dòng ca cao
hiện đang được canh tác tại Việt Nam và được chuyển vào vector biểu hiện thực
vật thích hợp phục vụ công tác chuyển gen;

-

Gen chỉ thị gusplus và gen mã hóa chitinase đã được chuyển thành công vào
dòng ca cao TD8 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
-

Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp dẫn liệu khoa học về ứng dụng công
nghệ tế bào thực vật và công nghệ gen trong việc nhân giống và chọn tạo giống
cây trồng nói chung và cây ca cao nói riêng, cải tiến giống và tăng khả năng
chống chịu với các tác nhân gây bệnh.

-

Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam công bố quy trình tái sinh in vitro
thông qua phôi soma của một số dòng ca cao hiện đang được canh tác ở Việt
Nam. Các kết quả đạt được trong nghiên cứu này là cơ sở cho các ứng dụng
nhân nhanh các dòng ca cao mới chất lượng, bảo tồn nguồn gen có giá trị cũng
như phục vụ công tác chuyển gen.

-

Quy trình chuyển gen chỉ thị và gen đích vào cây ca cao thông qua A.
tumefaciens là cơ sở khoa học để cải tiến giống ca cao thông qua công nghệ
chuyển gen; đồng thời đây là mô hình để nghiên cứu chức năng gen ở cây trồng.

-

Kết quả phân lập gen mã hóa chitinase kháng nấm, thiết kế vector biểu hiện thực
vật và chuyển gen này vào cây thuốc lá và cây ca cao là cơ sở khoa học cho việc
tạo ra các dòng ca cao có khả năng kháng nấm.

6. Cấu trúc của luận án
Luận án gồm 141 trang (bao gồm cả tài liệu tham khảo và phụ lục), được chia
thành các phần: Mở đầu gồm 3 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 28 trang;
Chương 2: Vật liệu và phương pháp, 16 trang; Chương 3: Kết quả nghiên cứu, 43
trang; Chương 4: Thảo luận, 11 trang; Kết luận và đề nghị, 2 trang. Các công trình
đã công bố liên quan đến luận án: 1 trang; Summary: 4 trang; Tài liệu tham khảo:
16 trang với 123 tài liệu tham khảo, trong đó 18 tài liệu tiếng Việt và 105 tài liệu
tiếng Anh. Phần kết quả luận án có 7 bảng số liệu, 36 hình. Phụ lục: 8 trang.


4

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CA CAO

1.1.1 Nguồn gốc và vị trí phân loại ca cao
Cây ca cao có nguồn gốc ở lưu vực sông Amazon, Nam Mỹ. Từ đây, ca
cao phát triển rộng sang nhiều quốc gia khác trên thế giới, tập trung ở khu vực
Nam Mỹ và Tây Phi. Ca cao đặc biệt thích hợp ở những quốc gia có khí hậu
nhiệt đới nóng ẩm. Theo xếp loại của Hiệp hội Ca cao Thế giới thì hai quốc gia
dẫn đầu về sản lượng ca cao hiện nay là Bờ Biển Ngà (Côte d’Ivoire) và Ghana
(thuộc Tây Phi). Ở khu vực châu Á, từ năm 1985 trở lại đây, ca cao được phát
triển khá mạnh, tiến tới trở thành vùng trồng ca cao lớn không kém Nam Mỹ và
châu Phi. Các quốc gia sản xuất ca cao hàng đầu ở khu vực này là Indonesia và
Malaysia. Việt Nam cũng nằm trong cùng vĩ độ “ca cao” với Ghana, Bờ Biển
Ngà, Indonesia, Malaysia với khí hậu nhiệt đới mưa nhiều, đất đai màu mỡ, rất
thích hợp với cây ca cao. Nhìn chung việc trồng, chế biến, tiêu thụ các sản
phẩm của cây ca cao trên toàn cầu đang có xu hướng tăng rất cao và nhanh nhờ
sự phát triển kinh tế năng động với mức sống của hàng tỷ người được nâng cao
và các sản phẩm ca cao được tiêu thụ phổ biến hơn. Trong khi, sản lượng ca
cao sản xuất hàng năm rất bấp bênh, không đủ đáp ứng nhu cầu…Vì vậy, việc
phát triển ca cao bền vững, chuyển dịch cơ cấu cây trồng, nâng cao chất lượng
giống, hạt ca cao là những vấn đề được đặc biệt lưu tâm ở các quốc gia ưu tiên
phát triển cây ca cao.
Ca cao thuộc chi Theobroma, họ Stercu-liaceae. Chi Theobroma bao
gồm 22 loài, trong đó chỉ có loài Theobroma cacao được trồng rộng rãi, còn
các loài khác hoặc hoang dại, hoặc rất ít được trồng. Các tác giả chia
Theobroma cacao ra hai loài phụ là: Theobroma cacao spp. ca cao, gồm các
quần thể dạng Criollo và Theobroma cacao sphaerocarpum, gồm các quần thể

còn lại, trong đó có Forastero. Các loài phụ này đều là các dòng nhị bội, với số
nhiễm sắc thể 2n = 20. Criollo có hạt dạng tròn, nội nhũ trắng, có hương vị nhẹ
và tương đối dễ nhiễm bệnh. Forastero có dạng cây cao, khỏe, hạt nhỏ hơn
Criollo nhưng hương vị đậm hơn. Hạt Forastero dạng dẹp, lá mầm bên trong


5

màu tím, chứa nhiều chất béo hơn Criollo. Do vậy, hầu hết các vùng trồng ca
cao lớn trên thế giới hiện nay đều trồng dạng Forastero. Giống thứ ba được
công nhận là Trinitario, một dòng lai giữa Criollo và Forastero, là giống có
khảng năng kháng bệnh và mang một số hương vị đặc trưng. Tập đoàn gen ca
cao phong phú nhất được lưu giữ ở Trinidad với khoảng 2.500 kiểu gen, ở
Brazil với khoảng 2.000 kiểu gen và ở Costa Rica với 700 kiểu gen. Nghiên
cứu gần đây về phân bố ca cao trên toàn thế giới cho thấy một số thay đổi về
các nhóm ca cao có thể phân biệt về mặt di truyền và địa lý. Theo các nghiên
cứu, ca cao phân bố ở Trung và Nam Mỹ đã được chia thành 10 cụm di truyền:
Amelonado, Contamana, Curaray, Guiana, Iquitos, Maranon, Nacional, Nanay
và Purus, xuất hiện ở lưu vực sông Amazon và Bahia. Nhóm số 10 được mô tả
là nhóm Criollo xuất hiện ở khu vực lưu vực sông Amazon (Motamayor et al.,
2008; Utro et al., 2012).
1.1.2 Đặc điểm hình thái của cây ca cao
Ca cao là loài cây thân gỗ nhỏ, có thể cao đến 10 - 20 m nếu mọc tự
nhiên. Trong sản xuất do trồng mật độ cao và khống chế sự phát triển thông
qua tỉa cành nên cây thường có chiều cao trung bình khoảng 5 - 7 m, đường
kính thân 10 - 18 cm. Ca cao sinh trưởng tốt dưới bóng che, do đó có thể trồng
xen với một số loại cây kinh tế khác. Thời kỳ kinh doanh hiệu quả có thể kéo
dài từ 25 - 40 năm (Phạm Hồng Đức Phước, 2009).
Thân: Đối với thân phát triển từ hạt, sự phát triển của thân có thể chia
thành ba giai đoạn. Giai đoạn 1: Hạt nẩy mầm thượng địa (lá mầm nhô lên khỏi

mặt đất). Đoạn thân dưới lá mầm không có mầm bất định là nơi để ghép khi
nhân giống vô tính mà không sợ bị lẫn giống. Giai đoạn 2: lá mầm mở, 4 lá đầu
tiên phát triển, đốt rất ngắn. Mỗi đợt sinh trưởng kéo dài khoảng 6 tuần, đốt dài
ra trong thời gian này. Tùy theo điều kiện môi trường, trong giai đoạn này thân
có thể cao lên từ 0,5 - 2 m. Giai đoạn 3: Cây tạm ngừng tăng trưởng về chiều
cao. Cành ngang trên đỉnh ngọn phát triển tạo tầng cành đầu tiên. Đối với thân
phát triển từ cành ghép (mầm ghép lấy từ cành ngang): Cành không tăng trưởng
thẳng đứng mà thường mọc nghiêng. Các chồi nách phát triển sớm, nhiều nên


6

cây có dạng bụi gồm nhiều cành chính và không có tầng cành. Nếu mầm ghép
lấy từ thân chính hoặc cành vượt, sự sinh trưởng giống như thân mọc từ hạt.
Lá: Lá non phát triển theo từng đợt, sau mỗi đợt ra lá, đỉnh cành vào
trạng thái ngủ. Thời gian ngủ tùy theo điều kiện môi trường nhưng thường
khoảng 4 - 6 tuần lễ. Sự phát triển lá liên quan đến tình trạng nước của cây. Ca
cao trồng không che bóng, các đợt ra lá nhanh hơn là trồng trong điều kiện có
bóng che. Điều này là do khi không có bóng che, sự biến động hàm lượng nước
trong cây xảy ra thường xuyên và nhiệt độ môi trường bên ngoài cao kích thích
chồi lá phát triển.
Cây cần dinh dưỡng khi đợt lá mới phát triển. Nếu cây thiếu dinh dưỡng
sẽ có sự vận chuyển dinh dưỡng từ lá già sang lá non mới ra và dẫn đến việc lá
già bị rụng sớm. Do đó, số lá già hiện diện trên thân giúp người trồng có thể
hiểu được phần nào hiện trạng dinh dưỡng của cây ca cao. Màu sắc lá non thay
đổi tùy theo giống từ màu xanh nhạt đến vàng, từ màu hồng đến đỏ đậm. Khi
trưởng thành, lá có màu xanh thẫm, cứng cáp hơn và nằm ngang. Lá dưới bóng
che có phiến rộng và xanh hơn ngoài nắng.
Rễ: Hạt sau khi nẩy mầm, rễ mọc rất nhanh và có nhiều rễ ngang mọc
thẳng góc quanh rễ trụ. Ba tháng đầu rễ phát triển rất nhanh có thể cao hơn 25

cm. Để tránh rễ cong khi ươm cây, cần chọn túi đủ dài để rễ phát triển trong 3 4 tháng đầu. Rễ trụ tiếp tục phát triển khi bị cắt ngang nên khi trồng ta cắt bỏ
phần rễ cong trong bầu đất mà không ảnh hưởng đến sinh trưởng tiếp theo của
rễ. Khi cây được 3 năm tuổi, rễ trụ dài khoảng 1,5 - 2 m. Trên suốt chiều dài
của rễ trụ, có rất nhiều rễ ngang mọc ra và phân nhánh với rất nhiều rễ con, tập
trung chủ yếu ở vùng rễ phía dưới cổ rễ khoảng 20 cm.
Hoa: Hoa xuất hiện trên sẹo lá ở thân, cành. Đợt hoa đầu tiên trên cây từ
hạt có thể nở vào khoảng 14 - 20 tháng sau khi trồng. Cây ghép hay giâm cành
có thể ra hoa sớm hơn từ 9 - 18 tháng sau khi trồng. Hoa ra tập trung vào mùa
mưa. Những nơi có đủ nước, cây ra hoa quanh năm và vẫn có cao điểm ra hoa
rộ. Do hàng năm, hoa xuất hiện cùng một chỗ nên lâu ngày phình to gọi là đệm
hoa. Thường mỗi đệm mang rất nhiều hoa, nếu đệm hoa bị tổn thương thì


7

lượng hoa giảm hoặc không ra nữa. Hoa có cuống dài từ 1 - 3 cm, có 5 cánh
đều đặn. Hoa bắt đầu nở từ khoảng 3 giờ chiều hôm trước cho đến 9 giờ sáng
hôm sau.
Thụ phấn: Hoa ca cao thụ phấn nhờ côn trùng thuộc họ Ceratopogonidae.
Loài Forcipomyia là loài phổ biến nhất tham gia thụ phấn. Côn trùng này rất
nhỏ thường cư trú trong điều kiện tối, ẩm nơi có các tàn dư thực vật đậu quanh
cây ca cao, do đó nếu vườn quá sạch hoặc quá khô sẽ không thuận lợi cho sự
thụ phấn. Hoa ca cao ra nhiều nhưng chỉ thụ phấn và đậu 1 - 5%. Phần lớn hoa
nở mà không được thụ phấn sẽ rụng sau 48 giờ.
Quả: Sự phát triển của quả: Sau khi thụ phấn, quả tăng trưởng chậm
trong khoảng 40 ngày đầu và đạt tốc độ tối đa sau 75 ngày. Sau 85 ngày, sự
tăng trưởng của quả chậm lại, trong khi hạt bên trong quả bắt đầu tăng trưởng
nhanh, đây cũng là thời kỳ hạt tích lũy chất béo. Lớp cơm nhầy hình thành
khoảng 140 ngày sau khi thụ phấn. Khi hạt tăng trưởng tối đa, quả vào giai
đoạn chín. Quả chín không nở bung ra và ít khi rụng khỏi cây. Quả có cuống

hóa gỗ nên rất dai. Quả non có 5 ngăn trong đó hạt được phân chia đều, khi quả
chín vách ngăn này biến mất chỉ còn lại một hốc chứa đầy hạt. Từ khi thụ phấn
đến khi quả chín kéo dài từ 5 - 6 tháng, tùy theo giống. Màu sắc của quả khá đa
dạng. Quả chưa chín có màu xanh, đỏ tím hoặc xanh điểm đỏ tím. Khi quả
chín, màu xanh chuyển sang màu vàng; màu đỏ tím chuyển sang màu da cam.
Hình dạng quả thay đổi nhiều từ hình cầu đến dài nhọn hay hình trứng. Số
lượng rãnh và độ sâu của khía trên quả cũng thay đổi từ 5 - 10 rãnh, rãnh có thể
sâu nhiều, nông hoặc trơn nhẵn. Vỏ quả có thể dày từ 1 - 3 cm. Trọng lượng quả
dao động từ 0,2 - 1 kg.
Hạt: Mỗi quả chứa từ 30 - 40 hạt. Mỗi hạt có lớp cơm nhầy bao quanh
có vị chua, ngọt, thơm và xếp thành 5 dãy. Hạt có vỏ mỏng màu hồng, nhiều
đường gân. Hạt rất dễ mất sức nẩy mầm sau khi tách khỏi quả nên thường phải
gieo ngay. Hạt sau khi tách lớp cơm nhầy và hong ráo, nếu giữ trong mùn cưa
hoặc than có thể giữ được sức nẩy mầm trong 3 - 4 tuần (Phạm Hồng Đức
Phước, 2009).


8

1.1.3 Ý nghĩa kinh tế của cây ca cao
Cây ca cao là cây kinh tế quan trọng đem lại lợi nhuận rất cao nhờ xuất
khẩu cho một số quốc gia trên thế giới. Hạt ca cao là nguồn cung cấp thực
phẩm giàu dinh dưỡng cho con người. Ca cao cho hạt làm nguyên liệu sử dụng
cho ngành công nghiệp thực phẩm cụ thể là các sản phẩm cao cấp như
chocolate, ca cao... Sản lượng ca cao hàng năm trên toàn thế giới (ca cao là sản
phẩm khô thu được bằng cách lên men hạt ca cao) 2/3 được chế biến thành bột
ca cao và bơ ca cao, 1/3 được sử dụng để chế biến các thành phần tạo hương vị
và màu của chocolate. Khoảng 5 - 6 triệu hộ nông dân sản xuất nhỏ chiếm 95%
sản lượng ca cao toàn thế giới. Theo thống kê mới nhất được công bố bởi ICCO
11/6/2015, trong năm 2013/2014, thế giới sản xuất được tổng cộng 4.232.000

tấn hạt ca cao, châu Phi chiếm ưu thế (71,6%). Trong số các nước sản xuất ca
cao, Bờ Biển Ngà và Ghana xếp hạng đầu tiên và thứ hai với khoảng 1.000.000
tấn mỗi năm. Ở châu Á và châu Đại Dương, Indonesia là quốc gia sản xuất ca
cao nhiều nhất. Ca cao còn được chứng minh về tác dụng phòng các bệnh tim
mạch. Các flavanol và procyanidin có trong hạt ca cao đã thể hiện khả năng
chống oxi hóa mạnh trong các thử nghiệm in vitro (Keen et al., 2005). Các ứng
dụng của hạt ca cao đã một lần nữa khẳng định giá trị quan trọng của loài cây
công nghiệp này.
Ngoài ra, trồng ca cao còn mang lại những lợi ích về môi trường. Do ca
cao là loại cây ưa bóng với thời gian thu hoạch trên 20 năm, có thể trồng dưới
tán những cây lâu năm khác, chúng mang lại các lợi ích như tăng cường đa
dạng sinh học trong những vùng đất có chim di cư, bảo vệ hành lang đầu
nguồn, đất, nguồn nước và các vùng đệm của những khu rừng nhiệt đới (Rice,
Greenberg, 2003). Các tổ chức quốc tế như Tổ chức Bảo tồn Quốc tế
(Conservation International), Liên đoàn Động vật hoang dã Thế giới (The
World Wildlife Federation) và Hiệp hội Ca cao Thế giới đã nhận thức được vai
trò của ca cao trong việc ổn định nền kinh tế địa phương và môi trường và đã
khuyến khích nông dân trồng ca cao trong những khu vực này (Guyton et al.,
2003).


9

1.1.4 Bệnh do nấm ở cây ca cao
Bệnh thường gặp ở ca cao do nấm hoặc côn trùng gây ra. Một số bệnh
hại chính do nấm bao gồm:
- Bệnh thối trái, loét thân, cháy lá (do nấm Phytophthora palmivora):
Bệnh xuất hiện từ khi giai đoạn vườn ươm đến khi thu hoạch và trên tất cả bộ
phận của cây (lá, thân, hoa, trái). Trên thân cách mặt đất khoảng 1 m, xuất hiện
các vết bệnh sậm màu hơi ướt, sau chuyển sang nâu đỏ, vỏ bị bệnh nứt ra và

chảy nhựa vàng. Lâu ngày, vết bệnh lan khắp vòng thân và ăn sâu vào phần gỗ,
lá héo và rụng. Ở những cây nhiều tuổi, bệnh có thể hại cả trên cành. Cây bị
bệnh lá héo, rụng, cành bị khô, cây có thể chết. Trên lá, vết bệnh màu xanh tái
hơi ướt xuất hiện đầu tiên trên mép và chóp lá, sau lan rộng vào phía trong
phiến lá, chuyển màu nâu, lá bị cháy khô từng mảng. Trong điều kiện ẩm ướt,
trên vết bệnh có lớp tơ nấm màu trắng. Trên vỏ trái xuất hiện những chấm màu
nâu lan rất nhanh, sau chuyển qua đen và từ từ bao kín mặt trái. Trái non đen
khô cứng và vẫn dính trên cây. Trái gần thu hoạch bị thối một phần hoặc cả
trái, trái bị rụng, hạt lép, giảm sản lượng;
- Bệnh khô vỏ thân (do nấm Colletotrichum gloeosporioides): Bệnh
thường xảy ra cả mùa khô lẫn mùa mưa, đặc biệt là đối với những cây ca cao
thiếu bóng che hoặc tỉa quá nặng. Trên thân, cành nấm xâm nhập vào lớp tế
bào dưới biểu bì tạo thành những vết sậm màu, sau đó vùng nhiễm bệnh xuất
hiện bào tử màu vàng cam, vỏ thân bị khô từng mảng, nếu bị nặng cây sinh
trưởng kém, lá vàng và rụng, một số cành bị khô. Trên lá, vết bệnh là những
đốm màu nâu, tròn, nhiều đốm liên kết nhau làm cháy lá;
- Bệnh vết sọc đen (do nấm Oncobasidium theobromae): Một hoặc nhiều
lá nằm sau đợt lá cuối cùng có màu vàng với những đốm xanh. Thân sần sùi
với những mụt nhỏ, cành khô và chết ngược dần từ ngọn vào. Nhiều chồi bên
phát triển nhưng không hoàn chỉnh. Đối với cây con: cây sinh trưởng chậm, lá
vàng, lá chân rụng sớm, khoảng cách giữa các lá ngắn; (4) Bệnh nấm hồng (do
nấm Corticium salmonicolor): nấm phá hại ở những cành đã hóa nâu. Các vết
bệnh lúc đầu có lớp mốc trắng, sau chuyển màu hồng. Nấm mọc sâu vào phần


10

gỗ cành, lá phần trên của cành nhiễm bệnh bị úa vàng và khô, nhưng vẫn lưu
trên cành một thời gian. Vỏ cành khô nâu và bong ra từng mảng, bị nặng cành
chết khô (Hình 1.1).

Hình 1.1. Bệnh do nấm ở cây ca cao
A. Bệnh thối trái, loét thân, cháy lá (P. palmivora); B. Bệnh vết sọc đen (O.
theobromae); C. Bệnh khô vỏ thân (C. gloeosporioides); D. Bệnh nấm hồng (C.
salmonicolor). Nguồn: />
Để phòng trị các bệnh trên cây ca cao, bên cạnh các biện pháp canh tác
và xử lý như tỉa cành hợp lý tạo thông thoáng, tiêu hủy cành, lá và trái bị bệnh,
nhổ bỏ cây con… thì đều cần phun, tiêm các loại thuốc hóa học - tác nhân gây
ô nhiễm môi trường và tác động xấu đến sức khỏe của người dân (Bowers et
al., 2001; Appiah et al., 2004; Aime, Phillips-Mora, 2005). Một số đồn điền ca
cao đã và đang đầu tư nghiên cứu giống kháng bệnh nhằm kiểm soát bệnh hại.


11

1.1.5 Phát triển cây ca cao ở Việt Nam
Theo Cục Trồng trọt, tính đến tháng 11.2014, diện tích trồng ca cao cả
nước là 16.800 ha, trong đó các tỉnh có diện tích trên 1.000 ha là: Bến Tre
(7.342 ha); Bà Rịa-Vũng Tàu (2.787 ha); Tiền Giang (2.578 ha); Đắk Lắk
(2.554 ha); Bình Phước (1.310 ha); Vĩnh Long (1.244 ha)… Diện tích ca cao
thu hoạch khoảng 11.055 ha, chiếm 50% tổng diện tích, sản lượng hạt ca cao
khô lên men năm 2014 là 6.765 tấn, tăng nhẹ so với năm 2013 (65 tấn), trong
đó phần lớn ca cao được xuất khẩu. Tại thị trường Việt Nam, hạt ca cao lên
men đang được thu mua với giá khá hấp dẫn và ổn định từ đầu năm tới nay, dao
động ở mức 55.000 đến 60.000 đồng/kg (chưa tính giá thưởng), tăng đáng kể
so với mức 45.000 đồng/kg vào cuối năm 2013. Cây ca cao Việt Nam đang
đứng trước những cơ hội mới do nhu cầu ca cao của thế giới ngày càng tăng,
dự báo năm 2020 sẽ thiếu hụt khoảng 1 triệu tấn ( />Giống hiện có ở Việt Nam là Forastero và con lai giữa Forastero và
Trinitario. Giống ca cao trước đây trồng rải rác ở các địa phương là con cháu
của sự phối hợp giữa ba nhóm Forastero, Criollo và Trinitario. Ca cao là cây

dài ngày nên việc chọn giống rất quan trọng. Việc chọn giống không đúng sẽ
dẫn đến thiệt hại lâu dài hoặc phải mất thời gian từ 3 - 5 năm và nhiều công của
cho thời kỳ kiến thiết cơ bản nếu quyết định thay giống khác tốt hơn. Hiện nay,
hệ thống giống được sử dụng rộng rãi là hạt lai F1 và các dòng vô tính đã chọn
lọc có năng suất cao và kháng sâu bệnh. Có hai nguồn giống chính để trồng ca
cao là hạt lai và dòng vô tính. Các dòng vô tính sau có tiềm năng năng suất từ 2
- 5 tấn/ha trong điều kiện đồng ruộng: TD1, TD2, TD3, TD4, TD5, TD6, TD7,
TD8, TD9, TD10, TD11, TD13, TD14, TD20, TD33, TD36, TD38, TD39,
TD54, TD55, TD62, TD63, TD64 (Phạm Hồng Đức Phước, 2009). Tuy nhiên,
ca cao cũng bị nhiều loại sâu bệnh tấn công, các loại sâu bệnh hại chính như:
rầy hoa, bọ xít, sâu hồng, rầy mềm…
Nhận thức rõ vai trò quan trọng của cây ca cao đối với sự phát triển kinh
tế - xã hội của đất nước, Ban Điều phối Phát triển Ca cao Việt Nam đã được
thành lập theo Quyết định số 803/QĐ-BNN của Bộ Nông nghiệp và Phát triển
Nông thôn ký ngày 11 tháng 4 năm 2005. Sau đó, ngày 14 tháng 9 năm 2007,


12

Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã phê duyệt Đề án phát triển ca cao
đến năm 2015 và định hướng đến năm 2020 (Kèm theo Quyết định số
2678/QĐ/BNN-KH), trong đó đặt mục tiêu là “Đến năm 2015, dự kiến diện
tích cây ca cao đạt 60.000 ha, trong đó có 35.000 ha kinh doanh, năng suất bình
quân 15 tạ/ ha, sản lượng hạt khô đạt 52.000 tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt 50 60 triệu USD...”. Đề án tập trung ưu tiên các nội dung: (1) Quy hoạch vùng sản
xuất; (2) Xây dựng các quy trình, quy phạm kỹ thuật để phát triển cây ca cao
bền vững; (3) Nghiên cứu chọn tạo và nhân giống cây ca cao; (4) Khuyến nông,
chuyển giao khoa học công nghệ về sản xuất và sơ chế ca cao; (5) Đầu tư phát
triển cơ sở hạ tầng các vùng trồng ca cao trọng điểm ( />Các chính sách, chương trình ưu tiên phát triển chiến lược của Chính phủ
cũng như sự hợp tác nhiều mặt của các tổ chức quốc tế, cùng với những thế
mạnh rõ rệt về khí hậu, thổ nhưỡng, nguồn nhân lực, là cơ sở đưa Việt Nam

vào bản đồ ca cao quốc tế, trở thành quốc gia giàu tiềm năng về cung cấp ca
cao. Hiện Dự án Hợp tác công - tư tăng cường phát triển ca cao bền vững tại Việt
Nam (PPP) đã và đang điều phối các nguồn hỗ trợ từ các công ty và tổ chức như
công ty Cargill, Grand Place Puratos, Mars, Bộ Nông nghiệp và Phát triển
Nông thôn, Chính phủ Hà Lan, Tổ chức IDH The Sustainable Trade
Initiative… Công tác hỗ trợ nhằm phát triển ca cao bền vững gồm khâu đầu tư
giống, cam kết bao tiêu thu mua sản phẩm, tập huấn chuyển giao kỹ thuật, xây
dựng vườn trình diễn kỹ thuật, cung cấp phân bón…
1.2

NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN VÀ CHỌN TẠO GIỐNG Ở CÂY CA CAO

1.2.1 Nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống ca cao theo phƣơng pháp
truyền thống
Nghiên cứu chọn tạo giống ca cao gặp nhiều khó khăn và hạn chế, do ca
cao có chu kỳ sống khá dài (tối thiểu là 2 - 3 năm, từ hạt ra hạt) và phải mất rất
nhiều năm thử nghiệm đồng ruộng để đánh giá đầy đủ hiệu suất và các đặc tính
kháng bệnh. Rất nhiều kiểu gen của ca cao tự bất tương hợp dẫn tới các nghiên
cứu chọn tạo giống và phân tích di truyền tốn nhiều công sức hơn. Ngoài ra, ca
cao cần diện tích canh tác lớn và cần nhiều nhân lực để duy trì và đánh giá các
thử nghiệm đồng ruộng. Hơn nữa, hạt ca cao cứng và nguồn gen phải được bảo


13

tồn dưới dạng sống trên đồng ruộng hay nhà kính. Hiện nay, hệ thống giống
được sử dụng rộng rãi là hạt lai F1 và các dòng vô tính đã chọn lọc có năng
suất cao và kháng sâu bệnh. Có hai nguồn giống chính để trồng ca cao:
Hạt lai: Là hạt từ những cặp lai đã xác định cha mẹ và đã kiểm nghiệm
năng suất thế hệ F1. Loại hạt giống này chỉ có ở những cơ sở nghiên cứu.

Nhiều cặp lai (5 - 10 cặp) có thể được phối trộn để tăng khả năng thụ phấn và
làm phong phú cơ sở di truyền. Từ các quần thể này, những cá thể tốt, đã thích
ứng được sinh thái địa phương được tuyển chọn, kiểm nghiệm lại và nhân vô
tính để phát triển thành dòng thương mại. Sử dụng hạt lai thì khả năng thích
ứng của chúng với môi trường địa phương sẽ cao hơn nhờ sự đa dạng về cơ sở
di truyền.
Hạt của những quả (kể cả từ cây có năng suất cao; từ quần thể hạt F1)
không biết rõ cha mẹ không nên sử dụng để làm giống. Ca cao vốn là cây giao
phấn nên nếu không được thử nghiệm đánh giá trước, sự phân ly của những hạt
không rõ nguồn gốc sẽ cho những cá thể không tốt như dự kiến.
Dòng vô tính: Là những cá thể xuất sắc được chọn lọc từ những quần
thể xác định được cha mẹ hoặc những cá thể không rõ nguồn gốc nhưng được
phát hiện thông qua điều tra tuyển chọn. Các cá thể này được nhân vô tính
(ghép, chiết hoặc giâm cành) nên vẫn giữ được hoàn toàn đặc tính của cây mẹ.
Nguồn giống này cho quần thể có độ đồng đều cao về sinh trưởng, năng suất và
chất lượng.
Các chương trình chọn tạo giống ca cao được bắt đầu từ những năm
1920 của thế kỷ trước ở nhiều quốc gia trồng ca cao. Vào những năm 1930,
1940, các nguồn gen ca cao có giá trị đã được thu thập từ các khu vực Amazon
thuộc Brazil, Ecuador và Peru. Các dòng vô tính của những nguồn gen có giá
trị này hiện vẫn được duy trì trong các bộ sưu tập nguồn gen ca cao. Sự đa
dạng di truyền lớn của ca cao đã được phát hiện trong các quần thể hoang dại ở
khu vực Amazon nhưng những đa dạng di truyền này chưa được lai tạo rộng rãi
với các dòng thuần. Tính trạng kháng bệnh hiện nay là tính trạng được các nhà
tạo giống quan tâm nhất. Các tính trạng khác được quan tâm bao gồm tăng