khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của bạch đầu ông vernonia cinerea

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BỘ MÔN HÓA
­­­­­­­­­­

MAI VĂN HIẾU

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH
KHÁNG OXY HÓA CỦA BẠCH ĐẦU ÔNG
VERNONIA CINEREA

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC

Cần Thơ, 2015


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BỘ MÔN HÓA
­­­­­­­­­­

MAI VĂN HIẾU

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH
KHÁNG OXY HÓA CỦA BẠCH ĐẦU ÔNG
VERNONIA CINEREA

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TS. NGUYỄN TRỌNG TUÂN

Cần Thơ, 2015


LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp cũng như quá trình
học tập và làm việc tại trường, để có được kết quả này, đầu tiên tôi xin gửi lời
cảm ơn chân thành và lời tri ân đến các Thầy, Cô bộ môn Hóa Học - khoa
Khoa Học Tự Nhiên - trường Đại học Cần Thơ đã tận tình chỉ bảo, động viên
tôi trong suốt 4 năm học vừa qua. Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn đến:
-

-

TS. Nguyễn Trọng Tuân đã tận tình chỉ bảo, khuyến khích và tạo điều
kiện cho tôi hoàn thành luận văn, giúp tôi định hướng được con đường
nghiên cứu khoa học của riêng mình.
ThS. Nguyễn Thế Duy, một người anh, người Thầy đã luôn khuyến
khích, chỉ bảo cho tôi từ những ngày đầu bước chân vào nhiên cứu khoa
học, giúp tôi có nền tảng vững chắc để hoàn thành tốt luận văn này.

Bên cạnh đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến TS. Đái Thị Xuân Trang,
bộ môn Sinh Học, Khoa Khoa Học Tự Nhiên đã có những đóng góp quí báo
để giúp tôi hoàn thành luận văn.
Tôi cũng xin gửi lời cám ơn đến tập thể lớp Hóa Dược K37 đã luôn đồng
hành cùng tôi 4 năm qua. Con xin cám ơn gia đình đã tin tưởng, ủng hộ con
trong suốt quãng thời gian học Đại học này.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn tổ chức phi lợi nhuận “Góp phần đào tạo nhân
tài Việt Nam” đã hỗ trợ tài chính cho tôi trong suốt 4 năm học. Song song đó,
tôi cũng gửi lời cám ơn đến “Hội cựu học sinh trường Trung học Thoại Ngọc
Hầu” luôn giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi học tập tốt.
Xin cảm ơn!

i


Trường Đại Học Cần Thơ

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Khoa Học Tự Nhiên
Bộ Môn Hóa Học

Độc Lập ­ Tự Do ­ Hạnh Phúc
­­­­­­­­­­­­

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
1. Cán bộ hướng dẫn: TS. Nguyễn Trọng Tuân
2. Đề tài: Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của bạch
đầu ông Vernonia cinerea
3. Sinh viên thực hiện: Mai Văn Hiếu MSSV: 2112023
Lớp: Hóa Dược – Khóa: 37
4. Nội dung nhận xét:
a) Nhận xét về hình thức của LVTN:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
 Những vấn đề còn hạn chế:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung
chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
d) Kết luận, đề nghị và điểm:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015
Cán bộ hướng dẫn

TS. Nguyễn Trọng Tuân

ii


Trường Đại Học Cần Thơ
Khoa Khoa Học Tự Nhiên
Bộ Môn Hóa Học

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Độc Lập ­ Tự Do ­ Hạnh Phúc
­­­­­­­­­­­­

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1. Cán bộ phản biện: ……………………………………………………………
2. Đề tài: Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của bạch
đầu ông Vernonia cinerea
3. Sinh viên thực hiện: Mai Văn Hiếu MSSV: 2112023
Lớp: Hóa Dược – Khóa: 37
4. Nội dung nhận xét:
a) Nhận xét về hình thức của LVTN:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):
 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
 Những vấn đề còn hạn chế:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung
chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
d) Kết luận, đề nghị và điểm:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015
Cán bộ phản biện

iii


TÓM TẮT

Bạch đầu ông (Vernonia cinerea) là một loại cỏ mọc hoang đã được sử
dụng từ lâu như là một vị thuốc trong y học cổ truyền. Từ các cao chiết của
Bạch đầu ông, bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH, đã xác định được
hoạt tính kháng oxy hóa của cao ethanol tổng với giá trị IC50 là: 127 g/mL.
Kết quả định tính cho thấy trong toàn cây Bạch đầu ông có chứa flavonoid,
triterpenenoid, steroid, glycoside, phenol, tannin. Từ cao chiết hexane đã phân
lập và xác định được cấu trúc của hai hợp chất là stigmasterol và một dẫn xuất
của acid béo bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Một vài sterol và
triterpene khác như: -Sitosterol, campesterol, lupeol, -amyrin cũng được
xác nhận hiện diện trong cao hexane bằng kĩ thuật GC-MS, trong đó
campesterol lần đầu được xác nhận hiện diện trong Bạch đầu ông. Các kết quả
này góp phần làm phong phú thêm vốn hiểu biết về loài Bạch đầu ông mọc ở
Việt Nam.

iv


ABSTRACT
Vernonia cinerea is widely distributed and has many traditionally
medical applications. From the various extracts of Vernonia cinerea, using the
free radical DPPH, have determined the antioxidant activity of ethanol extract
with IC50 = 127 (g/mL). The qualitative of phytochemical showed the present
of many phytochemical groups such as flavonoid, triterpenoid, steroid,
glycoside, phenol, tannin. From the hexane extract, two compounds namely:
stigmasterol and a fatty acid derivative have isolated and elucidated their
structure by NMR. Some phytosterols and triterpenes including -sitosterol,
campesterol, lupeol, -amyrin have also identified by GC-MS and campesterol
is the first time were reported in Vernonia cinerea. These results have
contributed to our knowledge about Vietnamese Vernonia cinerea.

v


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN

i

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

ii

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

iii

TÓM TẮT

iv

ABSTRACT

v

MỤC LỤC

vi

DANH SÁCH BẢNG

viii

DANH SÁCH HÌNH

ix

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

x

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
1.3 Nội dung nghiên cứu

1
1
1
1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về cây Bạch đầu ông
2.1.1 Tên gọi
2.1.2 Đặc điểm
2.1.3 Công dụng
2.1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
2.2 Hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH
2.2.1 Sơ lược về gốc tự do và tác hại
2.2.2 Các phương pháp thử hoạt tính kháng oxy hóa
2.2.3 Nguyên tắc của phương pháp DPPH

2.2.4 Cơ chế kháng oxy hóa của các hợp chất phenolic
2.2.5 Phương pháp TLC-DPPH
2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ

2
2
2
2
2
3
6
6
7
9
9
10
10

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm, thời gian và phương tiện
3.1.1 Địa điểm
3.1.2 Thu và xử lý mẫu
3.1.3 Dụng cụ và thiết bị

13
13
13
13
13

vi


3.1.4 Hóa chất
3.2 Điều chế các cao chiết
3.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng oxy hóa bằng DPPH
3.3.1 Lựa chọn các điều kiện phản ứng
3.3.2 Khả năng kháng oxy hóa của vitamin C
3.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết
3.3.4 Tính toán và biểu diễn kết quả
3.3.5 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa TLC-DPPH
3.4 Định tính thành phần hóa học của các cao chiết
3.4.1 Alkaloid
3.4.2 Flavonoid
3.4.3 Triterpenoid – steroid
3.4.4 Glycoside
3.4.5 Phenol
3.4.6 Saponin
3.4.7 Tannin
3.5 Phân lập chất từ cao hexane
3.6 Phương pháp xác định cấu trúc các chất

13
13
14
15
16
17
17
18

18
19
19
19
20
20
20
20
20
22

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả phân lập các cao chiết
4.2 Kết quả thử hoạt tính kháng oxy hóa
4.2.1 Nồng độ DPPH tối ưu
4.2.2 Đường chuẩn Vitamin C
4.2.1 Kết quả hoạt tính kháng oxy hóa
4.2.2 Kết quả hoạt tính kháng oxy hóa TLC-DPPH
4.3 Kết quả định tính thành phần hóa học
4.4 Kết quả phân lập các chất từ cao hexane
4.4.1 Hợp chất VC1
4.4.2 Hợp chất VC2
4.5 Kết quả phân tích thành phần triterpenoid-steroid

23
23
24
24
25
25

27
27
28
28
30
31

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1 Kết luận
5.2 Kiến nghị

33
33
33

TÀI LIỆU THAM KHẢO

34

PHỤ LỤC

37

vii


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1: Các sesquiterpene và hoạt tính sinh học của chúng .......................... 4
Bảng 2.2: Các phương pháp xác định khả năng chống oxy hóa ....................... 7
Bảng 2.3: Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học [22]........................... 12

Bảng 4.1: Độ hấp thu của dung dịch DPPH .................................................... 24
Bảng 4.2: Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH của Vitamin C ......................... 25
Bảng 4.3: Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH của cao chiết............................ 26
Bảng 4.4: Kết quả định tính các nhóm hợp chất.............................................. 27
Bảng 4.5: Độ dịch chuyển hóa học của VC1 so với ­stigmasterol ( ppm) 29
Bảng 4.6: Kết quả GC-MS của hhVC1 ........................................................... 31
Bảng 4.7: Kết quả GC-MS của hhVC2 ........................................................... 32

viii


DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1: Bạch đầu ông (Venonia cinerea) ....................................................... 2
Hình 2.2: Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH ................................................ 9
Hình 2.3: Cơ chế kháng oxy hóa của các hợp chất phenolic ........................... 10
Hình 3.1: Quy trình chiết phân đoạn các cao .................................................. 14
Hình 3.2: Quy trình thử hoạt tính kháng oxy hóa DPPH ................................ 16
Hình 3.3: Quy trình thử nghiệm TLC-DPPH .................................................. 18
Hình 3.4: Bố trí sắc kí cột nhanh - khô ............................................................ 21
Hình 3.5: Sơ đồ phân lập các chất từ cao hexane ............................................ 22
Hình 4.1: Sắc kí bản mỏng các cao phân đoạn ................................................ 23
Hình 4.2: Độ hấp thu theo nồng độ DPPH ở 0 và 30 phút .............................. 24
Hình 4.3: Phần trăm ức chế theo nồng độ của vitamin C ................................ 25
Hình 4.4: Phần trăm ức chế theo nồng độ của cao tổng .................................. 26
Hình 4.5: Kết quả hoạt tính kháng oxy hóa TLC-DPPH ................................. 27
Hình 4.6: Sắc kí bản mỏng hợp chất VC1 ....................................................... 28
Hình 4.7: Sắc kí bản mỏng hợp chất VC2 ....................................................... 30
Hình 4.8: Cấu trúc sơ bộ VC2 ......................................................................... 31

ix

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
br

broad, giãn rộng

d

doublet

13

C-NMR

Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance

EA

Ethyl acetate

1

Proton Nuclear Magnetic Resonance

H-NMR

Hex

Hexane

HMBC
HSQC

Heteronuclear Multiple-Bond Correlation
Heteronuclear Single Quantum Coherence

IC50

Half-maximal Inhibitory Concentration

IR

Infrared spectroscopy

MeOH

Methanol

MS

Mass Spectroscopy

m

multilet

Rf

Retention factor

s

singlet

SKC

Sắc ký cột

SKBM

Sắc ký bản mỏng

t

triplet

VitC

Vitamin C

x


CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Khí hậu Việt Nam thích hợp cho sự phát triển của nhiều loài thực vật
trong đó có nhiều loài được sử dụng làm thuốc. Bạch đầu ông là một loài cỏ
mọc hoang dại khắp nơi cả nước, ở một số vùng nó được dùng để ăn như một

loại rau. Bên cạnh đó, từ lâu trong dân gian đã sử dụng Bạch đầu ông như là
một vị thuốc nam. Tuy nhiên, các nghiên cứu về Bạch đầu ông vẫn còn hạn
chế, chưa làm rõ được nhiều hoạt tính sinh học tiềm năng cũng như thành
phần hóa học của nó. Do đó, việc đánh giá thành phần hóa học và hoạt tính
sinh học, của Bạch đầu ông là cần thiết nhằm làm sáng tỏ thêm nhiều hoạt tính
sinh học tiềm năng, góp phần làm rõ hơn tác dụng trị liệu của nó từ đó định
hướng sử dụng Bạch đầu ông vào lĩnh vực dược học hiệu quả hơn.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Trên cơ sở các nghiên cứu ở ngoài nước cũng như những hạn chế của các
nghiên cứu trong nước. Đề tài “Thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy
hóa của Bạch đầu ông Vernonia cinerea” mong muốn đạt được các mục
tiêu sau:
- Định tính các nhóm hợp chất có trong Bạch đầu ông.
- Phân lập các hợp chất từ cao chiết Bạch đầu ông ở quy mô phòng thí
nghiệm.
- Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa ở mức độ in vitro của cao chiết từ
Bạch đầu ông.
1.3 Nội dung nghiên cứu
- Thu hái, và xử lý nguyên liệu: Bạch đầu ông sau khi thu hái được cắt
nhỏ, phơi khô rồi nghiền thành bột.
- Trích ly cao ethanol tổng từ bột khô, sử dụng các dung môi có độ
phân cực khác nhau như: hexane, ethyl acetate, để phân lập các nhóm hợp
chất có độ phân cực khác nhau bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng.
- Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của các cao chiết bằng phương
pháp DPPH, TLC-DPPH.
- Khảo sát thành phần hóa học các cao chiết thu được.
- Xác định cấu trúc của các hợp chất cô lập được bằng phương pháp
phổ như: NMR, IR, MS…
1

CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về cây Bạch đầu ông
2.1.1 Tên gọi
Tên gọi khác: Nụ áo hoa tím, Bạc đầu nâu, Dạ hương ngưu.
Tên khoa học: Vernonia cinerea (L.) Less., họ Cúc – Asteraceae [1].
2.1.2 Đặc điểm
Mô tả thực vật: Cây thảo cao 20-80cm. Thân đứng có khía, có lông mềm
rạp xuống. Lá hình dải, hình múi mác hay hình quả Trám, gần như nguyên hay
có răng rõ, kích thước rất thay đổi. Cụm hoa là ngù ở ngọn, đôi lúc ở bên, gồm
nhiều đầu. Lá bắc xếp thành 3 hàng. Mào lông màu trắng hay vàng nhạt, lông
không đều nhau, những lông ngoài rất ngắn. Tràng hoa màu hồng hay đo đỏ,
các thuỳ thuôn, hình chỉ. Bao phấn có tai rất ngắn. Quả bế có lông nhung dày,
có rạch hay không [Hình 2.1].

Hình 2.1: Bạch đầu ông (Venonia cinerea)
Phân bố: Loài cây nhiệt đới, rất phổ biến ở nước ta, mọc hoang ven
đường đi, bãi cát, bờ ruộng từ miền núi đến đòng bằng trung du và ven biển.
Cũng phân bố ở nhiều nơi khác vùng Viễn Đông, ở châu Phi, châu Ðại Dương.
2.1.3 Công dụng
Tính vị, tác dụng: Cây có vị đắng, ngọt, tính mát; có tác dụng thanh can,
thoái nhiệt, an thần. Ở Java (Indonesia) người ta dùng toàn cây nấu chín ăn
như rau. Ở Ðông Phi Châu, lá và hoa được xem như là lợi tiêu hoá.

2


Công dụng: Thường dùng trị: 1. Sổ mũi, sốt, ho (lá); 2. Lỵ, ỉa chảy, đau
dạ dày (rễ); 3. Viêm gan (hoàng đản cấp tính); 4. Suy nhược thần kinh; 5. Mụn

nhọt, viêm tuyến sữa, hắc lào, chàm, rắn cắn... Ở Vân Nam, Trung Quốc cây
còn được dùng trị sốt rét, đòn ngã, mất ngủ, bạch đới, trẻ em khóc đêm. Ở
Nouvelle-Calédonie, cây được dùng hãm uống giúp lợi tiêu hóa, lợi dạ dày, trị
thấp khớp.
Cách dùng: Ngày dùng 15-30g cây khô sắc uống với các vị thuốc khác.
Dùng lá giã đắp để chữa đinh nhọt, rắn cắn và bệnh ngoài da. Bột lá lẫn với
vôi dùng đắp trị đau đầu, vết thương. Có thể dùng cành lá nấu nước rửa.
Ðơn thuốc:
- Sổ mũi, sốt, ho: Bạch đầu ông, Ngũ trảo, rễ Bồ hòn, lá Gừa (sanh) mỗi vị
15g nấu nước uống.
- Suy nhược thần kinh: Bạch đầu ông, Hy thiêm mỗi vị 15g, Chua me đất,
Rau bợ mỗi vị 12g, Sẹ (Alpinia oxyphylla) 6g, sắc uống.
- Huyết áp cao: Bạch đầu ông, Chua me đất, Hy thiêm mỗi vị 15g, đun sôi
lấy nước uống.
2.1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
a) Ngoài nước
Đã có nhiều công trình nghiên cứu ngoài nước về hoạt tính sinh học của
các cao chiết từ Bạch đầu ông. Nghiên cứu cho thấy cao methanol có khả năng
kháng khuẩn, có thể tiêu diệt và làm thay đổi hình thái của Pseudomonas
aeruginosa [2], cao benzene thể hiện hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng, có khả
năng kháng hàng loạt vi khuẩn Gram (-) lẫn Gram (+) [3]. Nghiên cứu trên mô
hình chuột cho thấy cao lá của Bạch đầu ông với nồng độ từ 100-400 mg/kg
có tác dụng giảm đau, hạ sốt kháng viêm nên có tiềm năng trong việc điều trị
sốt rét [4, 5]. Ngoài ra, cao chloroform từ lá có hoạt tính lợi tiểu trên mô hình
chuột bạch tạng trong khi cao nước và cao methanol lại có hoạt tính chống lợi
tiểu [6]. Nghiên cứu còn cho thấy cao chiết methanol không gây ra độc tính
trên mô hình chuột và brine shrimp thử nghiệm [7], từ đó cho thấy việc sử
dụng Bạch đầu ông là an toàn.
Các nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy thành phần chủ yếu là
các sesquiterpene với việc đã phân lập được rất nhiều sesquiterpene 1­19 với

nhiều hoạt tính đáng chú ý như kháng ung thư, kháng viêm, kháng sốt rét
[Bảng 2.1]. Ngoài ra, thành phần tinh dầu Bạch đầu ông cũng chứa gần 90%
các sequiterpene tiêu biểu là : β-caryophyllene (23.2%), δ-cadinene (10.3%),
γ-amorphene (7.5%), cis-β-guaiene (6.8%), premnaspirodiene (6.3%) and 9epi-β-caryophyllene (4.8%) [8].
3


Bảng 2.1: Các sesquiterpene và hoạt tính sinh học của chúng
Hợp chất

Bộ phận

Hoạt tính

Tham
khảo

1

8-Tigloyloxyhirsutinolide

Hoa, toàn
thân

Kháng viêm

[9-11]

2

8-Hydroxyhirsutinolide

Hoa, lá và
thân

Kháng viêm

[10, 11]

3

8-Hydroxyl-1-Omethylhirsutinolide

Hoa

4

8-Tigloyloxyhirsutinolide-13-Oacetate

Hoa, toàn
thân

Kháng viêm, ức chế
NO, kháng sốt rét, diệt
u nguyên bào đệm,
kháng ung thư vú

[9-11]

5

8-(2-Methylacryloyloxy)hirsutinolide-13-O-acetate

Hoa, toàn
thân

Kháng viêm, diệt u
nguyên bào đệm,
kháng ung thư vú

[9-11]

6

8-(2-Methylacryloyloxy)-1methoxyhirsutinolide-13-O-acetate

Hoa

Ức chế NO

[11]

7

Vernolide-B

Hoa, lá và
thân

Ức chế NO, diệt u

nguyên bào đệm

[10, 11]

8

Hirsutinolide-13-O-acetate

Hoa

Ức chế NO

[9, 11]

9

Vernolide-A

Hoa, lá và
thân

Kháng viêm, ức chế
NO

[10, 11]

10

8-epoxymethacryloyloxyhirsutinolide-13-O-acetate

Toàn thân

[11]

4

[9]


11

Vernolide C

Toàn thân

[9]

12

Piptocarphin D

Toàn thân

[9]

13

8-(4-Hydroxymethacryloyloxy)hirsutinolide-13-O-acetate

Toàn thân

Kháng sốt rét

[9]

14

Vernolide D

Toàn thân

Kháng sốt rét

[9]

15

8α-(2′ (Z)-Tigloyloxy)-hirsutinolide

Thân và lá

16

8α-(2′(Z)-Tigloyloxy)hirsutinolide-13-O-acetate

Thân và lá

17

8α-(4-Hydroxytigloyloxy)hirsutinolide

Thân và lá

18

8α-Hydroxy-13-O-tigloylhirsutinolide

Thân và lá

19

8α-(2-Methylacryloyloxy)hirsutinolide

Thân và lá

[10]
Kháng ung thư vú

[10]
[10]

Diệt u nguyên bào
đệm

[10]
[10]

Ngoài ra, cũng đã phân lập được một vài hợp chất dạng isoprenoid,
flavonoid và dẫn xuất của acid béo bao gồm: Loliolide 20, isololiolide 21
(3R)-3-hydroxy-ionone

22,
apigenine
23,
(9Z,12S,13S)dihydroxy-9-octadecanoic acid 24 [10].
HO
O
HO

O
R

O
22

20 R = CH3
21 R = CH3

OH
HO

O

OH
HO

CH2

(CH2)4CH3

7

OH O

O

OH
24

23

b) Trong nước
Nghiên cứu trong nước chỉ mới bước đầu xác định thành phần hóa học
với việc phân lập và xác định cấu trúc của 4 hợp chất thuộc loại triterpenesteroid bao gồm: lupeol acetate 25, -amyrinacetate 26, -sitosterol 27, spinasterol 28 [12].

5


2.2 Hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH
2.2.1 Sơ lược về gốc tự do và tác hại
Gốc tự do là những nguyên tử, phân tử hay những mảnh nguyên tử, phân
tử có chứa một hay nhiều electron không độc thân liên kết lớp ngoài cùng, có
khả năng tồn tại độc lập trong một thời gian ngắn. Chúng là những phần tử có
khả năng phản ứng cao, dễ dàng lấy đi điện tử của phân tử khác nhằm bền
vững hoá lớp vỏ điện tử của mình nhưng đồng thời sinh ra một gốc tự do mới,
gốc tự do mới lại tiếp tục phản ứng với phân tử khác và tạo thành phản ứng
dây chuyền [13].
Oxy hóa stress là hiện tượng khi các gốc tự do có vai trò quan trọng
trong cơ thể, là những chất chuyển hóa trung gian có hoạt tính mạnh, vượt quá
sự kiểm soát của cơ thể tấn công vào hệ thống các mô, cơ quan, các base trong
nucleic acid, các amino acid trong chuỗi protein, các acid béo chưa bão hoà…

và gây ra hàng loạt biến đổi có hại cho cơ thể như: lão hóa, các vấn đề tim
mạch, thoái hóa thần kinh, các bệnh ung thư,... Tuy nhiên, quan điểm hiện tại
cho rằng oxy hóa stress không hẳn luôn có hại. Tùy thuộc vào mức độ biểu
hiện, nó có thể đóng vai trò quan trọng trong một số quá trình quan trọng trong
cơ thể như: trong lộ trình truyền tín hiệu, sự tổng hợp các enzyme chống oxy
hóa, các quá trình tự sửa chữa, sự nhân lên hay chết theo chương trình của tế
bào. Vì thế, sự điều hòa các chất chống oxy hóa không đúng cách có thể gây ra
các tác động tiêu cực đến cơ thể sống [13].
6


Chất chống oxy hóa là những phân tử có thể ức chế quá trình oxy hóa
của các phân tử khác
2.2.2 Các phương pháp thử hoạt tính kháng oxy hóa
Ở mức độ in vitro, có nhiều phương pháp khác nhau để đánh giá khả
năng kháng oxy hóa nhưng nhìn chung rơi vào ba nhóm phương pháp là:
quang phổ, điện hóa hóa học và sắc kí. [Bảng 2.2] trình bày chi tiết về nguyên
tắc của từng phương pháp cũng như cách để xác định điểm kết thúc của các
phương pháp thử của nhóm quang phổ [14, 15].
Phương pháp quang phổ dựa trên phản ứng của một gốc tự do (DPPH,
ORAC, HORAC, TRAP); cation gốc tự do (ABTS) hay phản ứng tạo phức
(FRAP, PFRAP) với một chất chống oxy hóa có khả năng cho một nguyên tử
hydrogen. Phương pháp đo điện hóa học dựa vào sự khác biệt về điện trước và
sau khi phản ứng. Trong các phương pháp này, kĩ thuật quét thế vòng tuần
hoàn và biamperometry được sử dụng phổ biến nhất. Các phương pháp sắc kí
cũng cho phép xác định khả năng kháng oxy hóa toàn phần nhưng có ưu điểm
là cho phép tách riêng các thành phần kháng oxy hóa từ đó có thể định lượng
được chính xác các thành phần có hoạt tính kháng oxy hóa.
Bảng 2.2: Các phương pháp xác định khả năng chống oxy hóa
Phương pháp

Nguyên tắc

Điểm kết thúc

Phương pháp quang phổ
DPPH

Chất chống oxy hóa phản ứng với gốc Đo cường độ màu.
tự do hữu cơ.

ABTS

Chất chống oxy hóa phản ứng với gốc Đo cường độ màu.
tự do hữu cơ.

FRAP

Chất chống oxy hóa phản ứng với phức Đo cường độ màu.
Fe(III).

PFRAP

Chất chống oxy hóa khử kali Đo cường độ màu.
ferricyanide và phản ứng tiếp theo của
kali ferrocyanide với Fe3+.

CURAC

Chất chống oxy hóa khử Cu(II) thành Đo cường độ màu.

Cu(I).

ORAC

Chất chống oxy hóa phản ứng với gốc Đo độ giảm cường
tự do peroxyl (ROO•) được sinh ra từ độ huỳnh quang của
AAPH
(2,2’-azobis-2-amidino- fluorescein.
propane).

HOARC

Chất chống oxy hóa trung hòa gốc tự do Đo độ giảm cường
OH• sinh ra bởi Co(II) dựa trên hệ thống độ huỳnh quang của

7


tương tự Fenton.
TRAP

fluorescein.

Chất chống oxy hóa trung hòa các gốc Độ mất khả năng
tự do dẫn xuất từ luminol, sinh ra bởi sự phát quang hóa học.
phân hủy AAPH.
Phương pháp điện hóa hóa học

Quét thế vòng
tuần hoàn

(Cyclic
voltammetry)

Đo thế bằng điện cực, thế của điện cực Đo cường độ của tín
được tăng từ giá trị thế ban đầu tăng đến hiệu cathod/ anod.
giá trị thế cuối cùng, rồi giảm từ từ lại
đến giá trị ban đầu (vòng thế tuần
hoàn). Ghi lại cường độ của thế.

Đo dòng điện
(Amperometry)

Thế của điện cực dùng để đo được giữ Đo cường độ tín hiệu
cố định
bằng một hệ oxy hóa
- khử.

Biamperometry

Phản ứng của chất phân tích với chất Đo thế của hai điện
oxy hóa sẽ tạo thành một cặp oxy hóa, cực
giống
nhau
khử.
với…..
Phương pháp sắc kí

Sắc kí khí

Phân tách hỗn hợp chất dựa trên sự Đầu dò ion hóa ngọn

phân bố giữa pha tĩnh lỏng và pha động lửa hay đầu dò đo độ
là một chất khí.
dẫn nhiệt.

Sắc kí lỏng hiệu
năng cao

Phân tách hỗn hợp chất dựa trên sự Đầu dò UV-Vis,
phân bố giữa pha tĩnh rắn với pha động huỳnh quang, khối
là một chất lỏng có độ phân cực khác phổ, điện hóa.
nhau ở áp suất cao.

Ở mức độ thử nghiệm in vivo, một vài phương pháp bao gồm:
- Đánh giá khả năng khử Fe của huyết tương
- Đánh giá khả năng khử glutathione (GSH)
- Đánh giá mức glutathione peroxydase (GSHPx)
- Đánh giá glutathione-S-tranferase (GSt)
- Phương pháp superoxyde dismutase (SOD)
- Catalase (CAT)
-

Thử nghiệm hoạt tính của -glytamyl transpeptidase

-

Thử nghiệm glutathione reductase (GR)
Thử nghiệm mức độ peroxy hóa của lipid
Thử nghiệm LDL

Trong tất cả các phương pháp thử kể trên, DPPH là phương pháp được

sử dụng phổ biến nhất ở mức độ in vitro trong khi đó LPO là phương pháp
được sử dụng phổ biến nhất ở mức độ in vivo để đánh giá khả năng kháng oxy
hóa [16]. Vì thế, phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa thông qua
8


khả năng làm sạch gốc tự do DPPH được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng
oxy hóa của các cao chiết từ bạch đầu ông.
2.2.3 Nguyên tắc của phương pháp DPPH
Phương pháp DPPH được giới thiệu lần đầu tiên bởi Marsden Blois vào
năm 1958. DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là gốc tự do ổn định, bền ở
nhiệt độ thường, dạng bột màu đen ở điều kiện thường, có màu tím đặc trưng
trong dung môi (thường dùng methanol, ethanol). Gốc DPPH có bước sóng
hấp thu cực đại ở 517 nm và độ hấp thu của nó giảm tương ứng khi nguyên tử
N mang một điện tử lẻ nhận một điện tử hoặc hydro từ các chất chống oxy hóa
(dung dịch DPPH từ màu tím đen chuyển sang màu vàng) [Hình 2.2]. Do đó,
DPPH được sử dụng rộng rãi và là thử nghiệm cơ bản để đánh giá hiệu quả
hoạt động làm sạch gốc tự do của các chất chống oxy hóa dựa trên sự thay đổi
độ hấp thu của dung dịch DPPH ở 517 nm.

Hình 2.2: Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH
Khả năng kháng oxy hóa của một chất được biểu hiện bằng giá trị IC50,
nồng độ chất chống oxy hóa để có thể ức chế 50% gốc tự do DPPH. Giá trị
IC50 càng nhỏ, hoạt tính kháng oxy hóa càng mạnh.
2.2.4 Cơ chế kháng oxy hóa của các hợp chất phenolic
Các hợp chất phenolic là thành phần chủ yếu trong cao chiết thực vật có
vai trò như là các chất chống oxy hóa tự nhiên. Cơ chế phản ứng của các hợp
chất phenolic (ArOH) với DPPH được biểu diễn theo hai cơ chế: cơ chế
chuyển dịch electron (Hydrogen Atom Transfer – HAT) và cơ chế dịch
chuyển electron mất tuần tự proton (Squential Proton Loss Electron Transfer –

SPLET). Trong cơ chế HAT, nguyên tử H trong liên kết O–H dịch chuyển trực
tiếp từ ArOH đến DPPH. Thay vào đó, cơ chế SPLET khởi đầu bằng sự
deproton hóa tạo ion phenolic (ArO─) rồi DPPH nhận một electron từ ArO─.
9


[Hình 2.3] biểu diễn sự tương quan giữa hai cơ chế HAT và SPLET, từ đây ta
có thể thấy dung môi dung để hòa tan hỗn hợp phản ứng có thể ảnh hưởng đến
phản ứng của chất chống oxy hóa với DPPH thông qua cơ chế HAT. Dung
môi có thể đóng vai trò là chất cho hay nhận liên kết hydrogen [14].

Hình 2.3: Cơ chế kháng oxy hóa của các hợp chất phenolic
2.2.5 Phương pháp TLC­DPPH
Sắc kí bản mỏng kết hợp với việc hiện hình bằng DPPH (TLC-DPPH) là
một phương pháp cải biến của sắc kí bản mỏng thông thường cho phép định
tính khả năng kháng oxy hóa của một chất hay của các cao chiết thực vật. Bản
mỏng sau khi giải ly sẽ được hiện hình bằng dung dịch DPPH. Các thành phần
kháng oxy hóa sẽ chuyển sang màu vàng trên nền tím của DPPH tương tự như
khi ủ dung dịch chất kháng oxy hóa với cao chiết [17, 18]. Phương pháp này
có thể sử dụng cho cả bản mỏng pha thường và cả pha đảo [19].
Ưu điểm của phương pháp này là cho phép định tính nhanh các thành
phần gây ra hoạt tính kháng oxy hóa nên cho phép sử dụng để sàng lọc các
hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa từ thực vật [20]. Đồng thời, nó còn cho
phép đánh giá định tính khả năng kháng oxy hóa của các thành phần kém phân
cực vốn rất khó khi sử dụng phương pháp DPPH thông thường do khả năng
hòa tan kém của chúng trong các dung môi phân cực như ethanol, methanol.
2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ
Có nhiều phương pháp phổ nghiệm khác nhau để xác định cấu trúc một
chất như: phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (Nuclear Magnetic Resonance);
khối phổ MS (Mass Spectroscopy), phổ hồng ngoại (IR), phổ RAMAN, phổ

nhị sắc vòng tròn CD (Circular Dichroism), phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis
(Ultraviolet-Visible spectroscopy), nhiễu xạ tia X (X-Ray) [21].
Trong hóa học hữu cơ, để xác định cấu trúc hóa học một chất chưa biết,
cần phải kết hợp nhiều phương pháp phổ khác nhau. Công thức hóa học được
xác định chính xác bằng khối phổ MS thay cho các kĩ thuật phân tích nguyên
tố cổ điển kém chính xác. Phổ hồng ngoại cho biết thông tin về các nhóm chức
tồn tại trong phân tử trong khi đó, kĩ thuật UV chỉ cho thông tin ít ỏi, kém
10


chính xác về một số nhóm hợp chất đặc trưng nên ít khi được dùng trong việc
xác định cấu trúc phân tử. Phổ cộng hưởng từ NMR là một công cụ mạnh và
rất hữu dụng cho phép xác định khung sườn carbon của phân tử. Trong một số
trường hợp, nó còn cho phép xác định hóa học lập thể của phân tử. Nếu các kĩ
thuật cộng hưởng từ chưa đủ để kết luận lập thể của phản ứng thì có thể sử
dụng thêm các kĩ thuật phổ khác như phổ nhị sắc vòng tròn CD hay phổ tán xạ
quay ORD. Nhiễu xạ tia X (X-Ray) là một công cụ mạnh mẽ cho phép xác
định cấu trúc của các chất, đặc biệt là trong việc xác định cấu trúc của các
protein vốn dĩ các phương pháp phổ kể trên không thực hiện được. [Bảng 2.3]
trình bày tóm tắt các các phương pháp phổ kể trên cũng như uu nhược điểm
của từng phương pháp.

11


Bảng 2.3: Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học [22]
H-1

C-13

MS

IR/RAMAN

UV-VIS

ORD/CD

X-Ray

Loại bức xạ

Radio

Radio

Không

Hồng ngoại

Tử ngoại,
khả kiến

Tử ngoại,
khả kiến

Tia X

Thang phổ

0-15 ppm

0-220 ppm

50-4000 amu

400-4000 cm-1

200-800 nm

185-600 nm

Không

Mẫu

 1mg

 5mg

< 1mg

< 1mg

< 1mg

< 1mg

Đơn tinh thể

CTPT

Một phần

Một phần

Được

Không

Không

Không

Được

Được

Được

Hạn chế

Được

Rất hạn chế

Rất hạn chế

Được

Một phần

Hạn chế

Một phần

Hạn chế

Không

Không

Được

Khung carbon

Được

Được

Không

Không

Không

Không

Được

Vị trí nhóm thế

Được

Được

Không

Hạn chế

Không

Không

Được

Lập thể

Được

Được

Không

Hạn chế

Không

Không

Được

Phân tích hỗn hợp
đồng phân

Được

Được

Được (GC-MS,
LC-MS)

Được
(GC-IR)

Không

Không

Được (nếu tách được)

Thông tin
độ tinh khiết

Được

Được

Được

Được

Hạn chế

Hạn chế

Hạn chế

Diện tích peak
Độ dịch chuyển
Hằng số ghép

Độ dịch chuyển

Ion đơn hay
đa điện tích

Trạng thái
dao động

Trạng thái
electron

[]

Vị trí tương đối của
các nguyên tử
Cấu hình tuyệt đối
R/S

 (ppm)

 (ppm)

m/z

cm-1

Nm

nm

-

Nhóm chức
Cấu trúc phân tử

Đo cái gì

Đơn vị
Phổ đồ

12


CHƯƠNG 3
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm, thời gian và phương tiện
3.1.1 Địa điểm
Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm Hóa Sinh 1, khoa Khoa

Học Tự Nhiên, trường Đại học Cần Thơ từ tháng 01/2015 - 04/2015.
3.1.2 Thu và xử lý mẫu
Bạch đầu ông được thu hái vào 12/2014 tại khuôn viên trường Đại học
Cần Thơ trong thời kì cây đang ra hoa. Mẫu được thu hái toàn thân, kể cả rễ
rồi rửa sạch, loại bỏ tạp bẩn, cắt nhỏ được 20 kg mẫu tươi. Sấy mẫu tươi ở
600C đến khi mẫu giòn, có thể bóp vụn rồi nghiền mẫu thành bột thu được 3,2
kg bột khô, trữ mẫu trong túi nylon được cột kín ở nhiệt độ phòng.
3.1.3 Dụng cụ và thiết bị







Máy quang phổ hồng ngoại FT – IR Nicolet 6700.
Máy cô quay chân không.
Máy soi UV bước sóng 254 và 365 nm.
Cân phân tích Sartorius.
Bể siêu âm.
Máy GC-MS Thermo.

3.1.4 Hóa chất
 Các dung môi: hexane, ethyl acetate, acetone, methanol, ethanol… của
hãng Chemsol.
 Silica gel Merck (0,040 – 0,063 mm).
 Sắc kí bản mỏng tráng sẵn (Merck).
 DPPH Sigma.
 Vitamin C.
3.2 Điều chế các cao chiết

Bột Bạch đầu ông khô (3,2 kg) được cho vào túi vải rồi cột kín, ngâm
chiết trong 20 L EtOH 96 độ / 5 lần, mỗi lần ngâm không dưới 24 h. Sau đó
dịch chiết được lọc qua giấy lọc rồi tiến hành cô đuổi dung môi dưới áp suất
thấp thu được khoảng 0,5 L cao chiết EtOH tổng dạng lỏng.
Cao chiết EtOH tổng được phân bố vào 0,5 L nước dưới sự hỗ trợ của
sóng siêu âm thu được tổng cộng 1 L dịch nước. Tiến hành chiết phân bố lỏng13