Sản xuất vaccin ăn viêm gan b trên cây cà chua nhờ agrobacterium tumefaciens

ĐỀ TÀI:

Sản xuất vaccin ăn viêm gan B
trên cây cà chua nhờ
Agrobacterium tumefaciens
GVHD
NHÓM 1

Ngô Thái Bích Vân


Định nghĩa
Vaccine ăn từ thực vật là vaccine tiểu
phần protein làm kháng nguyên mong muốn
có thể tác động vào thể dịch, kích thích cả hệ
thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào
Vaccine ăn được có hoạt tính tương tự
như vaccine thông thường, chỉ khác là
vacine này được thực vật sản xuất trong
những phần ăn được như lá, củ, quả, hạt.


Ưu điểm của vaccin ăn
-Dể dàng tăng qui mô sản xuất và dể thu sinh
khối
-Tính ổn định cao,dễ bảo quản và sử dụng
-Tính ăn được
- Tính an toàn
- Vaccine ăn được kích thích sản xuất kháng
thể của hệ thống miễn dịch hiệu quả hơn
vaccine tiêm

NGUYÊN LÝ SẢN XUẤT VACCINE ĂN ĐƯỢC
-Lựa chọn gen cần được biểu hiện (gen quan tâm) và
đưa vào một vector thích hợp
-Lựa chọn đối tượng thực vật thích hợp để chuyển
gen
-Chuyển vector tái tổ hợp mang gen quan tâm vào
thực vật đã lựa chọn bằng các phương pháp chuyển
gen khác nhau
-Kiểm tra biểu hiện của gen quan tâm trong những bộ
phận ăn được của thực vật
-Thử nghiệm khả năng đáp ứng miễn dịch của
vaccine sản xuất từ thực vật
-Sử dụng vaccine đã thử nghiệm thành công bằng
cách ăn tươi dưới dạng thức ăn đã chế biến.


Gen lấy từ nguồn bệnh người được chuyển
vào vi khuẩn gây nhiễm thực vật
Vi khuẩn được nhiễm vào các
mẫu lá
Mầm tạo đựoc từ các mẫu lá
mang gen bệnh người
Khi ăn gây ra
phản ứng miễn
dịch mầm bệnh


Viêm gan B: virus viêm gan B

   
- Viêm gan B
(viêm gan virus B) là
bệnh phổ biến nhất
và lây lan mạnh ở
người hiện nay. Theo
WHO (tổ chức y tế
thế giới) cho biết
hàng năm có hơn 2 tỷ
người nhiễm virus
viêm gan B, trong đó
khoảng 300 triệu
người mang virus
mãn tính và hậu quả
là trên 1 triệu người
chết/ năm
.

- Ở Việt Nam, cứ 100 người thì có 15 26 người nhiễm virut viêm gan B và có
tới quá một nửa là trẻ em dưới 15 tuổi


Nước ta là vùng lưu hành cao của bệnh viêm gan do siêu vi
B (HBV). Tỷ lệ người mang mầm bệnh vào khoảng 10-15 %
dân số (trên dưới 10 triệu người).
 Tình trạng nhiễm này đã gây ra nhiều hậu quả nghiêm
trọng. Bệnh này lây lan theo hướng đa dạng và phức tạp,
trường hợp bệnh mạn tính có thể dẫn đến x ơ gan và ung
thư gan, thời gian chữa trị kéo dài hơn nữa chi phí điều trị
còn rất cao so với thu nhập.

 Cách tốt nhất là phòng ngừa và một trong các biện pháp
phòng ngừa quan trọng là chủng ngừa. Tuy nhiên, chi phí
cho chủng ngừa bệnh cũng còn khá cao nếu tuân thủ phác
đồ điều trị tiêu chuẩn (tiêm nhiều mũi cách quãng thời gian).


Cấu trúc virus HBV


Kích thước, đặc tính
 HBV là một loài virus nhỏ, đường kính 42-45 nm.
 HBV bền vững với nhiệt độ: ở nhiệt độ 100oC virus
HBV sống được 30 phút, ở -20oC sống tới 20 năm.
 HBV kháng ete (eter), nhưng bất hoạt trong formalin
(fócmon).


Cấu trúc của virus gồm:
- Lõi acid nucleic: ADN hoặc ARN
- Vỏ protein
- Vỏ capsit: là các chuỗi đơn hoặc
kép của các phân tử protein cấu
trúc, các phân tử này tạo nên các
capxome. Mỗi loại virus có một loại
capxome khác nhau


 Bộ gen của HBV là một phân tử ADN vòng có
cấu trúc mạch kép không hoàn toàn, kích
thước 3200base.

 Được cấu tạo bởi 2 sợi có chiều dài không
bằng nhau. Chuỗi dài nằm ngoài có cực âm
tính, tạo nên một vòng tròn liên tục có chiều
dài cố định là 3,2Kb và mã hoá cho các thông
tin di truyền của virus.
 Chuỗi ngắn nằm trong có cực tính dương
thay đổi và chỉ bằng 50-80% chiều dài sợi
âm.
 HBV có cấu tạo nhỏ gọn do có sự tiết kiệm
trong cấu trúc bộ gen nhờ cách sắp xếp
những miền giao của các gen S, C, P và X
nên có khả năng tổng hợp được nhiều
protein của virus


Caáu taïo boä gen HBV


Kháng nguyên của Virus
 1. HBsAg(Hepatitis B surface Antige- KN bề mặt):
 Là kháng nguyên bề mặt của HBV và cũng là
kháng nguyên bao ngoài.
 Kháng thể đối với HBsAg được kí hiệu là Anti-HBs
- Hepatitis B surface Antigen.
 Đây là loại kháng nguyên duy nhất được sử dụng
để sản xuất vaccin kháng HBV
 2. HBeAg(Hepatitis B evolope Antigen-KN vỏ nhân
của VRVGB):
 Là kháng nguyên xuất hiện sớm thứ 2 sau HBsAg.
 Máu có HBeAg không được dùng làm vacxin.

 3. HBcAg (Hepatitis B core Antigen-KN lõi):
 Là kháng nguyên lõi của HBV nằm riêng biệt trên
bề mặt nucleocapsid.


Đặc điểm của vi khuẩn
Agrobacterium
tumefaciens
- A. tumefaciens
là một loài
trực khuẩn sống trong
đất, kích thước 2,5-3,0 x 0,7-0,8nm, dạng đơn bào,
không tạo ra bào tử, có vỏ và lông roi, là vi khuẩn
hiếu khí, nhuộm gram (-), khuẩn lạc tròn và rìa nhẵn.
- Khuẩn lạc màu trắng kem, nhẵn, bóng, tròn, nhỏ,
rìa đều đặn và có màu xanh da trời nhạt sau đó đậm
dần trên môi trường chỉ thị D2M.
- Vi khuẩn A. tumefaciens không có khả năng
khử arginine, không phân giải gelatin, có thể phân
giải các loại đường, tinh bột, tryptophan, tạo NH3 và
H2S, khử oxydase.
- Vi khuẩn phát triển mạnh ở nhiệt độ từ 25-300C,
và phát triển tốt trong khoảng pH 6 -7.


Hình ảnh vi khuẩn Agrobacterium


Sự gây ra các khối u do Agrobacterium
 Agrobacterium tumefaciens gây ra bệnh khối u hình

chóp (crown gall) và bệnh lông rễ (hairy root) ở các
vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm
 Cơ chế gây bê ênh :
- - Sau khi xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn đoạn TDNA vào bô ê máy di truyền của tế bào thực vâ êt.
- - Một số gene nằm trên vùng T-DNA có khả năng
điều khiển sự tổng hợp các hormone sinh trưởng
như aucine, cytokinin và phytohormones, dẫn đến
sự phân bào nhanh chóng ở các tế bào chuyển
gene, đây chính là lý do tế bào phát triển thành khối
u
- Cây bị nhiễm Agrobacterium tumefaciens qua các
vết thương, khi đó các khối u đươc hình thành ngay
chổ lây nhiễm và sự phát triển của khối u này sau đó
không phụ thuộc vào sự có mặt của Agrobacterium
nữa


Cấu tạo plasmid


Ti-plasmid của Agrobacterium
tumefaciens
Cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium bao gồm
NST và Ti- plasmid có kích thước khoảng 200-250
kb. Chúng được duy trì ổn định trong tế bào vi
khuẩn Agrobacterium ở nhiệt độ dưới 300C.
Ti-plasmid có 4 vùng tương đồng:
• Vùng T-DNA (transferred DNA)
• Vùng gen vir (virulence)
• Vùng CON

• Vùng ORI.


a)Vùng T-DNA
- Đây là vùng được chuyển vào tế bào thực
vật và hợp nhất với genome nhân của tế
bào thực vật.
- T-DNA ổn định trong genome nhân.Vị trí
hợp nhất của T-DNA vào DNA thực vật là
hoàn toàn ngẫu nhiên.
-Vùng T-DNA có kích thước khoảng 24 kb.


b) Vùng vir:
Là vùng chứa các Gene vir ((virulence gene) mã
hóa cho các protein thực hiện việc cắt, chuyển và gắn TDNA vào genome thực vật.

c) Vùng CON:
Vùng mã hóa chức năng tiếp hợp

d) Vùng ORI :
Vùng mã hóa chức năng tái bản và khởi điểm tái
bản


Quá trình chuyển gen từ vi khuẩn vào tế bào thực vật



Cơ chế chuyển T-DNA agrobacterium vào tế

 Agrobacterium mang plasmid gây khối u ở thực
bào
vật này chứa các gen vir và vùng gen cần
vật,thực
plasmid

chuyển (T-DNA).
 Gen quan tâm được chèn vào vùng T-DNA.
 Các tế bào tổn thương thực vật tiết ra hợp chất
(phenol) bảo vệ, hợp chất này kích thích sự biểu
hiện gen vir ở Agrobacterium. Vir protein tạo ra Tstrand từ vùng T-DNA trên Ti-plasmid.
- đó vi khuẩn gắn vào tế bào thực vật, T-strand
 Sau
và một số protein vir chuyển vào tế bào thực vật
qua kênh vận chuyển. Trong tế bào thực vật, các
protein vir tương tác với T-strand tạo ra phức hệ (Tcomplex).
 Phức hệ này vào nhân tế bào thực vật, T-DNA chèn
vào bộ gen thực vật và biểu hiện gen quan tâm.


Một hệ thống chuyển gen bằng
Agrobacterium thường bao gồm:
1.Một chủng Agrobacterium mang vùng vir và một
T-DNA có chứa gen muốn chuyển.
2.Vùng vir và T-DNA có thể nằm trên cùng 1
vector hoặc trên các vector riêng biệt.
3.T-DNA được chuyển vào tế bào hoặc mô thực
vật và sau đó được gắn vào genome thực vật.
4.Gene chuyển biểu hiện trong tế bào thực vật.
5.Các tế bào hoặc mô chuyển gene tái sinh thành

cây hoàn chỉnh


Quá trình tạo vaccine viêm gan B:
1. Thu nhận Gene HBsAg chèn vào vector chuyển
gen
2. Tiến hành quá trình chuyển gen nhờ
Agrobacterium tumefaciens
3. Dùng kĩ thuâât PCR để xác nhâ n
â sự sát nhââp gene
4. Nuôi cấy mô sẹo để tạo cây trồng hoàn chỉnh
5. Phân tích Protein: dùng phương pháp Elisa kiểm
tra nồng độ protein HBsAg được biểu hiê ân
6. Xử lý với Pepsin: để xác định khả năng vượt qua
men tiêu hoá của dạ dày của vaccine này