Nghiên cứu sử dụng tinh bột và alginat làm chất bảo vệ trong quá trình tạo nguyên liệu lactobacillus acidophilus đông khô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN VĂN THÁI

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TINH BỘT VÀ
ALGINAT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG
QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU
LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS
ĐÔNG KHÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN VĂN THÁI

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TINH BỘT VÀ
ALGINAT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG
QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU
LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS
ĐÔNG KHÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ
THUỐC
MÃ SỐ: 60720402

Người hướng dẫn khoa học: TS. Đàm Thanh Xuân

HÀ NỘI - 2015


LỜI CẢM ƠN
Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS. Đàm
Thanh Xuân, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện và hoàn thiện luận văn.
Đồng thời, tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ
thuật viên trong Bộ môn Công nghiệp dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã cho tôi
những lời khuyên quý báu, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập
và hoàn thiện luận văn.
Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, Phòng sau đại
học, thư viện, cùng toàn thể các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ
và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình tôi học tập tại Trường.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Hội đồng quản trị, Ban giám hiệu Trường Cao
đẳng Dược Phú Thọ đã tạo mọi điều kiện cho tôi được học tập, làm việc, giúp tôi hoàn
thành tốt hơn luận văn này.
Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi xin gửi tới gia đình, người thân, bạn bè, đồng
nghiệp đã động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện luận văn tốt
nghiệp này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 31 tháng 08 năm 2015
Dược sĩ

Trần Văn Thái


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .........................................................................................2
1.1. Đại cương về Probiotic ...........................................................................................2
1.1.1.

Khái niệm Probiotic ....................................................................................2

1.1.2.

Các vi sinh vật probiotic............................................................................2

1.1.3.

Vai trò..........................................................................................................3

1.1.4.

Cơ chế tác dụng...........................................................................................5

1.2. Phương pháp đông khô ..........................................................................................5
1.2.1.

Khái niệm ....................................................................................................5

1.2.2.

Các giai đoạn của quá trình đông khô.........................................................5

1.2.3.

Ưu nhược điểm của phương pháp đông khô ...............................................6

1.2.4.

Ứng dụng của phương pháp đông khô ........................................................6

1.2.5.

Một số tá dược bảo vệ thường dùng trong đông khô vi sinh vật ................7

1.3. Phương pháp vi nang hóa tạo nguyên liệu Probiotic ........................................11
1.3.1. Khái niệm, đặc điẻm vi nang hóa probiotic ..................................................11
1.3.2. Ưu nhược điểm của phương pháp vi nang hóa .............................................13
1.3.3. Phương pháp tách pha đông tụ......................................................................14
1.3.4. Tá dược vi nang hóa......................................................................................16
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU19
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ...................................................................................19
2.1.1.

Nguyên vật liệu .........................................................................................19

2.1.2.

Môi trường sử dụng trong nghiên cứu ......................................................19

2.1.3.

Thiết bị ......................................................................................................20

2.2. Nội dung nghiên cứu.............................................................................................20


2.3. Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................21
2.3.1.

Phương pháp nhân giống...........................................................................21

2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào................................................21
2.3.3.

Phương pháp vi nang hóa bằng alginat......................................................22

2.3.4.

Phương pháp đông khô .............................................................................23

2.3.5.

Phương pháp xác định hàm ẩm .................................................................23

2.3.6.
tục

Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật theo nguyên tắc pha loãng liên
...................................................................................................................24

2.3.7. Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật sống sót trong điều kiện môi
trường pH dạ dày và pH ruột ..................................................................................25
2.3.8. Phương pháp tiệt khuẩn ................................................................................26
2.3.9. Phương pháp xác định độ trương nở hạt vi nang..........................................26
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ........................................................28
3.1. Tạo nguyên liệu chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus với chất bảo vệ .....28
3.1.1. Đánh giá cảm quan, thể chất của các nguyên liệu chứa Lactobacillus
acidophilus tạo thành đông khô khi kết hợp alginat và sữa gầy.............................28
3.1.2. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất hạt vi nang sau
đông khô .................................................................................................................30
3.1.3. So sánh khả năng tạo hạt vi nang khi phối hợp alginat với tinh bột và sữa
gầy…… ..................................................................................................................33
3.1.4. Khảo sát tác dụng bảo vệ của tinh bột và alginat trong quá trình đông khô
Lactobacillus acidophilus khi tạo dạng vi nang .....................................................37
3.1.5. Khảo sát lượng sinh khối thích hợp cho quá trình tạo nguyên liệu đông khô
probiotic dạng vi nang ............................................................................................39
3.2. Đánh giá khả năng bảo vệ lactobacillus acidophilus của hạt vi nang phối hợp
alginat với tinh bột và sữa gầy trong đường tiêu hóa mô phỏng. ...........................41
3.2.1. Khảo sát khả năng bao gói vi sinh vật của hạt vi nang trong môi trường acid
pH dạ dày ................................................................................................................41
3.2.2. Khảo sát khả năng giải phóng vi sinh vật của hạt vi nang trong môi trường
pH ruột . ..................................................................................................................42


3.2.3. So sánh tác dụng bảo vệ Lactobacillus acidophilus của hạt vi nang phối hợp
alginat với tinh bột và sữa gầy trong môi trường pH dạ dày. .................................43

3.3. Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu L. acidophilus đông khô trong thời gian
bảo quản và xây dựng công thức, tiêu chuẩn nguyên liệu tạo thành......................45
3.4. Xây dựng công thức và tiêu chuẩn nguyên liệu tạo thành ...............................46
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ...........................................................................................48
4.1. Bàn luận về tạo nguyên liệu đông khô chứa vi khuẩn Lactobacillus
acidophilus với các chất bảo vệ...................................................................................48
4.1.1. Tạo nguyên liệu lactobacillus acidophilus đông khô sử dụng alginat kết hợp
với sữa gầy. .............................................................................................................48
4.1.2. Tạo nguyên liệu lactobacillus acidophilus đông khô sử dụng alginat kết hợp
với tinh bột..............................................................................................................49
4.1.3. Tạo nguyên liệu lactobacillus acidophilus đông khô sử dụng alginat kết hợp
với tinh bột và sữa gầy............................................................................................52
4.1.4. Tác dụng bảo vệ của tinh bột và alginat trong quá trình đông khô
Lactobacillus acidophilus khi tạo dạng vi nang. ....................................................54
4.1.5. Lượng sinh khối thích hợp cho quá trình tạo nguyên liệu đông khô Probiotic
dạng vi nang............................................................................................................56
4.2. Bàn luận về khả năng bảo vệ Lactobacillus acidophilus của hạt vi nang phối
hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong đường tiêu hóa mô phỏng.....................58
4.3. Bàn luận về độ ổn định của nguyên liệu Lactobacillus acidophilus đông khô
trong thời gian bảo quản.............................................................................................61
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.....................................................................................63
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ATCC

: American Type Culture Collection
(Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Hoa Kì)

CFU, cfu

: Colony – Forming Units (Số đơn vị khuẩn lạc)

CMC

: Carboxylmethyl cellulose

ĐK

: Đông khô

EDTA

: Ethylenediaminetetriacetic acid

FAO

: Food and Agriculture Organization
(Tổ chức Nông lương thế giới)

IDF

: International Dairy Federation
(Liên đoàn sữa quốc tế)

MRS

: de Man, Rogosa, Sharpe

MT

: Môi trường

N/D

: Nước trong dầu

NL

: Nguyên liệu

PPI

: Proton-pump inhibitor (Thuốc ức chế bơm proton)

VSV

: Vi sinh vật

WHO

: World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Tên bảng

Trang

1

Bảng 2.1. Các hóa chất dùng trong nghiên cứu

19

2

Bảng 2.2. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu

20

3

Bảng 3.1. Các mẫu nguyên liệu khảo sát thể chất

28

4

Bảng 3.2. Thể chất của một số mẫu nguyên liệu Lactobacillus
acidophilus đông khô

29

Bảng 3.3. Đường kính hạt vi nang, hàm ẩm và thể chất của các
5

mẫu nguyên liệu chứa L. acidophilus dạng vi nang với các nồng

31

độ tinh bột ngay sau đông khô
6

7

8

9

10

11

Bảng 3.4. So sánh 2 phương pháp tiệt khuẩn nhiệt ẩm và
Tyndall về một số chỉ tiêu
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tinh bột và sữa gầy đến thể chất hạt vi
nang tạo thành
Bảng 3.6. Số lượng sống sót của VSV trong các mẫu vi nang
Ca-alginat phối hợp với tinh bột và sữa gầy sau đông khô
Bảng 3.7. Số lượng vi khuẩn sống sót và hàm ẩm của các mẫu
sau đông khô khi thay đổi lượng sinh khối
Bảng 3.8. Độ trương nở của các loại hạt vi nang sau khi tiếp xúc
với môi trường pH dạ dày
Bảng 3.9. Thời gian rã của hạt vi nang phối hợp alginat với tinh
bột và sữa gầy trong môi trường pH ruột

33

34

38

40

41

42

Bảng 3.10. Số lượng L. acidophilus sống sót trong hạt vi nang
12

phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy sau khi tiếp xúc với môi

44

trường pH dạ dày
13

Bảng 3.11. Hàm ẩm và số lượng VSV sống sót của nguyên liệu
trong thời gian bảo quản

46


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

STT

Tên hình vẽ, đồ thị

Trang

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của acid α - L - guluronic và β – D 1

2

3

4

5

mannuronic
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hàm ẩm và đường kính
hạt vi nang vào nồng độ tinh bột của các mẫu sau đông khô
Hình 3.2. Hình ảnh hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa
gầy sau đông khô
Hình 3.3. Biểu đồ thể hiện hàm ẩm và đường kính của hạt vi nang
phối hợp tinh bột và sữa gầy ngay sau đông khô
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn số lượng vi khuẩn sống sót của các mẫu
sau đông khô

9

32

35

36

40

Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn lượng vi sinh vật sống và hàm ẩm của
6

nguyên liệu trong thời gian bảo quản

46


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong thời gian gần đây, các sản phẩm y tế chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ
probiotic đã có sự gia tăng mạnh mẽ về số lượng. Probiotic ngày càng được bào chế
dưới nhiều dạng chế phẩm khác nhau sử dụng theo đường uống như bột, cốm, viên
nén, viên nang... hay sử dụng trong các sản phẩm cho đường dùng khác như viên
đặt, kem bôi da. Tuy nhiên, nhiều báo cáo chỉ ra rằng số lượng các vi khuẩn
probiotic trong các chế phẩm này còn thấp [49], [51]. Nguyên nhân là do các vi sinh
vật này rất nhạy cảm với sự thay đổi của điều kiện môi trường bảo quản như nhiệt
độ, độ ẩm, nồng độ oxy hòa tan và hàng rào sinh học của hệ tiêu hóa như pH acid,
enzym tiêu hóa, acid mật... Do đó, trong quá trình bảo quản và sau khi vi khuẩn
được đưa vào hệ tiêu hóa, số lượng vi khuẩn bị giảm đáng kể làm hạn chế tác dụng
của chế phẩm [39], [42].
Để giải quyết vấn đề này, cần phải tìm ra những phương pháp gia tăng tỉ lệ sống
sót và khả năng chống chịu của vi khuẩn probiotic trước các điều kiện bất lợi trong
sản xuất, bảo quản và sử dụng. Một trong các hướng nghiên cứu đáng chú ý trong
thời gian gần đây là sử dụng tinh bột và alginat như một tác nhân bảo vệ nhằm gia

tăng tỉ lệ sống sót của các vi khuẩn probiotic trong quá trình đông khô.
Xuất phát từ các lí do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sử dụng
tinh bột và alginat làm chất bảo vệ trong quá trình tạo nguyên liệu
Lactobacillus acidophilus đông khô” nhằm 2 mục tiêu sau:
1. Tạo nguyên liệu đông khô chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus với các chất
bảo vệ: sữa gầy, tinh bột và alginat.
2. Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu tạo thành trong thời gian bảo quản; trong
môi trường pH dạ dày, pH ruột và xây dựng công thức, tiêu chuẩn nguyên liệu
probiotic.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Đại cương về Probiotic

1.1.1. Khái niệm Probiotic
Probiotic là thuật ngữ bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là “dành cho sự
sống”, dùng để chỉ những vi khuẩn mang lại những tác động có lợi cho con người
và cho vật chủ [58].
Từ hàng nghìn năm trước đây, con người đã biết sử dụng các chế phẩm sữa lên
men với mục đích tăng cường sức khỏe. Tuy nhiên, phải đến đầu thế kỉ XIX, nhà
khoa học người Nga Elie Metchnikoff mới thực sự nghiên cứu vấn đề này trên cơ sở
khoa học. Thuật ngữ “Probiotic” được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1953 bởi
Kollath. Theo ông, Probiotic là “các yếu tố có nguồn gốc từ vi khuẩn, kích thích sự
phát triển của các vi khuẩn khác”[27]. Năm 1989, Fuller đã đưa ra một định nghĩa
khác về Probiotic: “Probiotic là thực phẩm bổ sung các VSV sống đem lại các tác
động có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện cân bằng hệ vi sinh đường ruột” [48].

Năm 2002, WHO và FAO đã đưa ra định nghĩa ngắn gọn và hoàn chỉnh nhất về
Probiotic ở thời điểm hiện tại như sau: “Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi
đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật
chủ”[57], [58]. Theo FAO, để có được hiệu quả thực sự thì VSV trong các chế
phẩm probiotic cần phải đến được vị trí tác dụng trong đường tiêu hóa. Do trong
quá trình sử dụng vi khuẩn probiotic phải đối mặt với các điều kiện bất lợi của
đường tiêu hóa nên để đem lại tác dụng, các chế phẩm probiotic phải chứa ít nhất
106 – 107cfu/ml tế bào VSV sống cho đến ngày hết hạn sử dụng để đảm bảo tác
dụng điều trị (FAO/WHO) [33], [52].
1.1.2. Các vi sinh vật probiotic
Bốn nhóm vi sinh vật thường được sử dụng trong các chế phẩm probiotic là:
Lactobacillus,

Bifidobacterium,

Saccharomyces,

Enterococcus.

Trong

đó

Lactobacillus và Bifidobacterium là hai loại vi khuẩn được sử dụng nhiều nhất [52].
Lactobacillus acidophilus thuộc họ Lactobacillaceae, chi Lactobacillus, thuộc
nhóm vi khuẩn lactic. Lactobacillus acidophilus là trực khuẩn Gram (+), kích thước

2

từ 0,6 – 0,9 × 1,5 – 6,0µm, mọc đơn hoặc mọc đôi tạo thành chuỗi ngắn không sinh
bào tử, không di động, kị khí không bắt buộc, phản ứng catalase âm tính. Nhiệt độ
phát triển: tối ưu 37oC, không phát triển trong khoảng 20oC – 22oC, tối đa trong
khoảng 43oC – 48oC. Tên gọi của loài có nghĩa là “ưa acid” cho thấy loài có thể
phát triển trong môi trường acid, pH khoảng 5 - 6, thời gian 24 – 36h [2].
L. acidophilus chiếm tỉ lệ chủ yếu trong số các vi sinh vật có ích cư trú ở đoạn
trên của ống tiêu hóa [32]. Chúng có khả năng làm giảm số lượng các vi sinh vật
hoặc nấm có hại ở ruột non; có khả năng sinh lactase – một enzym quan trọng trong
quá trình chuyển hóa sữa. Trong quá trình tiêu hóa, L. acidophilus còn tham gia sản
sinh niacin, acid folic, pyridoxin. Một vài nghiên cứu đã chứng minh L. acidophilus
làm tăng cường chức năng của hệ tiêu hóa, tăng khả năng miễn dịch cơ thể, ngăn
chặn bệnh tiêu chảy và làm giảm triệu chứng khó tiêu [32].
Với những đặc điểm trên, L. acidophilus là lựa chọn hàng đầu để sản xuất các
chế phẩm probiotic.
 Đặc điểm hạn chế của L. acidophilus
Khả năng sống sót của L. acidophilus phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: pH, sự
acid hóa trong sản phẩm lên men, sản phẩm hydroperoxid, nồng độ oxy hòa tan
(khuếch tán từ bao bì, trong môi trường nuôi cấy, bảo quản), nhiệt độ bảo quản, độ
ổn định của dạng khô hoặc đông khô…[50], [51]. Trong đó, nồng độ oxy hòa tan có
vai trò đáng kể trong việc hạn chế khả năng sống sót của L. acidophilus. Do đó, sau
một thời gian bảo quản, số lượng L. acidophilus sống sót sẽ bị giảm đáng kể [28].
1.1.3. Vai trò
Probiotic có một số tác dụng chính như sau:
 Ứng dụng trị liệu trong một số bệnh đường tiêu hóa ở người:
-

Ngăn chặn bệnh tiêu chảy:

Probiotic được chứng minh là có tác dụng trong 5 loại tiêu chảy: tiêu chảy liên
quan đến kháng sinh, do nhiễm khuẩn, do nhiễm virus, tiêu chảy ở người đi du lịch,

tiêu chảy do không dung nạp lactose. Hai tác nhân có hiệu quả với những bằng
chứng rõ ràng trong việc phòng ngừa tiêu chảy do kháng sinh là vi khuẩn
Lactobacillus rhamnosus GG và nấm men S. boulardii (S. cerevisiae)[54]. Các tác
3


nhân khác đang được nghiên cứu là Bacillus clausii, B. longum, L. acidophilus, L.
bulgaricus, L. plantarum, Enterococcus faecium, Clostridium butyricum... [14], [54]
-

Tác dụng lên Helicobacter pylori (H. pylori)

Helicobacter pylori đóng vai trong chủ yếu trong nguyên nhân và bệnh sinh loét
dạ dày tá tràng. Các nghiên cứu dùng kết hợp phương pháp điều trị bằng PPI và
kháng sinh với chế phẩm probiotic đã làm giảm đáng kể tác dụng không mong
muốn của kháng sinh đến hệ vi sinh vật đường tiêu hóa. Do vậy, sử dụng probiotic
để phòng ngừa các bệnh lí liên quan đến viêm loét dạ dày tá tràng là một hướng
điều trị được chú ý trong những năm gần đây [27], [32], [53].
Ngoài ra, probiotic còn có một số tác dụng khác như: “tăng cường khả năng tiêu
hóa lactose và hoạt động của các enzym khác”, “điều trị rối loạn tiêu hóa do dùng
kháng sinh”[14], “viêm ruột mạn tính”, “bội nhiễm ở ruột non”, “điều trị ung thư
ruột kết”... [32].
 Tăng cường miễn dịch
Vi khuẩn lactic làm tăng cả 2 loại đáp ứng miễn dịch: miễn dịch đặc hiệu (tăng
sản xuất kháng thể, cytokinase, tăng sinh tế bào lympho) và miễn dịch không đặc
hiệu - miễn dịch tự nhiên (tăng cường chức năng của đại thực bào, tăng số lượng và
tăng hoạt động của tế bào diệt tự nhiên) [9], [39], [45], [52]
 Hạ cholesterol máu
Vi khuẩn probiotic có thể lên men carbohydrat không thể tiêu hóa được và tạo
các acid béo chuỗi ngắn trong ruột, những chất này ức chế sự tổng hợp cholesterol

trong gan hoặc tái phân phối cholesterol từ huyết tương đến gan, vì vậy làm giảm
lượng cholesterol trong máu. Các chủng đơn lẻ có thể phân hủy muối mật và cản trở
sự hấp thu cholesterol từ đường ruột [27], [53].
 Chống lại tác nhân gây ung thư
Tác dụng chống khối u của probiotic có thể do một số cơ chế sau: gắn với tác
nhân đột biến, sản xuất các chất chống đột biến, ức chế enzym tiền ung thư như
nitroreductase và β-glucuronidase, tăng cường sản xuất β-glucosidase, chất giải
phóng flavonoids, sản xuất các chất chống oxy hóa...[27].

4


1.1.4. Cơ chế tác dụng
- Cạnh tranh năng lượng, vị trí bám
Probiotic khi phát triển trong đường tiêu hóa sẽ cạnh tranh chất dinh dưỡng và
năng lượng với các vi khuẩn gây bệnh, từ đó hạn chế sự sinh trưởng và phát triển
của chúng. Một số nghiên cứu in vitro cho thấy cả hai dạng vi khuẩn L. acidophilus
còn sống hoặc đã chết do nhiệt đều có khả năng ức chế sự bám dính của các vi
khuẩn gây bệnh [9], [58].
- Kích thích đáp ứng miễn dịch
Bằng việc bám dính vào niêm mạc ruột – nơi có nhiều tế bào lympho, probiotic
kích thích cả miễn dịch tại chỗ và miễn dịch toàn bộ cơ thể. Chúng làm tăng cả
miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu bằng cách kích thích các tế bào tham gia phản
ứng miễn dịch (macrophase, lymphocytes) và tăng cường sản xuất các chất tham gia
miễn dịch (cytokines, immunoglobulins, interferon) [52].
Ngoài ra một số cơ chế khác có thể kể đến như: “sản sinh ra các chất kháng
khuẩn”, “tăng cường khả năng chống đỡ của niêm mạc ruột”, “tăng cường chức
năng của hệ tiêu hóa” [9], [39].
1.2.

Phương pháp đông khô

1.2.1. Khái niệm
Đông khô (sấy thăng hoa) là phương pháp tách ẩm ra khỏi vật liệu bằng cách
thăng hoa, nghĩa là ẩm được chuyển thẳng từ pha rắn sang pha hơi mà không qua
trạng thái lỏng. Muốn vậy trước khi đông khô phải biến ẩm trong vật liệu thành thể
rắn, nghĩa là phải tiến hành làm lạnh đông vật liệu. Như vậy, đông khô được thực
hiện ở môi trường có độ chân không cao và nhiệt độ rất thấp (thường là âm). Chế độ
làm việc phải thấp hơn điểm ba của nước. Ở áp suất nhất định, nhiệt độ thăng hoa
của vật là không đổi, khi áp suất tăng thì nhiệt độ thăng hoa cũng tăng [43].
1.2.2. Các giai đoạn của quá trình đông khô
 Giai đoạn lạnh đông

5


 Vật tự lạnh đông ngay trong buồng sấy hoặc được làm lạnh đông riêng bên
ngoài buồng sấy nhằm chuyển toàn bộ ẩm từ trạng thái lỏng sang trạng thái
rắn, đồng thời làm giảm nhiệt độ xuống dưới nhiệt độ điểm ba của ẩm [43].
 Giai đoạn thăng hoa
Vật đã lạnh đông được đặt trong buồng sấy, đồng thời tiến hành hút chân không.
Chế độ làm việc trong buồng sấy phải ở chế độ thăng hoa: áp suất và nhiệt độ phải
thấp hơn điểm ba. Ẩm trong vật chuyển từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi mà
không qua trạng thái lỏng [43].
 Giai đoạn bay hơi ẩm liên kết còn lại
Ở giai đoạn này, nhiệt độ của vật tăng nhanh, ẩm trong vật là ẩm liên kết ở trạng
thái lỏng. Quá trình sấy trong giai đoạn này giống như quá trình sấy trong các thiết
bị sấy chân không bình thường. Nhiệt độ môi chất trong buồng sấy lúc này cũng cao
hơn nhiệt độ ở giai đoạn thăng hoa [43].
1.2.3. Ưu nhược điểm của phương pháp đông khô

 Ưu điểm
Do quá trình sấy được thực hiện ở nhiệt độ thấp, nước chuyển trực tiếp từ dạng
rắn sang dạng hơi nên đông khô có rất nhiều ưu điểm so với các phương pháp sấy
khác như: giữ nguyên màu sắc, cấu trúc, hương vị; giữ được hoạt tính sinh học; bảo
vệ nguyên vẹn các vitamin như lúc còn tươi, không làm biến chất albumin…; giữ
nguyên được thể tích ban đầu của vật sấy nhưng có cấu trúc xốp nên dễ hấp thụ
nước để trở lại trạng thái ban đầu [43].
 Nhược điểm
-

Giá thành thiết bị cao.

-

Vận hành phức tạp, đòi hỏi người thao tác phải có trình độ kĩ thuật cao.

-

Tiêu hao điện năng lớn làm giá thành sản phẩm tăng cao.

Do những ưu nhược điểm trên nên đông khô chỉ được áp dụng khi yêu cầu sản
phẩm phải có chất lượng cao [43].
1.2.4. Ứng dụng của phương pháp đông khô

6


Đông khô được ứng dụng trong ngành dược: trong sản xuất các thuốc kháng
sinh (penicillin, cephalexin...); làm khô các chế phẩm sinh học như albumin, vi sinh
vật. Ngoài ra, đông khô cũng được sử dụng như một phương pháp bảo quản trong

các ngành công nghiệp thực phẩm, vi sinh, thú y... để bảo quản một số sản phẩm
khác [43].
1.2.5. Một số tá dược bảo vệ thường dùng trong đông khô vi sinh vật
Đông khô là một trong những phương pháp phổ biến nhất để sản xuất lượng lớn
vi sinh vật với nồng độ cao [22]. Tuy nhiên, trong quá trình này, vi khuẩn vẫn gặp
phải nhiều điều kiện bất lợi, đặc biệt là trong giai đoạn tiền đông. Một số nghiên
cứu cho rằng các biến đổi sinh học xảy ra trong quá trình chuyển nước thành băng
là nguyên nhân chính gây tổn thương cho tế bào. Các tinh thể nước đá lớn hình
thành bên ngoài tế bào gây ra một áp lực thẩm thấu lớn do làm tăng nồng độ chất
tan bên ngoài tế bào làm tế bào bị mất nước, giảm khối lượng dẫn đến một số tình
trạng như thay đổi cấu trúc màng tế bào, mất hoặc hợp nhất lớp màng kép hay phá
hủy các cơ quan trong tế bào. Tiếp theo là sự hình thành các tinh thể nước đá bên
trong tế bào. Cơ chế chính xác gây tác hại từ băng trong tế bào vẫn chưa rõ ràng,
nhưng có thể do sự phá hủy vật lý của màng tế bào, sự hình thành bong bóng khí
trong tế bào và phá vỡ bào quan [23]. Một số nghiên cứu khác lại cho rằng nước kết
tinh và nhiệt độ thấp làm biến tính protein và tổn thương màng vi khuẩn tế bào vi
khuẩn, làm cho vi khuẩn giảm khả năng tồn tại, độ nhạy cao hơn với không khí và
mất khả năng sinh sản [42]. Để ngăn chặn hoặc giảm thiểu các tác dụng bất lợi này,
nhiều chất đã được sử dụng như tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô [22].
Các chất bảo vệ hay tá dược đông khô (Cryoprotectant – CPA) là các chất được
thêm vào trong thành phần nguyên liệu đem đông khô nhằm bảo vệ tế bào trong quá
trình đông khô và đảm bảo sức chịu đựng của VSV trong quá trình làm khô [42].
Một số tá dược được sử dụng trong đông khô:
- Sữa gầy: là sữa béo đã loại bỏ các acid béo, thành phần gồm lactose (chủ
yếu), acid amin, các vitamin và khoáng chất.
- Các loại đường: glucose, lactose, dextrin glucose,...
- Các acid amin: arginin, acid glutamic,...
7

- Peptid, protein, dịch chiết sinh học tự nhiên và polyme.
1.2.5.1. Sữa gầy
Sữa gầy hay còn gọi là “skim milk” là các sản phẩm sữa mà trong thành phần
có chứa không quá 0,5% chất béo. Thành phần dinh dưỡng chính trong sữa gầy:
32% - 35,7% protein; 48,4% - 54,1% lactose.
Sữa gầy có trong các chế phẩm đông khô probiotic vì nó có tác dụng bảo vệ tốt
probiotic trong quá trình đông khô. Theo nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước từ
trước tới nay thì sữa gầy sử dụng ở nồng độ khoảng 10% cho tỉ lệ sống sót cao nhất.
Tác dụng bảo vệ này có thể do nó chứa tỉ lệ lớn protein và carbohydrat - những chất
có khả năng bảo vệ tế bào.
Thành phần lactose có trong sữa gầy cũng như một số disaccharid khác có thể
thấm qua thành tế bào, sau đó chúng hình thành liên kết hydro giữa đường - protein.
Các liên kết này giúp duy trì cấu trúc của protein màng khi nước bị loại đi. Protein
giúp hình thành trạng thái glass xung quanh và bên trong tế bào tạo ra một môi
trường đủ nhớt bên trong và ngoài tế bào giúp ngăn cản sự biến đổi của tế bào ở
mức thấp nhất [25].
Theo một nghiên cứu khác thì protein trong sữa gầy có thể tạo thành lớp áo bảo
vệ trên thành tế bào, đồng thời sữa gầy còn cung cấp những chất đệm tan trong
nước (muối phosphat, muối citrat) giúp ổn định pH trong quá trình đông khô [42].
Nguyên liệu đông khô với sữa gầy vừa tạo cấu trúc xốp giúp quá trình bù nước
dễ dàng, nhưng đồng thời cũng làm cho nguyên liệu đông khô hút ẩm khá nhanh
nếu không được bảo quản tốt.
1.2.5.2. Alginat
 Nguồn gốc, cấu trúc của alginat
Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic với các ion kim loại như
Ca2+, Ba2+, Mg2+, Na+.... Alginat có nguồn gốc chủ yếu từ tảo nâu, rong mơ
Sargassum polycystum, S. kjellmanianum, ...
Acid alginic là một heteropolyme saccharid mạch thẳng cấu tạo từ hai gốc
uronic là acid α- L- guluronic (G) và acid β- D- mannuronic (M) [22], [35].

8


Acid α – L – Guluronic

Acid β – D – Mannuronic

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của acid α - L - guluronic và β – D - mannuronic
Hai monome này gắn với nhau bằng liên kết 1 – 4 glycosid nhưng các liên kết
này không phải ngẫu nhiên mà thành block: block homopolyguluronic (GGGG),
block homopolymannuronic (MMMM), block liên hợp (MGMG).
Tùy theo nguồn gốc của alginat mà độ dài trung bình của mạch phân tử, độ dài
của mỗi block, tỷ lệ và trình tự kết hợp của chúng với nhau có khác nhau. Điều này
làm cho tính chất của alginat biến đổi trong một dải rộng [22], [35].
 Một số tính chất của alginat
Độ hòa tan: Các muối kim loại hóa trị I (Na+, K+...), muối amoni và muối của
các amin phân tử lượng thấp của acid alginic tan được trong nước tạo dung dịch keo
nhớt. Các muối của acid alginic với các kim loại đa hóa trị (Ca2+, Ba2+...) không tan
trong nước (trừ muối Mg2+). Các muối alginat hòa tan được trong các dung môi
thân nước như alcol, aceton... và hòa tan dễ dàng hơn khi đun nóng [35].
Độ nhớt: Natri alginat khi tan trong nước tạo thành dung dịch có độ nhớt dao
động trong khoảng từ 10 – 3500 cps. Độ nhớt của dung dịch alginat ảnh hưởng bởi
khối lượng phân tử trung bình, nồng độ alginat sử dụng, nhiệt độ pH và sự có mặt
của các ion kim loại có trong dung dịch.
Sự gel hóa: Dung dịch natri alginat có khả năng tạo gel khi phản ứng với các ion
kim loại hóa trị II, III. Các gel này được hình thành ở các mức nhiệt độ nhỏ hơn
100oC, không tan chảy khi đun nóng. Sự tạo gel được giải thích bằng mô hình cấu
trúc phân tử của alginat - mô hình vỉ trứng: đoạn mạch của polymannuronic
(MMMM) là các dải hẹp, đoạn mạch của acid polyguluronic (GGGG) có dạng gấp
nếp như vỉ trứng. Khi có mặt các ion hóa trị II, III ở nồng độ thích hợp thì sự tạo gel

xảy ra, các phân tử alginat sắp xếp lại song song với nhau, các phần gấp nếp của
đoạn GGGG tạo thành khoảng không gian giống như chỗ đặt quả trứng. Các ion

9


Ca2+ khớp vào khoảng trống này liên kết với các nhóm chức carboxyl và các
nguyên tử oxy ở mỗi đoạn song song để hình thành gel alginat [20], [35]. Với tính
chất này, alginat được sử dụng rất rộng rãi trong công nghệ cố định tế bào và vi
nang hóa.
1.2.5.3. Tinh bột
 Cấu tạo, nguồn gốc
Trong tự nhiên, tinh bột là hợp chất hữu cơ rất phổ biến và dồi dào, chỉ đứng sau
cellulose. Người ta thấy tinh bột có trong cây xanh, rễ, cành, hạt, củ và quả. Walton
đã sưu tầm trên 300 nghiên cứu về tinh bột, tất cả đều cho thấy tinh bột của mọi
nguồn khác nhau đều có cấu tạo từ Amylose (Am) và Amylopectin (Ap) [12] [36].
Cả hai cấu tử này đều được cấu tạo từ α-D glucose. Các gốc glucose trong Am kết
hợp với nhau qua liên kết α-1,4-glucosid tạo nên chuỗi dài khoảng 500-2.000 đơn vị
glucose, phân tử lượng trung bình 10.000-300.000. Ap có cấu trúc phân nhánh,
ngoài liên kết α-1,4-glucosid còn có các liên kết α-1,6-glucosid ở điểm phân nhánh
[13]. Cấu trúc phân tử gồm một nhánh trung tâm, từ các nhánh này phát ra các
nhánh phụ có chiều dài khoảng vài chục gốc glucose, phân tử lượng Ap khoảng
5×105 - 1×106. Trong những nguyên liệu khác nhau thì hàm lượng Am và Ap cũng
không giống nhau, nhưng thường tỉ lệ Am và Ap của các tinh bột bằng 1/4.
Nước ta có nguồn nguyên liệu tinh bột rất đa dạng và phong phú. Trong đó, sắn
là loại cây lương thực có sản lượng cao và tinh bột sắn được ứng dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp dược
phẩm, thực phẩm… Vì vậy, ta sử dụng tinh bột sắn làm nguyên liệu trong nghiên
cứu này.
 Tính chất

Trong môi trường acid, tinh bột bị thủy phân thành sản phẩm hòa tan. Ở môi
trường acid mạnh, sản phẩm thủy phân cuối cùng là glucose. Trong môi trường
kiềm, tinh bột bị ion hóa từng phần do sự hydrat hóa tốt hơn.
Khi hòa tan tinh bột vào nước, do sự hấp thụ nước làm hạt tinh bột trương phồng
lên, tăng thể tích. Hiện tượng này gọi là hiện tượng trương nở của tinh bột. Trên 55

10


- 70ºC, các hạt tinh bột trương lên do hấp thụ nước vào các nhóm hydroxyl phân
cực, độ nhớt của dung dịch tăng mạnh. Kéo dài thời gian xử lý nhiệt có thể gây nổ
vỡ hạt tinh bột, thủy phân từng phần và hòa tan phần nào các phần tử cấu thành của
tinh bột, kèm theo sự giảm độ nhớt của dung dịch. Nhiệt độ để phá vỡ hạt, chuyển
tinh bột từ trạng thái đầu có mức độ oxy hóa khác nhau thành dung dịch keo gọi là
nhiệt hồ hóa [13] [36].
 Ưu điểm
Tinh bột là một polysaccharid tự nhiên, tương thích sinh học, phân hủy sinh học.
Tinh bột không độc, không sinh đáp ứng miễn dịch [18]. Tinh bột là tá dược độn
phổ biến, giá rẻ và có thể tiêu hóa được [28]. Tinh bột thường được sử dụng để ổn
định thực phẩm trong sản xuất sữa chua vì vậy tính tương hợp sinh học và độc tính
của nó với vi khuẩn đã được thử nghiệm rộng rãi [42].
 Ứng dụng
Tinh bột là một trong số tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô. Cơ chế bảo vệ
của tinh bột là làm giảm lượng nước liên kết trong mẫu [46]. Trong quá trình vi
nang hóa tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đông tụ hóa muối sử dụng alginat, tinh
bột được phối hợp như tá dược độn rắn, góp phần cải thiện tính chất vật lý của hạt
vi nang sau đông khô và giúp tế bào ổn định hơn trong quá trình đông khô và bảo
quản [28]. L. acidophilus không có khả năng tiêu thụ tinh bột, vì vậy tinh bột có thể
được lựa chọn trong vi nang hóa L. acidophilus.
Tinh bột là nguyên liệu quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp như công

nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp keo dán vì
những tính chất đặc trưng của nó như tạo hình, tạo dáng, tạo khung, tạo độ dẻo, độ
dai, độ đàn hồi, độ xốp và có khả năng tạo gel, tạo màng cho nhiều sản phẩm.
1.3. Phương pháp vi nang hóa tạo nguyên liệu Probiotic
Có rất nhiều phương pháp tạo chế phẩm probiotic như tạo dạng bột đông khô,
tạo cốm... Các phương pháp này đã và đang được sử dụng phổ biến do đã được
nghiên cứu lâu đời nên giá thành rẻ và dễ triển khai trên quy mô công nghiệp, tuy
nhiên khả năng sống sót của vi khuẩn lại không cao. Để cải thiện số lượng vi khuẩn

11


sống sót trong quá trình bảo quản và trong những điều kiện bất lợi về môi trường
như pH thấp ở dạ dày, các enzym tiêu hóa..., trên thị trường đã có các sản phẩm
probiotic được bào chế dạng pellet, vi nang và được bao bảo vệ tới thế hệ 4 [4].
Thế hệ 1
Không bao như bột, cốm, pellet...(Non – Coated)

Thế hệ 2
Bao tan trong ruột (Enteric – Coated)

Thế hệ 3
Vi nang hóa (Micro – Encapsulated)

Thế hệ 4
Bao 2 lớp ( Dual – Coated)
Hiện nay, hầu hết các nguyên liệu để sản xuất các chế phẩm probiotic trên thị
trường là dạng bột đông khô do khả năng duy trì số lượng VSV sống ngay cả trong
quá trình bảo quản thời gian dài. Ngoài ra, bột đông khô còn là dạng nguyên liệu tốt
nhất để sản xuất chế phẩm probiotic dạng rắn như bột, cốm hoặc viên nén, viên

nang.
Nhiều báo cáo chỉ ra rằng số lượng VSV sống sót trong các chế phẩm probiotic
rất nghèo nàn. Hơn thế, khả năng tồn tại của các vi khuẩn trong hệ thống tiêu hóa là
một vấn đề lớn cần giải quyết. Cung cấp cho các tế bào sống một rào cản vật lý để
chống lại các điều kiện bất lợi từ môi trường là một trong những hướng tiếp cận
được quan tâm hiện nay, trong đó phải kể đến công nghệ vi nang hóa [49].
1.3.1. Khái niệm, đặc điểm vi nang hóa probiotic
a. Khái niệm
Vi nang hóa là một trong những phương pháp cố định tế bào được sử dụng rộng
rãi hiện nay. Phương pháp sử dụng các chất tạo màng (gel) là các polyme có nguồn
gốc tự nhiên như gelatin, alginat, chitosan, cellulose… hoặc có nguồn gốc nhân tạo

12


như polyamid, polystyren, polyacrylat, polyacrylamid, polyester, polyvinyl
pyrrolidon (PVP), polyethylen glycol (PEG)… để bẫy, nhốt và bao gói các tế bào,
cơ thể vi sinh vật sống trong các nang nhỏ [8].
b. Đặc điểm
Vi nang có cấu tạo giống như một màng bán thấm hình cầu, mảnh và có lớp
thành bảo vệ vững chắc. Vi khuẩn được bao giải phóng theo các cơ chế: gãy vỡ
màng, hòa tan màng và khuếch tán qua màng... [39] Mỗi loại vật liệu bao vi nang và
mỗi loại tế bào sống lại hoạt động ở các điều kiện khác nhau nên phải lựa chọn điều
kiện để tạo thành vi nang như: pH, nhiệt độ, thời gian…
Vi nang hóa không làm tổn hại đến các tế bào sống mà còn bảo vệ tế bào. Vi
nang hóa cho phép cố định lượng lớn tế bào sống [58]. Độ bền cơ học của lớp màng
bao vi nang là một đặc điểm quan trọng. Màng phải có độ bền tương đối để có thể
bảo vệ được các tế bào sống, tuy nhiên nó lại không được quá vững chắc vì như thế
sẽ ảnh hưởng đến khả năng phóng thích tế bào khi cần thiết. Kích thước hạt vi nang
cũng là đặc điểm cần lưu ý. Giữa kích thước hạt, độ bền vững của hạt và khả năng

phóng thích tế bào có mối quan hệ với nhau. Kích thước hạt càng lớn thì độ bền
vững của hạt càng cao, khả năng bảo vệ tế bào sống càng cao, nhưng khả năng
phóng thích tế bào càng khó. Ngược lại, kích thước hạt càng nhỏ thì độ bền càng
thấp, khả năng bảo vệ tế bào sẽ thấp đi nhưng khả năng phóng thích tế bào sẽ dễ
dàng hơn. Ngoài ra còn có một số đặc điểm khác cần chú ý như: sự mài mòn của
các hạt vi nang do sự va chạm và ma sát vào nhau, khả năng kháng khuẩn của hạt…
[8], [39].
1.3.2. Ưu, nhược điểm của phương pháp vi nang hóa
a. Ưu điểm
Vi nang hóa có khả năng tạo ra mật độ vi sinh vật lớn do có thể cố định lượng
lớn tế bào sống. Hạt vi nang như tấm áo choàng giúp tế bào cách ly với môi trường
xung quanh, làm giảm sự tổn thương cũng như sự tổn thất số lượng tế bào, bằng
cách này các tế bào sẽ được bảo vệ tốt hơn trong các môi trường khắc nghiệt như
pH thấp, muối mật, sốc nhiệt... Ngoài ra, vi nang hóa cũng giúp tăng độ ổn định
hoạt tính trao đổi chất của tế bào khi có sự thay đổi pH, nhiệt độ hay sự có mặt các
13


chất ức chế trong môi trường lên men. Do đó, vi nang hóa làm cho tế bào kéo dài
khả năng tồn tại và tăng thời gian bảo quản chủng, giống [17] [58].
Màng bao vi nang giống như một rào chắn hạn chế giải phóng tế bào, giảm
thiểu sự nhiễm bẩn, bảo vệ tế bào chống lại tác nhân gây hại, từ đó đảm bảo cho quá
trình lên men không bị tạp nhiễm, hư hại. Lớp màng bao có thể được thiết kế để bảo
vệ và giải phóng vi khuẩn ở những điều kiện môi trường khác nhau cho phép kiểm
soát giải phóng vi khuẩn [17] [58].
Vi nang hóa có thể tạo ra các gradien nồng độ cơ chất, nồng độ sản phẩm, nồng
độ oxy hòa tan, pH môi trường lên men… từ đó có thể tạo ra các môi trường khác
nhau cho tế bào trong các lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng khác nhau. Vi nang hóa
cũng cho phép điều chỉnh tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật, cho phép sử dụng tế
bào ở một pha riêng biệt đối với môi trường lên men, do đó có khả năng dừng phản

ứng nhanh [8] [58].
Trong các ngành sản xuất, đặc biệt là ngành sản xuất các sản phẩm liên quan
đến probiotic, thì việc vi nang hóa tế bào có ý nghĩa rất quan trọng, giúp tăng độ ổn
định, thời gian bảo quản, kiểm soát giải phóng và cải thiện về mặt cảm quan cho sản
phẩm. Trong các ngành thực phẩm sản xuất các sản phẩm lên men như bia, rượu…
thì kỹ thuật vi nang hóa là một trong những lựa chọn để cố định tế bào vi sinh vật sử
dụng trong công đoạn lên men, từ đó sử dụng vi sinh vật tiết kiệm, tối ưu và hiệu
quả hơn [17] [39].
b. Nhược điểm
Mặc dù có nhiều ưu điểm đáng chú ý, song vi nang hóa tế bào vi sinh vật cũng
có một số nhược điểm. Trong quá trình trao đổi chất, tế bào vi sinh vật sản sinh ra
nhiều enzym trong đó có những enzym có thể cho xúc tác các phản ứng không
mong muốn làm tổn hại đến lớp vật liệu vi nang và cả chính tế bào. Để giải quyết
vấn đề này phải chọn lựa giống vi sinh vật thích hợp không tạo ra các enzym không
mong muốn mà vẫn đảm bảo hoạt tính của các enzym mong muốn [8] [58].
Đa số các vật liệu vi nang như gelatin, thạch… đều là các nguồn dinh dưỡng
mà vi sinh vật có thể tiêu hóa được. Điều này khá quan trọng vì như thế vi sinh vật
được vi gói bên trong hoặc vi sinh vật tạp nhiễm từ bên ngoài có thể tiêu hóa làm
14


cho lớp vi nang bị rách, thủng và như vậy hiệu quả vi nang hóa sẽ giảm xuống đáng
kể. Có bằng chứng cho thấy một số chủng vi khuẩn có khả năng tiêu hóa, sử dụng
chính vật liệu vi nang. Vì vậy, mỗi chủng vi sinh vật ta phải nghiên cứu vật liệu vi
nang phù hợp nhất cho đối tượng vi sinh vật đó.
1.3.3. Phương pháp tách pha đông tụ
a. Nguyên tắc
Tách pha nhờ sự thay đổi nhiệt độ, thay đổi pH, sự hóa muối hoặc khi thêm một
dung môi thứ hai vào hệ tạo vi nang. Từ dung dịch keo trong một dung môi thích
hợp, tiến hành các tác động nhằm thay đổi độ tan của nó, kết quả là một lượng đáng

kể keo được tách ra thành pha mới. Như vậy hệ trở thành hai pha, một pha có nồng
độ cao chất keo được tách ra dưới dạng giọt nhỏ gọi là các giọt đông tụ (coacervat).
Sau đó, các hạt coacervat dần kết dính lại với nhau hoặc hấp thụ trên bề mặt chất
cần bao gói tạo thành lớp màng bao [3] [16].
b. Phân loại
Nếu chỉ sử dụng một loại dung dịch keo thì gọi là phương pháp tách pha đông
tụ đơn giản, nếu sử dụng nhiều loại dung dịch keo thì gọi là phương pháp tách pha
đông tụ phức hợp [3] [16].
Tách pha đông tụ đơn giản là quá trình loại nước của các chất keo thân nước
dùng trong hệ, do đó làm giảm độ tan của chất keo. Phương pháp này thường chỉ sử
dụng một loại polyme (gelatin, polyvinyl alcol, carboxymethyl cellulose). Quá trình
làm giảm độ tan của chất keo có thể bằng các cách sau: thêm vào một dung môi có
thể trộn lẫn với nước (ethanol, aceton, isopropanol…), thêm vào một muối vô cơ
hay thay đổi nhiệt độ [55].
Tách pha đông tụ phức hợp là quá trình tương tác giữa phân tử tích điện âm và
tích điện dương của hai hoặc nhiều hợp chất cao phân tử, có thể do sự thay đổi nồng
độ các chất tan cao phân tử hoặc thay đổi pH. Các polyme càng có sự khác nhau về
điểm đẳng điện càng dễ tạo thành hạt đông tụ [3] [16] [55]. Tách pha còn có thể
được thực hiện do thêm vào một polyme khác không tương đồng, do thêm vào một

15


dung môi thứ hai, do sự hóa muối (đông tụ thông thường), hoặc do tương tác giữa
các polyme… [3].
Tách pha do sự hóa muối (đông tụ thông thường)
Tách pha do sự hóa muối được thực hiện theo nguyên tắc sau: khi thêm dung
dịch đậm đặc hoặc muối điện ly mạnh (muối vô cơ) vào hệ chế tạo vi nang sẽ tạo
thành hai pha, kết quả là một pha trong đó sẽ trở nên bão hòa các tiểu phân keo.
Kỹ thuật đông tụ hóa muối hay còn được biết đến là kỹ thuật ion hóa cố định

gel, ion hóa tạo gel (ionic gelation method, ionotropic gelation techniques) để tạo ra
các hạt gel không tan (hydrogel). Phương pháp này thường hay sử dụng các polyme
có nguồn gốc tự nhiên, có tính tương thích sinh học cao như alginat, chitosan, gôm
gellan… Trong phương pháp này, các polyanion như alginat kết hợp với các ion đa
hóa trị tạo thành các hạt gel có mạng lưới không gian ba chiều bao gói lấy dược
chất hoặc có thể kết hợp tạo phức với các polyanion khác trên bề mặt của hạt gel
alginat để tạo lớp màng có độ bền cơ học cao hơn và ngăn thấm tốt hơn. Hydrogel
được bào chế bằng hai kỹ thuật cơ bản là kỹ thuật nhỏ giọt và kỹ thuật phun đông tụ
[47].
1.3.4. Tá dược vi nang hóa
Tá dược phổ biến nhất dùng để vi nang hóa vi sinh vật là alginat.
Ưu điểm: Alginat không độc, tạo gel dễ dàng với Calci clorid, gel có độ ổn định
cao. Vi khuẩn sống không bị ảnh hưởng trong suốt quá trình bất động nhờ tính
thuận nghịch của gel: hòa tan lại trong môi trường có chứa ion Calci hoặc pH hơi
kiềm sẽ giúp giải phóng các tế bào bên trong. Alginat có độ ổn định cao, độ xốp cao
và có khả năng chống chịu các muối và chất tạo phức.
Nhược điểm: Khi có mặt acid lactic, các yếu tố tạo phức như lactat có thể làm
giảm độ bền của gel Calci alginat và làm cho tế bào thoát ra ngoài.
Các chất tạo gel khác gồm: chitosan, CMC, gelatin, pectin, gôm kappacarrageenan-locust đậu, gellan và agar.
1.3.5. Một số nghiên cứu sử dụng alginat làm tá dược vi nang hóa

16