Bài tiểu luận các phương pháp cải tiến giống vi sinh vật trong công nghiệp

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỈ THUẬT MÔI TRƯỜNG

 oOo 

huf

Đề tài: CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG

VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP.
BÀI TIỂU LUẬN NHÓM 4
Môn: VI SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: Ths. Trần Quốc Huy


TPHCM, tháng 9 năm 2015
BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỈ THUẬT MÔI TRƯỜNG

 oOo 

huf

Đề tài: CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH

VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP.

BÀI TIỂU LUẬN NHÓM 4
Môn: VI SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: Ths. Trần Quốc Huy
Nhóm sinh viên thực hiện
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Bùi Văn Sự
Nguyễn Phước Thịnh
Thái Văn Tú
Huỳnh Ngọc Quang
Nguyễn Đình Gian
Lê Tân
Trần Minh Quan

3008140170
3008140175
3008140580
3008140018
3008140143
3008140153
3008140207

TPHCM, tháng 9 năm 2015


LỜI CẢM ƠN
Chúng tôi xin trân thành cảm ơn Ths. Trần Quốc Huy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn
và giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian học tập.Một lần nữa nhóm chúng tôi xin trân
thành cảm ơn thầy.
Mặc dù bài tiểu luận đã hoàn thành nhưng khó tránh những sai sót.Mong rằng sẽ
nhận được đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để bài tiểu luận hoàn thiện hơn. Từ
đó,chúng tôi sẽ có thêm nhiều kinh nghiệm để thực hiện những bài tiều luận tiếp theo
cũng như đồ án sau này và nghề nghiệp tương lai.
Sau cùng chúng tôi xin chúc Ths. Trần Quốc Huy và toàn thể các thầy cô trong
Khoa thật dồi dào sức khỏe, niềm vui để tiếp tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là
truyền đạt kiến thức của mình cho thế hệ mai sau.
Trân trọng cảm ơn!
NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN

LỜI CAM ĐOAN
Chúng tôi xin cam đoan:

4


Bài tiểu luận do các thành viên trong nhóm cùng chung tay làm việc,có sự phân công
rõ ràng và công bằng giữa các thành viên trong nhóm. Đồng thời, không sao chép bất cứ
bài tiểu luận của bất kì ai. Các nội dung trong bài báo cáo đã được tham khảo kỉ lưỡng
trước khi đưa vào bài tiều luận.Chúng tôi sẽ chịu hoàn toàn trách nhiệm trước thầy và
Khoa về những cam đoan này.

TP.HCM, ngày 30 tháng 9 năm 2015

NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN

KÍ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT
VSV

Vi sinh vật

GFP

Green fluorescense protein

PTN

Phòng thí nghiệm
5


CN

Công nghệ

CNSH

Công nghệ sinh học

2,5- DKG

Axit 2,5-diketo-D-gluconic

2-KLG

Axit 2-keto-L-glucoznic

Vit

Vitamin

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT

Tên bảng

6

Số trang


1

2

Bảng 2.1 : Một số sản phẩm sinh ra thông
qua các vi khuẩn chứa các gene người
được tạo dòng nhờ phương páp kỉ thuật
di truyền.
Bảng 3.1 : Các loại protein trị liệu tạo ra
do E. coli hay nấm men S. cerevisiae

20-21

23-24

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH ẢNH
STT
1
2
3

Tên hình
Hình 1.1: “Ông tổ” của nghành vi sinh vật học
Hình 1.2 : Qúa trình sàng lọc

Hình 2.1 : Gen bị đột biến
7

Số
trang
2
3
6


4
5

Hình 2.2: Các tác nhân vật lí gây độ biến
Hình 2.3: Các tác nhân hóa học gây đột biến

6-7

8

6

Hình 2.4: Các loại vi sinh vật được cải tiến cho năng suất
cao

10

7

Hình 2.5 : Hiện tượng biến nạp

12

8

Hình 2.6: Kỉ thuật biến nạp được sử dụng ở vi khuẩn
E. Coli

13

9

Hình 2.7: Tải nạp chung (generalized transduction).

14

10

Hình 2.8: Tải nạp chuyên biệt hay tải nạp hạn chế
(restricted transduction).

15

11

Hình 2.9: Sơ đồ thí nghiệm tạo dòng vi khuẩn mang
ADN tái tổ hợp có chứa gen Insulin ở người

16

12

13

Hình 2.10: (a) Joshua Lederberg (trái) và E.L.
Tatum; (b) E. coli tiếp hợp. Hai tế bào kết hợp nhau
bằng một cầu nối, thể cho bên trái và thể nhận bên
phải.

Hình 2.11: Sự tiếp hợp giữa các tế bào E. coli
F+(đực) với F- (cái)

17

18

14

Hình 2.12 : Thí nghiệm kinh điển của J. Lederberg và
E. Tatum

19

15

Hình 2.13: Cơ chế tiếp hợp và tái tổ hợp gene ở các tế
bào E. coli.

19

8


9


MỤC LỤC


CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP

NHÓM 4

LỜI MỞ ĐẦU
Trong sự phát triển của Nghành Công Nghệ Sinh Học ngày nay Vi sinh vật đang
dần chiếm ưu thế về số lượng các ứng dụng trong nhiều lĩnh vực trong đó có lĩnh vực
công nghiệp. Và có thể nói ứng dụng của vi sinh vật trong công nghiệp ngày nay là rất
lớn nó được sử dụng rộng rãi trong công nghệ lên men( rượu, bia, sữa chua,...),sản xuất

các chế phẩm sinh học phục vụ cho con người.
Trên cơ sở những kiến thức đã được học trong môn học: nhóm chúng tôi đã được
giao thực hiện đề tài “Các phương pháp cải tạo giống vi sinh vật trong công nghiệp”
với mục đích là tìm hiểu thêm đề nâng cao kiến thức đã học cho bản thân và các bạn. Mặc
dù đã cố gắng do kiến thức còn hạn hẹp và thời gian thực hiện không được nhiều nên đề
tài của chúng tôi còn rất nhiều hạn chế và sai sót.
Đề tài này nhóm chia làm 5 phần như sau:
Phần I : Phân lập các giống vi sinh vật thuần chủng: Tạo cơ sở cho việc cải tạo
giống sau này.
Phần II: Các phương pháp cải tạo giống vi sinh vật trong công nghiệp : Ở đây trình
bày ba phương pháp cơ bản nhất
•
•
•

Phương pháp gây đột biến
Phương pháp tái tổ hợp
Phương pháp lựa chọn thường xuyên

Phần III: Các yêu cầu của cải tạo giống
Phần IV: Ứng dụng của các phương pháp cải tiến giống trong sản xuất công nghiệp.
Phần cuối: Sẽ trình bày một số thành tựu cải tiến giống vi sinh vat.
Chúng tôi mong sự góp ý của Ths. Trần Quốc Huy, các thầy cô trong khoa và các bạn
để bài luận này hoàn thiện và ngày càng tốt hơn.
NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN

Page | 11
Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP

NHÓM 4

Muốn cải tạo một giống vi sinh vật nào đó, trước hết ta phải có nguồn giống
muốn thế ta phải phân lập vi sinh vật thuần chủng từ nguồn gốc tự nhiên . Sau đó,
tiến hành cải tạo chúng bằng các biện pháp nhân tạo.

I . PHÂN LẬP GIỐNG VI SINH VẬT THUẦN CHỦNG
Để chọn được giống VSV thuần chủng, bước đầu tiên là phân lập chúng từ các
nguồn tự nhiên như: nước, không khí, đất, các mô động thực vật, các vật liệu hữu cơ vô
cơ đã bị phân huỷ ít nhiều. Bằng những kỹ thuật VSV cổ điển từ thời L. Pauster và
R.Koch đã đề ra . Nhiều phương pháp đặc biệt chủng giống thuần khiết dùng cho công
nghiệp đã được phát triển trên cơ sở những kỉ thuật vi sinh vật cổ điển này, nhất là trong
việc tìm chất sản xuất chất kháng sinh mới.

L. Pauster

R.Koch
Hình 1.1: “Ông tổ” của nghành vi sinh vật học

Theo kỹ thuật VSV cổ điển, việc phân lập các chủng thuần khiết mất nhiều công
sức và chậm. Ngày nay người ta dùng phương pháp “sàng lọc” vừa nhanh vừa có hiệu
quả.
Nguyên lý của phương pháp “sàng lọc” là:
Trước hết người ta kiểm tra sơ bộ hỗn hợp các giống VSV từ mẫu tự nhiên như đất
hoặc nước, cỏ cây chẳng hạn…pha loãng tạo thành các huyền phù pha có độ loãng từ
1/10 đến 1/100, rồi gieo dung dịch trên lên bề mặt hộp petri đựng môi trường thạch dinh
Page | 12
Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP

NHÓM 4

dưỡng và đã cấy một chủng VSVkiểm định có tác dụng đối kháng.Chỉ có những chất nào
trong đất sinh chất đối kháng với chủng kiểm định, nghĩa là có tính chất kháng sinh thì
sau khi nuôi sẽ tạo ra vùng ức chế đặc hiệu trên đĩa thạch. Ta tách khuẩn lạc của chủng ấy
và đem nuôi cấy, thử chất sinh ra và xác định tiếp theo.
Cũng có thể đơn giản là đặt các mẫu lên các điểm khác nhau trên mặt thạch dinh
dưỡng (nếu muốn tìm vi khuẩn) hoặc của thạch khoai tây (nếu muốn tìm nấm), đã có
chủng kiểm định được nuôi cấy từ trước. Giữ đĩa thạch ở 28-37 oC trong khoảng 2 ngày,
quan sát vùng bị ức chế và quyết định công việc phân lập các chủng vi sinh vật có tác
dụng tiếp theo.

Dung dịch huyền phù

Đĩa petri đã rắc huyền phù

Đĩa petri sau 1-2 ngày

đã cấy VSV kiểm định
Hình 1.2 : Qúa trình sàng lọc
Phương pháp “sàng lọc” cho phép nhanh chống xác định được tính kháng khuẩn
kháng nấm hoặc virus hoặc kháng ung thư của một chủng được phân lập.
Phương pháp này thường dùng hai kiểu kỹ thuật:
•
•

Lấy một mẫu thử để khảo sát tác dụng với nhiều chủng kiểm định.
Lấy nhiều mẫu thử để khảo sát tác dụng với một chủng kiểm định .

Cấy những chủng đã được phân lập bằng những đường vạch trên mặt thạch dinh
dưỡng trong hộp petri. Sau đó cấy chủng kiểm định theo đường song song hoặc vuông
góc với đường vạch của chủng nghiên cứu. Đặt hộp petri vào tủ ấm với nhiệt độ thích hợp
với chủng kiểm định. Tác dụng kháng sinh của mẫu thử sẽ được xác định ở vùng mặt
Page | 13
Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường


CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP

NHÓM 4

thạch không bị mờ tại các giao điểm đường cấy của chủng bị ức chế. Phương pháp này
chủ yếu được sử dụng trong việc tìm chủng sản xuất các chất kháng sinh. Từ nguyên lý cơ
bản phương pháp đã được cải tiến và ngày một phong phú hơn.
Để chọn các chủng sản xuất các acid amin người ta đã sử dụng kiểu chọn lọc theo
kỹ thuật penicilin. Trong phương pháp này các điều kiện được lựa chọn sao cho các tế
bào hoang dại có thể phát triển trong môi trường dinh dưỡng thiếu một acid amin nào đó
và bị giết chết bằng pennixilin. Chúng ta đã biết, penicilin chỉ có tác dụng lên các tế bào
đang sinh trưởng.Các tế bào cần acid amin không sinh trưởng được nên sống sót. Đối với
những vi khuẩn mẫn cảm với penicilin thì dùng chất kháng sinh khác.
Để phân lập những chủng có tính chất đặc biệt (như chuyển hoá steroit), người ta
dùng hỗn hợp của nhiều chủng vi sinh vật đem nuôi cấy trong cùng một môi trường có
chất mà ta muốn thực hiện sự biến đổi. Sau khi nuôi ta chiết xuất và các sản phẩm, phân
tích theo các phương pháp sắc ký.

Page | 14

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường


CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP

NHÓM 4

Các chủng thu được qua phân lập được gọi là chủng nguyên thủy, chủng
hoang dại hay chủng tự nhiên. Các chủng này chưa hẳn đã đáp ứng đầy đủ các yêu
cầu dùng cho sản xuất công nghiệp. Thông thường các chủng này được nghiên cứu
tuyển chọn tiếp dựa vào các điều kiện sinh lý, sinh hoá và các điều kiện tích hợp để
sao cho có hoạt tính cao và thực hiện được quá trình lên men có tính kinh tế.
Những chủng vi sinh vật nguyên thủy đạc biệt là các chủng có hoạt tính siêu
tổng hợp - tổng hợp thừa các sản phẩm trao đổi chất bậc 1 và bậc 2 có đặc điểm là
không bền vững, thường hay bị biến đổi các tính chất ban đầu. Vì thế mới cần tới
các phương pháp cải tiến giống vi sinh vật đề đáp ứng các nhu cầu đăt ra đó.

II. CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT
TRONG CÔNG NGHIỆP
Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật cho năng suất cao: Yêu cầu đối với giai đoạn
này là tuyển chọn được chủng tổng hợp sinh khối cần thiết, với lượng đáng kể và hoạt
tính cao. Môi trường tuyển chọn phân lập thường từ đất, nước, lương thực, thực phẩm….
Tuy nhiên các chủng phân lập theo phương pháp thông thường, chỉ tổng hợp một lượng
nhỏ sinh khối, người ta cần tiến hành gây đột biến bằng phương pháp sinh học, lý, hóa
học…để tạo chủng có khả năng “siêu tổng hợp sinh khối” như: Phương pháp gây đột
biến, phương pháp tái tổ hợp, phương pháp lựa chọn giống thường xuyên.

2.1 Phương pháp đột biến nhân tạo
2.1.1 Đặc điểm của phương pháp chọn lọc đột biến
Các thành tựu của Công nghiệp vi sinh vật không thể tách rời với những tiến bộ

nhảy vọt của khoa học kỉ thuật trong chọn lọc các chủng có năng suất cao.
Phương pháp này có các đặc điểm:
•
•
•
•
•

Thu nhận kết quả rất nhanh.
Chỉ đánh giá sản phẩm thu được, không quan tâm các biến đổi sinh lí, sinh hoá.
Tạo ra các chủng có năng suất cao.
Khắc phục một số nhược điểm của chủng ban đầu.
Làm biến đổi bản chất hoá học các chất trong chủng ban đầu.

Quá trình chọn giống các chủng Penicillium chrysogenum ở Mỹ có thể lấy làm ví dụ
điển hình cho phương pháp này. Từ dòng ban đầu có sản lượng 60mg/l, chọn các đột biến
ngẫu nhiên được dòng 150mg/l và sau đó sử dụng các đột biến nhận được do tác động tia
X và UV. Việc chọn lọc theo nguyên tắc: lấy dòng có sản lượng cao nhất đem gây đột
Page | 15
Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường


CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP

NHÓM 4

biến rồi chọn chủng Vi nấm Penoicillium chrysogenum suất cao nhất. Qua nhiều bước
trung gian cuối cùng tạo được dòng E.15.1 có sản lượng 7000mg/l.
Phương pháp chọn giống đột biến được sử dụng để tạo các chủng sản sinh ra nhiều
axit amin (như glutamic axit) hay các nucleotit. Ngoài ra còn có thể nhận các đột biến liên

quan đến cơ chế điều hoà trao đổi chất:
Các đột biến cơ cấu (constitutive mutants): tạo sản phẩm không cần chất cảm ứng
(inducer).
• Các đột biến kháng ức chế ngược là các đột biến tạo sản phẩm nhiều mà không bị
ức chế bởi sản phẩm cuối (end product repression).
•

Hình 2.1 : Gen bị đột biến

2.1.2 Phân loại các tác nhân gây đột biến.
2.1.2.1 Những tác nhân vật lý:
•
•
•
•

Tia cực tím
Tia X (rơnghen)
Tia Y
Bắn phá bằng hạt nơtron hay electron.

Page | 16
Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường


CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP

NHÓM 4

Hình 2.2: Các tác nhân vat lí gây độ biến

Trong các tác nhân vật lý dùng vào mục đích này là tia cực tím hay là tia tử ngoại.
Người ta dùng đèn thạch anh phát ra tia cực tím chiếu lên dịch huyền phù, giống vi sinh
vật được chuẩn bị trong môi trường đẳng trương, đựng trong hộp petri mở nắp và có
khuấy hoặc lắc. Khoảng cách từ đèn UV đến dịch huyền phù vi sinh vật, thời gian chiếu
và cường độ bức xạ được điều chỉnh sao cho số tế bào bị tiêu diệt và số sống sót tối đa
vào khoảng 0,2-0,5%.

2.1.2.2 Những tác nhân hoá học:
Page | 17
Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường


CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP

NHÓM 4

Sử dụng các hợp chất hóa học:
•
•
•
•
•

Nitrozometylguanidin.
Metyldicloroetylamin.
Nitrit.
Hydroxylamin .
Etylametansunfonat.

Hình 2.3: Các tác nhân hóa học gây đột biến

Dùng các tác nhân hoá học có thể tới mức các thể đột biến cần tìm xuất hiện
trong khoảng 105-108 tế bào. Nồng độ hoá chất và thời gian chiếu xạ là do thực nghiệm
xác định, làm sao cho chỉ còn một số rất nhỏ tế bào vi sinh vat sống sót. Những chủng sau
khi chịu tác dụng của các tác nhân đột biến được rửa bằng nước đẳng trương vô khuẩn và
sau nhiều lần pha loãng liên tiếp được cấy chuyền nhiều lần trên hộp petri để khảo sát đặc
tính mới của chúng. Việc cấy chuyền được thực hiện bằng kỹ thuật đóng dấu:dùng con
dấu nhung chuyển khuẩn lạc từ hộp petri này sang hộp petri khác.

2.1.3 Phát hiện các thể đột biến có hiệu quả.
Muốn phát hiện các đột biến có hiệu quả cần có hệ thống chọn lọc để tìm thấy các
đột biến hiếm hoi trong khối rất lớn các dạng không đột biến. Các hệ thống chọn lọc đột
biến có nhiều phụ thuộc vào các đột biến khác nhau. Liên quan đến chọn lọc đột biến ở vi
sinh vat, người ta đưa ra khái niệm lực phân giải (resolving power). Khái niệm này dùng
để chỉ khả năng phát hiện các đột biến rất hiếm so với không đột biến.

Page | 18
Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường


CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP

NHÓM 4

2.1.3.1 Phương pháp đề kháng:
Ở vi khuẩn các tác nhân chọn lọc thường là thuốc và phage. Các đột biến được dễ
dàng phát hiện trên môi trường agar có thuốc hay phage ở dạng các khuẩn lạc được mọc
lên.
2.1.3.2 Phương pháp làm giàu chậm:
Việc phát hiện đột biến khuyết dưỡng khó khăn hơn. Dung dịch vi khuẩn pha loãng
được cấy lên bề mặt môi trường agar tối thiểu để mọc rời thành khuẩn lạc. Một lớp môi

trường tương tự được đổ lên trên, phủ lớp mỏng. Hộp petri được ủ để các khuẩn lạc bình
thường mọc lên. Sau đó, đổ phủ thêm một lớp môi trường dinh dưỡng có chất bổ sung và
ủ tiếp cho chất bổ sung khuếch tán. Các đột biến khuyết dưỡng sẽ mọc sau khi có chất bổ
sung, nên khuẩn lạc nhỏ hơn do mọc chậm.
2.1.3.3 Phương pháp làm giàu hạn chế:
Là dạng đơn giản của phương pháplàm giàu chậm. Các vi khuẩn được cấy trên môi
trường tối thiểu có một ít bổ sung. Trong điều kiện đó các đột biến khuyết dưỡng mọc đến
khi hết chất dinh dưỡng bổ sung thì dừng, nên tạo khuẩn lạc nhỏ. Các vi khuẩn bình
thường tiếp tục mọc tạo khuẩn lạc to.
2.1.3.4 Phương pháp làm giàu nhờ penicillin:
Được áp dụng cho các vi khuẩn.Penicillin có tác dụng diệt các vi khuẩn bình
thường khi phân chia. Các vi khuẩn được cho vào môi trường tối thiểu có penicillin. Các
vi khuẩn đang tăng trưởng bị diệt chỉ có các tế bào đột biến không tăng trưởng còn sống
sót. Sau đó hỗn hợp được cấy lên môi trường không có penicillin thì các đột biến khuyết
dưỡng mọc lên với tỷ lệ tương đối cao hơn.
2.1.3.5 Phương pháp chọn lọc:
Được sử dụng để chọn lọc các đột biến khuyết dưỡng ở nấm sợi. Dung dịch các
bào tử được nuôi trong môi trường dinh dưỡng thiếu chất bổ sung. Các đột biến thiếu chất
bổ sung không mọc được, các dạng bình thường mọc ra nhiều sợi. Khi lọc qua màng lọc
sợi thủy tinh, các dạng bình thường nhiều sợi bị giữ lại, các dạng đột biến đi qua màng
lọc. Dung dịch có nhiều dạng đột biến được cấy trên môi trường có chất bổ sung và kiểm
tra tìm các dạng đột biến.
2.1.3.6 Phương pháp in
Các vi khuẩn được cấy để mọc rời từng khuẩn lạc trên môi trường dinh dưỡng tối
thiểu. Các khuẩn lạc đột biến không mọc lên được. Căn cứ vào đột biến không mọc ở bản
sao tách các đột biến khuyết dưỡng.

Page | 19
Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP

NHÓM 4

2.1.4 Thành tựu
Phương pháp này đã đem lại những thành tích ngoạn mục, góp phần tích cực cho
sự phát triển của công nghiệp lên men vi sinh như:
•
•
•
•

•

Chủng Penicillium chrysogenum ban đầu có năng suất 60 mg/l và nay đạt 60000
mg/l, hơn chủng ban đầu đến 1.000 lần.
Chủng Corynebacterium glutamicum tạo glutamic axit đạt hơn 200g/l so với ban
đầu chỉ có 20g/l.
Chủng Serratia marcescens sinh ra biotin đạt 600mg/l.
Riboflavin(vitamin B2) là sản phẩm thương mại được tổng hợp bằng phương pháp
lên men và phương pháp hoá học. Sản xuất riboflavin do 2 chủng vi nấm
Eremothecium ashbyii và Ashbya gossypii với sản lượng hơn 20 g/l, gấp 40000 lần
nhu cầu của nó.
Sản xuất vitamin B12 trong công nghiệp do các chủng vi khuẩn Propionibacterium
shermanii hoặc Pseudomonas denitrificans. Các chủng đột biến này sản sinh một
lượng sản phẩm lớn hơn rất nhiều so với nhu cầu của tế bào, thậm chí lớn hơn
nhiều lần khối lượng khô của nó. Pseudomonas denitrificans sinh ra vitamin B12
gấp 100000 lần nhu cầu của nó.

Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum

Vi khuẩn Serratia marcescens

Page | 20
Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường


CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP

NHÓM 4

Eremothecium ashbyii sinh vitamin B2 ngay trên môi trường
Hình 2.4: Các loại vi sinh vật được cải tiến cho năng suất cao
Thường các chủng hoang dại trong tự nhiên không có sự tổng hợp thừa. Các chủng
nguyên thủy thuần khiết sau khi phân lập cũng không bền vững. Từ nhu cầu của thực tế
sản xuất công nghiệp dẫn đến việc lựa chọn giống có khả năng “siêu tổng hợp” so với
chủng nguyên thủy nên phương pháp đột biến đã đáp ứng được yêu cầu.
2.2

Phương pháp tái tổ hợp gen: Biến nạp, tiếp hợp, tải nạp

Các tế bào vi sinh vật đã giúp cho việc tạo giống vi sinh vật công nghiệp. Nhiều
chủng mới có hoạt tính cao, có khả năng sinh tổng hợp các chất liệu quí mà trước đây chỉ
có thể sinh ra ở cơ thể động vật hoặc thực vật thì nay các gen điều khiển tổng hợp chất đó
đã được ghép vào tế bào vi khuẩn. Công việc sau đó là tổ chức một quá trình lên men và
đưa vào sản xuất công nghiệp như các sản phẩm truyền thống khác.
Các sản phẩm như interferon, insulin, các kháng thể đơn dòng…đã được sản xuất
theo công nghệ lên men. Cũng cần lưu ý rằng việc dùng các chủng vi sinh vật đã được
thay đổi bộ gen di truyền là một việc làm hết sức quan trọng, vì ra tự nhiên khó kiểm soát

được các chủng này và hậu quả thì khó lường được. Vì vậy, ở các nước phát triển có qui
định ngặt nghèo với việc cho phép sử dụng các chủng tái tổng hợp dùng cho công nghiệp.

2.2.1 Phương pháp biến nạp (transformation)
Hiện tượng biến nạp được Griffith phát hiện ở vi khuẩn Diplococus pneumoniae
(nay gọi là Streptococus pneumoniae - phế cầu khuẩn gây sưng phổi ở động vật có vú)
vào năm 1928.Đó là quá trình chuyển DNA trực tiếp tách ra từ tế bào thể cho sang tế bào
thể nhận nhằm truyền thông tin di truyền qua DNA. Trong biến nạp, ADN trần từ một tế
bào vi khuẩn (thể cho) này được truyền sang tế bào vi khuẩn khác (thể nhận). Biến nạp
xảy ra khi vi khuẩn nhận ADN ngoại lai và hấp thu vào trong tế bào. Khi tế bào vi khuẩn
bị vỡ do bị tan (lysis), ADN vòng tròn của chúng thoát ra môi trường thành các đoạn
thẳng với chiều dài khác nhau, có khả năng gây biến nạp cho các tế bào nhận khác.
Thí nghiệm được Griffith tiến hành:

Page | 21
Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường


CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP

NHÓM 4

Hình 2.5 : Hiện tượng biến nạp. Dạng SIII, gây bệnh có vỏ bao tế bào (capsule)
bằng polysaccharid cản trở bạch cầu phá vỡ tế bào. Dạng RII, không gây bệnh,
không có vỏ bao.
Hiện tượng trên cho thấy vi khuẩn S không thể tự sống lại được sau khi bị đun chết,
nhưng các tế bào chết này đã truyền tính gây bệnh cho tế bào R. Nó được gọi là biến nạp
(transformation)
Biến nạp được nghiên cứu kĩ nhất ở các vi khuẩn Streptococcus pneumoniae,
Bacillus subtilis, Haemophilus influenzae và ở một số nhóm vi khuẩn khác.

Page | 22
Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường


CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP

NHÓM 4

Hình 2.6: Kỉ thuật biến nạp được sử dụng ở vi khuẩn E. Coli
Hiệu quả của biến nạp phụ thuộc vào 3 yếu tố:
Tính dung nạp của tế bào nhận.
Kích thước của đoạn ADN ngoại lai.
Nồng độ của ADN
Sử dụng phương pháp biến nạp có thể sử dụng được các ADN có lợi trong công nghiệp
sản xuất.

2.2.2 Tải nạp (Transduction )
Chuyển gen gián tiếp hay phương pháp chuyển gen tải nạp nhờ các nhân tố trung gian
như vi khuẩn Agrobacterium hoặc virút và phage
 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium: Là phương pháp sử dụng vi khuẩn gây

các khối u ở thực vật. Vi khuẩn Agrobacterium chứa một plasmit lớn tạo nên khối
Page | 23
Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường


CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP

NHÓM 4

u ở thực vật gọi là Ti-plasmit. Cây bị nhiễm Agrobacterium qua vết xước thì vi
khuẩn truyền một đoạn ADN của Ti-plasmit có mang các gen sản sinh auxin,
opin... cho cây, làm cây hình thành khối u. Ti-plasmit được biến đổi bằng cách loại
bỏ gen gây khối u mà lại được gắn gen mới để chuyển gen vào cây trồng.
 Chuyển gen nhờ virút và phage: là phương pháp sử dụng các virut (SV 40, BPV...)
hoặc các phage (phage , phage M13) để chuyển gen vào vi khuẩn hoặc tế bào thực
vật.
Gồm hai kiểu tải nạp: tải nạp chung và tải nạp chuyên biệt( đặc hiệu)
 Tải nạp chung là trường hợp bất kì gene nào của thể cho cũng có thể được

chuyển sang thể nhận bằng phage.

Hình 2.7: Tải nạp chung (generalized transduction).


Tải nạp chuyên biệt( đặc hiệu, hạn chế) là trường hợp phage chỉ truyền đi
những gene nhất định từ thể cho sang thể nhận.

Page | 24
Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường


CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP

NHÓM 4

Hình 2.8: Tải nạp chuyên biệt hay tải nạp hạn chế (restricted transduction).
Ngoài ra có thể sử dụng các kĩ thuật như kĩ thuật siêu âm, kĩ thuật xung điện, vi tiêm,bắn
gen... để nạp gen là vào tế bào chủ.

 Kĩ thuật siêu âm: là kĩ thuật dùng máy siêu âm để đưa ADN ngoại lai xâm nhập

vào bộ gen tế bào trần của vật chủ.
 Kĩ thuật xung điện: là kĩ thuật sử dụng dòng điện cao áp khoảng 500V/cm với thời
gian 4-5%o giây tạo các lỗ thủng trên tế bào trần làm cho gen lạ bên ngoài dễ xâm
nhập vào bộ gen của tế bào chủ.
 Kĩ thuật vi tiêm: là kĩ thuật sử dụng một lượng nhỏ ADN (các gen) tiêm vào tế bào
chủ hoặc tiêm vào tế bào trứng đã thụ tinh ở giai đoạn phôi có 4-8 tế bào.
 Kĩ thuật bắn gen: là kĩ thuật sử dụng sử dụng thiết bị bắn vi đạn mang gen cần
chuyển (súng bắn gen) vào bộ gen của tế bào chủ. Vi đạn là các hạt vonfram hoặc
vàng trộn với gen cần chuyển và phụ gia làm gen chuyển bao quanh vi đạn. Vi đạn
được gắn vào đầu viên đạn lớn hơn, sau đó được nạp vào súng bắn gen. Súng bắn
gen có lưới thép mịn ở đầu nòng cho phép khi bắn thì viên đạn lớn được giữ lại,
còn vi đạn được bắn vào tế bào với gia tốc lớn... Gen cần chuyển được bắn vào có
thể tái tổ hợp với bộ gen của tế bào chủ, tạo nên tế bào mang gen được chuyển, từ
đó
tạo
ra
cơ
thể
chuyển
gen.

Page | 25
Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường