Báo cáo thí nghiệm vi sinh căn bản.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DUY TÂN
KHOA DƯỢC



BÁO CÁO THỰC HÀNH
MÔN : VI SINH CĂN BẢN
MÃ MÔN HỌC : MIB 251

Giáo viên hướng dẫn

:Ths Lê Thị Mai

Lớp môn học

:MIB251F2

Nhóm

:3

Nhóm trưởng

: - Phan Văn Sĩ

Thành viên

: - Văn Bá Bình Nguyên
-

Nguyễn Thị Thương

Thương
Nguyễn Thị Tình
Nguyễn Thị Ngọc

Đà Nẵng,tháng 5, năm 2015.

1


Bài 1. CÁC LOẠI HÌNH THỂ CỦA VI KHUẨN.
Theo hình thái bề ngoài,vi khuẩn thường được chia thành 3 loại hình thể chính: cầu
khuẩn,trực khuẩn và xoắn khuẩn.
1. Cầu khuẩn :(Coccus - từ tiếng Hy Lạp Kokkos - hạt quả): là loại vi khuẩn có hình

cầu. Nhưng có nhiều loại không hẳn hình cầu thí dụ như hình ngọn nến như phế
cầu khuẩn - Diplococcus pneumoniae hoặc hạt cà phê (lậu cầu khuẩn Neisseria
gonorrhoeae).Kích thước của vi khuẩn thường thay đổi trong khoảng 0,5x1,2µm
(1µ = 10-3 mm). Tuỳ theo từng loài mà chúng có những dạng khác nhau.
Đặc tính chung của cầu khuẩn:
- Tế bào hình cầu có thể đứng riêng rẽ hay liên kết với nhau.
- Có nhiều loài có khả năng gây bệnh cho người và gia súc
- Không có cơ quan di động.
- Không tạo thành bào tử.

a. Giống Monococcus (Đơn cầu)

Thường đứng riêng lẻ từng tế bào một, đa số chúng thuộc loại hoại sinh. Thường thấy
chúng sống trong đất, nước và trong không khí (Thí dụ như Micrococcus agilis, M.
roseus, M. luteus)

b. Giống Diplococcus (song cầu) :(Từ tiếng Hy Lạp - Diplos - thành đôi) phân cách

theo một mặt phẳng xác định và dính nhau thành từng đôi một. Trong số này có

2


một số có khả năng gây bệnh như giống Neisseria - Lậu cầu khuẩn N meningitidis
gonorrhoeae - Não mô cầu khuẩn).

c. Giống Tetracoccus (Tứ cầu):

Thường liên kết với nhau thành từng nhóm 4 tế bào một. Chúng thường gây bệnh cho
người và một số có thể gây bệnh cho động vật.

d. Giống Streptococcus(Liên cầu)

Từ tiếng Hy Lạp (Streptos - chuỗi) chúng phân cách theo một mặt phẳng xác định và
dính với nhau thành từng chuỗi một dài. Thí dụ như Streptococcus lactic. Streppyogenes.

3


e. Giống Sarcina

Từ tiếng Hy Lạp Saricio - gói hàng. Phân cách theo 3 mặt phẳng trực giao với nhau, tạo
thành những khối từ 8 - 16 tế bào (hoặc nhiều hơn nữa). Trong không khí chúng ta
thường gặp một số loài như Sarcinalutea, Sarcina auratiaca. Chúng thường nhiễm vào các
môi trường để trong phòng thí nghiệm và tạo thành màu vàng.

f.

Giống Staphilococcus (Tụ cầu)

Từ tiếng Hy Lạp Staphile - chùm nho. Thường chúng liên kết với nhau thành những đám
trông như chùm nho. Chúng phân cách theo một mặt phẳng bất kỳ và sau đó dính lại với
nhau thành từng đám như hình chùm nho. Bên cạnh các loài hoại sinh còn có một số loài
gây bệnh ở người và động vật (Staph. Curcreus, Staph. Emidermidis ...)
2. Trực khuẩn : Là tên chung chỉ tất cả các vi khuẩn có hình que. Kích thước của

chúng thường từ 0,5 - 1,0 x 1 - 4 µm.
Thường gặp các loài trực khuẩn sau đây:

4


a. Bacillus (Viết tắt là Bac)

trực khuẩn gram dương, sinh bào tử. Chiều ngang của bào tử không vượt quá chiều ngang
của tế bào. Vì thế khi tạo thành bào tử tế bào không thay đổi hình dạng chúng thường
thuộc loài hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc.

b. Bacterium (viết tắt là Bact)

Trực khuẩn gram âm không sinh bào tử. Thường có tiên mao mọc xung quanh tế bào
người ta gọi là chu mao. Các giống Salmonella, Shigella, Erwina, Serratia đều có hình
thái giống Bacterium.

c. Pseudomonas (viết tắt là Ps)

Trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, có một tiên mao (hoặc một chùm tiên mao) ở
một đầu. Chúng thường sinh ra sắc tố. Các giống Xanthomonas. Photobacterium,
Azotomonas, Aeromonas, Zymononas, Protaminobacter, Alginomonas, Mycoplazma,
Halobacterium, Methanomonas, Hydroginomonas, Carloxydomonas, Acetobater,
Nitrosomonas, Nitrobacter đều có hình thái giống Pseudomonas.
d. Corynebacterium

Không sinh bào tử, hình dạng và kích thước thay đổi khá nhiều. Khi nhuộm màu tế bào
thường tạo thành các đoạn nhỏ bắt màu khác nhau. Trực khuẩn bạch cầu
(Corynebacterium diphtheriae) có bắt màu ở hai đầu làm tế bào có hình dạng giống quả
5


tạ. Một số khác có hình thái giống Corynebacterium gồm có Listeria, Erysipelothric,
Microbacterium, Cellulomonas, Arthrobacter.

e. Clostridium (Viết tắt là Cl, tiếng Hy Lạp Kloster - con thoi)

Thường là trực khuẩn gram dương. Kích thước thường vào khoảng 0,4 - 1 x3- 8
Sinh bào tử, chiều ngang của bào tử thường lớn hơn chiều ngang của tế bào, do đó làm tế
bào có hình thoi hay hình dùi trống.
Chúng thường thuộc loại kỵ khí bắt buộc, có nhiều loài có ích. Thí dụ như các loài cố
định nitơ. Một số loài khác gây bệnh. Thí dụ vi khuẩn uốn ván ... Cl. Botulium
3. Vi khuẩn hình xoắn: gồm 3 dạng sau :
a. Phẩy khuẩn: Là tên chung chỉ các vi khuẩn hình que uốn cong giống như dấu

phẩy. Giống điển hình là giống Vibro (Từ chữ La tinh Vibrare - dao động nhanh).
Một số giống phẩy khuẩn có khả năng phân giải xenluloza (Cellvibrio,
Cellfalcicula) hoặc có khả năng khử sunfat (Desulfovibrio).
b. Xoắn khuẩn:Gồm các vi khuẩn dài,mảnh,có nhiều vòng xoắn.Một số có khả năng

gây bệnh cho người như xoắn khuẩn giang mai(Treponema pallidum),xoắn khuẩn
Leptospira,xoắn khuẩn hồi quy(Borrelia).

6


c. Spirillum - Từ chữ Spira - Hình cong, xoắn gồm tất cả các vi khuẩn có hai vòng

xoắn trở lên. Là loại gram dương, di động được nhờ có một hay nhiều tiên mao
mọc ở đỉnh.
Đa số chúng thuộc loại hoại sinh, một số rất ít có khả năng gây bệnh (SP. Minus) có kích
thước thay đổi 0,5 - 3,0 - 5 - 40µ.
Hình ảnh quan sát thực nghiệm :
*Mẫu lấy từ các mảng bám trên răng.

7


Mẫu vi khuẩn trong sữa chua khi nhuộm đơn bằng violet và safranin:

8


Bài 2 : PHƯƠNG PHÁP NHUỘM VI SINH VẬT
*NGUYÊN TẮC:
Nhuộm màu là quá trình làm cho tế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh vật có
màu dưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm.
*MỤC ĐÍCH
Giúp việc quan sát hình dạng tế bào, các thành phần cấu trúc tế bào của vi sinh vật
được dễ dàng.

• Giúp phân biệt các chủng vi sinh vật với nhau do việc bắt màu khác nhau đối với
các loại thuốc nhuộm tạo điều kiện cho việc phân loại, định dạng vi sinh vật .
•

*PHÂN LOẠI

Nhuộm màu vi sinh
vật
Nhuộm cố định

Nhuộm đơn

Nhuộm không cố định

Nhuộm kép

Nhuộm Gram

Nhuộm Ziehl Neelsen
Nhuộm bào tử

Nhuộm tiên mao

Ở bài này sẽ tìm hiểu phương pháp nhuộm đơn và nhuộm Gram thuộc phương pháp
nhuộm cố định.

A. DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT
9

Các dung dịch nhuộm gồm:
Dung dịch xanh methylene.
Dung dịch tím kết tinh ( Crystal violet ).
Dung dịch lugol.
Dung dịch tẩy màu.
Dung dịch nhuộm bổ sung ( Safranin O hoặc Fuchsin ).
CÁCH LÀM TIÊU BẢN
Cách lấy vi sinh vật để làm tiêu bản:
Muốn làm bất kỳ một loại tiêu bản nào về vi sinh vật cũng phải thực hiện các
thao tác lấy mẫu vi sinh vật để làm vết bôi trên tiêu bản. Các thao tác đó như sau:
- Đốt đèn cồn.
- Đặt ống nghiệm mẫu hay đĩa Petri có vi sinh vật vào giữa ngón cái và ngón trỏ
của bàn tay trái, lòng bàn tay ngửa ra. Ống nghiệm để hơi nghiêng nhưng không
được để canh trường vi sinh vật chạm vào nút bông đối với ống nghiệm.
- Tay phải dùng que cấy và vô trùng bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn. Để
que cấy thẳng đứng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi đầu que cấy nóng đỏ rồi từ
từ đặt và di chuyển que cấy theo chiều nằm ngang trên ngọn lửa.
- Kẹp nút bông vào giữa ngón út và lòng bàn tay phải, xoay nhẹ nút bông 1
vòng và kéo nút ra. Giữ nguyên nút bông như vậy cho đến khi đậy nút vào.
- Đốt miệng ống nghiệm trên ngọn đèn cồn.
- Khéo léo đưa que cấy (đã nguội) vào ống giống để lấy mẫu và nhẹ nhàng
đưa que cấy ra.
+ Nếu ống mẫu là môi trường lỏng chỉ cần nhúng đầu que cấy vào
canh trường rồi rút ra.
+ Nếu ống giống là môi trường đặc thì dùng que cấy lấy một chút sinh
khối vi sinh vật trên mặt thạch(nếu quan sát một loại vi khuẩn thì nên lấy trong
một khuẩn lạc) và hoà đều vào giọt nước cất vô trùng trên phiến kính. Chú ý thao
tác hết sức nhẹ nhàng để lấy mẫu mà không cầy mặt thạch lên.
- Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm, đậy ống nghiệm nghiệm lại và để
ống vào giá.

- Đưa giọt canh trường (hoặc sinh khối) vi sinh vật ở đầu que cấy đặt vào
giữa phiến kính để làm vết bôi.
- Khử trùng lại que cấy trên ngọn đèn cồn rồi cất vào giá.
2. Làm vết bôi:
Đặt một giọt nước sạch vào giữa phiến kính, sau đó dùng que cấy đã khử
trùng lấy một vòng que cấy vi sinh vật cho vào giọt nước và dàn đều ra. Trường
hợp nuôi cấy trên môi trường lỏng thì dùng pipet để lấy dung dịch nghiên cứu. Hơ
khô phiến kính đã có vi sinh vật trên ngọn lửa đền cồn hoặc để khô tự nhiên ta
•
•
•
•
•
B.
1.

10


được một vết mờ trên phiến kính gọi là vết bôi.
Chú ý:
- Lượng vi sinh vật lấy vừa phải.
- Vết bôi tròn, gọn, thật mỏng.
- Các tế bào vi sinh vật được dàn đều, dễ quan sát.
Cố định vết bôi:
- Việc cố định vết bôi nhằm các mục đích sau:
+ Giết chết vi sinh vật để chúng dễ bắt màu và an toàn khi tiếp xúc (nếu là vi
sinh vật gây bệnh).
+ Gắn chặt vi sinh vào phiến kính để lúc nhuộm không bị rửa trôi.
- Các cách cố định:

+ Cố định bằng nhiệt: dùng kẹp gỗ để kẹp phiến kính, hơ mặt dưới của
phiến kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần (chừng vài ba giây), tránh
không để tiêu bản quá nóng.
+ Cố định bằng hoá chất:
* Nhúng vết bôi vào cồn 95o khoảng 10 – 15 phút rồi sấy khô.
* Ngâm trong axeton 5 phút.
* Sấy bằng hơi formol 10 – 15 giây.
C. PHƯƠNG PHÁP NHUỘM:
1. Phương pháp nhuộm đơn:
Nhuộm đơn là dùng 1 loại thuốc nhuộm để nhuộm. Các loại thuốc nhuộm
thường dùng để nhuộm đơn là:
- Fuchsin kiềm.
- Xanh metylen.
- Tím gentian.
- Đỏ trung tính.
Phương pháp nhuộm: đặt tiêu bản đã cố định lên giá rồi nhỏ vài giọt thuốc
nhuộm phủ kín vết bôi. Sau 1 – 2 phút, đổ thuốc nhuộm đi và rửa nhẹ bằng
nước sạch tới khi nào thấy nước rửa chảy qua vết bôi không còn màu nữa là
được. Để tiêu bản khô dần hoặc thấm khô bằng giấy thấm. Khi tiêu bản khô
hẳn đem quan sát dưới kính hiển vi.
2. Phương pháp nhuộm Gram:
Đây là phương pháp thường được dùng trong thực nghiệm vi sinh vật học.
Phương pháp nhuộm kép do nhà bác học người Đan mạch Christian Gram
và những người cộng tác đưa ra năm 1884. Với cách nhuộm này ta có thể phân
biệt vi sinh vật thành 2 nhóm: Gram dương (G+) và Gram âm (G-).
Vi sinh vật bắt màu xanh tím sau khi nhuộm gọi là vi sinh vật Gram dương
(bao gồm hầu hết xạ khuẩn, trực khuẩn sinh bào tử hiếu khí, nấm mốc, nấm
11

men, cầu khuẩn). Còn những vi sinh vật bắt màu hồng gọi là Gram âm như
trực khuẩn sinh bào tử kỵ khí, một số cầu khuẩn như lậu cầu khuẩn, não mô
cầu khuẩn,các vi khuẩn đường ruột…)
a. Nguyên tắc: Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào
với thuốc nhuộm tím kết tinh và iot mà hình thành nên hai loại phức chất khác
nhau:
- Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không
bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram
dương.
- Loại phức chất thứ hai không giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu
khi bị xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. Vi sinh vật có
phức chất này thuộc loại gram âm.

b. Cách tiến hành:
Vết bôi

12


Phủ tím kết tinh (
Crystal violet )

1phút
Rửa nước

15
Phủ lugol

1phút
Rửa nước

Tẩy cồn

Rửa nước

Phủ safranin hoặc
Fuchsin

Rửa nước

15

15

15

1phút

15
Mẫu đã nhuộm

D. Kết quả thí nghiệm quan sát vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram

đối với 3 chủng vi khuẩn mẫu: Ecoli,Bacillus,Pseudomonas.
a. Chủng E.coli bắt màu Gram âm.

13


b. Chủng Bacillus bắt màu Gram dương (không rõ lắm do vi khuẩn còn non)

14


c. Chủng Pseudomonas bắt màu Gram âm:

Bài 3 : PHẢN ỨNG SINH HÓA
A. MỤC TIÊU:

Nắm được mục đích khảo sát những tính chất sinh hóa của vi khuẩn.
15


Trình bày được nguyên tắc của những phản ứng sinh hóa thông thường.
Quan sát các phản ứng sinh hóa và nhận xét kết quả.
B. THỰC HÀNH:
1. Những phản ứng liên hệ đến nguồn thức ăn có chứa Nitơ.
a. Phản ứng Indol:

Nguyên tắc: Phát hiện khả năng oxi hóa tryptophan thành các dạng của indol: Indole,
Skatole (methyl indole) và indole-acetate.Một số vi khuẩn như Ecoli có enzyme
Tryptophanase chuyển Tryptophan thành Indol.
Môi trường: Tryptophan hoặc peptone broth.Ta nuôi cấy vi khuẩn ở môi trường nước
pepton không chứa đường trong 24-48h trong tủ ủ 37oC
Thuốc thử: Kovacs’s
Kết quả :

– Dương tính: xuất hiện vòng màu đỏ trên bề mặt môi trường sau 5 phút.
– Âm tính: màu vàng (màu của thuốc thử Kovacs’s)
Hình ảnh thí nghiệm : Indol âm tính.

16


b. Khả năng tạo thành H2S :

Nguyên tắc : Nhiều vi khuẩn sử dụng những hợp chất chứa Sodium thiosunfuate thì có
thể tạo thành H2S.

Môi trường : Môi trường KIA gồm glucose và lactose (có thể lên men carbohydrat), đỏ
phenol (chỉ thị pH), pepton (nguồn carbon/nitrogen) và muối sắt cộng với thiosulfate
natri.
Kết quả :Dương tính khi làm cho môi trường thạch thành màu đen.

c. Phản ứng phân giải Urê :

Nguyên tắc:
Sử dụng để phát hiện khả năng phân cắt urea thành ammonia do hoạt tính của urease từ vi
sinh vật và kết quả là môi trường bị kiềm hóa do NH3 được tạo ra.
17


Môi trường: Urea broth (hoặc Urea agar)
Kết quả :
– Dương tính: môi trường có màu hồng
– Âm tính: môi trường không đổi màu (vàng cam)

2. Những phản ứng liên quan tới nguồn thức ăn có Carbon :
a. Khả năng lên men đường:

18


Cấy vi khuẩn vào ống đường chứa pepton,cao thịt,1% đường và chỉ thị màu.Trong quá
trình phát triển,vi khuẩn có thể lên men đường tạo thành acid đổi màu phenol đỏ từ màu
đỏ sang màu vàng.
ĐỐI VỚI GLUCOSE
2. S.aureus

(+) Sinh acid

5. E.coli

(+)

Sinh acid,gas

Streptococcus pyogenes lên men đường,
không sinh hơi

Đối với Lactose
2. S. aureus

(+) Sinh acid

5. E.coli

(+)

Sinh acid,gas

Streptococcus pyogenes lên men
đường, không sinh hơi

Hình ảnh thực hành : cả hai ống nghiệm đều dương tính.

19


b. Phản ứng MR (methyl red)

Mục đích: Vi khuẩn lên men tạo acid làm PH môi trường giảm mạnh,Khi cho đỏ methyl
vào môi trường xuất hiện màu đỏ là dương tính.
Chủng vi sinh vật

Môi trường MR-VP
Methyl
Red

24h,
37oC

Kết quả, màu đỏ (Dương tính), màu vàng: (âm tính)

Nuôi cấy 48h sau đó cho vài giọt methyl đỏ

Chủng
Vi Sinh Vật

Môi Trường Clack-lubs

Dương tính

Âm tính

Cơ sở sinh hóa:
Chất chỉ thị pH: methyl red
Dưới 4,4

5,0 – 5,8

Trên 6,0
20


Cơ chế: một số vi sinh vật có khả năng chuyển hóa Glucose qua quá trình đường phân tạo
thành acid pyruvic, rồi từ Acid pyruvic chuyển hóa thành acetyl coenzyme A, đi qua chu
trình Kreps tạo ra các acid: acid citric, acid succinic, acid fomic, a cid malic, a cid
oxalic… hoặc từ Acid pyruvic chuyển trực tiếp thành các acid lactic, acid fomic,…
Trong môi trường MR-VP có PH= 6.9±0.2 có K2HPO4 (đệm phosphat) giúp ổn định PH,
khi có mặt các acid hữu cơ mạnh sẽ tấn công và phá vỡ thế PH ổn định làm cho PH giảm
mạnh, PH<4.3, Với sự có mặt của thuốc thử MR (Methyl Red) sẽ làm môi trường chuyển
sang màu đỏ (Phản ứng dương tính)
Ý nghĩa: Định danh vi sinh vật có khả năng chuyển hóa Glucose (thường là gram -).
Kết quả thí nghiệm :

Phản ứng Metyl Red

Ống 1,2 (+)

E.coli, Salmonella

c. Phản ứng Voges-Proskauer ( VP).

Ống 3

(-)

Ống 4

đối chứng

21


Nguyên tắc: Xác định khả năng sinh acetylmethylcarbinol (acetoin) trong quá trình lên
men glucose của một số vi sinh vật. Hợp chất này bị khử oxy cho butylene glycol,thuốc
thử VP phát hiện sự hiện diện của acetonin.
Môi trường nuôi cấy : Clark-lubs
Thuốc thử :
- Naphtol, (chất tăng cường màu)
- KOH 40%, (chất oxi hóa)
Phản ứng:

22


Kết quả thí nghiệm : (hình ảnh không được rõ)
Dương tính: Màu đỏ-hồng nhạt trên bề mặt môi trường (có acetoin)
Âm tính: Màu vàng trên bề mặt môi trường (như màu của thuốc thử)

23


d. Khả năng sử dụng Citrat:

Nguyên tắc:
Xác định khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất trong quá trình biến
dưỡng của vi sinh vật,(các loài Krebsiella và Enterobacter)
Môi trường: Simmons citrate medium,chứa chỉ thị.Ta nuôi cấy VK trong 48h.
Thuốc thử: Bromthymol blue – chất chỉ thị pH
Cơ sở sinh hóa: Môi trường có chứa muối ammonium vô cơ. Vi sinh vật có khả năng
sử dụng citrate làm nguồn Carbon duy nhất thì có khả năng sử dụng muối Amonium
làm nguồn Nitơ và sinh NH3 làm môi trường trở nên kiềm.
Phản ứng :

Kết quả thí nghiệm :
Dương tính: Màu xanh dương đậm (kiềm)
Âm tính: Màu xanh rêu
Ống 1 : Âm tính
Ống 2 : Dương tính

24


25