CÁC QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

CÁC QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
VI SINH VẬT

TS. NGUYỄN TIẾN DŨNG

1


TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ

TPC (Total Plate Count)/ APC (Aerobic Plate Count)

• Đònh nghóa

– VSV hiếu khí là vi sinh vật phát triển và tạo
được khuẩn lạc có thể nhìn thấy trong điều
kiện có O2
– Tổng số vi sinh vật hiếu khí là số khuẩn lạc
hình thành được nhìn thấy trong một khối
lượng mẫu
– Số đơn vò hành thành khuẩn lạc (cfu – colony
forming unit) là số khuẩn lạc được nhìn thấy
trong môi trường nuôi cấy
2


Ý NGHĨA
• TPC phản ánh mức độ nhiễm vi sinh vật
trong mẫu
• TPC không phản ảnh tổng số vi sinh vật
trong mẫu

• TPC không phản ánh mức độ an toàn vệ
sinh của thực phẩm/ nước uống, sinh hoạt
• Số TPC thấp hơn rất nhiều so với mật độ
vi sinh vật trong mẫu
3


NGUYÊN TẮC

• Đònh lượng TPC bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc theo nguyên tắc sau:
- Mẫu được đồng nhất, pha loãng theo từng bậc
10
- TPC được đònh lượng theo phương pháp đổ đóa:

- 1ml mẫu (dd mẫu đã pha loãng) cấy
vào đóa petri trống vô trùng
- Môi trường agar không chọn lọc được đun
chảy và làm nguội đến 45±1oC được đổ vào trong
đóa, lắc đều
- Ủ đóa ở 25-30oC trong 72 ±6giờ
- Đếm tất cả các khuẩn lạc nhìn thấy được 4
trong đóa


MÔI TRƯỜNG
• Dung dòch pha loãng
• - Pepton
• - NaCl

1g
8.5g

• Môi trường không chọn lọc
• - Plate count agar
• - Nutrient agar
• - Standard count agar

5


QUI TRÌNH ĐỊNH LƯNG TỔNG VI SINH
VẬT HIẾU KHÍ
10g mẫu + 90g Salin Pepton Water, đồng nhất
bằng stomacher trong 30 giây  dd 10-1

Pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 …
Cấy 1ml dd mẫu đã pha loãng vào đóa petri
trống vô trùng. Cấy 3 độ pha loãng liên tiếp,
mỗi độ pha loãng cấy 2 đóa
Đỗ vào mỗi đóa đã cấy mẫu 15-20ml môi trường
PCA đã đun chảy và làm nguội đến 45oC. Lắc
cho mẫu khuếch tán vào môi trường

6


QUI TRÌNH ĐỊNH LƯNG TỔNG VI SINH
VẬT HIẾU KHÍ (tt)
Để đóa trên mặt phẳng ngang cho môi trường đông đặc

Lật ngược đóa và ủ ở tủ ấm 30±1oC trong 72± 6 giờ
Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đóa. Chọn các
đóa có khoảng 15 –300 khuẩn lạc / đóa để tính kết quả
Tổng số vi sinh vật hiếu khí / g (TPC)
N
TPC =
n1V1F1 + …+ niViFi
N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đóa
n: số đóa tại mỗi nồng độ
V: thể tích cấy vào đóa (=1)
F: độ pha loãng

7


TÍNH KẾT QUẢ
• Chọn các đóa có số khuẩn lạc trong
khoảng 25-250KL hay 30-300 KL để tính
kết quả
N
• Số CFU/g(nl) =

n1V1f1+…+niVifi

• Nếu ở độ pha loãng thấp nhất hay cao
nhất mà có số đếm ngoài giới hạn trên thì
kết quả sẽ được đánh dấu
8

KEÁT QUAÛ (tt)
10-2

10-3

TPC/g

12

2

<1.5x103 hay
1.2x103(*)

0

0

<2.5x103 hay
<1x102(*)

Nhieàu

420

>3.0x105 hay
4.2x105(*)
9

ĐỊNH LƯNG BÀO TỬ VI SINH VẬT
KỴ KHÍ SINH H2S (CLOSTRIDIA)
• Đònh nghóa
– Thuộc giống Clostridium, phát triển trong
điều kiện kỵ khí
– Hình que, gram dương, di động (trừ C.
perfingens)
– Tạo bào tử bền nhiệt
– Tạo được H2S từ nguồn Sulphite
– Tạo được enzym protease ngoại bào
10


Ý NGHĨA
• Vi sinh vật chỉ thò mức độ vệ sinh của
thực phẩm, chỉ thò ô nhiễm ngầm, lâu
ngày
• Vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm
• Trong giống có nhiều loài tạo độc tố
gây ngộ độc thực phẩm như: C.
botulinum, C. perfrigens…
11


ĐỊNH LƯNG CLOSTRIDIA
Nguyên tắc
• Mẫu được xử lý nhiệt để loại bỏ tế bào sinh
dưỡng, chọn lọc bào tử
• Nuôi cấy kỵ khí trong môi trường có Na2S2O3 là
cơ chất tạo H2S.

• Phát hiện H2S bằng Ferric ammonium citrate
• Nuôi cấy trong ống nghiệm hay trong đóa với
điều kiện kỵ khí
• Đếm tất cả các khuẩn lạc màu đen xuất hiện
trong ống/ đóa
12


MOÂI TRÖÔØNG
• Iron sulphite agar
• - Tryptose
• - Soyton
• - Cao naám men
• - Na2S2O5

15g
5g
5g
1g

• - Ferric ammonium citrate 1g
20g
• - Agar
1lít
• - Nöôùc caát

13


ĐỊNH LƯNG TỔNG BÀO TỬ VI SINH VẬT

KỴ KHÍ SINH H2S
Cấy 1ml mẫu đã pha loãng 10-1 vào ống
nghiệm 18 x 180 mm
Xử lý nhiệt ở 75-80oC trong 15-20 phút
trong bể điều nhiệt
Đổ khoảng 15ml môi trường ISA đã đun
tan và làm nguội ở 45oC
Để yên cho môi trường đông đặc trong ống
Đổ 3-5ml môi trường ISA lên trên mặt ống
nghiệm

14


ĐỊNH LƯNG TỔNG BÀO TỬ VI SINH VẬT
KỴ KHÍ SINH H2S (tt)
Ủ 37 ± 1oC trong 24 giờ
Đếm tất cả các khuẩn lạc màu đen xuất hiện
trong ống
Tổng bào tử vi sinh vật kỵ khí sinh H2S/ (cfu)g (A)
N
A =
nVf
N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các ống
n: số ống tại mỗi nồng độ (=2)
V: thể tích cấy vào ống (=1)
F: độ pha loãng (10-1)

15

ĐỊNH LƯNG COLIFORM,
F. COLIFORM
• Đòng nghóa
– Coliform là vi khuẩn hình que, gram âm,
thuộc họ Enterobacteriaccae, có khả năng lên
men lactose và sinh hơi ở 37oC

16


FEACAL COLIFORM
Đònh nghiã
- Coliform chòu nhiệt: là coliforms có khả năng
lên men lactose và sinh hơi ở 44oC. Nhóm này
còn được goi là Feacal Coliform giả đònh
(presumtive F. coliform)
- Feacal Coliform (xác nhận): là Coliform chòu
nhiệt có phản ứng indol dương tính. Còn được
gọi là E. coli giả đònh (presumtive E. coli)
- E. coli xác đònh: là feacal coliform có nghiệm
pháp IMViC theo trật tự + + - 17


SÖÏ TÖÔNG QUAN COLIFORM – E. COLI
Coliform
Coliform chòu nhieät
Feacal Coliform
E. coli

18


Ý NGHĨA CHỈ TIÊU COLIFORM
• Là vi sinh chỉ thò an toàn vệ sinh thực
phẩm vì:
- Có quan hệ họ hàng gần với các VSV gây
bệnh đường ruột
- Luôn đồng hành với các vi sinh vật gây
bệnh đường ruột và VSV gây ngộ độc thực
phẩm
- Số lượng cao VSV này trong thực phẩm thì
khả năng có mặt của vi sinh vật gây bệnh
khác cũng cao

• Số lượng Coliform giảm dần theo thời
gian trong các sản phẩm đông lạnh

19


NGUYÊN TẮC PHƯƠNG PHÁP ĐẾM
KHUẨN LẠC
• Phương pháp: đổ đóa (pour plate)
• Môi trường chọn lọc cho Coliform: chứa
laclose, muối mật, chất nhận dạng sự tạo
thành axít
Trong trường hợp vi khuẩn bò yếu hay tổn thương,
phải phục hồi bằng môi trường không chọn lọc,
không chứa nguồn carbonhydrate khác (vd TSA)

• Khẳng đònh khuẩn lạc đã đếm bằng môi
trường lỏng chọn lọc cho Coliform
20


CÁC TRƯỜNG HP CẦN PHẢI
KHẲNG ĐỊNH
• Mẫu có hệ VSV gây nhiễu trong môi
trường dành cho Coliform: ví dụ: nước
biển, cá và các sản phẩm của cá, rau quả
Các vi sinh vật gây nhiễu: Aeromomas,
Flavobacterium, Erwinia

• Mẫu có chứa nguồn carbohydrate khác
lactose: bánh ngọt, nước ngọt, thực phẩm
chứa tinh bột …
21


FEACAL COLIFORM
• Hiện diện thường xuyên trong ruột người
và động vật
• Sự hiện diện của F. coliform được đánh
giá là ô nhiễm phân tươi
• Gồm các giống: Escherichia, Klebsiella,
Citrobacter, Enterobacter

22

MÔI TRƯỜNG
• Violet red bile agar (VRB)

Cao nấm men
3g
NaCl
5g
Muối mật số 3
1.5g
Lactose
10g
Neutral red
0.03g
Crystal violet
0.002g
Agar
15g
nước cất
1000g
pH 7.4 ±0.2
23


MOÂI TRÖÔØNG (tt)

• Trypton soya agar (TSA)
•
•
•

•
•

Trypton
Soya pepton
NaCl
Agar
Nöôùc

15g
5g
5g
15g
1 lít

pH 7.3 ± 0.2

- Brilliant green bile lactose broth
Pepton
Lactose
Ox bile
Brilliant green
Nöôùc caát
pH 7.2 ± 0.2

10g
10
20g
0.0133g
1 lít

24


ĐỊNH LƯNG TỔNG SỐ COLIFORMS
(PP ĐẾM KHUẨN LẠC)
Cấy 1ml mẫu đã pha loãng 10-1 vào đóa petri
Đổ khoảng 5ml TSA tan chảy và làm nguội đến
45oC, lắc đều
Ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 1-2 giờ
Đổ vào 10-15ml VRB đã đun tan và làm nguội
đến 45oC  chờ đông đặc
Lật ngược và ủ ở 37.0 ± 0.5oC trong 24 - 48 giờ
Chọn và đếm các khuẩn lạc có màu đỏ, đến đỏ
đậm, có quầng tủa muối mật, Φ≥0.5mm

25