Xác định đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn bạc lá lúa xanthomonas oryzae pv oryzae ở miền bắc việt nam bằng chỉ thị phân tử

MỤC LỤC
MỤC LỤC.................................................................................................................... 1
Hiện đã có một số nghiên cứu về trình tự genom của các chủng vi khuẩn Xoo,
trong đó gần đây nhất là cơng trình nghiên cứu giải mã cấu trúc genom của ba
chủng phổ biến nhất hiện nay là: MAF311018 (Nhật Bản) và KACC10331 (Hàn
Quốc), PXO99A (Philippin)........................................................................................9
LỜI CẢM ƠN...............................................................................................................i
....................................................................................................................................... ii
DANH MỤC BẢNG...................................................................................................iv
DANH MỤC HÌNH.....................................................................................................v
TĨM TẮT................................................................................................................... vi
Phần 1. MỞ ĐẦU.........................................................................................................3
1.1. Đặt vấn đề........................................................................................................................3
1.2. Mục đích và yêu cầu........................................................................................................5
1.2.1. Mục đích...................................................................................................................5
1.2.2. Yêu cầu.....................................................................................................................5

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................................6
2.1. Bệnh bạc lá lúa.................................................................................................................6
2.1.1. Lịch sử, tầm quan trọng bệnh bạc lá lúa...................................................................6
2.1.2. Triệu chứng, dấu hiệu bệnh bạc lá............................................................................6
2.1.3. Quy luật và các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh............................7
2.1.3.1. Quy luật phát sinh, phát triển.................................................................................7
2.1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh, phát triển bệnh.......................................7
2.1.4. Chẩn đốn bệnh bạc lá..............................................................................................8
2.1.5. Các biện pháp phịng trừ bệnh bạc lá........................................................................8
2.2. Vi khuẩn Xoo...................................................................................................................8
2.2.1. Đặc điểm đặc trưng...................................................................................................8
2.2.2. Đặc điểm bộ genom Xoo..........................................................................................9

Hiện đã có một số nghiên cứu về trình tự genom của các chủng vi khuẩn Xoo,

trong đó gần đây nhất là cơng trình nghiên cứu giải mã cấu trúc genom của ba
chủng phổ biến nhất hiện nay là: MAF311018 (Nhật Bản) và KACC10331 (Hàn
Quốc), PXO99A (Philippin)........................................................................................9
2.2.2.1. Cấu trúc genom Xoo chủng MAFF311018............................................................9
2.2.2.2. Cấu trúc genom Xoo chủng KACC10331...........................................................10
2.2.2.3. Cấu trúc genom Xoo chủng PXO99A..................................................................11
2.2.3. Những gen quy định tính độc của vi khuẩn Xoo (Pathogenicity-related genes)....12
- Nhóm gen hrp (hypersensitive reaction and pathogenicity):..............................................12

1


- Gen điều hịa HrpX.............................................................................................................13
- Nhóm gen avr (avirulence).................................................................................................15
2.2.4. Trình tự lặp lại (Repeitive sequence) trong bộ gen vi khuẩn Xoo..........................16
2.3. Đa dạng các chủng Xoo.................................................................................................17
2.3.1. Định nghĩa đa dạng di truyền......................................................................................17
2.3.2. Thành phần chủng Xoo...............................................................................................17
2.3.2.1. Trên thế giới.............................................................................................................17
2.3.2.2. Tại Việt Nam............................................................................................................18
2.3.3. Các nghiên cứu đa dạng di truyền của Xoo................................................................19
2.3.3.1. Các loại chỉ thị phân tử ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền...................19
2.3.3.2. Nghiên cứu đa dạng di truyền của Xoo trên thế giới...............................................19
2.3.3.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền của Xoo tại miền Bắc Việt Nam..............................20

Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................21
3.1. Vật liệu nghiên cứu........................................................................................................21
3.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................................................22
3.2.1. Kết quả nuôi cấy vi khuẩn...........................................................................................22
3.2.2. Phương pháp xác định vi khuẩn Xoo bằng kỹ thuật PCR...........................................23

3.2.3. Phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng của vi khuẩn........................................25
3.2.5. Phương pháp dùng chỉ thị phân tử DNA xác định thành phần chủng vi khuẩn Xoo..27
3.2.6. Phương pháp lây nhiễm nhân tạo................................................................................28

Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................................30
4.1. Kết quả phân lập, nuôi cấy và xác định chính xác vi khuẩn Xoo..................................30
4.1.1. Kết quả phân lập và nuôi cấy......................................................................................30
4.1.2. Kết quả xác định vi khuẩn Xoo bằng kỹ thuật PCR...................................................30
4.2. Kết quả nghiên cứu tốc độ sinh trưởng của các mẫu vi khuẩn......................................32
4.3. Kết quả xác định đa dạng di truyền DNA của các mẫu vi khuẩn Xoo bằng phương pháp
Rep - PCR.............................................................................................................................35
4.4. Kết quả lây nhiễm nhân tạo............................................................................................39
4.5. Mối quan hệ giữa sinh trưởng và tính gây bệnh của các mẫu vi khuẩn nghiên cứu:.....40
4.6. Kết quả so sánh 2 phương pháp nghiên cứu đa dạng các mẫu Xoo nghiên cứu............41

Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..........................................................................45
5.1. Kết luận..........................................................................................................................45
5.2. Đề nghị...........................................................................................................................46

2


Phần 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. Oryzae (Xoo) gây ra là
bệnh nhiệt đới điển hình của các vùng trồng lúa, đặc biệt ở những vùng thâm canh cao.
Ở miền Bắc nước ta, bệnh gây hại cả vụ xuân lẫn vụ mùa và hại trên nhiều giống khác
nhau, đặc biệt đối với vụ mùa và trên các giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc. Bên
cạnh đó, các chủng vi khuẩn Xoo ngày càng phong phú và phức tạp, cả về thành phần
lồi và tính độc. Để phịng trừ bệnh bạc lá người ta đã sử dụng nhiều biện pháp khác

nhau như: dùng thuốc hóa học; bón phân sớm, cân đối; vệ sinh đồng ruộng; mật độ
gieo trồng hợp lý; dùng giống kháng bệnh.... Trong đó sử dụng giống kháng bệnh là
một trong những giải pháp rất quan trọng, có hiệu quả kinh tế, không gây ảnh hưởng
tới chất lượng nông sản và an tồn với người sử dụng, khơng gây ô nhiễm môi trường.
Muốn tạo giống kháng bệnh bền vững thì trước hết phải có nguồn gen kháng
hữu hiệu, phải xác định chính xác số lượng và thành phần chủng lồi gây bệnh hiện có
ở mỗi vùng. Tuy nhiên, một gen kháng có thể kháng được chủng này nhưng lại không
kháng được chủng khác, chủng này nhiễm được trên giống lúa này nhưng giống lúa
khác khơng bị nhiễm. Vì vậy để tạo giống kháng bạc lá bền vững cần lai quy tụ nhiều
gen kháng vào trong một giống luá. Hiện nay người ta đã phân lập được hơn 30 chủng
vi khuẩn Xoo, tương ứng đã xác định được hơn 30 gen kháng bệnh bạc lá khác nhau. Ở
mỗi nước có một số chủng gây bệnh nhất định, ở Philippin có 6 chủng, Ấn Độ có 9
chủng, Nhật Bản có 12 chủng. Phan Hữu Tôn và cộng sự, 2002 đã phân lập được 12
chủng Xoo ở miền Bắc Việt Nam trên cơ sở lây nhiễm trên các dòng đẳng gen, dựa
vào phổ kháng nhiễm đã tạm thời phân ra ở miền Bắc tồn tại 10 chủng; đồng thời đã
xác định được 4 gen kháng hữu hiệu là Xa4, xa5, Xa7 và Xa21 kháng mạnh và kháng
được hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập. Nếu đúng như vậy thì việc chọn tạo giống
lúa kháng bệnh bạc lá chỉ cần đưa 1 gen Xa4, xa5, Xa7, hoặc Xa21 vào một giống, khi
đó công việc dễ dàng hơn nhiều so với chuyển đa gen kháng. Tuy nhiên có phải các
chủng vi khuẩn này khơng khác nhau nhiều nên đánh giá tính kháng của các gen

3


kháng đó chưa chính xác? Vì vậy vấn đề xác định chính xác mức độ đa dạng thành
phần chủng vi khuẩn Xoo thực sự cần thiết để tạo giống lúa kháng bạc lá bền vững.
Theo phương pháp truyền thống, để xác định thành phần chủng, tiến hành phân
lập vi khuẩn từ lá bị bệnh, sau đó lây nhiễm nhân tạo trên dòng đẳng gen, trên cơ sở
phổ kháng nhiễm phân ra các chủng. Tuy nhiên, do phương pháp lây nhiễm nhân tạo
có một số nhược điểm như phụ thuộc vào thời tiết, địa hình, tốn thời gian, nhiều khi

kết quả thu được chưa thật chính xác. Để khắc phục nhược điểm trên thì cần thiết phải
xác định một cách chính xác sự đa dạng di truyền giữa các chủng ở mức phân tử.
Trên thế giới đã có khá nhiều cơng trình nghiên cứu xác định thành phần các
chủng vi sinh vật gây bệnh. Lee và cộng sự 2005 lần đầu tiên cơng bố đã xác định
được trình tự của genome vi khuẩn Xoo, vòng genome dài 4,9 triệu bp. Đã xác định
được những vùng gen bảo thủ đặc trưng cho vi khuẩn Xoo và vùng biến động nhiều
giữa các chủng. Đồng thời xác định được các phổ enzyme, phổ protein của vi khuẩn
Xoo. Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, phương pháp sử dụng chỉ thị
phân tử (DNA, Protein hay Isozyme) xác định đa dạng di truyền các chủng được áp
dụng và gặt hái nhiều thành công.
Nghiên cứu của Phan Thanh Tùng 2008 sử dụng kỹ thuật rep-PCR và IS-PCR
đã xác định đa dạng một số chủng vi khuẩn thu thập ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam
năm 2007, và so sánh với các chủng do Phan Hữu Tôn và cs thu thập 2002; kết quả
cho thấy số lượng các chủng bạc lá ở miền Bắc nước ta đang tăng lên nhanh chóng và
đa dạng, địi hỏi cần phải có những nghiên cứu chính xác các chủng vi khuẩn Xoo
đang tồn tại để lựa chọn được những gen kháng hữu hiệu, và từ đó có kế hoạch chọn
tạo giống kháng bệnh bền vững. Do đó việc thu thập mẫu bệnh mới và phân loại chúng
là cơng việc cần phải làm thường xun. Vì vậy được sự hướng dẫn của bộ môn
CNSHƯD, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Xác định đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn bạc lá lúa Xanthomonas
oryzae pv. oryzae ở miền Bắc Việt Nam bằng chỉ thị phân tử”.

4


1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Nghiên cứu đa dạng di truyền ở mức phân tử DNA các mẫu vi khuẩn Xoo, từ đó
phân chia thành các nhóm chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa.
1.2.2. Yêu cầu

- Nuôi cấy, tách chiết DNA vi khuẩn và xác định chính xác các mẫu vi khuẩn
Xoo nghiên cứu.
- Xác định khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn Xoo bằng phương
pháp đo OD.
- Sử dụng kỹ thuật rep-PCR để xác định đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn
Xoo, trên cơ sở đó phân chia ra các chủng.
- Lây nhiễm các dịng đẳng đơn gen, đa gen, xác định tính độc của mẫu vi
khuẩn và phổ kháng nhiễm.

5


Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Bệnh bạc lá lúa
2.1.1. Lịch sử, tầm quan trọng bệnh bạc lá lúa
Bệnh bạc lá lúa được phát hiện đầu tiên ở Fukuoka - Nhật Bản vào năm 1884.
Ban đầu người ta lầm tưởng nguyên nhân gây nên triệu chứng bệnh là do acid đất
(Bokura, 1911). Nhưng khơng lâu sau đó, người ta đã cơng nhận ngun nhân của nó
là do vi khuẩn gây nên và theo Ishiyama, 1922 thuộc loại Bacillus oryzae. Vi khuẩn
này sau đó được Mizukami, Wakimoto, 1969 đặt tên là Pseudomonas oryzae, cuối
cùng Oku, 1972 đã xác định là do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây nên.
Bệnh bạc lá lúa trở nên phổ biến ở tất cả các vùng trồng lúa trên khắp thế giới
vào cuối thập kỉ 60 đến đầu thập kỉ 80 của thế kỉ XX, đặc biệt trên các nước trồng lúa
ở Châu Á như: Indonexia (1950), Philippin (1957), Trung Quốc (1957), Ấn Độ (1990)
….
Hàng năm, theo thống kê năng suất lúa toàn thế giới giảm từ 10-20% do các
bệnh vi khuẩn, trong đó 50% là do bệnh bạc lá gây nên (Mew, 1989).
Tác hại của bệnh chủ yếu là làm cho lá địng sớm tàn khơ xác, giảm quang hợp,
tăng lượng hạt lép, dẫn đến giảm năng suất lúa.

2.1.2. Triệu chứng, dấu hiệu bệnh bạc lá
Vi khuẩn Xoo gây ra 3 triệu chứng điển hình của bệnh bạc lá lúa là: bạc lá, vàng
nhợt, héo xanh (còn được gọi là Kresek). Cho đến nay mối quan hệ giữa 3 triệu chứng
này vẫn chưa được làm sáng tỏ, nhiều thí nghiệm trong nhà lưới đã chứng minh hiện
tượng Kresek và bạc lá khác nhau rõ rệt mặc dù chúng đều là triệu chứng ban đầu của
sự nhiễm bệnh.
Khi bị bệnh, trên lá vết bệnh lan dần từ mép lá vào phiến lá, kéo dài theo gân
chính, có khi vết bệnh từ ngay giữa phiến lá lan rộng ra. Vết bệnh lan từ mép ngoài
vào gân lá theo đường gợn sóng. Vào lúc trời ẩm hoặc buổi sáng sớm, đầu hoặc mép lá
có dạng giọt vi khuẩn dịch màu vàng, gặp trời nắng tạo thành dạng hạt keo vi khuẩn
màu hổ phách.

6


Hình 2.1. Triệu chứng, dấu hiệu bệnh bạc lá lúa
2.1.3. Quy luật và các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh
2.1.3.1. Quy luật phát sinh, phát triển
Bệnh bạc lá phát sinh phát triển mạnh ở vụ mùa các tỉnh phía Bắc. Bệnh phát
triển, lây lan nhanh trong điều kiện nhiệt độ 26-29°C, ẩm độ 90%, đặc biệt khi có mưa
to và gió lớn làm rập nát lá lúa tạo thuận lợi cho bệnh truyền lan. Vì thế vụ mùa bệnh
thường gây tác hại nặng hơn vụ xuân.
Nhìn chung, bệnh phát triển mạnh nhất vào giai đoạn lúa làm địng đến chín sữa
vì đây là giai đoạn lúa mẫn cảm nhất với bệnh bạc lá.
Sự có mặt của các chủng vi khuẩn bạc lá phụ thuộc vào cơ cấu các giống lúa và
điều kiện tự nhiên của mỗi vùng.
2.1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh, phát triển bệnh
Có nhiều yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến sự phát sinh phát triển của bệnh.
Ẩm độ và lượng mưa là hai yếu tố quyết định cho sự phát sinh phát triển của bệnh bạc
lá, lượng mưa lớn và nhiều kèm theo gió bão khơng những làm tổn thương đến lá

khiến vi khuẩn dễ dàng xâm nhập mà còn tạo điều kiện cho vi khuẩn sinh sản nhanh,
tạo nhiều giọt dịch vi khuẩn và lây lan nhanh chóng.
Phân bón và thời kỳ bón cũng là yếu tố ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát sinh phát
triển của bệnh. Lượng đạm bón lớn làm thân lá phát triển mạnh, cây mềm yếu và dễ bị
tổn thương nên dễ bị nhiễm bệnh.
Đất màu mỡ, nhiều chất hữu cơ; đất chua, ngập úng, nhiều mùn, lúa bị che
bóng, bệnh cũng phát triển mạnh hơn.
Giống cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh phát triển của bệnh bạc lá.

7


2.1.4. Chẩn đốn bệnh bạc lá.
Hiện nay đã có nhiều phương pháp khác nhau để chẩn đoán bệnh bạc lá. Mỗi
phương pháp đều có ưu và nhược điểm riêng. Có thể kể ra ở đây một vài phương pháp
và kỹ thuật chẩn đoán phổ biến như sau: quan sát trực tiếp mẫu bệnh; phương pháp
giọt dịch; phương pháp Test ELISA; phương pháp thấm hút tế bào trực tiếp (Direct
tissue blotting), sử dụng que DNA/RNA; phương pháp thấm hút nén (Squash blot
method); phương pháp sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc trưng cho vi khuẩn Xoo
XOR-R2 và XOR-F.
Trong số các phương pháp kể trên thì phương pháp xác định vi khuẩn Xoo bằng
kỹ thuật PCR là tiên tiến và cho kết quả chính xác nhất. Phương pháp này khắc phục
được những nhược điểm của các phương pháp khác và là phương pháp thích hợp được
sử dụng trong điều kiện nghiên cứu tại phịng thí nghiệm.
2.1.5. Các biện pháp phịng trừ bệnh bạc lá
Các biện pháp canh tác bao gồm vệ sinh đồng ruộng, diệt trừ cỏ dại, phun thuốc
trừ bệnh, bón phân đúng cách, thích hợp, điều chỉnh mực nước hợp lý và trồng giống
kháng bệnh. Ngồi ra cịn có biện pháp xử lý hạt giống trước khi gieo. Cho đến nay,
biện pháp sử dụng giống kháng bệnh vẫn được coi là biện pháp có hiệu quả và khả thi
nhất.

2.2. Vi khuẩn Xoo
2.2.1. Đặc điểm đặc trưng
Vi khuẩn Xoo thuộc họ Pseudomonadaceae, có dạng hình gậy hai đầu hơi trịn,
có một lơng roi ở một đầu, kích thước 0.7-2 x 0,4-0,7 µm. Trên mơi trường nhân tạo
khuẩn lạc cầu vi khuẩn có dạng hình trịn, màu vàng sáp (do hình thành sắc tố
xanthomonadin), rìa nhẵn, bề mặt khuẩn lạc ướt, háo khí, nhuộm Gram âm. Xoo tạo
nhiều polysacharide ngoại bào EPS, có vai trị quan trọng trong việc hình thành giọt
dịch vi khuẩn trên lá bệnh, bảo vệ vi khuẩn khỏi bị khô và tạo điều kiện cho vi khuẩn
phát tán nhờ gió, mưa. Vi khuẩn khơng có khả năng phân giải nitrat, khơng dịch hố
gelatin, khơng tạo NH3, nhưng tạo H2S, tạo khí nhưng khơng tạo axít trong mơi trường
có đường. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng từ 26 - 30 0C, nhiệt độ tối thiểu

8


0 - 50C, tối đa 400C nếu cao hơn 530C sẽ làm vi khuẩn chết. Vi khuẩn có thể sống
trong phạm vi pH khá rộng từ 5,7 - 8,5, thích hợp nhất ở pH 6,8 - 7,2.

Hình 2.2. Tế bào vi khuẩn Xoo và khuẩn lạc Xoo trên môi trường nhân tạo
2.2.2. Đặc điểm bộ genom Xoo
Hiện đã có một số nghiên cứu về trình tự genom của các chủng vi khuẩn Xoo,
trong đó gần đây nhất là cơng trình nghiên cứu giải mã cấu trúc genom của ba chủng
phổ biến nhất hiện nay là: MAF311018 (Nhật Bản) và KACC10331 (Hàn Quốc),
PXO99A (Philippin).
2.2.2.1. Cấu trúc genom Xoo chủng MAFF311018
Cấu trúc genom nhiễm sắc thể vi khuẩn Xoo chủng MAFF311018 thể hiện bằng
tám vịng trịn. Vịng ngồi cùng biểu hiện chiều dài của mỗi vùng gen bằng đơn vị
100 kb, vòng thứ 2 và 3 biểu hiện vị trí của các gen theo các hướng phiên mã khác
nhau tương ứng. Những gen đã xác định rõ chức năng được ký hiệu màu vàng, gen
chưa xác định rõ chức năng được ký hiệu màu xanh. Vòng tròn thứ tư biểu hiện vị trí

tụ tập của các gen hrp và những gen gây độc avr ký hiệu màu xanh. Vòng tròn thứ
năm biểu hiện vị trí của các trình tự gắn chèn. Vịng thứ sáu biểu thị hàm lượng C + G
của mỗi trung bình 20kb của mỗi đoạn. Vịng số bẩy biểu hiện vị trí của các gen mã
hóa tạo ra tRNA và rRNA của vi khuẩn. Cuối cùng là vòng số tám biểu hiện vị trí của
các prophage cùng các gen của phage.

9


Hình 2.3. Bản đồ genom vi khuẩn Xoo chủng MAFF311018.
Theo đó genom của Xoo chủng MAFF311018 gồm một nhiễm sắc thể vịng dài
4.940.217 bp, với hàm lượng G+C trung bình chiếm 63,7%. Bên trong khơng phát
hiện thấy có chứa một thể plasmid nào. Trong đó phát hiện thấy có hai bản copy của
operon rrn và thứ tự liền kề một số gen như sau: 16S-tRNAAla -tRNAIle -23S-5S.
Genom chứa tổng số 53 gen mã hóa tạo thành các tRNAs đại diện cho 43 loại tRNA
khác nhau.
Trong tổng số 4.372 khung đọc mở được phát hiện (ORFs) trong genom chủng
MAFF311018 thì có 2.799 (64%) gen đã xác định được chức năng, 1.383 (32%)
proteins được xác định tương đồng với nhiều protein điển hình của vi khuẩn Xoo
nhưng chưa biết rõ chức năng. Có 190 gen (4%) được xác định là khơng tương đồng rõ
rệt với những gen đã được xác định và cơng bố trước đó của vi khuẩn.
2.2.2.2. Cấu trúc genom Xoo chủng KACC10331
Theo Lee và cộng sự, 2005 thì genom vi khuẩn Xoo chủng KACC10331 có cấu
trúc như sau: tổng genom nhiễm sắc thể vòng dài 4.941.439bp, với hàm lượng C + G
chiếm 63.7%. Genom có 4637 khung đọc mở, trong đó có 3340 (72.0%) có thể xác
định được chức năng. Khoảng 80% số gen trong đó được phát hiện thấy trong các

10

loài vi khuẩn X. axonopodis pv. citri (Xac) và X.campestris pv. campestris (Xcc). Tuy
nhiên, 245 gen được xác định là chỉ đặc thù đối với Xoo, trong đó có 8 gen gây độc.
Đồng thời nhóm tác giả cịn xác định được vị trí của cả những gen tạo phản ứng siêu
nhạy (hrp), những gen sinh ra vỏ polysaccharide, gen mã hóa tạo enzyme phân rã
màng tế bào thực vật. Điều này giúp chúng ta hiểu rõ được cơ chế tương tác giữa vi
khuẩn Xoo gây bệnh đối với ký chủ họ hịa thảo.

Hình 2.4. Bản đồ genom vi khuẩn Xoo chủng KACC10331.
2.2.2.3. Cấu trúc genom Xoo chủng PXO99A
Đây là công bố mới nhất về trình tự genome của vi khuẩn Xoo được tiến hành
bởi Steven L. Salzberg và cộng sự. Bộ genom PXO99 A là bộ nhiễm sắc thể vòng đơn
gồm 5,240,075bp, dài hơn genom hai chủng trước (4,941,439bp và 4,940,217bp), hàm
lượng G + C chiếm 63.6%, chứa 5083 gen mã hóa protein, trong đó 87 gen khơng có ở
KACC10331 hay MAFF311018, có 2 operon RNA ribosome, 55 tRNA. PXO99 A gồm
có một số lượng lớn tính độc liên quan đến hoạt động phiên mã - các gen giống như
effector và có ít nhất 10 vùng NST được sắp xếp lại so với genome của hai chủng
KACC10331 và MAFF311018, trong đó có 7 trong 10 vùng là do có sự gắn thêm vào

11


của các trình tự chèn. PXO99A gồm nhiều bản copy của các trình tự chèn khác nhau.
Một vùng CRISPR (clustered regularly interspersed short palindromic repeats) mở ra
nhanh chóng ngăn cản sự nhiễm thực khuẩn thể đối với chủng PXO99A.

Hình 2.5. Bản đồ genom vi khuẩn Xoo chủng PXO99A.
2.2.3. Những gen quy định tính độc của vi khuẩn Xoo (Pathogenicity-related
genes)
- Nhóm gen hrp (hypersensitive reaction and pathogenicity):
Trong số các vi khuẩn gây bệnh cho thực vật thì những gen hrp mã hóa cho hệ

thống tiết loại III (TTSS) đóng vai trị quan trọng nhất. Nhóm gen hrp tìm thấy trong
genom Xoo gồm 27 gen kí hiệu từ hpa2 đến hpaF và chúng có cấu trúc tương đồng với
cấu trúc của những gen này ở những vi khuẩn thuộc loài Xanthomonas, trừ trường hợp
ở vùng hrpE2 của gen hpaB và vùng hrpF. Trong genom vi khuẩn Xoo, thấy có 3 gen
đặc thù được phát hiện giữa gen hpaB và hrpF. Một gen định vị tại phần sau của gen
hpaB (hrpE2) và có cùng hướng phiên mã với operon hrpE. Hai gen còn lại cũng nằm
ở vùng sau của hpaB (hrpE2), nhưng hướng phiên mã theo chiều ngược lại. Theo sơ

12


đồ này có 4 tương đồng chuyển vị liên tục nằm ở vùng giữa hpaB và hrpF là ISXo8,
ISXo1, ISXo8 và ISXoo6.

Hình 2.6. So sánh tổ chức di truyền nhóm gen hrp của 3 loài vi khuẩn
Xoo, Xcc và Xac.
A. Tổ chức di truyền của những gen bình thường.
B. Những vùng biến động của nhóm gen hrp. Mỗi một gen có tên nằm trên hoặc
dưới các mũi tên. Bản đồ được biểu diễn dựa trên số liệu trình tự các Nucleotit được
xác định trong ngân hàng gen (GenBankdatabase). Trình tự được xác định trên cơ sở
sử dụng các gen của chủng X. axonpodis pv. citri - Xac 306 (kí hiệu AE008923) và
gen của chủng X. campestris pv. campestris - Xcc ATCC 33913 (kí hiệu AE008922).
- Gen điều hịa HrpX
Trong vi khuẩn Xanthomonas, sự biểu hiện của một số gen cấu trúc TTSS và
một số gen hiệu ứng được điều hòa bởi sản phẩm của các gen hrpG và hrpX, các gen
sản phẩm này đều có mặt ở cả 2 loại vi khuẩn Xac và Xcc. Một số gen hoạt động phụ
thuộc vào gen HrpX đều cùng chứa một trình tự giống nhau là: TTCGC…N15…
TTCGC, gọi là hộp PIP (PIP box). Hộp PIP này là một chỉ tiêu để phán đoán liệu gen
nào đó có bị điều khiển bởi gen HrpX hay khơng. Đặc biệt đối với những gen mã hóa
tạo ra các protein hiệu ứng. Trong vi khuẩn Xoo, người ta đã phát hiện có 37 bản copy

hộp PIP hồn chỉnh hoặc gần hồn chỉnh có trình tự: TTCGN…N15…TTCGN, nằm ở

13


vùng điều khiển của gen. Năm trong số đó nằm ở cụm tụ điểm của các gen hrp, số
còn lại nằm rải rác ở vùng khác trong genom.
Bảng 2.1. Danh sách các gen chịu sự điều hòa bởi gen HrpX trong genom Xoo

14


- Nhóm gen avr (avirulence)
Protein khơng gây độc thuộc hệ thống tiết loại III, chúng kích thích khả năng
kháng bệnh trong cây tương ứng có những gen kháng bởi vậy chức năng của nó được
xác định mang tính đặc thù theo giống lúa và chủng gây bệnh. Chủng MAFF311018
biểu hiện mức độ đặc thù theo kí chủ giống lúa rất cao. Nó chứa một số các gen khơng
gây độc. Vi khuẩn Xoo chứa rất nhiều bản copy các thành viên trong họ gen không độc
avrBs3/pth. Các gen thuộc họ này mã hóa cho các protein chứa khoảng 13 – 23 các
chuỗi lặp gồm 34 aa ở vùng trung tâm. Đầu C của các protein này chứa dấu hiệu nhập
nhân (NLS) và một vùng hoạt hóa phiên mã (AD). Cấu trúc này chứng tỏ các protein
này hoạt động trong nhân và tương tác với quá trình phiên mã của tế bào ký chủ.
Trong genom vi khuẩn Xoo, nhóm tác giả đã phát hiện có 17 bản copy phân bố và tụ
tập tại 7 vùng genom khác nhau, được trình bày ở bảng dưới đây:
Bảng 2.2. Bảng liệt kê 17 bản copy các thành viên trong họ gen avrBs3/pth

15


Mặc dù chúng có trình tự khá giống nhau nhưng chúng hoàn toàn phân biệt

được với nhau bởi sự khác nhau chủ yếu ở số lượng các đoạn lặp lại nằm ở vùng trung
tâm. Số lần lặp lại biến động từ 12,5 đến 31,5 và từ 2 đến 4 gen avr hầu hết nằm ở
những vùng không gây độc, và những yếu tố di động như IS và những gen có liên
quan đến phage được định vị ở những vùng bên cạnh. Vị trí của những gen khơng gây
độc này được trình bày ở hình dưới. Riêng vùng avrV, chúng bị ngắt quãng bởi một
gen di động là ISXoo9 nằm ở đầu 3’. Hướng phiên mã của gen không độc avr ở vùng I,
II và III là sợi anti-sense, nhưng đối với vùng IV, VI và VII là sợi sense theo hướng
ngược lại.
Vị trí tương đối của mỗi vùng và chiều dài của mỗi gen như sau: vùng I dài
1,228,783-1,246,335bp; II, 2,201,149-2,216,771 bp; III, 2,352,186-2,360,329 bp; IV,
2,383,115-2,392,653 bp; V, 2,999,333-3,001,924 bp; VI, 3,213,703-3,234,123 bp; và
vùng VII dài 4,525,416-4,529,345 bp.

Hình 2.7. Bản đồ vị trí các gen khơng độc avr/pth của vi khuẩn Xoo.
2.2.4. Trình tự lặp lại (Repeitive sequence) trong bộ gen vi khuẩn Xoo
Là những cấu trúc được hình thành do sự lặp lại liên tiếp nhiều lần một đoạn
trình tự trong gen. Đây là hiện tượng rất phổ biến ở cả sinh vật nhân sơ và sinh vật
nhân chuẩn, được ví như là các “gia đình” gen nhỏ nằm trong cấu trúc genome. Trình
tự lặp lại là những trình tự bền vững, được sao chép ổn định qua nhiều thế hệ, với cấu

16


trúc khá đa dạng thay đổi theo loài. Đặc biệt, ở hai đầu của trình tự lặp lại có các trình
tự Nu rất đặc thù, thích hợp cho nghiên cứu đa dạng di truyền, lập bản đồ và nhận
dạng gen.
Trong vi khuẩn trình tự lặp được phân thành 3 nhóm chính:
- Nhóm 1: bao gồm các trình tự có kích thước 35 – 40 bp, chúng là các yếu tố di
truyền thêm vào lặp lại, có chiều ngược xi giống nhau (REPs: repetitive extragensis
palidromic) (Stem, 1988).

- Nhóm 2: là các yếu tố lặp lại hình thành do sự chập lại của hai trình tự lặp kích thước
124 – 127bp (ERIC: enterobachterial repetitive intergensis conversus) (Hulton CS, Higgins

CF, Sharp PM, 1991) hay là đơn vị gen lặp lại (Shaples và Llyod, 1990).
- Nhóm 3: là các trình tự hộp BOX, kích thước khoảng 154bp (Versalovic, 1994).

Đây chính là cơ sở cho phương pháp dùng chỉ thị DNA dựa trên các trình tự lặp
lại để tiến hành phản ứng PCR, nghiên cứu đa dạng di truyền các chủng bệnh bạc lá,
gọi chung là phương pháp Rep-PCR.
2.3. Đa dạng các chủng Xoo
2.3.1. Định nghĩa đa dạng di truyền
Theo Công ước Đa dạng sinh học, khái niệm "Đa dạng sinh học" (biodiversity,
biological diversity) có nghĩa là: Sự khác nhau giữa các sinh vật sống ở tất cả mọi nơi,
bao gồm: các hệ sinh thái trên cạn, trong đại dương và các hệ sinh thái thuỷ vực khác,
cũng như các phức hệ sinh thái mà các sinh vật là một thành phần; thuật ngữ này bao
hàm sự khác nhau trong một loài, giữa các loài và giữa các hệ sinh thái (Norse and
McManus, 1980). Ngoài ra còn nhiều định nghĩa về đa dạng di truyền khác.
2.3.2. Thành phần chủng Xoo
Thành phần và sự phân bố của các chủng vi khuẩn bạc lá là rất khác nhau, thêm
vào đó là sự biến đổi thường xuyên, phát sinh thêm nhiều chủng vi khuẩn mới, là
thách thức không nhỏ đối với cơng tác quản lý và phịng trừ bệnh bạc lá lúa trên tồn
thế giới. Cơng tác điều tra, xác định thành phần chủng là khâu quan trọng.
2.3.2.1. Trên thế giới

17


Nghiên cứu của Devadath, 1985 đã thống nhất phân chia vi khuẩn bạc lá
lúa thành 3 nhóm chính, ký hiệu là I, II, III. Từ đó làm tiền đề cho nhiều nghiên
cứu về sau.

Tại philippin đã xác định được 6 nhóm nịi (race) ký hiệu từ PXO1 đến PXO6
(PXO-Philippin Xanthomonas Oryzae pv. oryzae). Tại Thái Lan, các mẫu bệnh được
thu thập từ 4 vùng sinh thái khác nhau trong khoảng thời gian từ 1972 – 1977 đã phân
ra làm 3 nhóm nịi.
Tại Ấn Độ, năm 1985 Dugapal đã sử dụng bộ giống chỉ thị gồm Bj1, TKM6,
T65, Taichung Nativel để nghiên cứu trên nhiều isolate tại Ấn Độ, đã phân ra được 5
chủng, ký hiệu từ I đến V. Tiếp đó năm 1986, Gupta và cộng sự đã tiến hành nghiên
cứu với 13 isolate, sử dụng bộ giống chỉ thị của IRRI, phân ra được 11 chủng. Đến
năm 1988, tiến hành trên 150 isolate, Ready và cộng sự phân chia các chủng tại Ấn Độ
thành 3 nhóm chính là Ia, Ib, II. Sau đó, Rehman, 1993 đã kiểm tra trên 122 isolate
trên 5 giống của IRRI đã xác định được 5 Race (Ia, Ib, II, III, IV)
Viện nghiên cứu nông nghiệp Bogor, Indonesia đã sử dụng 10 giống chỉ thị của
Nhật Bản và IRRI để phân chia thành 4 nhóm nịi (A, B, C, D). Sau đó, 1977,
Yamamoto và cộng sự kiểm tra 71 isolate tại Nhật Bản đã tìm được 3 chủng là III, IV,
V. Năm 1983, Horino chỉ ra chủng A và B lần lượt giống với các chủng 3 và 1 của
philipppin.
Tại Hàn Quốc, năm 1979, Choi và cộng sự đã tiến hành trên 224 isolate, phát
hiện được 4 chủng là I, II, III, IV. Sau đó, Yun, 1984 đã tiến hành kiểm tra trên 625
isolate phát hiện được 5 chủng, ký hiệu từ I đến V. Tiếp đến 1985, Yun phân chia 210
isolate thành 4 chủng ký hiệu là K1, K2, K3, K4.
2.3.2.2. Tại Việt Nam
Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, vào thập kỷ 90 có 4 nịi sinh lý phổ
biến ở miền Bắc nước ta. Nhưng nghiên cứu gần đây của Phan Hữu Tơn và cộng sự,
2002 thì trên các mẫu bệnh thu thập được ở các tỉnh miền Bắc phân lập được 154
isolate trong đó 64 isolate thuộc 16 chủng vi khuẩn gây bệnh khác nhau. Tuy trong kết

18


quả nghiên cứu của tác giả có kết luận là tồn tại 2 chủng phổ biến kí hiệu là chủng 2 và

chủng 3 ở vùng Đồng bằng sông Hồng. Song những chủng cịn lại vẫn có tiềm năng
gây nguy hiểm vì dù xuất hiện với tần xuất thấp hơn nhưng chúng vẫn có khả năng gây
bệnh với các giống lúa. Điều này cho thấy số lượng các chủng bạc lá ở miền Bắc nước
ta đang tăng lên nhanh chóng và đa dạng, địi hỏi cần phải có những nghiên cứu chính
xác các chủng vi khuẩn Xoo đang tồn tại để lựa chọn được những gen kháng hữu hiệu,
và từ đó có kế hoạch chọn tạo giống kháng bệnh bền vững.
2.3.3. Các nghiên cứu đa dạng di truyền của Xoo
2.3.3.1. Các loại chỉ thị phân tử ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền
RFLP: Sự sai khác về kích thước các đoạn cắt thu được khi cắt bằng enzyme
giới hạn gọi là sự đa hình về chiều dài của các đoạn cắt giới hạn (Retriction Fragment
Lenght Polymorphism – RFLP). Các đoạn cắt ra bởi cùng một loại enzyme giới hạn
với kích thước hay chiều dài khác nhau có thể được dùng như các dấu hiệu di truyền
để phân biệt các chủng, loài khác nhau.
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) – Đa hình các đoạn DNA nhân
bản ngẫu nhiên. Phương pháp RAPD thực chất là quá trình nhân bản các đoạn DNA
bằng kỹ thuật PCR có sử dụng các mồi được thiết kế ngẫu nhiên. Các mồi này sẽ bắt
cặp một cách ngẫu nhiên vào DNA khn ở vị trí bất kỳ vị trí nào mà tại đó có trình tự
bổ sung với nó.
Ngồi ra cịn một số chỉ thị khác để nghiên cứu đa dạng nhưng ít sử dụng hơn.
2.3.3.2. Nghiên cứu đa dạng di truyền của Xoo trên thế giới
Tháng 3 năm 1997, J.Yashitola, D. Krishnaveni, A.P.K.Reddy và R.V.Sonti đã
thu thập 67 isolate từ năm 1994 đến 1995 trên 18 vùng của Ấn Độ. Sử dụng phương
pháp RFLP với hai mẫu dị (probe) là các trình tự lặp lại riêng biệt: Probe dựa vào
trình tự gen avrXa10 và Probe dựa vào trình tự yếu tố chèn IS 1112.
Kết quả, với Probe avrXa10 từ 67 Isolate tác giả đã phân ra 9 kiểu sai khác
phân tử dựa vào enzyme cắt giới hạn BamHI. Probe IS 1112 phân ra 11 kiểu sai khác

19

phân tử dựa vào enzyme cắt giới hạn EcoRI. Cuối cùng, các tác giả tổng hợp cả hai
Probe avrXa10 và Probe IS 1112 thu được 15 kiểu sai khác phân tử.
Năm 1999, Tika B.Adhikari, T.W.Mew, và Jan E. Leach sử dụng 2 phương
pháp rep-PCR và IS-PCR để tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền đối với 171
Isolate phân lập được ở 8 vùng sinh thái khác nhau tại Nepal. Trong đó tác giả sử dụng
3 mồi ERIC1R, ERIC2 (trong cùng một phản ứng) cho rep-PCR và mồi J3 cho ISPCR. Mồi ERIC1R và ERIC2 được thiết kế trên cơ sở những các chuỗi lặp bảo thủ
vùng liên gen (enterobacterial repetitive intergenic consensus) có kích thước 124 - 127
bp. Cịn mồi J3 được thiết kế trên cơ sở hai đoạn chèn ở trình tự IS1112, IS1113. Kết
quả phân lập được 31 haplotype (kiểu sai khác phân tử) từ 171 Isolate nghiên cứu.
ERIC1R:

5’ – ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC – 3’

ERIC2F :

5’ – AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG – 3’

J3:

5’ – GCTCAGGTCAGGTCGCCTGG – 3’

Năm 2000, Edmilson R. Gonc: alves và Yoko B. Rosato sử dụng mồi BOXA1R
với trình tự: 5’- CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’ cho phản ứng rep-PCR. Kết
quả từ 55 Isolate thu thập được đã phân lập thành 16 loài Xanthomonas and
Pseudomonas syringae pv. Passiorae
Tiếp nối thành công của Tika B.Adhikari (1999), tháng 6 năm 2007, Jiajian và
cộng sự đã sử dụng phương pháp IS-PCR với mồi J3 trên 7 chủng vi khuẩn Xoo tồn tại
tại Trung Quốc. Khi so sánh với DNA ladder và so sánh với trình tự genome của 2
chủng KACC10331 (Hàn Quốc) và MAFF311018 (Nhật Bản), các tác giả đã phát hiện
ra 3 locus mới trên trình tự chèn IS1112.

A. Onasanya và cộng sự 2008, sử dụng các mẫu isozyme khác nhau để kiểm tra
mức đa hình enzyme và đa dạng di truyền của 30 isolate Xoo phân lập ở Tây Phi.
Nghiên cứu đã phát hiện 23 locut isozyme, trong đó SKDH cho đa hình từ 33,3 –
93,3%, EST and G6PH cùng cho đa hình 40 – 96,7% trong các mẫu Xoo phân lập. 23
loci isozyme này được sử dụng để xây dựng cây phả hệ giữa 30 mẫu Xoo, kết quả chia
thành 2 nhóm di truyền chính (Xoo-A and Xoo-B), mỗi nhóm chính chia thành 2 nhóm
nhỏ (Xoo – A1 và Xoo - A2) và (Xoo – B1 và Xoo - B2).
2.3.3.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền của Xoo tại miền Bắc Việt Nam

20


Những nghiên cứu về đa dạng vi khuẩn Xoo tại miền Bắc Việt Nam cho đến nay
vẫn thường chỉ sử dụng phương pháp lây nhiễm nhân tạo trên các dòng lúa đẳng đơn
gen (gen kháng bệnh bạc lá). Từ đó thiết lập được một phổ kháng nhiễm và dựa vào
đây, các tác giả phân tích sự đa hình của các mẫu vi khuẩn, phân lập chúng vào những
nhóm chủng có biểu hiện kháng nhiễm khác nhau đối với các dòng đẳng đơn gen.
Năm 2008, Phan Thanh Tùng đã ứng dụng những nghiên cứu của các tác giả
Adhikari, 1999 và Vera Cruz, 1996 đề xuất. Sử dụng phương pháp nghiên cứu đa dạng
di truyền bằng Rep-PCR và IS-PCR, xử lí bằng phần mềm NTSYSpc2.0 để phân tích
đa hình DNA xác định được 13 chủng vi khuẩn tại hệ số tương đồng di truyền 0,95.
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu nghiên cứu
Sử dụng 3 mẫu vi khuẩn Xoo0 (R7, R10, R14) do Phan Hữu Tôn và cộng sự
phân lập năm 2002 bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo và các isolate mới phân lập
vụ mùa năm 2009 (Bảng 3.1). Các mẫu vi khuẩn này được bảo quản trong môi trường
Skim – Milk (Skim Milk 10g, L-glutamic 1.5g, nước cất 100ml) ở -80 0C tại phịng thí
nghiệm Bộ mơn CNSHƯD – Khoa CNSH.
Dùng 10 dịng đẳng đơn gen IRBB1, IRBB2, IRBB3, IRBB4, IRBB5, IRBB7,
IRBB10, IRBB11, IRBB14, IRBB21 và 16 dòng đa gen IRBB1/4, IRBB1/5, IRBB1/7,

IRBB4/5, IRBB4/7, IRBB4/10, IRBB4/11, IRBB3/7, IRBB3/10, IRBB4/5, IRBB4/7,
IRBB4/10, IRBB4/11, IRBB5/7, IRBB5/10, IRBB5/11, IRBB7/10 chứa lần lượt các
gen kháng đơn và đa tương ứng. Đối chứng là giống IR24 mẫn cảm với bệnh bạc lá
(không chứa gen kháng bệnh bạc lá).
Bảng 3.1. Danh sách và nguồn gốc các mẫu vi khuẩn phân lập
St
t
1
2
3
4
5
6
7

Isolate/Rac
e
R7
R10
R14
136
135
134
59

Tên mẫu
HAU 020191
HAU 020321
HAU
HAU 01043

HAU 020361
HAU 020083
HAU 020131

Tên giống
Nếp thơm
Hybrid rice
Khang dân
TN 13-4
Nếp tân
Nhị ưu 838
Khang dân

21

Địa điểm thu thập
Bình Giang, Hải Dương
Yên Bình, Yên Bái
Tiên Du, Bắc Ninh
Hà Nội
Thuận Châu, Sơn La
Quỳnh Lưu, Nghệ An
Diễn Châu, Nghệ An


8
9
10
11
12

13
14
15
16
17
18

49
47
34
554
507
743
568
596
791
679
664

HAU 020346
HAU 020191
HAU 020081
HAU 09118-1
HAU 08086-6
HAU09119-1
HAU 01100-2
HAU 09102-7
HAU 00183-1
HAU 09111-1
HAU00108

Nhị ưu 383
Q5
Nhị ưu 838
Bắc thơm 7
Q5
HT1
Hương cốm
Khang dân
Bắc thơm
Thục Hưng
Nàng hương

Yên Bình, Yên Bái
Bình Giang, Hải Dương
Quỳnh Lưu, Nghệ An
Cổ Loa, Đông Anh, Hà Nội
Quốc Tuấn, Nam Sách, Hải Dương
Nam Sách, Hải Dương
Đơng Quan, Đơng Hưng, Thái Bình
Sóc Sơn, Hà Nội
Nam Sách, Hải Dương
Hưng Hà, Thái Bình
Hưng Hà, Thái Bình

3.2. Phương pháp nghiên cứu
Phân lập, nuôi cấy và xác định chính xác vi khuẩn
Xoo

So sánh khả

năng sinh
trưởng của
các chủng
nghiên cứu

Nghiên cứu
đa dạng di
truyền các
mẫu Xoo
bằng lây
nhiễm nhân
tạo

Nghiên cứu
đa dạng di
truyền bằng
phương
pháp repPCR

3.2.1. Kết quả ni cấy vi khuẩn
Mục đích của phương pháp này là cấy truyển lại nhằm đánh thức vi khuẩn và để
vi khuẩn làm quen môi trường, phục vụ cho nghiên cứu. Chúng tôi tiến hành nuôi cấy
vi khuẩn Xoo trên môi trường Wakimoto (Wakimoto,1955). Dựa trên mục đích nghiên
cứu, vi khuẩn Xoo được ni cấy trên hai loại mơi trường: thạch nghiêng và mơi
trường lỏng có lắc.
-

Thành phần mơi trường Wakimoto (tính trên 1000 ml mơi trường) như sau:

Khoai tây gọt vỏ

NaHPO4.12H2O
Ca(NO3)2.4H2O
Peptone

:
:
:
:

300g
2g
0,5g
5g

Đường Saccarose
Agar
Nước cất
pH

22

:
:
:
:

15g
15g
1000ml
7,0

+ Khoai tây gọt vỏ, thái miếng, cho vào nồi, thêm 1200ml nước cất và đun sôi
trong 15 – 20 phút sau đó thu lấy dịch.
+ Hịa tan dịch khoai tây với thành phần hóa chất như trên và thêm nước cất cho
đủ 1000ml, dùng khuấy từ khuấy đều và chuẩn độ cho pH = 7,0.
+ Đem hấp khử trùng ở 121oC; 1,5atm trong 20 phút.
- Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch nghiêng dùng để chiết
tách DNA vi khuẩn, protein vi khuẩn và bảo quản mẫu. 1 – 2 vòng que cấy khuẩn lạc
vi khuẩn được cấy chuyển từ môi trường bảo quản sang ống nghiệm mới chứa mơi
trường Wakimoto theo đường zigzac, sau đó đặt trong điều kiện ni cấy thích hợp.
- Phương pháp ni cấy trên mơi trường lỏng, có lắc dùng để đánh giá tốc độ
sinh trưởng của vi khuẩn thông qua xác định OD – Optical Density (giá trị mật độ
quang) môi trường nuôi cấy. Thành phần môi trường giống như môi trường thạch
nghiêng, chỉ khác là mơi trường lỏng khơng có agar. Tiến hành: Lấy 1 – 2 vòng que
cấy khuẩn lạc vi khuẩn từ ống nghiệm bảo quản cấy sang bình ni cấy chứa 100ml
mơi trường lỏng, vi khuẩn sinh trưởng trong mơi trường lỏng, lắc nhẹ nhàng 100
vịng/phút ở điều kiện nhiệt độ 28oC.
3.2.2. Phương pháp xác định vi khuẩn Xoo bằng kỹ thuật PCR
Để kiểm tra kết quả cấy chuyển từ ống vi khuẩn gốc sang ống mới, cũng như
kiểm tra các isolate mới phân lập có thành cơng hay khơng, chúng tơi tiến hành thí
nghiệm xác định chính xác vi khuẩn Xoo nhằm đảm bảo vi khuẩn được cấy truyền
thành công, không bị nhiễm tạp. Dựa trên phản ứng PCR được thiết kế để nhân đoạn
trình tự bảo thủ vùng giữa 2 đoạn trình tự 16S rDNA và 23S rDNA từ vi khuẩn này ,
chúng tôi đã thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc trưng XOR – R2 và XOR – F
(theo Adachi, 1999).
* Chiết tách DNA vi khuẩn Xoo (N. Furuya et al, 2003):
- Lấy 1 - 2 vòng que cấy khuẩn lạc vi khuẩn Xoo 2-3 ngày tuổi cho vào ống
eppendorf có chứa 200 µl dung dịch proteinase K (50 µl/ml proteinase K; 10 mM TrisHCl, pH 7.5 và 1mM EDTA pH 8.0), vortex nhẹ làm phân tán đều vi khuẩn trong ống
eppendorf.

23


- Đặt vào máy gia nhiệt ở 56oC trong 15 phút để proteinase K phân giải màng tế
bào vi khuẩn.
- Nâng đột ngột lên nhiệt độ 80oC trong 15 phút để làm bất hoạt enzyme
proteinase K.
- Ly tâm tốc độ 13000 vịng/phút trong 15 phút.
- Hút phần dịch trong phía trên chuyển sang ống eppendorf mới, bảo quản ở 4oC.

24


* Kiểm tra sản phẩm chiết tách:
Điện di 5 µl DNA vi khuẩn (lấy 5 µl DNA trộn với 2 µl Loadingdye) trên gel
agarose 1%, hiệu điện thế 70 V trong 60 phút, sau đó nhuộm bản gel điện di với
ethydium bromide trong 10 phút, quan sát dưới đèn UV, mẫu chiết tách thành công sẽ
hiện một vệt sáng rõ nét trên gel.
* Thực hiện phản ứng PCR
Các mẫu DNA chiết tách thành công sẽ được sử dụng để thực hiện phản ứng
PCR. Sử dụng cặp mồi đặc trưng cho vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae, đó là
XOR – R2 và XOR – F (Odachi,1990):
Tên mồi
XOR – R2
XOR - F
Thành phần phản ứng:

Trình tự mồi
5’ – CTCGGAGCTATATGCCGTGC - 3’

5’ – GCATGACGTCATCGTCCTGT – 3’
1x Taq buffer; 2.5 mM MgCl 2; 0.2 mM dNTPs; 0.2 mM

Primer XOR – R2; 0.2 mM Primer XOR – F; 1.25u Taq DNA polimerasae; 2 µl DNA
vi khuẩn; cịn lại là Free Water; tổng thể tích cho 1 phản ứng là 20 µl.
Chu trình nhiệt: 94oC trong 30 giây → tiến hành trong 30 chu kỳ (94 oC trong 1
phút → 60oC trong 30 giây → 72oC trong 1 phút) → 72oC trong 7 phút → bảo quản
sản phẩm PCR ở 4oC.
* Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
Lấy 10 µl sản phẩm PCR trộn với 2 µl Loading dye, nhỏ vào giếng gel agarose.
Điện di được thực hiện trên gel agarose 2%, hiệu điện thế 80V trong 45 phút, nhuộm
bản gel bằng ethydium bromide trong 10 phút, quan sát dưới đèn UV. Những mẫu
chính xác là vi khuẩn Xoo sẽ có vệt băng DNA được nhân lên kích thước 470 bp (so
sánh với DNA ladder 100 bp).
3.2.3. Phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng của vi khuẩn
Mục đích của phương pháp là xem xét tốc độ sinh trưởng của các chủng vi khuẩn
khác nhau.
Có nhiều phương pháp xác định tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn, phụ thuộc vào
loại vi khuẩn như đo OD, đo pH môi trường nuôi cấy, đếm số lượng tế bào bằng
buồng đếm hồng cầu,.... Trong đó phương pháp đo OD được dùng khá phổ biến.

25