Bacillus thuringiensis var.israelensis

Mở Đầu
Một trong những tác nhân truyền nhũng bệnh hiểm nghèo cho ngời nh sốt
rét, sốt xuất huyết, viêm não Nhật Bản là do muỗi gây ra. Muỗi sinh tr ởng và
phát triển rất tốt ở những vùng có điều kiện thuận lợi cho nhiều loài côn trùng phát
triển nh những vùng nhiệt đới trong đó có Việt Nam . Theo thống kê của Tổ chức
Y tế thế giới (WHO) thì hàng năm, trên Việt Nam thế giới có tới hàng triệu trờng
hợp mắc các bệnh do muỗi truyền. Riêng ở Việt Nam , theo thống kê 6 tháng đầu
năm 2001vẫn còn 126.000 ca sốt rét, 8.700 ca sốt xuất huyết, trong đó 20-25% ca
tử vong và 60-70% để lại di chứng. Các bệnh hiểm nghèo do muỗi truyền đã có
mặt ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nớc làm ảnh hởng đến tình hình kinh tế xã
hội. Bên cạnh đó, sự tiềm ẩn nguy cơ bùng nổ thành dịch do hiện tợng kháng
thuốc của côn trùng làm cho các nhà quản lý phải có những nỗ lực để thanh toán
các bệnh trên. Sở dĩ có những nguy cơ đó là do một thời gian khá dài từ trớc những
năm đầu của thập kỉ 80, chúng ta đã sử dụng thờng xuyên các hoá chất độc thuộc
nhóm lân hữu cơ, các chất thuộc nhóm Pyrethroid để tẩm nhuộm màn. Điều này
không những phá vỡ cân bằng sinh thái, gây hiện tợng bùng nổ côn trùng do
kháng thuốc mà còn ảnh hởng tới sức khoẻ con ngời.
Loài phụ Bacillus thuringiensis var.israelensis (Bti) đợc phát hiện vào năm 76
tại Israel có khả năng diệt muỗi đã mở ra một triển vọng mới cho việc kiểm soát
các vectơ truyền bệnh hiểm nghèo cho ngời. Nhiều chế phẩm sinh học diệt muỗi
từ Bacillus thuringiensis var.israelensis đã đợc sản xuất và ứng dụng thành công
nh Bactimos (Bỉ), Skeetan (Anh), Vectobac (Mỹ) Theo tổ chức Y tế thế giới thì
việc sử dụng chế phẩm sinh học diệt muỗi từ các chủng Bacillus thuringiensis
var.israelensis là một biện pháp rất an toàn và hiệu quả.
ở nớc ta, việc nghiên cứu về Bacillus thuringiensis var.israelensis mới chỉ bắt
đầu từ một vài năm gần đây nhng cũng đã thu đợc những kết quả đáng kể. Nhiều
chủng Bacillus thuringiensis var.israelensis có hoạt lực cao đã đợc phân lập, một
vài dòng gen đã đợc nghiên cứu tách dòng, đọc trình tự và biểu hiện. Chúng ta
cũng đã bớc đầu thử nghiệm thành công chế phẩm trong phạm vi phòng thí
1
nghiệm. Tuy nhiên việc sản xuất và ứng dụng chế phẩm diệt muỗi từ Bacillus

thuringiensis var.israelensis cần phải đợc nghiên cứu thêm nữa.
2
Phần I:Tổng quan về Bacillus
thuringiensis

1.1. Tóm tắt về lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis
Lịch sử về Bacillus thuringiensis bắt đầu từ khi Loius Pasteur phát hiện thấy
một loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho tằm ông đặt tên là Bacillus
bombyces. Năm 1901, Ishiwata phân lập ra một loại vi khuẩn từ ấu trùng tằmbị
bệnh và đặt tên là Bacillus sotto, năm 1911, Berliner đã phân lập đợc một loại vi
khuẩn tơng tự từ xác ấu trùng bớm ĐịaTrung Hải. Đến năm 1915, vi khuẩn này
chính thức mang tên Bacillus thuringiensis .
Năm 1928, Huszddax phân lập chủng B.thuringiensis (Bt ) từ Ephestia, thử
nghiệm nó trên sâu đục thân ngô ở Châu Âu, đây đợc coi là ứng dụng đầu tiên của
Bacillus thuringiensis .Chế phẩm thơng mại đầu tiên , Sporeine, đợc sản xuất ở
Pháp năm 1938. Năm 1951-1956 Steinhaus nghiên cứu khả năng diệt côn trùng
của Bacillus thuringiensis và đã sản xuất ở Mỹ. Trong suốt những năm 1960,
nhiều chế phẩm thơng mại của Bt đã đợc sản xuất ở nhièu quy mô khác nhau tại
Mỹ, Pháp, Đức.Sau đó Howard Dulmage và Clayton Beesle của viện nghiên cứu
Nông Nghiệp USDA đã thu thập đợc bộ su tầm đầu tiên về các chủng Bt. Năm
1970, Dulmage đã phân lập đợc chủng HD-1 và cho đến nay nó vẫn đợc sử dụng
cho nhiều nghiên cứu và trong chế phẩm Bt.
Thập niên 80, nhiều công ty sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh đã đăng ký sản
xuất và kinh doanh các chế phẩm BT. Đầu những năm 90 tại một số quốc gia nh
Cuba, Trung Quốc, Mỹ đẫ sản xuất chế phẩm BT ở quy mô công nghiệp. Ngày
nay một số lợng lớn thơng phẩm trừ sâu sinh học BT đợc sử dụng trong việc kiểm
soát ấu trùng bộ cánh vẩy, hai cánh và cánh cứng
1.2. Sự phân bố của B.thuringiensis
Bacillus thuringiensis tồn tại ở khắp mọi nơi trong đất và trên bề mặt lá, ở
đất rừng, thảo nguyên, sa mạc hay ở môi trờng có điều kiện thuận lợi cho sâu bọ

phát triển nh bụi hạt từ các nhà máy xay lúa mì, trong các kho bảo quản ngũ cốc
3
Sự phân bố của Bt là không liên quan đến sự phân bố của côn trùng đích. Tuy
nhiên ,Bt thờng có xu hớng tồn tại nhiều trong môi tròng có nhiều sâu bọ phát
triển và giàu dinh dỡng.Có thể phân lập Bt từ nhiều loại môi trờng khác nhau. Bt
dễ dàng phát triển trong môi trờng thí nghiệm chỉ với một lợng tối thiểu chất dinh
dỡng. Mặc dù bào tử Bt tồn tại trong nhiều năm, nhng chúng không nảy mầm và
nhân lên nh các tế bào sinh dỡng trong đất tự nhiên. Điều này chứng tỏ rằng Bt
không thích nghi với môi trờng đất.
1.3. Đặc điểm sinh thái của B.thuringiensis
B.thuringiensis là thành viên của nhóm I, chi Bacillus. Đây là loại vi khuẩn
sinh bào tử, Gram dơng, hô hấp hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc. Tế bào có
kích thớc 3x6
à
m, có phủ tiêm mao không dày, có khả năng chuyển động , tế bào
đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi.
Là một loài thuộc chi Bacillus nên khi gặp điều kiện không thuận lợi nh
thiếu dinh dỡng, nhiệt độ cao, khô hạn Bt có khả năng sinh nội bào tử giúp cho
chúng chống chịu với điều kiện khắc nghiệt đó. Bào tử của vi khuẩn có dạng hình
trứng với kích thớc 1,5x2
à
m và có thể nảy mầm thành tế bào sinh dỡng khi có
điều kiện thuận lợi.
Sự hình thành bào tử diễn ra đồng thời với sự tạo thành protein tinh thể có
khả năng diệt côn trùng. Tinh thể có nhiều hình dạng khác nhau ( hình vuông, chữ
nhật, hình tháp, hình ôvan hoặc vô định hình ). Khi tế bào phân giải tinh thể và
bào tử đợc giải phóng ra ngoài. Tinh thể có kích thớc khoảng 0,6x0,2
à
m, và có
thể chiếm tới 30% trọng lợng khô của tế bào. Tinh thể này đợc gọi là thể vùi. Tinh

thể và bào tử có thể quan sát dới kính hiển vi đối pha ở vật kính đầu. Tinh thể bắt
màu sẫm còn bào tử không bắt màu nhng có mép sáng. Hình dạng của tinh thể đợc
quyết định bởi gen mã hoá cho tổng hợp protein của tinh thể nằm trên plasmid.
1.4. Đặc điểm sinh hoá của B.thuringiensis
Nói chung B.thuringiensis không lên men sinh axít đối với arabinoza,
xiloza, và manitol,khử nitơrat thanh nitơrit, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà, phát
4
triển đợc trong môi trờng thạch kị khí có chứa 1% lizozym. Sinh trởng tốt nhất ở
nhiệt độ 28-30
0
C, pH 6,8-7,2.
1.5.Phân loại B.thuringiensis
Bt đợc chia làm nhiều loại phụ dựa trên các đặc điểm sau:
+ Khả năng hình thành enzym leucitinase.
+ Cấu trúc tinh thể và khả năng gây bệnh cho côn trùng.
+ Đặc tính huyết thanh học.
+ Phản ứng ngng kết của các tế bào sinh dỡng với các huyết thanh t-
ơng ứng.
Cho đến nay phơng pháp phân loại Bt đợc sử dụng khá phổ biến là
dựa trên các đặc tính huyết thanh học. Đặc tính huyết thanh học của chủng Bt đợc
xác định chủ yếu dựa trên kháng nguyên tiên mao H và đợc tiến hành bằng phản
ứng ngng kết các tế bào sinh dỡng với các kháng huyết thanh tơng ứng. Tuy nhiên
việc phân loại chỉ dựa trên typ huyết thanh vẫn cha phản ánh đợc mối liên hệ giữa
chủng giống và hoạt lực diệt côn trùng. Viẹc phân lập và tuyển chọn các chủng Bt
có giá trị vẫn gặp khó khăn. Chính vì vậy, gần đây một số nhà khoa học đã đề nghị
đa ra phơng pháp phân loại mới dựa trên kết quả xác định typ huyết thanh, hình
dạng tinh thể, hoạt lực diệt côn trùng, gen Cry và thành phần protein tinh thể, hình
dạng tinh thể và hoạt lực diệt côn trùng.
5
Bảng 1: Quan hệ giữa các lớp Cry, hình dạng tinh thể, thành phần protein và hoạt

lực diệt côn trùng.
Lớp gen Thành phần
Protein (KDa)
Hình dạng
tinh thể
Typ huyết
thanh
Hoạt lực diệt
côn trùng
Cry1A
Cry1B
Cry1C
Cry1D
Cry1E
131
138
135
133
133
Tháp đôi
Tháp đôi
Tháp đôi
Tháp đôi
Tháp đôi
1
3
6
7
8
Cánh vẩy

Cánh vẩy
Cánh vẩy
Cánh vẩy
Cánh vẩy
Cry2A
Cry2B
71
71
Tròn
Tròn
3
3
Cánh vẩy, hai
cánh
Cánh vẩy
Cry3A
Cry3B
Cry3C
Cry3D
73
74
129
73
Tháp đôi
Tháp đôi
Tháp đôi
Tháp đôi
8
8
8

8
Cánh cứng
Cánh cứng
Cánh cứng
Cánh cứng
Cry4A
Cry4B
Cry4C
Cry4D
135
128
78
67
Hình cầu
Hình cầu
Hình cầu
Hình cầu
14
14
14
14
Hai cánh
Hai cánh
Hai cánh
Hai cánh
Cry5 81 Tháp đôi 3 Cánh vẩy,
cánh cứng
Cry6 ? ? ? Giun tròn
CytA 28 14
1.6.Các loại độc tố do B.thuringiensis sinh ra

Trong quá trình hình thành bào tử Bt có khả năng sinh ra 4 loại độc tố:
+-Exotoxin hay ngoại đọc tố A
Năm 1954 lần đầu tiên Tomanaff phát hiện thấy vi khuẩn Bt var.elesti sản
sinh ra enzym leucintinase. Tác động độc của enzym này liên quan đến sự phân
6
huỷ mang tính chất cảm ứng của phospholopit trong mô của côn trùng, làm côn
trùng chết.Enym này lần đầu tiên liên kết với tế bào ruột sau đó tách ra và đợc
hoạt hoá bởi một chất không bền nhiệt. Chất này có trọng lợng phân tử thấp, có
thể là lipit. -Exotoxin có khả năng hoà tan vào nớc và đặc biệt chỉ tác động vào
loài ong xẻ có pH đờng ruột phù hợp với hoạt đông của enzym này. -Exotoxin
cũng có hiệu lực với sâu thuộc bộ cánh cứng, cánh vẩy
+-Exotoxin hay ngoại đọc tố B
Đọc tố này bền nhiệt ở 120
0
C trong vòng 15 phút vẫn giữ đợc hoạt tính. Một
số Bt không sinh ra tinh thể độc nhng có thể sinh ra ngoại độc tố . Hoạt tính của
ngoại độc tố bắt đầu xuất hiện trong giai đoạn phát triển mạnh trớc khi hình
thành bào tử. Ngoại độc tố là một nucleotid có trọng lợng phân tử thấp. Ngoại độc
tố còn có tác dụng cộng hởng với nội độc tố , sau khi có tác dụng gây dập vỡ,
phá huỷ hoàn toàn biểu mô ruột giữa của ôn trùng mẫn cảm, ngoại độc tố nhanh
chóng xâm nhập vào huyết tơng và máu gây thay đổi sinh lý dẫn tới cái chết
nhanh của côn trùng.
+-exotoxin hay độc tố tan trong nớc
-exotoxin thuộc nhóm photpholipaza, nó tác động lên photpholipit và giải
phóng ra axit béo -exotoxin có chứa các peptid với trọng lợng phân tử thấp và
một số axitamin tự do. Ngoại độc tố này tan trong nớc, không ổn định, mẫn cảm
với ánh sáng, oxy, không khí và nhiệt độ.
+-endotoxin (tinh thể độc)
Đặc điểm quan trọng nhất của vi khuẩn Bt là có khả năng tạo thành trong té
bào một loại tinh thể có bản chất là protein độc tính đối với nhiều loại côn trùng.

Nội độc tố là một loại protein kết tinh từ 1180 gốc axitamin. Các axitamin
chủ yếu gồm axit glutamic, axit asparaginic chiếm trên 29% tổng số axitamin
trong phân tử protein, là nguyên nhân gây điểm đẳng điện thấp.
Nguyên tố của tinh thể, ngoài C, H, O, N, S còn thấy một số nguyên tố khác
nh là Ca, Mg, Si, Fe với một l ợng nhỏ Ni, Zn, Al và hầu nh không có P.
7
Sự tổng hợp tinh thể xẩy ra khoảng 3 giờ sau pha cân bằng. Mỗi tế bào sinh
bào tử chỉ có thể có từ 1 đến 3 tinh thể độc. Tinh thể độc không tan trong dung
môi hữu cơ. Có những tinh thể khi mới tách khỏi bào tử chỉ tan trong pH rất kiềm.
Tinh thể đọc rất bền nhiệt,ủ 1 giờ ở 65
0
C vẫn không bị mất hoạt tính, tính độc
chỉ mất đi nếu ủ ở 100
0
C trong 30-40 phút.
1.7. Phân loại gen độc tố diệt côn trùng của B.thuringiensis
Ngày nay ngời ta đã phân tích 50 gen độc tố của Bt và nhận thấy một số hoàn
toàn giống nhau, đại diện cho cùng một gen hay biến dạng từ một gen. Trong đó
có khoảng 20 gen phân biệt chịu trách nhiệm tổnh hợp các protein tinh thể, nhất là
các protein tinh thể độc.
Bảng 2. Phân loại gen độc tố và phổ tác dụng của Bt
Tên độc tố Trọng lợng
phân tử,
kDa
Côn trùng
đích
Chủng
Bacillusthuringiensis
Hình dạng
tinh thể

Cry1A(a, b, c)
Cry1B
Cry1C
Cry1D, E, F
130-133
138
135
130-134
Cánh vẩy
Cánh vẩy
Hai cánh
Hai cánh
B. berliner
B. kurstaki KTO
B. entomocidus
B. aizawai
Lỡng
tháp
Cry2A
Cry2B, C
71
71
Cánh vẩy
Hai cánh
B. aizawai
B. kurstaki HD-1
Lập ph-
ơng
Cry3A, B, C, D 66-73 Cánh cứng
B. tenebrionis

Thoi dẹt
Cry4A, B
Cry4C, D
125-140
68 Hai cánh
B. morrisoni PG14
B. israelensiss
Cầu
Chữ nhật
Cry5A
Cry5C
81 Hai cánh
Cánh cứng
B. kurstaki JHCC
Lỡng tháp
Cry6 44 Giun tròn
B. thómponi
Lỡng tháp
8