BÁO CÁO DI TRUYỀN THỰC VẬT LY TRÍCH DNA TỪ TẾ BÀO THỰC VẬT VÀ ĐỘNG VẬT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TPHCM
KHOA NÔNG HỌC


BÁO CÁO DI TRUYỀN THỰC VẬT
CHỦ ĐỀ: “CÁCH LY TRÍCH DNA TỪ TẾ BÀO
THỰC VẬT VÀ ĐỘNG VẬT”
GVHD: TS. Nguyễn Phương

TPHCM, tháng 10 năm 2014


I. Phần giới thiệu
II. Nguyên tắc và yêu cầu
III. Một số hoá chất thông dụng dùng trong ly trích axít
nucleic
IV. Quy trình ly trích DNA sử dụng CTAB
V. Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction)
VI. Phương pháp ly trích DNA từ bào thực vật (lá bưởi):
VII. Phương pháp ly trích DNA từ bào động vật (tôm):


I. Phần giới thiệu:
 DNA - vật liệu mang thông tin di truyền, là yếu tố mở đầu cho

mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử.
 ly trích DNA nhằm mục đích thu nhận DNA ra khỏi cấu trúc bao

bọc của tế bào, để phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng sinh
học phân tử.
 Trong phạm vi bài báo cáo, chúng ta tìm hiểu quá trình ly trích

DNA từ tế bào thực vật và động vật


II.Nguyên tắc và yêu cầu
 Ly trích DNA là cần thiết bởi các thực nghiệm của công nghệ gen
đều tiến hành với DNA (hay RNA).
 DNA ly trích được cần đảm bảo về độ tinh khiết và độ nguyên
vẹn về cấu trúc để thực hiện được các khâu nghiên cứu tiếp theo

trong công nghệ gen thực vật và động vật.
 Có rất nhiều phương pháp ly trích DNA , tuỳ thuộc mục đích

nghiên cứu mà lựa chọn các phương pháp tách DNA cho phù
hợp.


1. Chuẩn bị mẫu

Giải phóng DNA
Trong dd buffer TE
(pH 8) => DNA
không biến tính
Proteinase K: loại
bỏ protein
CTAB: loại
bỏ polysaccharide
và lipid.
Chloroform: phân
tách và kéo các
thành phần không

phải là DNA xuống
mặt dưới dung
dịch.

2. Phá vỡ màng
TB
3. Hòa tan DNA
4. Loại bỏ các
thành phần không
phải là DNA
5. Tủa DNA

6. Rửa DNA

7. Làm khô
DNA

8. Kiểm tra chất lượng DNA

TBĐV (thường sử dụng mô
trên cơ thể)
TBTV (thường sử dụng mẫu
lá)
Nghiền nhỏ trong
Phương pháp vật lý
nitơ lỏng

Đối với TBTV do còn lớp Cellulose
Phương pháp ly tâm
Phương pháp hóa học

ethanol 95% hoặc
isoproanol ủ ở – 200C

Hợp chất tẩy SDS
và Proteinase

Cô đặc axít
nucleic và
tránh phân
hủy chúng
bởi enzyme

Bằng ethanol 70% => loại
các muối và dấu vết
isopropanol
Sấy khô hay để qua đêm => tránh ảnh
hưởng của ethanol còn sót lại
Độ nguyên vẹn
Độ sạch
Nồng độ axít nucleic


Kiểm tra chất lượng DNA:
1.Định tính DNA bằng phương pháp điện di
 Để kiểm tra kết quả ly trích có thu được DNA hay không, chúng
tôi tiến hành điện di các mẫu DNA đã ly trích trên gel agarose
0.8%. Sau đó đem nhuộm ethium bromide trong 20 phút. Gel sau
khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại (UV). Nếu mẫu có
DNA thì băng DNA sẽ phát sáng dƣới dạng vạch trên gel điện di.
Độ tập trung và độ đậm nhạt của băng điện di phản ánh độ tinh

sạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA.


Kiểm tra mẫu bằng phương pháp điện di:
 Sau khi thu được sản phẩm ly trích, có thể tiến hành kiểm tra kết
quả ly trích bằng phương pháp điện di trên agarose dựa trên đặc
tính tích điện âm của DNA, vì vậy, khi được đặt vào điện trường
trong dung dịch có pH trung tính, DNA sẽ bị hút về cực dương
(anod) và bị đẩy khỏi cực âm (catod).


Kiểm tra mẫu bằng phương pháp điện di:
 Trong quá trình điện di, các phân tử DNA sẽ được phân loại
theo kích thước, các phân tử nhỏ sẽ bị hút về cực dương trước
do các phân tử nhỏ đi qua lỗ gel dễ dàng hơn. Có thể nói khoảng
cách mà đoạn DNA đi qua sẽ tỉ lệ nghịch với trọng lượng phân tử
của nó.
 Thông qua bước điện di kiểm tra kết quả ly trích có thể cho ta
biết được độ nguyên vẹn cao DNA khi các băng DNA gọn, tập
trung và rõ nét. Qua kiểm tra độ nguyên vẹn của DNA cũng xác
định được mức độ tinh sạch của sản phẩm DNA ly trích được.



2. Định lượng DNA bằng quang phổ kế
 Các mẫu DNA ly trích sau khi đã định tính được kiểm tra độ tinh
sạch và ước lượng hàm lượng DNA bằng cách đo mật độ quang
OD (optical density) với bước sóng 260nm và 280nm bằng máy
quang phổ kế với độ pha loãng 100 lần. Hàm lượng DNA được
tính theo công thức:

 DNA (ng/µl) = [(62.9 x OD260nm) – (36 x OD280nm)] x 100
 DNA được xem là sạch nếu tỉ số OD260nm/OD280nm nằm trong
khoảng 1.7 đến 2.2.



Hình ảnh sợi DNA trong ống nghiệm


III. Một số hoá chất thông dụng dùng trong ly trích axít nucleic
Hóa chất
Chức năng
Nitơ Lỏng
Phá màng tế bào
EDTA
Ngăn chặn sự hoạt động của các
(Ethylenediaminetetraacetic acid) enzyme phân hủy DNA
Dung dịch đệm Tris

CTAB (Cetryl Ammonium
Bromide)
Chloroform
Isoamyl Alcohol
Ethanol 70%

Tạo môi trường ly trích có pH
8.0, pH giúp này giúp DNA ổn
định
Phá vỡ vách tế bào và màng nhân

Làm biến tính Protein; tách lớp
dung dịch sau ly trích
Giúp mẫu không bị sủi bọt trong
khi vortex hay ly trích tốc độ cao
Rửa DNA thu được


III. Một số hoá chất thông dụng dùng trong ly trích axít nucleic
(tt)
Hóa chất
Chức năng
Isopropanol ở -200C
Kết tủa DNA
Enzyme Rnase
Loại bỏ RNA
Nước cất hoặc dd buffer TE
Giúp DNA không bị biến tính
SDS - Sodium Dodecyl Sulfate
Phá vỡ màng tế bào
Proteinase K
Loại bỏ các protein; phân giải các
enzyme nuclease


IV. Quy trình ly trích DNA sử dụng phương pháp CTAB:
 Được sử dụng để chiết suất DNA đạt chất lượng cao và
với số lượng lớn.
 Quy trình ly trích DNA sử dụng phương pháp CTAB:
1. Chọn mẫu từ 0,5 – 3g hoặc nhiều hơn, rửa sạch, lau khô
2. Nghiền mẫu trong Nitơ lỏng

3. Xử lý mẫu trong CTAB
4. Ủ 1 giờ ở 60oC => phá vở màng sinnh chất, màng nhân
5. Ly tâm ở 9000 rpm trong 10 phút thu lấy dịch nổi
6. Xử lý dung dịch thu được với Chloroform/Isoamyl alcohol
10 phút => làm biến tính protein
7. Ly tâm với 9000 rpm trong 10 - 15 phút, thu lấy dịch nổi
8. Xử lý dung dịch thu được với enzyme Rnase => thu được
DNA tinh khiết
9. Kết tủa với dung dịch Isopropanol tỷ lệ 1:2/3


 Quy trình ly trích DNA sử dụng phương pháp CTAB (tt):
10. Để lắng, rửa, sấy khô, hòa tan trong nước cất hoặc dung
dịch TE bảo quản ở 40C để sử dụng hoặc lâu dài ở (-200C
đến 800C


VIII. Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction)
 PCR là phương pháp nhân nhanh một đoạn phân tử DNA trong
ống nghiệm. Đây là một kỹ thuật nhằm tạo ra hàng triệu đoạn
DNA đồng nhất từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm RNA,
protein, polysacharide, DNA không có chức năng và DNA có
chức năng di truyền. Người ta còn gọi đó là kỹ thuật tạo dòng
DNA invitro.


 PCR được dùng rất phổ biến trong nhiều lĩnh vực về sinh học.
PCR được thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều
chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 trình tự như sau:

Bước 1: Biến tính (Denature)
 Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao (94 – 95 độ C) trong
vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách
hoàn toàn thành 2 mạch đơn.
 Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng
hợp 2 mạch bổ sung mới.


Bước 2: Bắt cặp (Annealing)
 Phản ứng của primer tác động lên dây nền, các primer này gắn
vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã trên dây template để
có phân tử DNA mới.
 Ở giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp đến mức cho phép các
primer bắt cặp được với khuôn, nhiệt độ này dao động trong
khoảng 30 – 70 độ C, kéo dài trong khoảng 30 giây đến 1 phút,
tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy Tm (melting temperature) của
các primer sử dụng.


 Bước 3: Kéo dài (Extension)
 Đây là giai đoạn tổng hợp dây đơn bổ sung dọc theo chiều 5’ - 3’
của 2 primer nhờ hoạt động của polymerase.
 Nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp cho DNA


IX. Phương pháp ly trích DNA từ tế bào thực vật
(tế bào lá non):
1. Hóa chất:


•
•
•
•

Dung dịch đệm 1,5 CTAB
1,5% CTAB
75mM Tris-HCL
15mM EDTA
1,05M NaCl

 Đệm TE
• 10mM Tris-HCl
• 1mM EDTA


•
•
•

Đệm kết tủa CTAB
1% CTAB
50mM Tris-HCL
10mM EDTA

 Đá khô CO2
 Nitơ lỏng
 Chloroform: isoamylalcohol
(24:1)

 10mg/ml enzyme RNase
 99.5% , 70% ethanol
 1M NaCl
 10% CTAB


2. Máy móc:
 Máy xay
 Máy ly tâm
 Tuýp Eppendorf 1.5ml
 Ống dùng để quay ly tâm loại 50 ml
 Vi pi-pét Micropipette 20, 200, 1000µl
 Bình tam giác


3. Nguyên tắc
 Để tiến hành ly trích DNA từ tế bào thì ta phải tiến hành phá bỏ
màng tế bào và màng nhân, sau đó biến tính protein để loại bỏ
lượng protein chứa trong dịch tách, loại bỏ RNA và sau cùng là
kết tủa DNA bằng cồn. Tủa sau khi thu được được hòa tan lại
trong dung dịch đệm TE hoặc nước cất vô trùng tùy theo mục
đích nghiên cứu.
 Khác với ly trích tế bào động vật, khi ly trích tế bào thực vật thì ta
phải tiến hành loại bỏ đường thành phần có nhiều trong mô thực
vật. Ở đây ta dùng phương pháp tách CTAB tức là dùng dung
dịch đệm CTAB để tách DNA ra khỏi mô thực vật. Chất này chỉ
hòa tan DNA chứ không hòa tan được đường, nhờ vậy mà có thể
loại bỏ đường ra khỏi dịch chiết tách DNA.