nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy mô sẹo để thu sinh khối và tái sinh ây trinh nữ hoàng cung

Môc lôc


Tóm tắt kết quả khóa luận
1. Tên đề tài
Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy mô sẹo để thu sinh khối và tái sinh cây
Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.).
2. Đối tợng
Thí nghiệm đợc tiến hành trên củ cây Trinh nữ hoàng cung.
3. Mục tiêu
Nhằm tạo đợc nguồn cây giống đồng đều, sạch bệnh, giữ đợc các đặc tính
quý của nguyên liệu ban đầu với hệ số nhân giống cao gấp nhiều lần so với sử
dụng phơng pháp nhân giống truyền thống.
4. Kết quả chính
1) Chế độ khử trùng phù hợp đối với mẫu củ cây Trinh nữ hoàng cung là chế
độ 2 (cồn 70% trong 30 giây, javen 50% trong 7 phút) cho tỷ lệ sống cao
nhất.
2) Môi trờng có tỷ lệ tạo mô sẹo cao là môi trờng TN3 (MS + 30 g/l đờng + 8
g/l agar + 2 mg/l NAA) và môi trờng TD3 (MS + 30 g/l đờng + 8 g/l agar +
2 mg/l 2,4-D). Ngoài ra môi trờng TN4 (MS + 30 g/l đờng + 8 g/l agar +
2,5 mg/l NAA) và TD4 (MS + 30 g/l đờng + 8 g/l agar + 2,5 mg/l 2,4-D)
cũng cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao.
3) Môi trờng NB6 (MS + 8 g/l agar + 30 g/l đờng + 1,5 mg/l NAA + 1 mg/l
BAP) và môi trờng NK6 (MS + 8 g/l agar + 30 g/l đờng + 1,5 mg/l NAA +
1 mg/l kinetin) là thích hợp cho nhân sinh khối mô sẹo.
4) Môi trờng thích hợp cho tái sinh cây TNHC từ mô sẹo và lõi củ là MB 4
(MS + 8 g/l agar + 30 g/l đờng + 100 mg/l nớc dừa + 0,5 mg/l NAA + 2
mg/l BAP) và MK4 (MS + 8 g/l agar + 30 g/l đờng + 100 mg/l nớc dừa +
0,5 mg/l NAA + 2 mg/l kinetin).
5) Môi trờng CB3 (MS + 0,5 mg/l IBA + 0,2 mg/l GA 3 + 5 mg/l BAP + 8 g/l
agar + 30 g/l đờng) thích hợp cho việc nhân chồi TNHC.

6) Môi trờng IR3 (MS/2 + 1,5 mg/l IBA + 8 g/l agar) thích hợp để tạo cây
TNHC in vitro hoàn chỉnh.


Mở đầu
Cuộc sống ngày càng hiện đại thì con ngời lại phải đối mặt với nhiều căn
bệnh nguy hiểm, đặc biệt là bệnh u xơ và ung th. Theo con số thống kê hàng năm
về số ngời chết vì bệnh u xơ, ung th trên thế giới thì số ngời tử vong do ung th
tuyến tiền liệt và tử cung gây ra tại Hoa Kỳ và Châu Âu đợc xếp vào hàng đầu
[24]. Tại Hoa Kỳ có 11,7 triệu ngời mắc bệnh u xơ, trong đó có 400000 ngời tử
vong do bệnh u xơ tuyến tiền liệt và u xơ tử cung. ở Việt Nam, hơn 50% phụ nữ
bị u xơ tử cung không biểu hiện kịch tính và nếu cắt u xơ tỷ lệ tái phát khoảng
10%. Vì vậy, với nguyện vọng to lớn là tìm kiếm từ thảo dợc những viên thuốc
mới phục vụ sức khỏe cộng đồng, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu để
tìm ra loài thảo dợc chứa các chất có hoạt tính chống ung th.
Năm 1980, các nhà khoa học đã quan tâm hàng đầu đến việc nghiên cứu
thành phần hoá học của cây thuốc có nhiều tác dụng dợc lý là Trinh nữ hoàng
cung (Crinum latifolium L.). Từ lâu, Trinh nữ hoàng cung (TNHC) là cây thuốc
dân gian có rất nhiều tác dụng trong việc chữa bệnh của nhân dân ấn Độ, Việt
Nam, Trung Quốc... nh bệnh bong gân, thấp khớp, mụn nhọt, áp xe, tê thấp, đau
nhức... Gần đây, các nhà khoa học đã khám phá ra TNHC là dợc liệu có tác dụng
điều trị u xơ tuyến tiền liệt ở nam giới và u xơ tử cung ở phụ nữ và đặc biệt là
chống ung th. Họ tìm ra trong dịch chiết của cây TNHC có chứa các chất có hoạt
tính chống ung th, đó là hợp chất Alcaloid - chất hữu cơ mang tính chất kiềm có
tác dụng tích cực trong y học chống ung th [3]. Hiện nay, để tiện cho việc sử dụng
và điều trị bệnh thì TNHC đợc chế biến thành nhiều sản phẩm khác nhau là thuốc
Panacrin, Crila, Katana, chè tan... Bởi vậy, vấn đề đặt ra là cần phải cung cấp đủ
nguồn nguyên liệu đáp ứng cả về số lợng và chất lợng cho việc sản xuất các sản
phẩm từ TNHC. Do đó, trong những năm qua các nhà khoa học đã và đang tìm
kiếm phơng pháp thích hợp nhất với việc ứng dụng các thành tựu khoa học trong

nhân giống cây TNHC. Một trong các phơng pháp đó là nhân giống vô tính bằng
kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Đây là phơng pháp thể hiện tính u việt trong việc nhân
nhanh một dòng chọn lọc, có phẩm chất tốt, hàm lợng thành phần hoá học có tác
dụng dợc lý cao, tạo nguồn cây giống đồng đều, sạch bệnh, giữ đợc các đặc tính


quý của nguyên liệu ban đầu với hệ số nhân giống cao gấp nhiều lần so với phơng
pháp nhân giống truyền thống. Xuất phát từ ý nghĩa khoa học trên, chúng tôi đã
tiến hành đề tài : Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy mô sẹo để thu sinh
khối và tái sinh cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) với những
nội dung sau:
1. Nghiên cứu chế độ khử trùng phù hợp với mẫu củ cây TNHC.
2. Nghiên cứu ảnh hởng nồng độ NAA, 2,4-D đến khả năng tạo mô sẹo từ củ
cây TNHC.
3. Nghiên cứu ảnh hởng của tổ hợp NAA, BAP và kinetin đến khả năng nhân
sinh khối mô sẹo.
4. Nghiên cứu ảnh hởng của tổ hợp giữa NAA, BAP, nớc dừa và kinetin đến
khả năng tái sinh cây.
5. Nghiên cứu ảnh hởng của sự kết hợp IBA, GA3 và BAP đến khả năng nhân
chồi.
6. Nghiên cứu ảnh hởng của IBA đến khả năng tạo cây hoàn chỉnh.


Chơng 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Sơ lợc về cây Trinh nữ hoàng cung
1.1.1. Nguồn gốc và vị trí phân loại
Trinh nữ hoàng cung (TNHC) có nguồn gốc từ ấn Độ. Tên khoa học của
TNHC là Crinum latifolium L. Loài latifolium thuộc chi Crinum, họ Thuỷ tiên
(Amaryllidaceae), bộ hành (Liliales), lớp hành (Liliopsida - lớp một lá mầm),
phân lớp hành (Liliidae), ngành hạt kín Magnoliophyta, giới thực vật [4].

Họ thủy tiên (Amaryllidaceae) hiện nay có 13 chi. Trong đó chi Crinum có
khoảng 100 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới, một số loài đợc trồng làm
cảnh và làm thuốc tơng đối phổ biến [3].
1.1.2. Đặc điểm sinh thái và hình thái của cây Trinh nữ hoàng cung
1.1.2.1. Đặc điểm sinh thái
TNHC là cây a ẩm, a sáng, sinh trởng và phát triển tốt trong điều kiện khí hậu
nóng, ẩm của vùng nhiệt đới với nhiệt độ trung bình từ 22 0C - 270C, độ ẩm 60% 70%, lợng ma trên 1500 mm/năm. ở Việt Nam, TNHC ra hoa hàng năm nhng
không đậu quả, cây sinh trởng mạnh trong mùa xuân hè, mùa ra hoa vào tháng 8 9. Cây trồng ở các tỉnh phía Bắc có hiện tợng tàn lụi vào mùa đông. Cây có khả
năng đẻ nhánh khoẻ, hàng năm có thêm 3 - 5 hành con từ thân hành mẹ, trồng đợc 3 năm sẽ tạo thành một khóm lớn, có đến 20 nhánh ở các tuổi khác nhau. Tuy
nhiên, năm đầu tiên cây hầu nh không đẻ nhánh. Từ năm thứ hai trở đi cây mới
bắt đầu đẻ nhánh. Vì vậy, tốc độ nhân giống rất chậm [3].
1.1.2.2. Đặc điểm hình thái
TNHC thuộc họ thuỷ tiên (Amaryllidaceae) nên nó mang một số đặc điểm
chung của họ này nh thân hành hình củ, mọng nớc. Bao hoa thờng hợp, đôi khi có
phần phụ ở vùng trong, nhị 6, bầu dới [2]. Bên cạnh đó, TNHC có đặc điểm riêng
nh sau:


Hình 1. Cây và hoa Trinh nữ hoàng cung


Thân

TNHC là loại cây thảo mộc mọc lên từ một thân hành ở dới mặt đất. Nó là
một cây cỏ lâu năm cao khoảng 2 m [26]. Thân hành to, hình cầu hoặc hình trứng,
trông giống nh củ hành tây, đờng kính 8 - 10 cm, đợc phủ bởi những vảy hình bản
to, dày, màu trắng, các bẹ lá úp vào nhau tạo thành một thân giả dài khoảng 10 15 cm [3], [9], [22].


Lá

Lá mọc từ thân hành, mỏng hình dải dài 60 - 90 cm, rộng 6 - 11 cm, mép lá l ợn sóng. Gân lá song song, mặt trên của lá lõm thành rãnh, mặt dới lá có một
sống lá nổi rất rõ. Gốc phẳng có bẹ lá ở nơi sát đất màu đỏ tím. Đầu lá nhọn hoặc
tù, lá bắc rộng hình thìa dài 7 cm, màu lục, đầu nhọn [3], [5], [19], [22].


Rễ

TNHC là loại sống địa sinh có hệ rễ chùm do rễ chính không phát triển. Rễ
to, có số lợng nhiều. Kích thớc của các rễ tơng đối đồng đều.


Hoa

Hoa hợp, mọc thành tán gồm 6 - 18 hoa trên một cán hoa dài 30 - 60 cm, có
bẹ hình tam giác màu xanh ve, dài từ 5 - 7 cm, cuống hoa ngắn. Cánh hoa màu
trắng pha hồng. Bao hoa hơi cong dài 7 - 10 cm, gồm 6 phiến bằng nhau, hàn liền
1/3 thành ống hẹp, khi nở đầu phiến quăn lại, nhị 6 bầu hạ. Bao phấn hình sợi dài


20 - 25 mm, đính lng, bầu hình ống chỉ, vòi nhị mảnh vợt lên trên nhị [3], [5], [7],
[9].


Quả

Quả có hình cầu, rất ít gặp. ở Việt Nam, cây không đậu quả.


Hạt

TNHC thuộc bộ hành nên hạt của nó chứa nội nhũ.
1.1.3. Tác dụng dợc lý
Trong y học dân gian, TNHC có hữu ích trong điều trị những căn bệnh
nghiêm trọng nh u xơ tuyến tiền liệt, u xơ tử cung... Nó đợc sử dụng để làm tăng
cờng miễn dịch qua trung gian tế bào và hoạt động có hiệu quả trong việc hoạt
hoá lympho T. Đồng thời, TNHC đợc sử dụng trong trờng hợp giảm oxy huyết, sự
viêm, sự giải độc, sự phục hồi mô và sự cân bằng hoocmon. Nớc ép lá đợc sử
dụng khi đau tai, thấp khớp và bong gân [26].
Panacrin là chế phẩm đợc bào chế từ hỗn hợp 3 dợc liệu: lá TNHC, củ tam
thất và lá đu đủ đợc nghiên cứu về tác dụng chống ung th. Trên mô hình gây u
báng thực nghiệm bằng cách cấy truyền xoang bụng chuột nhắt trắng tế bào u
báng Sarcom TG-180, thuốc đã có tác dụng làm giảm sinh khối của u hay giảm
tổng số tế bào ung th, đồng thời làm giảm chỉ số gián phân của tế bào ung th.
Panacrin đợc dùng cho 3 nhóm bệnh nhân ung th dạ dày, ung th gan và u lympho
ác tính, qua kiểm chứng thấy đợc dung nạp tốt và có ít tác dụng không mong
muốn. Trong mô hình gây ung th đùi thực nghiệm bằng tiêm vào đùi chuột trắng
tế bào u báng Sarcom TG-180, Panacrin có tác dụng hạn chế sự phát triển khối u
và hạn chế sự di căn của tế bào ung th từ u đùi lên gan, phổi, lách. Thuốc có tác
dụng kéo dài thời gian sống của chuột mang ung th đợc điều trị gần gấp đôi so với
chuột đối chứng mang ung th [3].
Tác dụng của TNHC chủ yếu phụ thuộc vào các alkaloid của chúng. Một số
alkaloid nh Lycorin ức chế sự tổng hợp protein và ADN của tế bào chuột và ức
chế sự phát triển của u báng cấy ở chuột. Trong thử nghiệm in vivo, lycorin làm
giảm khả năng sống của các tế bào u. Lycorin-O-glycosid gây kích thích các tế
bào lympho lách chuột nhắt trắng, có tác dụng điều hoà miễn dịch.


Pseudoglycorin có tác dụng làm ngừng sự phát triển tế bào Hela, ngăn cản sự tổng
hợp protein trong tế bào u báng và làm chậm lại quá trình tổng hợp ADN [3], [8].

TNHC là một dợc liệu rất quan trọng trong sản xuất thuốc viên Crila. Đây là
sản phẩm 100% chiết suất từ lá cây TNHC. Việc bào chế ra Crila - viên tân d ợc
đầu tiên có khả năng ức chế sự phát triển của khối u đã đợc hội đồng các nhà
khoa học Việt Nam chấp nhận. Đây là tin vui cho các bệnh nhân bị phì đại tuyến
tiền liệt và u xơ tử cung. Khả năng điều trị phì đại tuyến tiền liệt của crila đạt
89,18% (2005) và u xơ tử cung đạt 79,5% (2007) [23], kết quả này đợc hội đồng
khoa học quốc gia kiểm nghiệm lâm sàng tại Việt Nam theo quy chế 371 của bộ y
tế. Crila có khả năng làm giảm thể tích tiết tiền liệt đồng thời cải thiện tiểu tiện và
tăng chất lợng cuộc sống của bệnh nhân. Trong kiểm nghiệm lâm sàng thể tích
khối u giảm 33% trong thời gian điều trị 60 ngày [25]. Loại thuốc này còn mở ra
hớng điều trị các bệnh nan y bằng phơng pháp kích thích hệ miễn dịch với các
loại sản phẩm có nguyên liệu từ các loại cây cỏ thiên nhiên và ít độc hại.
Nh vậy, TNHC không chỉ có tác dụng chữa các bệnh trong y học dân gian mà
nó còn có khả năng chống ung th và kích thích miễn dịch. Tất cả các công dụng
của TNHC đã và đang đợc các nhà khoa học khám phá nhằm đáp ứng nhu cầu
chữa các căn bệnh ung th - một trong những nhu cầu hàng đầu mà toàn thế giới
rất quan tâm.
1.1.4. Thành phần hoá học
Nhận thấy tác dụng dợc lý của TNHC, các nhà khoa học ở nhiều nớc đã tiến
hành nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính của nó chủ yếu từ năm 1980.
Bằng các phơng pháp thông thờng các nhà khoa học đã định tính sơ bộ các nhóm
hợp chất quan trọng có trong các bộ phận chính của cây TNHC nh các chất
alkaloid, saponin, axit hữu cơ và các chất chống oxi hoá [6]. Trong các hợp chất
đó thì alkaloid là nhóm chất rất quan trọng. Alkaloid là chất hữu cơ có tính kiềm,
có vị đắng. Các alkaloid thuộc hai nhóm là: dị vòng và không dị vòng.
Năm 1984, Ghosah đã phân lập và xác định từ cán hoa TNHC một
glucoalkaloid có tên là latisolin. Khi bị thuỷ phân bằng enzyme thu đợc aglycon
có tên là latisodin. Ghosal và Shibnath còn phân lập đợc từ thân hành lúc cây

đang ra hoa pratorimin và pratosin là 2 alkaloid pyrolophenanthrindon mới cùng
với những chất đã đợc biết nh paratorimin, ambelin và lycorin. Năm 1986, Ghosal
công bố tách chiết đợc từ TNHC một số dẫn xuất của alkaloid có tác dụng chống
ung th nh crinafolonin và crinafolin. Năm 1989, ông còn chiết đợc từ dịch ép của
cán hoa hai alkaloid mới có nhân pyrolophennanthridin là 2-epilycorin và 2epipancrassidin [9].
Một số nhà khoa học Nhật Bản đã tìm thấy một số chất alkaloid khác từ
TNHC nh beladin, pratorin (hippadin), latidin, 11-o- acetylambelin , 11-o-acetyl
1,2-epoxyambelin, epilicorin, epipancrassidin...[3].
Qua xác định hoạt tính có trong cây TNHC của một số nhà khoa học Việt
Nam thấy trong lá cây có 23 - 43 loại alkaloid tuỳ theo thời kỳ cây đang ra hoa
hay sau ra hoa, carotenoid, saponin, acid uronic và counarin [25]. Saponin thuộc
nhóm steroid, trong thành phần genin có chứa các nhóm -OH, -CO, -CH 3, -CH2.
Thân rễ chứa hai glucan A và glucan B. Glucan A gồm 12 đơn vị glucose, còn
glucan B có khoảng 110 gốc glucose.
Ngoài ra các thành phần khác đang tiếp tục đợc các nhà khoa học nghiên
cứu.
1.2. Tình hình sử dụng Trinh nữ hoàng cung ở Việt Nam và trên thế giới
1.2.1. Trên thế giới
Cây có nguồn gốc từ ấn Độ, hiện đợc trồng rộng rãi ở nhiều nớc trong khu
vực Đông Nam á nh Thái Lan, Malaysia, Philippin, Campuchia, Lào, Việt Nam
và cả ở phía nam Trung Quốc [3]. ở ấn Độ, nhân dân dùng thân hành cây TNHC
xào nóng, giã đắp để trị thấp khớp, và cũng dùng đắp trị mụn nhọt và áp xe để gây
mng mủ; Dịch ép lá là thuốc nhỏ tai chữa đau tai. ở Campuchia, nhân dân dùng
cây TNHC để điều trị bệnh phụ khoa. Ngoài ra, thân hành TNHC còn đợc sử dụng
nh một loại thực phẩm ở Thái Lan.
Bộ phận sử dụng là thân hành và cán hoa đợc thái nhỏ, phơi khô để dùng dần.

1.2.2. Đối với Việt Nam

ở Việt Nam thì không biết từ bao giờ, ngời dân đã thấy cây thuốc quý này
mọc hoang ven suối trong rừng ở Huế, Đà Nẵng, Nha Trang và một số địa phơng
các tỉnh phía Nam. Và hiện nay, TNHC đã có mặt cả ở ba miền Bắc, Trung và
Nam. Trong đó đã xác định đợc vùng đất Long Thành (tỉnh Đồng Nai) là đất rất
thích hợp cho sự phát triển của TNHC. Bộ phận sử dụng là lá dùng tơi hay phơi
khô hoặc thái nhỏ dùng dần. ở các tỉnh phía Nam, TNHC đợc dùng phổ biến để
chữa bệnh đờng tiết liệu. Ngoài ra, ở Việt Nam nhân dân còn sử dụng TNHC làm
cây cảnh do hoa có màu sắc đẹp.
Tình hình sử dụng TNHC trong nớc và trên thế giới đòi hỏi phải có phơng
pháp nhân giống thích hợp đáp ứng đợc nhu cầu sử dụng của nhân dân. Trong đó
phơng pháp hữu hiệu nhất là phơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.
1.3. Nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào (NCMTB) thực vật là phơng pháp sử dụng các điều kiện
nhân tạo để duy trì sự sống của tế bào thực vật trong điều kiện in vitro. Mục đích
chung của NCMTB thực vật là sử dụng các điều kiện nh ánh sáng, nhiệt độ, thành
phần dinh dỡng, chất điều hoà sinh trởng... để điều khiển quá trình sinh trởng và
phát triển của tế bào, mô nuôi cấy theo mục tiêu đặt ra [14].
1.3.1. Vài nét về lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật
NCMTB thực vật đã hình thành từ vài thập kỷ trớc mà cơ sở của nó đợc bắt
đầu từ những thí nghệm đầu tiên của Harberlandt (1898 - 1902) khi ông đa các
giả thuyết của Schleiden và Schwann vào thực nghiệm mọi cơ thể sinh vật phức
tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ là các tế bào hợp thành. Các tế bào đã phân hoá đều
mang các thông tin di truyền có trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh
và là đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể [11]. Và
Harberlandt là ngời đầu tiên đề xớng ra tính toàn năng của tế bào (totipotency),
nghĩa là bất kỳ một tế bào nào của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm
tàng để phát triển thành cá thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi. Tiếc thay,
các thí nghiệm của ông đã không thành công.
Năm 1922, Kotte và Robbins lập lại thí nghiệm của Harberlandt với đỉnh sinh

trởng tách từ đầu rễ một cây hoà thảo. Trong môi trờng lỏng gồm muối khoáng và
glucose, đầu rễ phát triển mạnh tạo hệ rễ gồm cả rễ phụ. Nhng chỉ sau một thời
gian rễ phát triển chậm dần rồi ngừng hẳn mặc dù đã thay đổi môi trờng [20].
Năm 1934, White đã duy trì đợc đỉnh sinh trởng của đầu rễ cà chua
(Lycopersicon esculentum) trong một thời gian khá dài trên môi trờng lỏng có
chứa đờng, một số muối khoáng và dịch chiết nấm men. Sau đó ít lâu, White
chứng minh là có thể thay nớc chiết nấm men bằng hỗn hợp ba loại vitamin nhóm
B: Thiamin (B1), Piridoxin (B6) và Nicotinic axit. Cùng thời gian đó, Went và
Thiamin tìm ra và tinh chế đợc chất kích thích sinh trởng đầu tiên là IAA. Năm
1939, Gautheret và Nebecout đã duy trì đợc sự sinh trởng của mô sẹo cà rốt
(Daucus carota) trong một thời gian dài trên môi trờng thạch rắn [23]. Năm 1941,
Overbeck chứng minh tác dụng của nớc dừa trong nuôi cấy phôi cây họ cà
(Datura). Trong thời gian này, nhiều chất điều hoà sinh trởng thuộc nhóm auxin
đã đợc tổng hợp thành công nh - napthyl acetic axit (NAA) và chất 2,4Dichlorphenoxy acetic axit (2,4-D) [13].
Trong khoảng thời gian 1954 - 1959, kỹ thuật NCMTB đơn đã đợc phát triển
và hoàn thiện dần. Năm 1954, Skoog phát hiện chế phẩm thuỷ phân của tinh dịch
cá bẹ có tác dụng kích thích sinh trởng rất rõ rệt trong nuôi cấy những mảnh mô
thân cây thuốc lá. Ông cho rằng chất có hoạt tính là sản phẩm phân giải, và một
năm sau, chất đó đợc tổng hợp thành công, đợc Skoog gọi là kinetin do có tác
dụng kích thích sự phân bào. Việc phát hiện ra NAA, 2,4-D, kinetin cùng với các
loại vitamin và nớc dừa là những bớc tiến có ý nghĩa trong giai đoạn thứ hai của
NCMTB thực vật. Nickell (1956) đã duy trì đợc sự sinh trởng liên tục huyền phù
cây đậu trắng (Phaseolus vulgarisi). Melcher và Beck đã nuôi các tế bào đơn
trong các bình dung tích lớn có sục khí và bổ sung chất dinh dỡng định kỳ. Khả
năng nuôi cấy các tế bào thực vật và tái tạo đợc cây hoàn chỉnh từ tế bào đã mở ra
những triển vọng mới cho chọn dòng đột biến, sản xuất các chất trao đổi thứ cấp
[15]. Năm 1957, Skoog và Miller đã chứng minh sự biệt hoá của rễ, chồi trong
nghiên cứu nuôi cấy mô tuỷ thuốc lá phụ thuộc nồng độ tơng đối của tỷ lệ
auxin/cytokinin và từ đó đa ra quan niệm điều khiển hoocmon trong quá trình

hình thành cơ quan thực vật.


Trong giai đoạn mới từ năm 1960 trở lại đây, cùng với việc NCMTB đơn, tế
bào trần (protoplast), kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn đợc phát triển mạnh.
Các kỹ thuật lai tế bào soma bằng dung hợp tế bào trần và các kỹ thuật chuyển
gen đợc phát triển và thu đợc những thành tựu đáng kể.
ở nớc ta, NCMTB phát triển từ những năm 1980 và đạt đợc những kết quả
khích lệ trong nhân giống in vitro các cây khoai tây, cây hoa Phong lan, Hồng,
Cúc...; một số cây công nghiệp nh Bạch đàn, Keo; cây dợc liệu nh Thông đỏ,
TNHC... Đến nay, NCMTB thực vật trở thành một công cụ không thể thiếu của
CNSH hiện đại nhất là trong lĩnh vực ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp, tạo
giống và nhân giống thực vật.
1.3.2. Các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
NCMTB thực vật ngày càng đợc hoàn thiện với nhiều kỹ thuật. Tuỳ theo mục
đích và đối tợng thực vật mà sử dụng kỹ thuật NCMTB thực vật cho phù hợp.
Theo quan điểm hiện nay, NCMTB thực vật bao gồm sáu kỹ thuật sau :


Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời:

Phơng pháp này để nghiên cứu điều kiện sinh trởng đối với một bộ phận hoặc
một mô của cây in vitro, tạo thành mô sẹo phục vụ cho các nghiên cứu cơ bản nh
chọn dòng tế bào; đột biến xoma và ứng dụng phân hoá tế bào, cơ quan.


Nuôi cấy mô phân sinh:

Đợc dùng trong các trờng hợp tạo những giống cây sạch bệnh và nhân giống
in vitro; tạo cây đa bội thông qua xử lý colchicin và nghiên cứu quá trình hình

thành cơ quan.


Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo (Callus) là một khối các tế bào phát sinh vô tổ chức và có hình dạng
không nhất định. Nuôi cấy mô sẹo đợc ứng dụng trong nhân giống in vitro ở
những thực vật mà phơng pháp nhân giống bằng đỉnh sinh trởng ít có hiệu quả
hoặc không thực hiện đợc; làm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn; thu nhận các
chất có hoạt tính sinh học; nguyên liệu cho chọn tạo giống tế bào đột biến, chọn
dòng tế bào chịu mặn, chịu bệnh và nghiên cứu hình thành cơ quan.




Nuôi cấy phôi:

Nuôi cấy phôi vô tính hiện nay đợc xem nh một kỹ thuật mang lại nhiều hiệu
quả. Phơng pháp này đợc dùng để phá trạng thái ngủ nghỉ của hạt, thử sức sống
của hạt, duy trì phôi yếu.


Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn:

Phơng pháp này dùng để tạo dòng thuần, nghiên cứu sự biểu hiện của gen
lặn, chọn dòng đột biến.


Nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần

Nhằm nghiên cứu cấu trúc tế bào, ảnh hởng của các điều kiện khác nhau lên
quá trình sinh trởng, phát triển và phân hoá tế bào. Phơng pháp này đợc sử dụng
trong việc chọn dòng tế bào.
1.3.3. Các yếu tố ảnh hởng tới nuôi cấy mô tế bào thực vật
Sự sinh trởng và phát trởng của thực vật in vitro đợc quy định bởi một số
nhân tố phức tạp nh: các yếu tố trong môi trờng; những yếu tố vật lý và các chất
điều hoà sinh trởng, các vitamin...
1.3.3.1. ảnh hởng của các yếu tố trong môi trờng nuôi cấy
Môi trờng NCMTB thực vật có nhiều loại khác nhau nh môi trờng MS
(Murashige và Skoog), môi trờng Knop, Gamborg Tuy nhiên, các môi trờng
đều bao gồm các thành phần chính sau:


Đờng

Đờng là thành phần quan trọng trong môi trờng dinh dỡng. Các mô tế bào
thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phơng thức dị dỡng mặc dù ở nhiều
trờng hợp chúng có thể sống bán dị dỡng nhờ điều kiện chiếu sáng nhân tạo [1].
Đờng đợc sử dụng làm nguồn cacbon cung cấp năng lợng trong nuôi cấy, đồng
thời đóng vai trò duy trì áp suất thẩm thấu của môi trờng [16]. Đờng thờng dùng
là Sacarose hàm luợng 2% - 8% [21]. Nếu sử dụng ở nồng độ cao hơn sẽ ức chế
sự sinh trởng phát triển của mô nuôi cấy [18]. Ngoài ra, các đờng khác nh
Maltose, Glucose, Fructose... ít đợc sử dụng.




Thành phần khoáng

Sau đờng, chất khoáng là nhóm dinh dỡng quan trọng không kém cho sự phát

triển in vitro. Nhu cầu muối khoáng của mô tế bào thực vật tách rời không khác
nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Cho đến nay rất nhiều môi trờng
dinh dỡng muối khoáng đợc tìm ra nh môi trờng MS ( Murashige và Skoog,
1962), môi trờng Knop (1974), Gamborg (1968)... Trong đó, môi trờng MS đợc
đánh giá là phù hợp nhất đối với đa số các loài thực vật, nó chứa đủ thành phần
khoáng đa lợng và vi lợng cho cây phát triển [13]. Ngày nay, có nhiều môi trờng
đợc cải tiến từ môi trờng MS.
Trong môi trờng nuôi cấy, nguồn Nitơ vô cơ đợc cung cấp dới dạng NO3- và
NH4+. Đồng thời có thể sử dụng các dạng nitơ hữu cơ nh axit amin. Một số ít trờng hợp nitơ có thể đợc cung cấp dới dạng ure. Đối với photpho thì hai dạng thờng dùng nhất là NaH3PO4.7H2O và KH2PO4. Nồng độ photpho trong môi trờng
biến thiên từ 0,15 - 4 mM. Nguyên tố Kali thờng đợc cung cấp cho môi trờng
nuôi cấy dới dạng muối KNO3, KCl, KH2PO4. Nồng độ K+ biến thiên từ 2 - 2,5
mM. Canxi cũng đợc cung cấp dới dạng muối Ca(NO3).4H2O hoặc CaCl2.6H2O
hoặc CaCl2.2H2O. Nồng độ Ca2+ trong môi trờng từ 1 - 3,5 mM. Magiê đợc cung
cấp dới dạng MgSO4.7H2O với nồng độ từ 0,5 - 3 mM. Đối với các muối khoáng
vi lợng nh Mn2+, Bo2+, Zn2+, Cu2+ đợc cung cấp với lợng nhỏ [11].


Nớc

Nớc là một thành phần quan trọng trong môi trờng nuôi cấy. Nó chiếm 95%
trong môi trờng dinh dỡng. Nớc đợc sử dụng là nớc đợc trng cất hai lần.


Agar

Agar là loại polysaccarit của tảo (chất dẫn xuất của Dong biển) đợc thu nhận
thành dạng viên nhỏ mà có thể đợc sử dụng nh là tác nhân làm đông. ở 800C agar
ngậm nớc chuyển sang dạng sol. Còn ở 40 0C agar ngậm nớc chuyển sang trạng
thái gel. Hàm lợng agar thờng đợc sử dụng là 0,6% - 1%
1.3.3.2. ảnh hởng của các yếu tố vật lý

ánh sáng


ánh sáng có tác động mạnh đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi
cấy. Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy phụ thuộc vào chu kỳ, cờng độ, thành
phần quang phổ của ánh sáng [18]. Cờng độ ánh sáng thích hợp cho nhiều loại mô
trong giai đoạn tái sinh là 2000 - 3000 lux.


Nhiệt độ

Tuỳ thuộc vào loài thực vật mà nhiệt độ nuôi cấy là khác nhau nhng nhiệt độ
thích hợp là 25 20C. Nhiệt độ này có ảnh hởng tích cực tới quá trình sinh trởng
và phát triển của đa số các loài thực vật nuôi cấy. Trong một số trờng hợp, nhiệt
độ lạnh lại có ảnh hởng tốt hơn chẳng hạn xử lý bao phấn lúa ở 4 0C thì hiệu suất
tạo mô sẹo sẽ tăng [14]. Nhiệt độ cao còn ảnh hởng tới sinh trởng của các mô
nuôi cấy thông qua tác động lên cấu trúc của các chất điều hoà sinh trởng thực vật
nh phân huỷ IAA và GA [21].


Độ pH

Độ pH ảnh hởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dỡng vào tế
bào. Giá trị pH thay đổi làm thay đổi chiều hớng và tốc độ của nhiều phản ứng
sinh hoá, quyết định hấp thụ cation và anion của tế bào, ảnh hởng đến áp suất
thẩm thấu của tế bào [12]. pH khoảng 5,5 - 6 là thích hợp với nhiều loại mô nuôi
cấy. Khi pH thấp sẽ hoạt hoá enzyme hydrolaza dẫn tới kìm hãm sự sinh tr ởng và
phát triển, đồng thời kích thích sự hoá già của tế bào [14].

1.3.3.3. ảnh hởng của các chất điều hoà sinh trởng và vitamin
Các chất điều hoà sinh trởng ở thực vật là những chất có bản chất hoá học
khác nhau nhng đều có tác dụng điều tiết quá trình sinh trởng, phát triển của cây.
Chúng bao gồm các phytohoocmon và các chất điều hoà sinh trởng tổng hợp nhân
tạo. Phytohoocmon là những hoocmon đợc tổng hợp trong thực vật với liều lợng
nhỏ ở các cơ quan và từ đó đợc vận chuyển tới các cơ quan khác. Còn các chất
điều hoà sinh trởng tổng hợp nhân tạo là các chất đợc tổng hợp bằng con đờng
hoá học, có hoạt tính sinh lý tơng tự nh các phytohoomon. Các chất điều hoà sinh
trởng có hai loại là chất kích thích sinh trởng và chất ức chế sinh trởng. Trong
nuôi cấy mô thờng dùng là chất kích thích sinh trởng nhân tạo thuộc nhóm auxin
và cytokinin.




ảnh hởng của auxin

Auxin là hợp chất chứa nhân indol trong phân tử. Trong nuôi cấy in vitro,
auxin có tác dụng kích thích sinh trởng kéo dài tế bào, thúc đẩy sự sinh trởng của
mẫu thông qua hoạt hoá sự phân chia và làm giãn tế bào, kích thích quá trình tổng
hợp và trao đổi chất, điều hoà sự phân chia rễ và chồi. Nồng độ NAA thấp sẽ dẫn
tới sự hình thành rễ phụ, nồng độ auxin cao sẽ dẫn tới hình thành mô sẹo. Tuy
nhiên nếu quá cao sẽ ức chế sự phát triển của rễ. Các chất thuộc nhóm auxin th ờng dùng là IBA, NAA và 2,4-D.


ảnh hởng của Cytokinin

Cytokinin là chất điều hoà sinh trởng có tác dụng tăng sự phân chia tế bào.
Các cytokinin thờng gặp là BAP và kinetin. Trong đó kinetin là dẫn xuất của bazơ
nitơ adenin. BAP là cytokinin đợc tổng hợp nhân tạo. Chúng cũng có tác dụng

kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh với
sự phát triển chồi từ mô sẹo nuôi cấy. Nồng độ cytokinin thờng đợc sử dụng là 0,5
- 2mg/l. Nếu nồng độ thấp hơn thì biểu hiện hiệu quả kích thích kém, khả năng
tạo chồi giảm. Ngợc lại, cytokinin ở nồng độ cao sẽ hoạt hoá hình thành chồi bất
định gây ra hiện tợng mọng nớc và kìm hãm quá trình tạo rễ.
Trong nuôi cấy in vitro thì sự kết hợp giữa auxin và cytokinin có tác dụng
quyết định đến sự phát sinh hình thái của tế bào và mô nuôi cấy. Các tỷ lệ
auxin/cytokinin khác nhau sẽ có tác dụng không giống nhau đối với sự phân hoá
của mô nuôi cấy. Nếu tỷ lệ này cao thì thích hợp cho hình thành rễ, còn thấp sẽ
hình thành chồi. Nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thuận lợi cho phát triển của
mô sẹo.
Ngoài auxin và cytokinin còn có nhiều chất điều hoà sinh trởng khác nh
Giberellin, etylen, axit ascorbic. Giberellin có tác dụng kích thích kéo dài tế bào
nhất là thân và lá. Etylen và axit ascorbic là chất ức chế sinh trởng có tác dụng
đối với hoạt động sinh lý và trao đổi chất ở thực vật [11].


ảnh hởng của vitamin


Vitamin là chất xúc tác quan trọng trong các phản ứng enzyme. Mặc dù tất cả
các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có khả năng tự tổng hợp đ ợc hầu
hết các loại vitamin nhng thờng không đủ về số lợng do đó phải bổ sung thêm vào
môi trờng một số vitamin, đặc biệt là vitamin nhóm B nh vitamin B1, vitamin B2,
vitamin B3, vitamin B5, vitamin B6. Trong đó vitamin B1 đợc coi là cần thiết nhất
đối với sự sinh trởng và phát triển của tế bào thực vật.
1.3.4. ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống in vitro
Qua lịch sử phát triển lâu dài, đến nay nuôi cấy mô tế bào thực vật có rất
nhiều ứng dụng thực tiễn. Trong đó, nhân giống in vitro đợc coi là phơng pháp
hữu hiệu nhất. Nhân giống in vitro là lĩnh vực sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế

bào thực vật để nhân giống cây trồng trong ống nghiệm. Với phơng pháp này
hoàn toàn có thể tạo ra một quần thể cây trồng đồng đều giữ nguyên đặc tính của
cây mẹ, có hệ số nhân giống và hiệu quả kinh tế cao, không tốn diện tích nhân
giống. Hiện nay, đã có nhiều quy trình nhân giống in vitro của nhiều loài thực vật.
Nhìn chung, các quy trình gồm 5 giai đoạn [10], [17]:


Giai đoạn 1: Chọn mẫu

Lựa chọn đối tợng (có thể là thân, lá, củ) thích hợp để làm mẫu. Kết quả của
quy trình phụ thuộc rất nhiều vào đặc tính của mẫu. Quan trọng nhất vẫn là đỉnh
sinh trởng, chồi nách, sau đó là hoa, đoạn thân, mảnh lá, rễ... Mô chọn để nuôi
cấy thờng là các mô có khả năng tái sinh cao, sạch bệnh, giữ đợc các đặc tính sinh
học quý của cây mẹ và ổn định. Cây đợc chọn để lấy mẫu thờng là cây u việt,
khoẻ, có giá trị kinh tế cao. Tuỳ mục đích nuôi cấy và đặc tính của loài mà chọn
mẫu phù hợp. Bên cạnh đó phải chú ý tới tuổi mẫu, thời gian lấy mẫu, mùa vụ.


Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng

Mẫu phải đợc khử trùng trớc khi cấy vào môi trờng nuôi cấy. Việc khử trùng
mẫu trong điều kiện vô trùng sẽ làm giảm khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi
cấy. Tuỳ theo sự tiếp xúc của mẫu với môi trờng mà lựa chọn hoá chất, chế độ
khử trùng cho phù hợp. Sau khi khử trùng, cấy mẫu vô trùng vào môi trờng nhân
tạo trong ống nghiệm hoặc trong bình nuôi. Các mẫu nếu không bị nhiễm vi
khuẩn, nấm hoặc virus sẽ đợc lu giữ trong phòng với nhiệt độ, ánh sáng thích hợp,


nếu là nuôi cấy mô sẹo thì đợc để trong tối. Sau một thời gian nhất định, từ mẫu
nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào là mô sẹo, hoặc cơ quan hoặc phôi vô

tính có đặc điểm gần nh phôi hữu tính. Giai đoạn này thờng kéo dài 2 - 12 tháng.


Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

Thành phần và điều kiện môi trờng nuôi cấy phải đợc tối u hoá nhằm đạt đợc
mục đích nhân nhanh. Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi khoảng 1 - 2
tháng tuỳ loài cây. Nhìn chung, giai đoạn 3 thờng đợc thực hiện trong 10 - 36
tháng và cũng không nên kéo dài quá lâu.


Giai đoạn 4: Hình thành rễ

Khi đạt đến một kích thớc nhất định thì các chồi tái sinh đợc chuyển sang
môi trờng tạo rễ. Trong giai đoạn này, ngời ta thờng bổ sung vào môi trờng nuôi
cấy auxin có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Giai đoạn này thờng diễn ra
trong 2 - 8 tuần.


Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng

Đây là giai đoạn cuối cùng của quy trình nhân giống in vitro. Cây con lấy từ
ống nghiệm ra phải đợc rửa sạch môi trờng bám vào rễ để tránh sự xâm nhập của
côn trùng và nấm mốc. Trong giai đoạn này, cần phải chăm sóc, bảo vệ cây trớc
những yếu tố bất lợi sau: Mất nớc nhanh làm cây bị héo, nhiễm vi khuẩn và nấm,
bị bệnh thối nhũn, cháy lá do nắng... Cần phải che phủ cây bằng nilon, tới, phun
sơng đảm bảo độ ẩm và làm mát. Giá thể trồng cây có thể là đất, mùn ca và bọt
biển. Giai đoạn này thờng đòi hỏi 4 - 16 tuần.
Với phơng pháp nhân giống in vitro, nuôi cấy mô thực vật đã góp một phần
rất lớn vào kết quả nghiên cứu của di truyền học, hoá sinh học, vi sinh học, thể

hiện tính u việt hơn so với phơng pháp nhân giống khác. Đồng thời đã có những
thành tựu mang ý nghĩa lớn không chỉ trong nghiên cứu mà còn có ý nghĩa đối
với cuộc sống của con ngời.


Chơng 2. đối tợng và phơng pháp nghiên cứu
2.1. Đối tợng nghiên cứu
Cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) thuộc họ thuỷ tiên
(Amaryllidaceae) do Viện dợc liệu cung cấp.
2.2. Phơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm đợc tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh học - Bộ môn Khoa
học sự sống - Trờng Đại học Khoa học. Thời gian thực hiện từ tháng 9 - 2008 đến
tháng 5 - 2009.
2.2.2. Phơng pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu hiệu quả khử trùng

Mẫu dùng cho nuôi cấy là củ cây TNHC, thờng là củ cái có sự sinh trởng
phát triển tốt. Cây TNHC đợc cắt hết lá, rễ chỉ lấy phần thân, sau đó tiến hành
khử trùng. Việc khử trùng gồm 2 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: Khử trùng bên ngoài box cấy vô trùng
Trớc tiên củ cây TNHC đợc rửa sạch bụi đất bằng xà phòng loãng rồi rửa dới
vòi nớc chảy khoảng 15 phút. Cuối cùng, tráng lại bằng nớc cất.
- Giai đoạn 2: Khử trùng trong box cấy vô trùng
Sau khi khử trùng bên ngoài, củ cây TNHC đợc đa vào box cấy vô trùng để
tiến hành khử trùng bằng hoá chất theo các bớc sau:
Khử trùng bằng cồn 70% trong khoảng thời gian thay đổi từ 30 giây - 60
giây. Sau đó tráng lại bằng nớc cất vô trùng khoảng 3 - 4 lần.
Khử trùng bằng javen (NaClO) 50% trong khoảng thời gian 5 - 10 phút. Sau
đó tráng lại bằng nớc cất vô trùng khoảg 4 lần.

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hởng của auxin đến khả năng tạo mô sẹo

Củ TNHC sau khi khử trùng đợc tách lấy các vẩy hành và cắt thành những
miếng nhỏ kích thớc 1 cm x 1 cm rồi cấy lên môi trờng có bổ sung NAA hoặc
2,4-D với các nồng độ khác nhau và đặt trong bóng tối. Môi trờng tạo mô sẹo có
bổ sung 30 g/l đờng + 8 g/l agar + NAA đợc ký hiệu là TN, môi trờng tạo mô sẹo
có bổ sung 2,4-D ký hiệu là TD với các công thức sau:
TN1= MS + 1 mg/l NAA

TD1= MS + 1 mg/l 2,4-D

TN2= MS + 1.5 mg/l NAA

TD2= MS + 1.5 mg/l 2,4-D

TN3= MS + 2 mg/l NAA

TD3= MS + 2 mg/l 2,4-D

TN4= MS + 2.5 mg/l NAA

TD4= MS + 2.5 mg/l 2,4-D

TN5= MS + 3 mg/l NAA

TD5= MS + 3 mg/l 2,4-D

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hởng của tổ hợp NAA, BAP và kinetin đến

khả năng nhân sinh khối mô sẹo
Sau khi mô sẹo hình thành, để thu đợc sinh khối mô đủ to đáp ứng đợc cho
việc tái sinh cây thì cần phải bố trí thí nghiệm nhân sinh khối mô sẹo. ở thí
nghiệm này, mô sẹo đợc cấy lên môi trờng nền cơ bản MS có bổ sung các chất
kích thích sinh trởng, NAA, BAP hoặc kinetin với những tỷ lệ khác nhau và 30 g/l
đờng + 8 g/l agar. Môi trờng nhân sinh khối bổ sung NAA và BAP ký hiệu là NB;
còn bổ sung NAA và kinetin ký hiệu là NK với các công thức nh sau:
NB1= 1 mg/l NAA + 0.5 mg/l BAP

NK1= 1 mg/l NAA + 0.5 mg/l kinetin

NB2= 1 mg/l NAA + 1 mg/l BAP

NK2= 1 mg/l NAA + 1 mg/l kinetin

NB3= 1 mg/l NAA + 1.5 mg/l BAP

NK3= 1 mg/l NAA + 1.5 mg/l kinetin

NB4= 1 mg/l NAA + 2 mg/l BAP

NK4= 1 mg/l NAA + 2mg/l kinetin

NB5=1.5 mg/l NAA + 0.5 mg/l BAP

NK5= 1.5 mg/l NAA + 0.5 mg/l kinetin

NB6= 1.5 mg/l NAA + 1 mg/l BAP

NK6= 1.5 mg/l NAA + 1 mg/l kinetin

NB7= 1.5 mg/l NAA + 1.5 mg/l BAP

NK7= 1.5 mg/l NAA + 1.5 mg/l kinetin

NB8= 1.5 mg/l NAA + 2 mg/l BAP

NK8= 1.5 mg/l NAA + 2 mg/l kinetin


Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hởng của tổ hợp NAA, BAP và kinetin đến

khả năng tái sinh cây TNHC
Việc tái sinh để tạo chồi có thể tiến hành từ mô sẹo hoặc trực tiếp từ lõi củ
cây TNHC. Vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi bố trí hai thí nghiệm nhỏ.
Thí nghiệm 4.1: Tái sinh cây từ mô sẹo

Từ mô sẹo có thể phát sinh hình thái thành chồi trong điều kiện thích hợp.
Thí nghiệm đợc tiến hành trên môi trờng có bổ sung 100mg/l nc dừa và tổ hợp
các chất kích thích sinh trởng NAA, BAP hoặc kinetin có nồng độ phù hợp và
30g/l đờng, 8g/l agar. Môi trờng tạo chồi đợc ký hiệu là MB và MK với các công
thức nh sau:
MB1= 0.5 mg/l NAA + 0.5 mg/l BAP MK1= 0.5 mg/lNAA + 0.5 mg/l kinetin
MB2= 0.5 mg/l NAA + 1 mg/l BAP

MK2= 0.5 mg/l NAA + 1 mg/l kinetin

MB3= 0.5 mg/l NAA + 1.5 mg/l BAP MK3= 0.5 mg/l NAA + 1.5 mg/l kinetin
MB4= 0.5 mg/l NAA + 2 mg/l BAP

MK4= 0.5 mg/l NAA + 2 mg/l kinetin

Thí nghiệm 4.2: Tái sinh cây từ lõi củ TNHC

Sau khi sử dụng những vẩy hành ở bên ngoài củ để tạo mô sẹo, lõi củ TNHC
có kích thớc 1 x 2 cm đợc cấy vào môi trờng MB1, MB2, MB3, MB4, MK1, MK2,
MK3, MK4 để tạo chồi trực tiếp.
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hởng của sự kết hợp giữa auxin, cytokinin

và gibberellin đến khả năng nhân chồi TNHC
Để có số lợng chồi đủ lớn cho việc tạo cây hoàn chỉnh thì chồi tạo thành đợc
đa vào môi trờng nhân nhanh. Trong môi trờng này có sự kết hợp của môi trờng
nền GA3 + IBA + BAP + 30g/l đờng + 8g/l agar. Thí nghiệm tiến hành trên các
công thức môi trờng nhân chồi có ký hiệu là CB.
CB1= 0.2 mg/l GA3 + 0.5 mg/l IBA + 3 mg/l BAP
CB2= 0.2 mg/l GA3 + 0.5 mg/l IBA + 4 mg/l BAP
CB3= 0.2 mg/l GA3 + 0.5 mg/l IBA + 5 mg/l BAP
CB4= 0.2 mg/l GA3 + 0.5 mg/l IBA + 6 mg/l BAP


Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hởng của IBA trong môi trờng tạo rễ cây

TNHC in vitro
Sau khi nhân chồi, các chồi có kích thớc đủ lớn đợc đa vào môi trờng tạo rễ
đợc bổ sung môi trờng nền MS có nồng độ giảm 2 lần + IBA + 8g/l agar để tạo
cây hoàn chỉnh. Thí nghiệm đợc tiến hành ở ba công thức nh sau:
IR1 = MS/2 + 0,5 mg/l IBA

IR3 = MS/2 + 1,5 mg/l IBA

IR2 = MS/2 + 1 mg/l IBA
2.2.3. Các chỉ tiêu đánh giá


Đánh giá kết quả khử trùng

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = (Tổng số mẫu nhiễm/Tổng số mẫu cấy) x 100
Tỷ lệ mẫu chết (%) = (Tổng số mẫu chết/Tổng số mẫu cấy) x 100
Tỷ lệ mẫu sống (%) = (Tổng số mẫu sống/Tổng số mẫu cấy) x 100


Đánh giá kết quả tạo mô sẹo

Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) = (Tổng số mẫu tạo mô sẹo/Tổng số mẫu) x 100


Đánh giá kết quả nhân sinh khối mô sẹo

Tỷ lệ mô sẹo ra rễ (%)= (Số mô sẹo ra rễ/Tổng mô sẹo đa vào) x 100
Tỷ lệ mô sẹo hoá nâu (%)= (Số mô sẹo hoá nâu/Tổng mô sẹo đa vào) x 100


Đánh giá kết quả tái sinh cây từ mô sẹo
Tỷ lệ tạo chồi (%) = (Số mô sẹo tạo chồi/Tổng mô sẹo đa vào) x 100
Tỷ lệ tạo rễ (%) = (Số mô sẹo tạo rễ/Tổng mô sẹo đa vào) x 100
Tỷ lệ lục hoá (%) = (Số mô sẹo lục hoá/Tổng mô sẹo đa vào) x 100

Đánh giá kết quả tạo chồi từ lõi củ
Tỷ lệ tạo chồi (%) = (Số lõi củ tạo chồi/Tổng số lõi củ đa vào) x 100



Đánh giá kết quả nhân chồi
Hệ số nhân chồi (lần) = (Số chồi tạo thành/Số chồi đa vào)
Đo chiều cao chồi (cm)




Đánh giá kết quả tạo rễ
Số rễ (cái/chồi) = (Tổng số rễ tạo thành/ Tổng số chồi ra rễ)
Đo chiều dài rễ (cm)

2.2.4. Phơng pháp xử lý số liệu
Kết quả đợc xử lý theo phơng pháp thống kê sinh học trên phần mềm exell.
Giá trị trung bình: X =
Sai số chuẩn:
Kết quả:

SX =

Xi
n
S
n

Sai số chuẩn tuyết đối: X = t(,f) . SX

Độ lệch chuẩn: S =



(Xi - X)2

X = X X

Trong đó: Xi là giá trị của từng số liệu
n: Số lần thí nghiệm; t( ,f) tra bảng với = 0.05; f = n -1

n -1


chơng 3. Kết quả và thảo luận
3.1. Nghiên cứu hiệu qủa khử trùng
Trong kỹ thuật nuôi cấy mô, phơng pháp khử trùng là rất quan trọng, nó
quyết định đến sự thành công của quá trình nuôi cấy in vitro. Tuỳ theo sự tiếp xúc
của mẫu với môi trờng mà nó chứa nhiều hay ít mầm bệnh vi sinh vật nh nấm, vi
khuẩn Vì vậy cần phải có chế độ khử trùng hợp lý cho kết quả tốt nhất. Phơng
pháp khử trùng mẫu cấy thông dụng nhất là dùng các hoá chất có khả năng tiêu
diệt vi sinh vật. Hoá chất đợc sử dụng làm chất khử trùng mẫu cần đảm bảo hai
đặc tính: có khả năng diệt vi sinh vật tốt và không độc hoặc độc ở mức độ thấp
với thực vật. Chế độ khử trùng tốt nhất cần đảm bảo vô trùng, tỉ lệ mẫu nhiễm
thấp, tỉ lệ mẫu sống cao, mẫu có khả năng phân hoá sinh trởng và phát triển tốt.
Đối với mẫu cây TNHC, chúng tôi sử dụng củ làm nguồn nguyên liệu để tái
sinh cây trong điều kiện in vitro. Trong thí nghiệm này, chúng tôi bố trí khử trùng
mẫu củ ở sáu chế độ với thời gian khử trùng bằng cồn 70% trong 30 - 60 giây.
Sau đó tráng nớc cất vô trùng 3 - 4 lần rồi khử trùng tiếp bằng javen 50% trong 5 10 phút. Cuối cùng tráng nớc cất vô trùng 4 lần.
Kết quả của chế độ khử trùng đợc trình bày ở bảng 1:

Bảng 1. ảnh hởng của chế độ khử trùng
Hoá chất khử trùng
Chế độ
Cồn
Javen
khử trùng 70%
50%
(giây)
(phút)
Chế độ 1
Chế độ 2
Chế độ 3
Chế độ 4
Chế độ5
Chế độ 6

30

60

Các chỉ tiêu đánh giá
Số
mẫu

Tỷ lệ
nhiễm (%)

Tỷ lệ chết
(%)

Tỷ lệ sống
(%)

5
7
10
5
7

56
78
79
58
70

17,85 2,05 6,31 0,54 75,84 2,83
87,0 5,21
1,33 0,26 11,70
4,98
1,27 0,13 31,24 3,65 67,49 4,01
1,15 0,05

28,52 5,63 70,33 5,61

10

89

1,12 0,04

53,42 4,35 45,46 4,76

15,52 1,95 7,28 0,81

77,20 2,34


Kết quả trên đợc thể hiện ở hình 2:

Hình 2. Hiệu quả của chế độ khử trùng đối với củ TNHC
Qua bảng 1 và hình 2 chúng tôi thấy: Các chế độ khử trùng khác nhau thì cho
tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ chết và tỷ lệ sống là khác biệt nhau rõ rệt.
Khi khử trùng mẫu ở chế độ 1 (cồn 70% trong 30 giây và javen 50% trong 5
phút) cho tỷ lệ nhiễm là 17,85%; tỷ lệ chết là 6,31% và tỷ lệ sống là 75,84%. Giữ
nguyên thời gian khử trùng với cồn (30 giây) và tăng thời gian khử trùng với
javen lên 7 phút (chế độ 2) thì thấy rằng tỷ lệ nhiễm đã giảm rất nhiều chỉ còn
1,33% tuy nhiên tỷ lệ chết lại tăng lên 11,7%. Tiếp tục tăng thời gian khử trùng
bằng javen lên 10 phút (chế độ 3) thì tỷ lệ nhiễm giảm không đáng kể còn 1,27%,
trong khi đó tỷ lệ chết lại tăng lên rất cao là 31,24%. Do đó tỷ lệ sống ở chế độ 2
cao đạt 87%, còn ở chế độ 3 tỷ lệ sống giảm xuống còn 67,49%.
Khi tăng thời gian khử trùng mẫu bằng cồn lên 60 giây và javen 5 - 10 phút
thì thấy ở chế độ 4 (javen 50% trong 5 phút) tỷ lệ nhiễm là 15,52%; tỷ lệ chết là
7,28%; tỷ lệ sống đạt 77,20%. ở chế độ 5 (javen 50% trong 7 phút), tỷ lệ nhiễm
đã giảm rõ rệt so với chế độ 4 và chỉ còn 1,15%, tuy nhiên tỷ lệ chết lại tăng cao
là 28,52%, do đó tỷ lệ sống giảm còn 70,33%. ở chế độ 6 (javen 50% trong 10
phút), tỷ lệ nhiễm là 1,12% nhng tỷ lệ chết tăng rất cao là 53,42%, vì vậy tỷ lệ
sống giảm rõ rệt là 45,46%.
Do đó, khi giữ nguyên thời gian khử trùng bằng javen ở các thời gian 5, 7, 10
phút và tăng thời gian khử trùng bằng cồn lên 60 giây thì thấy ở cùng một thời