Bước đầu xây dựng chương trình xử lý và kế hoạch hóa thực nghiệm hóa học hữu cơ ths hóa học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRUỒNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN

TRẦN VÃN TÍNH

BƯỚC DẦU NGHIÊN CỨU MỘT sô CHẤT ẢNH
HƯỞNG VÀ ĐIỀU KIỆN HOẠT DỘNG TỐI UỊJ CỦA ENZYM

LUẬN ÁN THẠC SỸ KHOA HỌC HOÁ HỌC
CHUYÊN NGÀNH: HOÁ HỌC HŨU cơ
'^

,

.A MA
•

-HUM

:■

Ví

; Nc M-lsịH
Hướng dẫn khoa học: PGS.TSKH. Nguyến Đình Triệu.

TS. Nguyễn Anh Trí.

|\ỌI

í

!


MỤC LỤC
ĐẬT VẤN ĐỀ .......................................................................................................................................... 1

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

('HƯƠNG 1: TổNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................................. 3
1.1- Cacboxylesteraza: Danh pháp, phân bố, cấu trúc, sinh tổng hợp, chức năng sinh
AdCMV:
AdenoCytoMegaloVirus.
lý và bệnh lý trong cơ thể......................................................................................................................3
1.1.1- Danh pháp và phân bố của cacboxylesteraza......................................................................3
ANAE:
a-naphtylacetate.
1.1.2- Cấu trúc của ANAE ............................................................................................................... 5
1.1.3- Sinh tổng hợp ANAE ............................................................................................................. 6
Asp:
Aspartic.
1.1.4- Chức năng
sinh lý và bệnh lý của ANAE trong cơ thể ...................................................... 8
1.1.5- ứng dụng của ANAE trong y học.......................................................................................12
1.2- Cơ chế, điều kiện tối ưu và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác phản
CE:
CacboxyEsteraza.
ứng thuỷ phân liên kết este của ANAE..............................................................................................16

1.2.1- Cơ chế và điều kiện tối ưu xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết este của
CPT-11:
7-ethyl-10-[l-piperidino-l-piperidino] carbonyloxy-camptothecin.
ANAE.................................................................................................................................16
1.2.2- Các chất ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác cho phản ứng thuỷ phân liên kết
ELISA:
Enzym - Linked ImmunoSorbent Assay - Kỹ thuật hấp thụ miễn
este của ANAE.................................................................................................................................19
1.3- Các phương pháp xác định ANAE .............................................................................................. 21
1.3.1- Phương pháp phá vỡ tế bào .................................................................................................
22
dịch gắn enzym.
1.3.2- Phương pháp không phá vỡ tế bào hay hoá học tế bào ................................................... 25
1.3.3- Những ưu và nhược điểm của hai phương pháp phân tích ..............................................27
FAB:
French-American-Bristish - Bảng phân loại Pháp -Anh - Mỹ.
1.3.4- ứng dụng toán học và tin học trong nghiên cứu enzym...................................................28
CHUƠNG 2: Đối TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu ..................................................... 32
2.1Đối tượng .......................................................................................................................................
32
FACEES:
Fatty Acid 2-CloroEthyl Este Synthase.
2.2- Phương pháp nghiên

cứu........................................................................................................ 32
i
/


3.1- Kết quá về tối

3.1.1- Các tham

ưu hoá hình học bằng phương pháp tính lượng tử gần đúng ...................42
số vể mật độ điện tích electron và cấu trúc lập thể....................................42

3.1.2- Kết quả về nãng lượng, nhiệt hình thành phân tử (kcal/mol).........................................49
3.2- Kết quả về tối

ưu hoá thực nghiệm theo phương pháp đơn hình ....................................... 53

3.3- Kết quả về các

chất có ảnh hưởng tới hoạt động xúc tác của ANAE ................................. 57

3.3. L- Kết quả tiêu bản đối chứng: ............................................................................................... 57
3.3.2- Nhóm halogen và kim loại nặng:.......................................................................................57
3.2.3- Nhóm các chất vitamin và kháng sinh:.............................................................................58
3.3.4- Nhóm các chất bảo vệ thực vật và thuốc bảo quản: ........................................................ 59
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN...................................................................................................................63
4.1 - Tối ưu hoá hình học ..................................................................................................................... 63
4.1.1- Về mật độ điện tích electron:.............................................................................................63
4.1.2- Về mặt năng lượng: ............................................................................................................. 64
4.1.3- Về mặt cấu trúc lập thể: ...................................................................................................... 66
4.2- Về tối ưu hoá thực nghiệm theo phương pháp đơn hình ......................................................... 67
4.2.1- Về nhiệt độ ........................................................................................................................... 67
4.2.2- Về pH....................................................................................................................................68
4.2.3- Về thời gian .......................................................................................................................... 68
4.2.4- Về nồng độ cơ chất: ............................................................................................................. 68
4.3 - Về ảnh hướng của

các chất hoá học ..................................................................................... 69

4.3.1 - Về ảnh hưởng của muối natri halogenua và các ion kim loại .................................... 69
4.3.2- Về ảnh hưởng

của các kháng sinh và vitamin.............................................................70

11
/


ĐẶT VẤN ĐỂ

Cacboxvlesteraza bạch cầu là một enzym thuỷ phân liên kết este của axit cacboxvlic
với ancol (E.c. 1.1.1), đây là một enzym không đổng nhất gồm nhiều isoenzym, được tổng
hợp sinh học trong ribosom ở nguyên sinh chất và lưới nội mô. Chức năng sinh lý của
esteraza là thuỷ phân các dị nguyên như vi khuẩn, độc tố và trong quá trình chuyển hoá của
tế bào... tức là tham gia vào các chức năng khác nhau của tế bào bạch cầu. Vì vậy đối với
mỗi loại bạch cầu khác nhau thì có chứa cacboxylesteraza khác nhau, có khả năng xúc tác
phản ứng thuỷ phân cho một cơ chất tuỳ thuộc vào chức năng của nó. Sự khác nhau này có
thể phát hiện bằng các cơ chất, chất ức chế, chất hoạt hoá hay thay đổi điều kiện môi trường
như pH, nhiệt độ, chất cố định... Nhiều loại enzym được phát hiện và phân loại nhờ các kỹ
thuật ức chế và hoạt hoá như: Phát hiện esteraza bạch cầu týp A và B nhận được nhờ chất ức
chế bằng hợp chất photpho hữu cơ: týp A không bị ức chế còn týp B thì bị ức chế. Ngoài ra
nghiên cứu sự ức chế và hoạt hoá còn cho phép hiểu sâu hơn về cơ chế hoạt độne của các
enzym, tác dụng, ảnh hưởng của các chất đưa vào cơ thể một cách chủ động hay vô tình
như: dược phẩm, thuốc trừ sâu, hoá chất... Việc nghiên cứu các chất ức chế và hoạt hoá đã
trở thành đề tài đang rất được quan tâm và thường xuyên được đăng tải trên các tạp chí khoa
học. Đúng như giáo sư Kaphalia khoa Y học của Trường Đại học tổng hợp Texas đã viết
trên tạp chí "Hoá học độc chất" tháng 2/1997 như sau: "Việc nghiên cứu các chất ức chế,

hoạt hoá và các thực nghiệm độc chất về enzym là Iihữnq cơ sà khoa học nền tảng giúp
chúng ta nắm vững được 11 quyên nhân bệnh sinh các bệnh của con người" [79].

Hiện nay phương pháp nhuộm phát hiện cacboxylesteraza mà cụ thể là anaphtylacetate esteraza (ANAE) được ứng dụng rộng rãi trong các phòng xét nghiệm huyết
học để chẩn đoán dòng tế bào trong bệnh ung thư máu và là một tiêu chuẩn để xếp loại thể
bệnh theo FAB. Ngoài ra, HW Macedo và c.s (1991) dùng phương pháp nhuộm hoá học tế
bào ANAE để phát hiện sự giảm tế bào lymphocytes T ớ các bệnh nhàn phong và so sánh
với phương pháp phát hiện marker bằng kháng thể đơn dòng đã đi đến kết luận: phương
pháp nhuộm ANAE phát hiện số lượng tế hào lvmphocytes T tuy không đặc hiệu bằng kỹ
thuật miễn dịch song đây là một kỹ

1
/


thuật tin cậy, kinh tế, không đòi hỏi máy móc đắt tiền và có thể đáp ứng được nhu cầu chẩn
đoán và điều trị [98 ].

Về mặt chất lượng của kỹ thuật đòi hỏi phải đạt được tính đặc hiệu tức là phải phát
hiện được đúng enzym esteraza, giữ nguyên vị trí của chúng như khi tế bào còn sóng tại
thời điểm nghiên cứu. Vì vậy kỹ thuật phát hiện esteraza là một kỹ thuật khó, như trên đã
trình bày kỹ thuật chịu sự tác động của rất nhiều yếu tố như: nhiệt độ. chất cố định, thời
gian bán huỷ, nồng độ cơ chất, tác dụng của các chất ức chế và hoại hoá... dễ dẫn đến kết
quả sai khác với cấu trúc tổ chức esteraza trong bạch cầu như khi tế bào còn đang sống. Tại
Việt Nam hiện mới chỉ có một vài phòng thí nghiệm triển khai kỹ thuật này ứng dụng vào
việc phân loại dòng tế bào ung thư máu. Nhưng kết quả nhuộm có sự sai lệch về độ đặc hiệu
so với kỹ thuật marker cần điều chỉnh tới 26,19% [10]. Nguyên nhân sai lệch này có thể là
do kỹ thuật nhuộm cúa chúng ta chưa đạt được độ nhạy theo yêu cầu của kỹ thuật trong
phân loại bạch cầu của FAB dẫn tới nhận định sai kết quả. VI vậy vấn đề mà chúng ta quan
tâm là phái tìm cách nâng cao chất lượng nhuộm giúp cho việc chấn đoán chính xác các

bệnh dùng đến kỹ thuật nhuộm ANAE. Xuất phát từ những điều trình bày trên đây chúng tôi
quyết định chọn đề tài:

“Bước đầu nghiên cứu một số chất ảnh hưởng và điều kiện hoạt động tối ưu của enzym
cacboxyesterciza ở bạch cầu người bằng phương pháp nhuộm hoá học tê bào”
Vói mục tiêu:
-

Tìm hiểu cơ chế động học của phản ứng nhuộm ANAE thông qua các tham số lượng
tử từ đó rút ra các điều kiện tối ưu, các yếu tố có khả năng ảnh hưởng đến phản ứng.

-

Tìm điều kiện tối ưu về mặt thực nghiệm cho phản ứng nhuộm ANAE bạch cầu.

9


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1- CACBOXYLESTERAZA: DANH PHÁP, PHÂN Bố, CẤU TRÚC, SINH TổNG HỢP, CHỨC
NĂNG SINH LÝ VÀ BỆNH LÝ TRONG cơ THỂ.
Cucboxvlesteraza bạch cầu là một enzym nằm trong nhóm enzym cacboxylesteraza nên
mọi nghiên cứu về enzym này cấn phải dựa trên các hiểu biết cơ bản về cacboxylesterazu
nói chung.
1.1.1- Danh pháp và phân bô của cacboxylesteraza
Danh pháp:
Cacboxyesteraza (CE) là enzym thuỷ phân liên kết este của axit cacboxylic và
ancol. Cũng như các enzym khác CE có nhiều tên gọi khác nhau. Trong tế bào CE được tìm
ra đầu tiên bởi Gomori (1952) bằng phương pháp nhuộm hoá học tế bào ở tế bào bạch cầu
monocytes và macrophages vì thế còn gọi là monocytes/macrophages esteraza [20, 29]. Sau

đó người ta thường gọi tên và phân loại enzym bằng cách lấy tên cơ chất đặc hiệu của
enzym cộng thêm đuôi aza. Nhưng do CE có khả năng thuỷ phân rất nhiều loại cơ chất khác
nhau (19 cơ chất) vì thế nó còn được gọi là esteraza không đặc hiệu [36]. Tuy vậy anaphtylaxetat là một cơ chất đặc hiệu thường được sử dụng trong nghiên cứu nhất vì vậy để
gọi theo tên cơ chất CE còn được gọi là alpha naphtyl acetat esteraza (ANAE). Khi nghiên
cứu về cấu trúc của tâm hoạt động và cơ chế thuỷ phân người ta thấy rằng vị trí xúc tác cho
phản ứng cắt đút liên kết este nằm trên gốc serin nên đôi khi người ta còn gọi là serin
esteraza. Sau này để thống nhất tên gọi cho các enzym nói chung Hội Hoá sinh quốc tế
(UIC) đã đưa ra cách phân loại dựa trên các loại phản ứng và cơ chế phản ứng. Như vậy
nhóm enzym này có tên gọi chính thức là cacboxyesteraza và nằm trong nhóm một của hệ
thống các enzym thuỷ phân (E.c.3.1 .1.1). Tuy vậy việc sử dụng tên gọi enzym theo cơ chất
sẽ giúp chỉ rõ các isoenzym đặc hiệu đối với cơ chất đang nehiên cứu, cho nên trong đề tài
này chúng tôi vẫn sử dụng danh pháp thường được gọi trong các y văn là alpha naphtol
acetate esterase (ANAE).

/


Về phân bở:
Các công trình công bố gần đây đã cho thấy rằng ANAE có mặt ở hầu hết các mỏ
trong CO' thế người. Hàm lượng ANAE cao nhất là trong các tế bào thực bào, sau đó đến tế
bào gan, ruột, dạ dày, phổi, tiền liệt tuyến, tuỵ và ít nhất là trong não [96, 145, 168]. Bên
cạnh đó B Yan và c.s (1994) bằng kỹ thuật Western immunoblotting đã không thấy có hoặc
có rất ít ARN thông tin (mRNA) của ANAE týp B trong các tế bào tuyến sinh dục, phổi, não
và tim [185]. Ở gan G.c Budd và c.s bằng kỹ thuật đo hình thái và định lượng phát xạ đồ
hiển vi điện tử đã tìm thấy 64- 67% vùng gan có ANAE dương tính [145]. Hàm lượng của
ANAE phân bố rất khác nhau trong các mô tuỳ thuộc vào chức năng và nhiệm vụ của mô đó
đối với cơ thể.

Đối với các tế bào máu, tùy thuộc vào từng dòng tế bào và giai đoạn trưởng thành
mà sự phân bố này cũng khác nhau. Trong các dòng bạch cầu thì các tế bào đơn nhân thực

bào như dòng monocytes, macrophages có hàm lượng ANAE lớn nhấl sau đó đến dòng bạch
cầu đoạn trung tính, ít nhất là đòng hồng cầu và dòng lymphocytes [1 17, 122, 155]. Đặc
biệt tế bào huỷ cốt bào thì cho phản ứng ANAE dương tính rất mạnh (JR Connor và c.s
-1995) [39]. Một điều cần lưu ý là trong các giai đoạn phát triển của các dòng tế bào thì các
tế bào trung gian thường có hàm lượng ANAE lớn hơn các tế bào đẩu dòng và các tế bào
trưởng thành. Khi quan sát bằng kính hiển vi điện tử tiêu bản nhuộm hoá học tế bào, RM
Hoedemakers và c.s (1995) đã cho rằng hàm lượng ANAE tỷ lệ với kích thước của tế bào
[67]. Như vậy sự có mặt của ANAE là để đảm nhiệm chức năng của tế bào trong cơ thể nên
nó có the có trong tế bào này mà lại không có trong tế bào khác. Ví dụ như dòng bạch cầu
monocyles có nhiệm vụ thực bào nên nó cần có một hàm lượng ANAE lớn hơn các dòng tế
bào khác để đảm nhiệm chức nâng thuỷ phân chống lại các dị nguyên xâm nhập từ bên
ngoài vào [84].

Trong tế bào thì sự phân bố ANAE cũng rất khác nhau ở các bộ phận của tế bào.
Đối với bạch cầu hàm lượng ANAE cao nhất tại màng tế bào, các tiểu bào quan, dịch bào
tương và ít nhất là dịch nhân. Nơi dự trữ và phóng thích ANAE nhiều nhất là lưới nội

4


AN AE có mặt ở mặt ngoài của màng bào tương và trên mặt ngoài bao quanh thân tế bào Kurloff.
Còn M Frage và c.s (1991) khi phân tích ảnh tán xạ ngược (Ì)LU kscattered) và ảnh của các
electron thứ cấp (secondary electron) thấy rằng trong các tế bào lymphocytes ANAE tập
trung chủ yếu ở các màng và các hạt trong bào tương của tế bào [30]. Các công trình công
bố gần đây đã cho thấy hầu hết các ANAE liên kết với màng tế bào [17, 33, 49].

1.1.2- Cấu trúc của ANAE
ANAE là một enzym thuộc loại serin eseraza tức là có tâm hoạt động được cấu tạo
bởi ba axit amin Ser-His-Asp/Glu [182]. Đây là một nhóm enzym không đồng nhất về mặt
cấu trúc. Các công trình công bố gần đây đã cho thấy trong các tổ chức khác nhau thì ANAE

có cấu trúc khác nhau. Kích thước của enzym vào khoảng 2-3 Ả. Trọng lượng phân tử từ
19.500 đến 180.000 dantol. Bằng kỹ thuật sắc ký cột sephadex Kaphalia và c.s ị1997) đã xác
định được ANAE trong microsome của tế bào mỡ gồm hai phần một phần có trọng lượng
phân tử là 60 kDa và phần kia là 180 kDa. Phần 180 kDa là một trimer và bị ức chế bởi
diisopropyl florophotphat tức là nó thuộc loại B esteraza [79]. về mặt điện tích thì ANAE là
một enzym mang điện tích âm và các isoenzym nằm trong vùng đẳng điện (pl) từ 5,5-6,1
[146, 180]. Nhiều isoenzym có tính đặc hiệu khá cao cho từng dòng tế bào và có thể coi nó
như một giá trị tham chiếu để nhận dạng dòng tế bào. SM Ginac và c.s (1996) bằng phương
pháp điện di đã tìm ra 5 isoenzym của ANAE đặc hiệu cho các dòng tế bào máu khác nhau:
Monocytesl/Monocytes2 tìm thấy trong các tế bào dòng monocytes, Myl/My2 trong tế bào
dòng tuỷ, bệnh đa u tuỷ, dòng hồng cầu, và dòng tiểu cầu, Lyml/Lym2 trong tế bào
lymphocytes và cuối cùng là Und trong dòng tế bào chưa biệt hoá [59]. Có thể khẳng định
ANAE là một nhóm enzym không đổng nhất trong các tế bào khác nhau cũng như trong các
bào quan khác nhau thì ANAE cũng khác nhau. Ớ tế bào thận chuột thì ANAE có hai
isoenzym [22].

cs.

Scott và c.s, bàng phương pháp điện di đã thu được ANAE tinh khiết

nhờ kỹ thuật săc ký các mảnh lưới nội nguyên sinh chất từ các tế bào dòng tuỷ và tìm ra hai
isoenzym của ANAE. Hai isoenzym này thường có mặt trong tế bào ở cả hai dòng bach cầu
đoạn và monocytes. Sự khác biệt của hai isoenzym là khác nhau về sự ức

5
i


chế hởi nhiệt độ và NaF [45]. Trong các lysosom của tế bào monocytes, HJ. Radzun và c.s đã tìm
ra 5 isoenzym đặc hiệu cho các vùng đẳng điện khác nhau. Theo ngân hàng dữ liệu cấu trúc

enzym của Trung tâm Thông tin kỹ thuật sinh học Quốc gia Hoa Kỳ ( NCtìỉ) bằng kỹ thuật
Northern blot năm 1991, S.Munger và c.s đã giải mã mARN tinh khiết chiết xuất từ tế bào
monocytes và đã tìm ra cấu trúc bậc một của ANAE gồm 503 axit (Xin xem phẩn phụ lục ỉ).
Trên bản đồ gen người ANAE bạch cầu được mã hoá trên nhiễm sắc thể thứ 16 [105]. Trọng
lượng phân tử là 60 kDa và bị ức chế bởi diisopropyl florophotphat nồng độ 2 mM. Tác giả
cũng đã thấy rằng có sự giống nhau đến 90% về cấu trúc của ANAE bạch cầu với ANAE ở
microsome cứa tế bào gan. ANAE tế bào gan có cấu trúc gồm 507 axit amin và tâm hoạt
động cũng gồm Ser - His - Asp [95, 113]. Các cấu trúc bậc hai, bậc ba và bậc bốn đang tiếp
tục được nghiên cứu. Khi phân tích gen lambda mã hoá ANAE của tế bào gan, T Langmann
và c.s (1997) nhận thấy chúng gồm một trimer, xếp chồng lên nhau với mỗi đoạn dài khoảng
30 kb và được làm thành 14 cầu ngoại có chiều dài từ 39 đến 379 bp [88, 150]. Song vị trí
mà các nhà khoa học quan tâm hơn cả là vùng trung tâm hoạt động của enzym. Tất cả các
ANAE đều có tâm hoạt động bao gồm một

gốc nucleophil là Ser, một gốc bazơ His và một gốc axit Asp. Ổ một số isoenzym của
ANAE thì gốc axit Asp được thay bằng Glu [185, 186].

1.1.3- Sinh tổng họp ANAE
Bản chất của ANAE là protein nên nó cũng được tổng hợp như các protein khác.
Quá trình tổng hợp diễn ra trong các ri bosom. Các ribosom này thường được gắn với màng
lưới nội nguyên sinh. Lưới nội nguyên sinh (reticuloendothelium) là một hệ thống ống nhỏ
xuyên qua toàn bộ tế bào và đặc biệt phát triển trong các tế bào chế tiết cao như tế bào gan
nó chiếm tới 70%. Lưới nội nguyên sinh là một trong những thành phần của màng nhân, ở
đây nó biệt hoá thành các lỗ nhân, do đó nhân có thể liên hệ gần như trực tiếp với nguyên
sinh chất. Tại đây ARN thông tin (mARN) sau khi sao chép thông tin di truyền từ ADN ở
trong nhân đi qua một cách dễ dàng và tiến tới các ribosom có gắn với màng của lưới nội

6

sinh gọi là màng cửa sổ, những màng này tập trung khá nhiều trong nguyên sinh chài. Các
mARN cũng có thể đi qua các lỗ này mà vào nguyên sinh chất để gắn vào ribosom tự do
trong nguyên sinh chất. Quá trình tổng hợp ANAE được diễn ra tại các ribosom gắn với
màng của lưới nội nguyên sinh chất là chủ yếu. mARN của bạch cầu monocytes và
macrophage để tổng hợp ANAE bao gồm 1766 bases (S.Munger- 1991). Sự sao mã di
truyền từ ADN sang mARN trong tế bào monocytes bắt đầu từ vùng Spl [87].

Quá trình tổng hợp ANAE được điều chỉnh bởi các hormon tăng trưởng và các chất
nội tiết tố của cơ thể. Điều này được chứng minh là quá trình tổng hợp isoenzym ANAE là
ES-4 được điều chỉnh bởi thyroxin là một nội tiết tố của tuyến giáp. Các tiền hormon sinh
dục như: Demethasone gây kìm hãm quá trình sao mã của mANR dẫn tới làm giảm quá trình
tổng hợp một số isoenzym ANAE, còn testosteron thì kích thích tổng hợp ANAE [43, 54,
70, 140, 189]. Các isoenzym chịu sự điều chỉnh của các hormon này được gọi là ANAE phụ
thuộc hormon sinh dục. ANAE-29 là một isoenzym điển hình cho nhóm này, quá trình tổng
hợp ANAE-29 tại các mô phụ thuộc vào nồng độ của testosterol trong huyết tương [178].
Trong bệnh đái đường hàm lượng ANAE trong tuyến thượng thận thường giảm rõ rệt. RD
Duan và c.s (1993) cho rằng sự thiếu hụt insulin đã gây cảm ứng ức chế tổng hợp ANAE
trong tuyến thượng thận [47].

Cũng như các quá trình sinh học khác việc tổng hợp ANAE được kích thích bởi phản
ứng cảm ứng đối với cơ chất đặc hiệu của từng isoenzym. HA Van Lith và c.s thấy rằng quá
trình tổng hợp ANAE trong huyết tương và ruột tăng lên khi tăng chế độ ãn dầu dừa, dầu
oliu và dầu ngô ở những người bị bệnh đái đường. Tác giả cho rằng có sự tăng này là do có
sự cảm ứng đối với cơ chất của các isoenzym của ANAE [173]. Sau khi tổng hợp ANAE
được vận chuyển vào lưới nội nguyên sinh chất, từ đây ANAE tiếp tục được đưa vào
lysosom, ty lạp thể và chủ yếu là gắn với mặt trong của màng tế bào [114]. Ngoài ra có rất
nhiều loại thuốc gây ức chế hay làm tăng sự tổng hợp ANAE trong bạch cầu như:
hexametylen bisaxetamit làm tăng ANAE trong tế bào ung thư dòng tuỷ chưa biệt hoá U-

7

1.1.4- Chức năng sinh lý và bệnh lý của ANAE trong cơ thể
Như trên ta đã biết ANAE có thể xúc tác cho phản ứng thuỷ phân các este của axit
cacboxylic và ancol. Các este này có thể là các aliphatic, este vòng thơm, amit thơm. Đây là
một phản ứng phổ biến trong mọi tế bào đặc biệt trong việc chuyến hoá các chất nội, ngoại
sinh. Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra tính đa dạng trong hoạt động xúc tác của ANAE ở
các tế bào khác nhau [91, 146]. ANAE tham gia chủ yếu vào các chức năng sinh lý sau:

1.1.4.1- Chức năng chuyên hoá:
ANAE tham gia vào rất nhiều các phản ứng như chuyển hoá các chất dinh dưỡng,
chuyển hoá thuốc, điều hoà sinh tổng hợp...
Đối với chuyển hoá glucozơ : ANAE tham gia vào các chu trình Krebs sinh năng
lượng, chu trình xitric để tạo axyl-coA, điều hoà chuyển hoá lipit và nhiều chu tình chuyển
bon. khác [l 5 ??]. Trong chuyển hoá glucoza, ANAE xúc tác cho phản ứng thuỷ phân
axylglycerol hay axyl-Co A tao thành axit tương ứng để hình thành chất vận chuyển glucoza
vào chu trình Krebs tạo nãng Iượrig cho tế oào [92, 109].

Đối với chuyển hoá lipit : T Tsujita và c.s (1994) cho rằng ANAE có vai trò quan
trọng trong việc chuyển hoá và tổng hợp các lipit phức tạp. ANAE thuỷ phân các triaxyl
glyxerol, axyl-CoA mạch dài tạo thành gốc axyl kết hợp với ancol hoặc cholesterol hình
thành các este. Tốc độ các gốc axyl kết hợp với ethanol nhanh gấp khoảng 25-30 lần so với
H 2 0 [123, 166, 167]. HA Vanlith và c.s (1993) thấy rằng hàm lượng ANAE tăng lên trong
huyết thanh của những người ăn kiêng hoàn toàn cholesterol. Nguyên nhân của sự tăng này
là nhằm hấp thu tối đa lượng cholesterol có trong thức ăn ở ruột [168, 174]. Một số
isoenzym của ANAE như ES-4 tham gia trực tiếp vào chu trình tổng hợp axit béo bằng phản
ứng thuỷ phân axyl-CoA [184, 189].

Đối với chuyển hoá ancol đưa từ ngoài vào : BS Kaphalia và c.s (1997) phát hiện
ANAE trong mô mỡ tham gia vào khâu đầu của quá trình tổng hợp sinh học các este của

8


enzym lổng hợp este của oroetyl với axit béo (FAEES) xúc tác phản ứng este hoá các axit
này với ancol đưa từ ngoài vào. Bằng phương pháp dùng kháng thể đa giá Ihỏ T Tsujita và
c.s ( Ị 9 9 2 ) đã thấy rằng tỷ lệ ANAE tham gia vào chuyển hoá ancol trong mô IĨ1Ỡ 86%, gan
23%, phổi 62%, tinh hoàn 82% [165]. Nhưng trong các mô khác như dạ dày, gan, tuỵ là
những mô có chứa nhiều ANAE thì ancol lại làm giảm hoạt tính của enzym. Nhờ thực
nghiệm in vitro, B Stem và c.s (1996) đã thu được kết quả: với nồng độ etanol 5% sẽ làm
giảm hoạt tính ANAE của các tế bào gan 10%, trong tế bào dạ dày là 20% và trong tế bào
tuỵ tới 46% [157]. Nhiều tác giả cho rằng hệ ba enzym này đóng vai trò quan trọng trong
các bệnh mãn tính gây ra bởi rượu ở những người nghiện rượu như bệnh: thoái hoá thể kính
trong gan những người nghiện rượu [79, 158, 165]. Như vậy ANAE có vai trò quan trọng
trong chuyển hoá các ancol đưa từ ngoài vào.

Đối với chức năm của hê thần kinh : Trong tế bào thần kinh ANAE có mặt trong lưới
nội nguyên sinh chất và xúc tác cho phản ứng thuỷ phân tạo temocapril, p-nitrophenylaxetate là các chất trung gian dẫn truyền tín hiệu thần kinh [21, 63, 109].

Như vậy ANAE có khả năng tham gia vào một số chu trình quan trọng trong cơ thể
nên một số tác giả còn cho rằng sự thay đổi nồng độ của ANAE có ảnh hưởng đến kích cỡ
và thói quen ăn uống của một số loài. MC Fossi và c.s (1996) thấy rằng có sự liên quan chật
chẽ giữa hàm lượng ANAE trong máu với kích thước và thói quen ăn uống của một số loài
chim. Các loài chim có kích thước nhỏ thì có hàm lưọng ANAE cao và thường là những loài
không ăn thịt và ngược lại [52].

Chức năng chuyển hoá thuốc : ANAE có khả năng tham gia vào chuyển hoá thuốc
đặc biệt là các tiền được (được để cập kỹ hơn ở phần ứng dụng ANAE), phân huý các sản
phẩm chuyển hoá thuốc trung gian độc đối với cơ thể [15, 183]. Bên cạnh đó nó cũng là
nguyên nhân giảm hoạt tính và tác dụng của nhiều loại thuốc khác nhau.

9


hào. Khi bị nhiễm độc ANAE trong các tế bào bạch cầu thường bị giảm mà biểu h i ệ n trên
kính hiển vi quang học là giảm các hạt đặc hiệu của tế bào bạch cầu. Sự giám này thường
thấy trong các công nhân làm ngành than, hoá chất bảo vệ thực vật Ị107]. Sự tăng ANAE
trong máu đặc biệt là isoenzym ANAE-S có nguồn gốc từ gan là dấu hiệu của sự ngộ độc
[187]. Các hợp chất ngoại lai đặc biệt là các hợp chất có chứa photpho hữu cơ là những độc
tố đối với cơ thể nhưng đồng thời cũng là chất ức chế đối với ANAE. Cơ chế của sự ức chế
này sẽ được trình bày trong phần sau. Sự kết hợp của ANAE với loại hợp chất này mang
tính không thuận nghịch vì thế nó làm cho mất hoạt tính và phức hợp enzym-độc chất nhanh
chóng bị loại ra khỏi cơ thể [36, 146, 163]. Đối với tế bào thần kinh các isoenzym của
ANAE được coi như hàng rào máu - não bảo vệ hệ thống thần kinh trung ương đối với các
hợp chất este hoặc amit có hại xâm nhập vào não [109, 112, 184]. Pindel và c.s (1999) đã
cho răng ANAE có vai trò quan trọng trong việc thải độc, phân huỷ và làm giảm hàm lượng
các chất ma tuý trong cơ thể người [130]. Nó phân cắt các nhóm benzoyl của cocain và
nhóm axetyl của 4-metylumbelliferyl axetat, heroin và 6- monoaxetylmorphin để tạo thành
các sản phẩm cuối cùng là morphinglucoronat đào thải ra ngoài nước tiểu. Quá trình thuỷ
phân này chủ yếu diễn ra tại các mô có khả năng sản xuất và dự trữ ANAE cao như gan,
huyết tương, thận... Trong các isoenzym của ANAE thì hCE-2 có ái lực đối với các chất ma
tuý cao hơn so với các isoenzym khác [130]. ANAE còn tham gia chuyển hoá các nicotin
thuốc lá, quá trình này phụ thuộc vào tương tác giữa nhóm kị nước của enzym cũng như cấu
trúc lâp thể và các dạng chuyển hoá trung gian của nicotin [48].

1.1.4.3- Chức năng miễn dịch:
ANAE đóng vai trò quan trọng trong phản ứng miễn dịch chống lại các dị nguyên
bảo vệ cơ thể [87]. Shiotsuki và c.s dùng lipopolysaccharide của vỏ vi khuẩn E. coli tiêm
vào tổ chức lymphocytes sau 6 giờ nồng độ của isoenzym của ANAE là hCE-1 và hCE-2
tãng lên rõ rệt. Như vậy các dị nguyên như vỏ vi khuẩn, các độc tố chính là các chất cảm

ứng kích thích quá trình tổng hợp ANAE trong tế bào. Trong tế bào bạch cầu ANAE tham
gia trực tiếp vào việc thuỷ phân các dị nguyên xâm nhập vào cơ thể.

10


Cơ chế của quá trình thực bào với sự tham gia của ANAE đã được

s

Yokota và c.s

( Ị 9 9 3 ) phát hiện qua thí nghiệm sau: tiêm leupeptin cho chuột với liều 2 mg / 100 g trọng
lượng, sau 20 phút tất cả các lysosom và ty lạp thể của tế bào bạch cầu được bao quanh một
màng kép của lưới nội chất. Những màng này dương tính với ANAE. Sau một thời gian (40
tới 60 phút) xuất hiện rất nhiều các không bào thực bào chứa leupeptin. Lúc đầu bao quanh
các không bào là một lớp màng kép của lưới nội nguyên sinh chất sau đó lớp màng kép mất
đi và thay thế bằng một màng đơn. Và trong lớp màng đơn này ANAE vẫn dương tính. Tác
giả đã cho rằng quá trình thực bào bắt đầu hình thành không bào từ lưới nội nguyên sinh
chất trong đó có chứa các kháng nguyên, lysosom, ty lạp thể; sau đó màng của lysosom, ty
lạp thể và lưới nội nguyên sinh chất kết hợp với nhau dẫn đến thoái biến chỉ còn một màng
có bủn chất là màng của lysosom. Chính tại lysosom này các enzym đã được phóng thích để
ly giải các kháng nguyên lạ xâm nhập vào cơ thể trong đó có ANAE [192]. B Sternby và c.s
(1991) khi nghiên cứu hoạt tính của ANAE trong các tế bào ruột bị tổn thương do nhiễm
trùng cũng thấy ANAE tăng cao (165% so với chuẩn) và giảm chí còn 32% ở giai đoạn
cuối. Tác giả cho rằng sự tăng ANAE trong giai đoạn đầu nhằm tăng khả năng thuý phân
các vi khuẩn và độc tố của chúng, còn ở giai đoạn sau giảm đi là để tránh sự thuỷ phân các
chất cần thiết hàn gắn vết thương do nhiễm trùng gây ra [84].

1.1.4.4- Bệnh lý ANAE

Năm 1986 Markey và c.s thông báo phát hiện 3 người trong một dòng họ có sự ihiếu
hụt ANAE trong tế bào bạch cầu monocytes. 95% tế bào monocytes trong máu của bà mẹ
và con gái, 60-70% tế bào monocytes của 2/4 cháu gái không có ANAE. Sau đó khi nghiên
cứu tỷ lệ thiếu hụt ANAE trong quần thể dân cư tác giả phát hiện tần suất thiếu hụt ANAE
là 1,7% nhưng trong nhóm bệnh u lympho không Hođgkin hav ung thư bạch cầu dòng
lympho B thì tỷ lệ này chiếm tới 7,1%. Các nơhiên cứu về gia đình sau đó đã chỉ ra rằng
bệnh có tính chất gia đình và truyền cho con gái theo nhiễm sắc thể X. Sau đó Becker và c.s
cũng gặp 4 bệnh nhân tương tự nhưng trên bệnh nhân viêm khớp [105].

]1


Di
BANG 1 . 1 : BẢNG PHÂN LOẠI BỆNH UNG THƯ MÁU DÒNG MONOCYTES THEO FAB [8, 15]

■

■

t(9;
9
Úng
dụng của ANAE trong
y học
>30% TB blast 1.1.5■ >5.10
/LTB
PER (+)
SD (+)
CD13(+)
ANCE (+)

CD15(+)
11)
A N A E tìíịùV nav được ứng íluniị rộng rãi trong ngành V học ở cả lĩnh vực chan
ANAE (+)
CD33(+)
đoán vù diều trị.
HLA-DR (+)
<50% HC non monocytes
CD14(+)
Trong lĩnh vực chẩn đoán:
(p22;
Chẩn đoán bênh lý huyết hoc :

Trong các dòng tế bào máu thì dòng monocytes/macrophages, lymphocytes T có
ê'bào non dòng HC:
■Nếu <5.107L TB monocytes
hoạt tính ANAE cao hơn so với các tế bào khác. Nhờ đặc điểm này mà các nhà hu vết học
■ >30% ТВ blast
■ >5% là BC eosin bấtPER (+) SD (+)
CD13(+)
t(16;
có thể sử dụng nó như một công cụ hữu ích dùng trong việc xác định các dòng tế bào trong
thường
ANCE (+)
CD15(+)
bệnh ung thư máu. Hội các nhà huyết học ANAE
của Anh-Pháp-Mỹ
( F A B ) đã đưa ra cách phân
(+)
CD33(+)

■

(+) miễn dịch và di truyền
loại ung thư máu dựa trên những đặc điểm về hình thái,HLA-DR
hoá tế bào,
<50% НС non
16)
CD14(+)
trong đó nhuộm■ phát
hiện TB
ANAE
thực sự là một chỉ số tham chiếu quan trọng giúp phân
> 5.107L
monocytes
biệt ung thư máu thể M - 4 và M - 5 với các thể khác (bảng 7.7 - trang 13). Đó là các thể

ung thư hỗn hợp dòng tuỷ - monocytes
ế bào non dòm HC:

■

■

inv

9
>30% TB blast ■ >5. IO / LTB

t(9;
PER (-/+) SD (-/

CD13(+)
+) ANCE (-)
CD15(+)
11)
monocytes
( M 4 ) và dòng monocytes ( M 5 ) . Ở các thể này ANAE dương tính rất mạnh nhưng ở thể MANAE (+) và
CD33(+)
5 thì bị ức chế bỏ'i NaF [16]. Bằng cách nhuộm
có
sử
dụng
chất ức
bị ức chế HLA-DR
(+)chế là NaF chúng ta có
<50% HC non
bằng
NaFmonocytes
CD14(+)
thể chẩn đoán phân biệt được đó là ung thư
dòng
hay các dòng khác (clònf>
(p22;
■< 5.107L TB monocytes
hồiìíỊ cầit, tuy....). Ngoài ra, sử dụng kỹ thuật nhuộm ANAE còn cho phép xác định số

lượng tế bào lymphocytes T trong máu điểu này sẽ giúp ích rất nhiều cho việc chẩn đoán
ế bào non dòng HC:
các bệnh giảm tế bào lymphocytes T như bệnh phong [98].
■ >5. IO 7 LTB
t(8;

■ >30% TB blast
PER (-/+) SD (-/
CD13(+)
16)
+) ANCE (-)
CD15(+)
monocytes
(pll:
ANAE (+) và
CD33(+)
pl3)
bị
ức
chế
HLA-DR
(+)
Trong chẩn đoán pháp ỵ :
■ <50% HC non
bằng NaF
CD14(+)
Ngày nay ■hoáhoá học tếТВ
bào ngày càng được ứng dụng vào công tác pháp y
monocytes
và được coi như những
tài liệu mang tính pháp qui dùng để tham chiếu trong công tác thi

hành pháp luật. Theo w Dachun và c.s (1992), thì việc sử dụng kỹ thuật xác định ANAE
ebào non dons HC:
trong các mô tổn thương để xác định thời gian chết cũng như đặc điểm tổn thương rất có giá

trị và có độ chính xác cao với a=0,01. ANAE giảm dần tại các mô bị chết theo thời gian và
tổn tại tối đa là 4 giờ sau khi chết. Dựa vào đường cong động học của quá trình giảm này

12


Trong chấn íỉoán dôc chất :
E.Heymann ( 1 9 9 9 ) đã giới thiệu hai phương pháp định lượng photpho hữu cơ nhờ
kỹ thuật ức chế ANAE [66]. Cả hai phương pháp đều dựa vào việc thêm một lượng mẫu
chưa biết nồng độ photpho hữu cơ vào hỗn hợp phản ứng chứa enzym ANAE tinh khiết và
cơ chất đặc hiệu. Do bị ức chế làm cho tốc độ phản ứng giảm đi so với mẫu chuẩn từ đó tìm
ra được nồng độ photpho. Với kỹ thuật này cho phép xác định được photpho hữu cơ ngay cả
khi hàm lượng rất nhỏ (cỡ 0,1 nmoỉ paraoxon) và có giá trị trong lĩnh vực độc chất bởi vì
rất nhiều thuốc trừ sâu có chứa photpho hữu cơ.

Trong lĩnh vục điều trị:
Từ những năm 1990, một hướng nghiên cứu mới sử dụng phương pháp kết họp
enzym - tiền dược - liệu pháp gen đạt hiệu quả thử nghiệm rất cao trên cả phương pháp nuôi
cấy và thực nghiệm ở động vật đổng thời mang lại nhiều hy vọng trong điều trị bệnh nan y.
Một trong các hướng đó là người ta đã sử dụng các tiền dược như một cơ chất của ANAE,
sau khi thuốc đi vào máu nhờ ANAE xúc tác thuỷ phân tạo ra hoạt chất chính tác dụng lên
các mô đích cần điều trị. Điều này sẽ có nhiều lợi ích trước hết là giảm được liều thuốc đưa
vào bởi vì các tiền dược thường là các chất ít bị phân huỷ bởi các enzym do nó là một este.
Thứ hai là thuốc sẽ được giải phóng một cách từ từ nên luôn duy trì được một hàm lượng
thuốc nhất định trong cơ thể. Ngoài ra còn có thể chọn lựa được mô đích mà thuốc cần tác
dụng như gan, thận là các mô có chứa nhiều ANAE. Đặc biệt khi kết hợp với liệu pháp ghép
gen sinh tổng hợp ANAE thì hiệu quả điều trị của các tiền dược là rất cao nhất là đối với
ung thư của các mô đặc, nó cho phép thuốc tác động chính xác vào vị trí ung thư và giảm
tính độc dược toàn thân, về mặt động học thì tác dụng của ANAE phụ thuộc nhiều vào sự
phân cực và cấu trúc lập thể của các nhóm thế axyl của tiền dược. Tốc độ xúc tác của

ANAE tăng tuyến tính với khả năng phân cực của tiền dược tức là khả năng tan của tiền
dược trong dung dịch. Mặt khác ANAE là một enzym xúc tác thuỷ phân đặc hiệu về mặt lập
thể thường là thuỷ phân liên kết este nằm ớ vị trí equatorial vì thế trong tổng hợp tiền dược
cần chú ý tính tan và cấu hình lập thể của tiền dược [53, 149,182]. Sau đây là ba ví dụ về sử
Ghi chú : TB: tế bào; HC: hồng cầu; PER: nhuộm peroxydaza; SD: nhuộm sudan B;
dụng tiền dược ANCE: nhuộm esteraza đặc hiệu bằng cơ chấta- Naphtylchloracetate.
13
14


N

ANAK
liệu này
phápsẽgen:
n h â n vào các tế bào gan đối với các
bệnhvànhân
làm tăng hiệu quả điều trị lên nhiều
lần.

Ể

—

- Trans điều tri U H Í > thư : CPT-11 hay còn gọi là irinotecan, PC thuộc họ tiền
dược paclitaxel
là cáctritiền
chất
chống
thư theo cơ farnesil

chế này.( ICPT-11
và PC
sau tiền
khi được
- Trong điều
bênh
viêm
khớpung
: Indometacin
M F ) cũng
là một
dược
đưa thuộc
vào cơANAE,
thể sẽ bị
phânphân
bởi ANAE
thành
và pađitaxel( tương
là
phụ
khithuỷ
bị thuỷ
trong tếtạo
bào
hoạtcamptothecin
dịch nó tạo indometacin
I N D ) ứng
là một

/

hoạt chất
chống
ung hợp
thư prostaglandin
mạnh đặc biệtE2làtừung
phổi
ungkhớp
thư hắc
tố [133,
ức chế
sự tổng
đó thư
làm biểu
giảm mô
phản
ứngvà
viêm
[106].
1 thuốc
147]. Trong đó isoenzym của ANAE là hCE-2 có ái lực cao với CPT-11 [42, 70, 116]. Với
liều điều trị 2,5 mg/kg/ngày X 5 ngày/tuần X 2 tuần và nhắc lại sau 21 ngày với 3 chu kì

1.2TỐI- ƯU
VÀ 7/7
CÁCcon
YẾUchuột
Tố ẢNH
HƯỞNG

ĐẾN
ĐỘNG
xúcđều
TÁCkhỏi
điều Cơ
trị CHẾ,
(MK ĐIỀU
DanksKIỆN
và c.s
1999)
được
gây ung
thưHOẠT
tế bào
cơ vân
PHẢN ỨNG THUỶ PHÂN LIÊN KẾT ESTE CỦA ANAE.
và không thấy tái phát [180]. A Kojima và c.s (1998) đã dùng AdCMV mang đoạn mã di
1.2.1- Cơ chê và điều kiện tối ưu xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết
truyền
ghép vào ADN của tế bào ung thư biểu mô tuyến A549
este của ANAE-ADN
ANAE
His
Hisgiảm 35% kích cỡ khối LI
Hisvào ngày thứ 27 và
(adenocarcinoma)
kháng CPT-11. Kết quả
41% ở ngày thứ 34 sau điều trị bằns CPT-11 so với khối u không [+]
được ghép gen đồng thời
hoạt tính của1 ANAE lang 42% so với tế bào A549 không kháng thuốc nhờ đó có thể giảm

H —o
\ /
được liều điều trị tức là giảm độc tính của thuốc đối với cơ thể [82, 83]. Điều này đã mở ra

c

hy vọng về điều trị ung
thư đặc biệt là_ các ung thư đặc kháng thuốc.
-OR,
/
Ser
I
N
Se
o — c —OR!
- T i o i m điều tri các rối loan chuyển hoá ỉipid : Lovastatin (LVS) là một tiền dược
đang được sử dụng điều trị rộng rãi bệnh tăng Cholesterol loại LDL. LDL tăng thường gây
giảm sức bền thành mạch và dễ dẫn tới xuất huyết ở người bị bệnh cao huyết áp. LVS tồn
tại dưới dạng este khi đưa vào cơ thể, nhờ tác dụng của ANAE thuỷ phân tạo thành
lovastatin hydroxy axit ( L H A ) tác dụng lên LDL để loại nó ra khỏi cơ thể. Trong huyết
tương LHA được tạo thành với tốc độ 15,8 pmol.min' 1 , trong tế bào gan ở microsome là
2,13 pmol.mg' 1 protein.min' 1 và trong cytosol là 0,92 pmol.mg' 1 protein.min' 1 . BK Tang và
c.s (1995) đã tính toán trung bình huyết tương thưý phân LVS khoảng 18%, lysosom 15%
và cytosol chiếm khoảng 67% ị 162]. Hiệu quả điều trị phụ thuộc vào khả năng tổng hợp
ANAE trong tế bào gan. Qua khảo sát 17 mẫu sinh thiết tế bào gan tác giả thấy rằng có 1/17
mẫu cả cytosol và microsome đều không có ANAE, 2/17 mẫu thiếu hụt ANAE. Điều này

15

[36]

acyl --------c-------o -------- alkyl

'

- Nói về tủm hoat đông : ANAE gồm một số isoenzym thuộc loại serin esteraza và
có tâm hoạt động là Ser-His-Asp [101]. Một số isoenzym của ANAE thì Asp được thay thế
bằng Glu. MA Myers và c.s (1993) khi tiến hành thay thế His 187 năm trong tâm hoạt động
của isoenzym ANAE-6 bằng Glu thấy rằng ANAE bị biến đổi I'õ rệt về đặc điểm xúc tác.
Nó làm pH hoạt động tối ưu tăng từ 7 lên 9, giảm ái lực đối với cơ chất là este của (3naphtyl và p-nitrophenylaxetate, mất hoạt tính đối với axetylthiocholine và làm tăng năng
lượng hoạt hoá tự do Gibb's. Điều này đã chứng tỏ gốc thứ 187 nằm trong trung tâm hoạt
động của ANAE-6 đã tương tác trực tiếp với nhóm ankyl kị nước và sự tương tác này nằm
trong giai đoạn chuyển tiếp. Sự thay thế Glu làm giảm khả năng tham gia vào quá trình xúc
tác các phản ứng thuỷ phân [115]. Mô hình RD Newcomb và c.s (1997) đưa ra đã chứng
minh rằng Aspl37 có thể đóng vai trò như một bazơ định hướng phân tử H 2 0 vào vị trí phù
hợp tại vùng tâm hoạt động thuận lợi cho quá trình thuỷ phân cơ chất của ANAE [118].
Theo Webb thì tâm hoạt động của ANAE được chia làm 4 vùng ái lực với các nhóm: gốc
của ancol (Vị), liên kết este (V 2 ), gốc của axyl có hai vùng (V 3 , V 4 ) (Hình 1.1). Tác giả cho
rằng ái lực và phản ứng thuỷ phân este tăng lên nếu nhóm axyl có chiều dài từ 4-6[-]nguyên
tử

c.

Nếu chiều dài của gốc axyl tăng lên trên 4 nguyên tử

c

thì nó sẽ được hấp phụ tĩnh

G

điện lên vùng v4. Khi đó phân tử sẽ bị quay đi một góc làm thay đổi không gian lập thể của
phân tử cơ chất vì thế tốc độ phản ứng bị giảm đi

[-)

1.1hoạtcho
động
theo liên
Webb
S ơ đ ồ ỉ Hình
.ì : C
ơ c Mô
h ế Ahình
N A E tâm
xúc tác
phảncủa
ứngANAE
thuỷ phân
kết este Như vậy
dó :thuỷ phân diễn ra tại trung tâm hoạt động trên hai axit amin là His và Ser
quá trìnhTrong
xúc tác
Vcòn
Ị ' . Vùng
lực axit
với amin
liên kết
V 2 : Tâm

có ái lực với liên kết este;
Asp làáimột
có ankyl;
vai trò định hướng
phân hoạt
tử Hđộng
2 0 vào vị trí thích hợp cho quá
trình tương tác với gốc axyl-His.

16


Còn Jones đưa ra mô hình tâm hoạt động được biểu diễn theo không gian

Hình ỉ .2- Mô hình tâm hoạt động theo Jones Trong đó : Hị! Vùng ái
lực kị nước lớn; H s : Vùng ái lực kị nước nhỏ. p f : Vùng án ngữ không gian cực trước;
P B : Vùng án ngữ không gian cực sau. Ser: axit amin serin nằm trong trung tâm hoạt
động.

Vùng Hị là vùng dành cho tương tác điện giữa enzym và nhóm ankyl. Còn vùng H s
là vùng tương tác điện giữa enzym và gốc axyl. Chính vì có cấu trúc tâm hoạt động như vậy
nên phân tử cơ chất có khả năng liên kết thuận lợi khi các gốc ankyl có cấu trúc lớn còn gốc
axyl thì nhỏ. ỉ.2.1.2- Điều kiện tối ưu:

vể cơ chất : ANAE có thể thuỷ phân được khoảng 19 cơ chất khác nhau: pnitrophenylaxetat, a và P-naphtylaxetat... Ái lực của ANAE đối với các cơ chất này là rất
khác nhau và phụ thuộc vào các isoenzym. ANAE-A trong microsom của tế bào gan có ái
lực thấp đối với p-nitrophenylaxetat Km vào khoảng 25 nmol. Còn cũng với cơ chất này thì
ANAE-B có ái lực khá cao Km tới 400 I^mol [168, 185]. Tuy vậy trong sô các cơ chất
nhuộm ANAE theo phương pháp tạo phẩm màu azo thì a-naphtol axetate phù hợp để phát
hiện nhiều isoenzym của ANAE nhất. Sở dĩ như vậy là vì gốc ancol tạo ra sau khi thuỷ phân

có tính tan thấp và có tính đặc hiệu cao với nhóm enzym ANAE. Trong các nhóm thế axyl
của a-naphol thì ANAE-1 có ái lực đối với propionate cao hơn so với axetat, butyrat và
hexonat [171].

18


về nhiêj đô : dải nhiệt độ của ANAE hoạt động khá cao từ 35-60° thậm chí G Manco
và c.s đã phát hiện một ANAE trong vi khuẩn Bacillus có khả năng hoạt động tối ưu ở nhiệt
độ rất cao đến 70° c. [102]

1.2.2- Các chất ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác cho phản ứng thuỷ phân liên
kết este của ANAE
Việc phát hiện các chất ức chế không những giúp tìm hiểu nguyên lý hoạt động,
phân loại ANAE mà còn giúp tìm ra các chất độc đối với hoạt động của enzym trong cơ thể.
ANAE bị ức chế bởi nhiều chất hoá học khác nhau [190]. Nhiều chất ức chế ngoài việc làm
mất hoạt tính còn làm mất hoặc bất hoạt được tính kháng nguyên trong các phản ứng miễn
dịch của ANAE [187, 190]. D Patel và c.s (1991) đã tìm ra 17 chất ức chế khác nhau đối với
ANAE của bạch cầu mà chủ yếu là hợp chất photpho hữu cơ và hợp chất của flo. Cơ chế của
sự ức chế này phụ thuộc chủ yếu vào sự tương tác cạnh tranh giữa cơ chất và chất ức chế tại
tâm hoạt động [125]. Các chất ức chế ANAE có thể phân loại ra một số loại chính sau đây:

1.2.2.1- Các hợp chất flo:
Có rất nhiều công trình công bố về các dẫn chất có flo gây ức chế ANAE [25, 36,
75]. Trong các isoenzym của ANAE thì loại A bị ức chế bởi phenylmethylsunfonyl floride

( P M S F ) - sản phẩm thuỷ phân của parathion và cresylbenzodioxaphotphorin oxit còn gọi
là paraoxon - với nồng độ rất thấp IC50 vào khoảng 100 nmol/ml. Còn loại B thì chỉ bị ức
chế ở nồng độ PMSF khá cao IC50 vào khoảng 100 |ig/ml [168]. Theo Pophof thì cơ chế của
sự ức chế này là do cơ chế tương tác tĩnh điện đẩy nhau giữa cơ chất và hợp chất của flo

hoặc giữa yếu tố tiếp nhận của phân tử với vùng tâm hoạt động [132].

1.2.2.2- Các dẫn chất của photpho hữu cơ:
Về mặt hoá học thì đó là một nhóm chất mà trong phân tử của nó có chứa ion
photpho hoá trị 5 liên kết trực tiếp với các gốc hữu cơ hoặc thông qua nguyên tử oxy. Đây là
một phản ứng ức chế cạnh tranh giữa cơ chất và hợp chất có chứa photpho hữu cơ [36]. Quá
19


trình ANAE xúc tác cho phản ứng thuỷ phân cơ chất là quá trình thuận nghịch, enzym sau
khi tham gia vào phản ứng thuỷ phân tiếp tục quay trở lại xúc tác cho phân tử cơ chất tiếp
theo. Đời sống của ANAE càng kéo dài thì khả năng xúc tác của enzym càng lớn. sản phẩm
phản ứng, các chất hoá học và các yếu tố vật lý không thuận lợi thường là các yếu tố gây ức
chế làm giảm đời sống của enzym.
R, -o
o
\^p/\YX

R, -O

A

Ọ
+ HX

R 2 -Y
Phospho hữu cơ

\4
Mất hoạt tính

+ ANAE.H

o
R, - c

o

- ANAE +

R Ị COOH

R 2 OH

Sơ đồ 1.2: Cơ chế của sự ức chếANAE xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết este Trong
đó: Rj, R 2 : là các gốc ankyl; Y: -O, -C ; X: -CN, -F, -0C 6 H 4 N0 2 . Trong những năm gần đây
có rất nhiều cổng trình công bố về các hợp chất photpho hữu cơ gây ức chế ANAE in vitro
và in vivo [66, 100, 151, 163, 180, 190]. Các hợp chất được tập trung nghiên cứu nhiều nhất
là: parathion, tri - o - tolyl photphat, dietyl 4-nitrophenyl este của axit photphoric, o,odialkyl-s- bromethiophotphat, p,p-diphenyletylphotphonic...

AP Brestkin và c.s cho rằng quá trình ức chế ANAE phụ thuộc vào cấu trúc của gốc
ankyl và trọng lượng phân tử của hợp chất photpho hữu cơ [25]. Hầu hết các hợp chất này là
các chất độc. Bằng thực nghiệm trên chuột Nagy và c.s (2000) đã chứng minh diisopropyl
florophotphat gây ức chế hoạt động của ANAE, làm giảm khả năng thải độc đối với chất độc
2-pyrrolino-doxorubixin [116]. Ngoài ra parathion sau khi vào cơ thể gây ức chế ANAE làm
ngăn cản sự dẫn truyền của hệ thần kinh trung ương. Chính vì thế parathion thường được
dùng trong các thuốc bảo vệ thực vật. RD Newcomb và c.s (ỉ 997) đã cho rằng sự kháng
thuốc trừ sâu có chứa photpho hữu cơ luôn đi kèm với sự giảm hoạt tính của ANAE trong
các loài này.

20


Nguyên nhân của sự giảm này là do đột biến trong mã di truyền tại vùng tâm hoạt
động và Gly]37 đã thay thế cho Asp]37. Đặc biệt có rất nhiều công trình báo cáo cho rằng
ANAE có vai trò quan trọng gây ra hiện tượng kháng thuốc diệt muỗi của các loại muỗi
truyền bệnh sốt rét [29, 118, 148, 187, 188]. Ngược lại với các loại sâu thì nồng độ của
ANAE trong muỗi lại tăng cao, sự tăng này do hiệu ứng cảm ứng sự kích thích tổng hợp
ANAE nhằm bảo vệ cơ thể muỗi [28]. AJ Ketterman và c.s ( 1 9 9 2 ) căn cứ vào hệ số động
học của tốc độ thuỷ phân liên kết este ANAE ở muỗi đối với 4 loại thuốc diệt muỗi là
temephos, clorpyriíbs, ĩenitrothion và propoxur, tác giả cho rằng ái lực của liên kết giữa
ANAE với các chất này đóng vai trò quyết định trong việc đào thải các thuốc diệt muỗi và
tính kháng thuốc [81, 131].

1.2.2.3- Các hợp chất khác:
EDTA cũng là một chất ức chế mạnh đối với một isoenzym của ANAE là hCE-A
phụ thuộc canxi vì vậy máu thu thập có chất chống đông là EDTA sẽ làm giảm hoạt tính của
ANAE [163]. T Purshottam và c.s (1992) khi sử dụng soman với liều LD50 (0,22mglỉkg)
thấy rằng sau 30 phút ANAE trong huyết thanh bị ức chế hoàn toàn, trái lại ANAE trong tế
bào gan lại hầu như không bị ảnh hưởng [135]. Ngoài ra các kim loại nặng cũng là những
chất ức chế đối với ANAE. Đặc biệt các ion kim loại này thường đi kèm với muối điazo để
làm tăng tính bền của muối vì vậy khi chọn muối điazo cần hết sức chú ý đến các ion kim
loại tạo phức với các muối này.

1.3- CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ANAE
Có hai phương pháp chính xác định ANAE: phương pháp phá vỡ màng tế bào và
phương pháp không phá vỡ màng tế bào. Mỗi phương pháp có những ưu và nhược điểm
riêng. Mỗi phương pháp đòi hỏi những trang thiết bị thích hợp. Vì vậy tuỳ vào mục đích
nghiên cứu, ứng dụng mà người ta sử dụng phương pháp nào cho thích hợp. Trong thực tế
nghiên cứu enzym người ta thường sử dụng cả hai phương pháp, chúng bổ sung cho nhau từ

đó có thể thu được kết quả tổng quan và toàn diện hơn về enzym.

21


Sơ đồ 1.3 dưới đây sẽ trình bày một cách tổng quát nhất về vai trò, ứng dụng cua hai
phương pháp phân tích này:

Sơ đồ 1.3: Các phương pháp xác định ANAE
1.3.1- Phương pháp phá vỡ tẽ bào
Là phương pháp xác định ANAE bằng cách phá vỡ tế bào từ đó thu được các dịch
bào tương hay các mảnh bào quan như: màng tế bào, lưới nội nguyên sinh chất, bộ máy
golgi, lysosom... Trước hết người ta tách tế bào định nghiên cứu bằng các phương pháp ly
tâm tỷ trọng hay tách bằng các phương pháp tách đặc hiệu cho từng

22


dòng tế bào nhằm thu được tế bào nghiên cứu thuần nhất. Để tách bạch cầu thì người ta
thường dùng bông thuỷ tinh, còn tách bạch cầu monocytes thì tốt nhất là dùng ống plastic
bẹt và ly tâm trong dung dịch Percoll và NaCl 1,5 mol.r' với tỷ trọng 1,033 tới 1,050 [74,
104]. Sau đó phá vỡ màng tế bào bằng nước cất hoặc nhiệt độ đông lạnh tức là đưa tế bào
vào nhiệt độ âm sau đó đưa nhanh lên nhiệt độ cao mà ở đó enzym còn giữ nguyên được cấu
trúc. Tiến hành ly tâm tỷ trọng hoặc kết tủa các microsome bằng aceton sẽ thu được dịch
bào tương, các bào quan, hoặc các mảnh tế bào [165, 166]. Dịch bào tương có thể tiến hành
phân tích định lượng ANAE ngay hoặc được tiếp tục tinh chế để thu ANAE tinh khiết. Đối
với các mảnh bào quan tiến hành phá vỡ màng bào quan ta thu được dịch chứa các enzym
hay các mARN. Tinh khiết các enzym hoặc mARN này bằng các phương pháp sắc ký lỏng
cao áp hoặc sắc ký phân bố [63]. Một kỹ thuật tinh khiết enzym thường hay được sử dụng là
phương pháp sắc ký tương tác kỵ nước hay sắc ký ái lực với xanh Cibacron [146]. Thang độ

tinh khiết thường được đo bằng kỹ thuật quét gel đo tỷ trọng (demitometric gel scanning
assay) [169]. Sau khi thu được enzym thì tiến hành xác định enzym bằng các kỹ thuật phân
tích enzym. Có nhiều phương pháp phân tích enzym và mỗi phương pháp thu được các khía
cạnh khác nhau về enzym.

Phương pháp phân tích quang phổ:
Đây là phương pháp phổ biến dùng để nghiên cứu định lượng, động học, ức chế và
hoạt hoá enzym. Các phương pháp quang phổ như: Phổ khối, phổ huỳnh quang, phổ hấp thụ,
phát xạ được sử dụng rộng rãi vào việc phân tích ANAE. Có rất nhiều loại cơ chất dùng để
xác định ANAE bằng phương pháp phân tích quang phổ. M Hosokawa và c.s (1995) đã tìm
được 10 loại cơ chất khác nhau dùng để xác định các ANAE trong microsome của tế bào
gan [68]. Người ta thường dùng các cơ chất phổ biến như: naphtol axetat, các dẫn xuất của
phenyl benzoates, isocacboxazid, palmitoyl coenzym A... [19]. L Sreerama và c.s (1994) đã
phát triển một kỹ thuật phân tích các isoenzym ANAE bằng phương pháp dùng các chất ức
chế dựa trên nguyên lý quan sát điểm gẫy tại vị trí IC50 của đường cong động học. Với kỹ
thuật này đã cho phép tác giả phân biệt được hầu hết các isoenzym của ANAE [156].

23


Cơ chất để xác định ANAE thường được dùng là a-naphtylaxetat.

- Kỹ thuật phân tích phổ phát xạ: là một phương pháp có độ nhạy cao. Cơ chất
thường được sử dụng để xác định ANAE là beclomethasone-17,21- dipropionate. Sau khi bị
thuỷ phân tạo sản phẩm cuối cùng là beclomethason-17- monopropionate [96J.

- Kỹ thuật đo phổ huỳnh quang: phương pháp này đặc biệt hay được sử dụng trong y
tế nhằm phân tích và theo dõi các enzym thuỷ phân thuốc nói chung và ANAE nói riêng. Các
enzym này khi thuỷ phân thuốc thường làm thay đổi pH của môi trường phản ứng. Các thuốc
thử huỳnh quang nhạy cảm với pH như 2',7'- bis(cacboxyetyl)-5(6)-cacboxyflorescein

thường được lựa chọn làm chất chỉ thị pH vì nó phù hợp pKa đối với các nghiên cứu trong
điều kiện sinh lý của cơ thể con người và không ảnh hưởng tới hoạt động thuỷ phân của
enzym. Quá trình đo phổ được tiến hành ở bước sóng nhỏ hơn 442 nm [144].

-Phươns pháp điên di:
Chủ yếu được sử dụng để định lượng và phân tích các isoenzym và xác định trọng
lượng phân tử [76, 148, 172]. Có nhiều phương pháp điện di khác nhau như: điện di trên
giấy, điện di trên hồ tinh bột, polyacrylamit (7%)... Các hệ đệm điện di thường được sử dụng
là hệ đệm tris-boric, tris-glycin. Đây là một phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao.
SM Gignac và c.s ị1991) đã tách dải isoenzym ANAE đặc hiệu của tế bào monocytes và dải
này có độ nhạy với tỷ lệ monocytes trong tế bào máu tới 1% [58]. Nhưng đều theo nguyên lý
chung là ANAE mang điện tích âm trong môi trường điện chúng di chuyển về cực dương và
bị tách thành nhiều vạch do điểm đẳng điện khác nhau. Như phần trên đã đề cập vùng đẳng
điện của ANAE trong bạch cầu nằm từ 5,5-6,1. Việc xác định điểm đẳng điện thường dựa
vào các chất chuẩn. Sau khi điện di xác định enzym bằng các cơ chất đặc hiệu và phản ứng
lên màu. 5-bromoindoxyl axetat, naphtyl AS axetate kết hợp với muối điazo là những cơ chất
thích hợp với phương pháp này [140]. Tuỳ theo cường độ màu mà có thể xác định được hàm
lượng của enzym.
24