BÁO cáo MIỄN DỊCH học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

BÁO CÁO MIỄN DỊCH HỌC

PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HỌC
(NGUYÊN LÝ- GIỚI THIỆU MỘT VÀI PHẢN ỨNG
MIỄN DỊCH HỌC)
MÃ SỐ HỌC PHẦN: NN112

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN:

PGs. Ts. TRẦN NGỌC BÍCH

1. Lê Thị Mỹ Phượng

B1303709

2. Phan Ngọc Thảo

B1303850

3. Bùi Thị Yến Nhi

B1303823

4. Nguyễn Thị Ngọc Mai

B1303807

5. Nguyễn Ngọc Thanh Vy

B1303759

6. Lê Duy Thống

B1203163

7. Huỳnh Thị Kim Tuyền

B1308946

Cần Thơ, Tháng 04/2015


LỜI MỞ ĐẦU
Phương pháp huyết thanh học giúp ta phát hiện kháng nguyên hoặc kháng thể trên
cơ sở phát hiện sự hình thành tổ hợp kháng nguyên - kháng thể khi trộn một thành phần
đã biết (kháng nguyên hoặc kháng thể) với một dịch nghi có chứa yếu tố kia (kháng thể
hoặc kháng nguyên). Phát hiện kháng nguyên trong bệnh phẩm chứng tỏ con vật bị cảm
nhiễm mầm bệnh có kháng nguyên tương ứng. Tuy nhiên, phản ứng phát hiện kháng
nguyên thường có độ nhạy thấp và khó có được bệnh phẩm thích hợp đặc biệt khi động
vật còn sống. Vì vậy, người ta thường vận dụng phản ứng phát hiện kháng thể. Phản ứng
này có nhược điểm là khó giải thích kết quả phản ứng. Kết quả dương tính thường nói
rằng trong quá khứ cơ thể động vật đã tiếp xúc với kháng nguyên tương ứng vừa có thể
do cảm nhiễm tự nhiên, vừa có thể do đã được tiêm phòng. Như vậy, ngay cả khi đã loại
trừ trường hợp đáp ứng miễn dịch do vacxin thì nếu giết hủy hay loại thải những con vật
kháng thể dương tính thì vẫn có thể là lạm sát. Tuy nhiên, trong trường hợp bệnh tiến
triển nếu lấy máu kiểm tra kháng thể hai lần mà thấy có sự gia tăng lượng kháng thể

chứng tỏ bệnh do mầm bệnh tương ứng đang tiến triển. Về mặt kỹ thuật mặc dù nguyên
tắc của phản ứng kháng nguyên - kháng thể là đơn giản, nhưng tổ hợp kháng nguyên kháng thể được hình thành thường khó phát hiện nếu không có những thủ thuật thích hợp.
Chính vì vậy, xuất hiện những phương pháp phân tích khác nhau. Có thể nói, mỗi phương
pháp là một thủ thuật phát hiện tổ hợp kháng nguyên - kháng thể. Ngoài ra, các phản ứng
định lượng (thường bán định lượng) như xác định hiệu giá kháng thể có ý nghĩa quan
trọng trong đánh giá đáp ứng miễn dịch tập đoàn. Do đó, những ứng dụng của phản ứng
miễn dịch học hiện nay đang được sử dụng phổ biến.


Mục lục

PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HỌC
1 Quy luật chung của phản ứng
1.1 Khái niệm
Phản ứng miễn dịch hay còn gọi là phản ứng kháng nguyên- kháng thể. Phản ứng
kháng nguyên- kháng thể là phản ứng cơ bản nhất của miễn dịch học. Phản ứng nói lên sự
kết hợp kháng nguyên- kháng thể là một trường hợp cụ thể của sự tác động tương hỗtương ứng của kháng nguyên- kháng thể. Khả năng chính xác của phản ứng này rất cao,
nó có thể phân biệt được các dạng protein gần nhau về chủng loại, cũng như các hóa chất
giống nhau về hình dạng, về phân tử lượng hoặc phát hiện được ở tỉ lệ kháng thể vô cùng
nhỏ (ở tỉ lệ pha loãng 10-4).
Ở in vivo, nó là nguyên nhân của mọi hiện tượng bảo vệ cũng như phản vệ.
Ở in vitro, nó là cơ sở của rất nhiều thử nghiệm dùng để phát hiện kháng nguyên,
kháng thể hoặc cả kháng nguyên - kháng thể, là cơ sở để phân loại sinh học hoặc vi sinh
học trong y học, nông học...
1.2 Cơ chế của phản ứng miễn dịch học
Phản ứng kháng nguyên- kháng thể là sự kết tương ứng của 2 thành phần cơ bản là
kháng nguyên và kháng thể. Phản ứng xảy ra trong các điều kiện nhất định như: nhiệt độ,
các muối của môi trường, cơ thể, các chất bổ trợ, sự chuyển động của các phân tử...Kết
quả là kháng nguyên- kháng thể lên kết chặt chẽ với nhau nhờ các lực lý- hóa của phân tử
kháng nguyên và kháng thể. Song phản ứng này có thể xảy ra ở trạng thái hoàn nguyên.

KN + KT
KN---KT
Phản ứng kết hợp KN-KT có thể xảy ra theo 2 giai đoạn khác nhau:
- Sự liên kết đặc hiệu của kháng nguyên-kháng thể.
- Hình thành phức hợp KN-KT có thể trực tiếp hoặc gián tiếp nhìn thấy được.
3


Sự liên kết giữa kháng nguyên với kháng thể luôn mang tính đặc hiệu cao. Tính đặc
hiệu này tương tự như giữa enzyme với cơ chất, nghĩa là khớp với nhau như khóa với
chìa.

Kháng thể không thể liên kết toàn bộ với kháng nguyên mà chỉ một phần nhất định
của kháng nguyên gọi là quyết định kháng nguyên hay epitope. Kích thước của epitope
khoảng 7x12x35 Ao gồm 5-7 acid amin. Phần tương ứng của nó trên mỗi kháng thể gọi là
vị trí kết hợp kháng nguyên hay là paratope. Mỗi epitope chỉ gắn đặt hiệu với mỗi
paratope của kháng thể và chỉ sinh ra một dòng kháng thể đặc hiệu. Một kháng nguyên có
nhiều epitope khác nhau sẽ tạo thành nhiều dòng kháng thể khác nhau tương ứng với từng
epitope.

Hình 1. Phức hợp kháng nguyên- kháng thể

4


Hình 2. Kháng nguyên với một epitope

Hình 3. Kháng thể với các epitope khác nhau
Về mặt kỹ thuật mặc dù nguyên tắc của phản ứng kháng nguyên - kháng thể là đơn
giản, nhưng tổ hợp kháng nguyên- kháng thể được hình thành thường khó phát hiện nếu

không có những thủ thuật thích hợp. Chính vì vậy, xuất hiện những phương pháp phân
tích khác nhau. Có thể nói, mỗi phương pháp là một thủ thuật phát hiện tổ hợp kháng
nguyên- kháng thể.
1.3 Phân loại phản ứng miễn dịch học
Người ta chia phản ứng huyết thanh học làm 2 nhóm:
- Nhóm thứ nhất: phát hiện kháng thể nhờ kháng nguyên đã biết.
- Nhóm thứ hai: phát hiện kháng nguyên nhờ kháng thể đã biết.
Trong từng nhóm người ta lại chia thành loại đơn giản (có 2-3 thành phần tham gia)
và loại phức tạp (có trên 3 thành phần tham gia).
5


1.3.1 Nhóm phản ứng loại đơn giản
a. Loại 2 thành phần
KN + KT
KN---KT
Phản ứng nhìn thấy được, đánh giá được gọi là phản ứng đơn giản trực tiếp, ví
dụ như phản ứng HA (Haemagglutination). Trường hợp một thành phần phải gắn trên
chất khối (hồng cầu) mới cho phép ta quan sát, được gọi là phản ứng đơn giản gián tiếp,
ví dụ như phản ứng HA gián tiếp.
Trong phản ứng 2 thành phần chỉ có kháng thể hoàn toàn (hóa trị 2) và kháng
nguyên hoàn toàn (đa hóa trị) thì kết quả của phản ứng mới có khả năng tạo ‘lưới’- nhìn
thấy được. Còn nếu 1 trong 2 thành phần không có hóa trị hoàn toàn thì phản ứng sẽ
không tạo lưới- không quan sát trực tiếp được.

b. Loại 3 thành phần
Chia làm 2 nhóm
- Nhóm 1 :
Sự kết hợp giữa kháng nguyên- kháng thể là kết quả của phản ứng không nhìn
thấy được, buộc chúng ta phải đọc kết quả gián tiếp theo sự tác động của kháng nguyên

với hệ thống chỉ thị (động vật thí nghiệm, phôi gia cầm, môi trường thay đổi pH). Điển
hình của nhóm phản ứng này là phản ứng trung hòa để xác định đặc tính của mầm bệnh
(vi khuẩn, virus) hoặc sản phẩm của chúng (độc tố).
- Nhóm 2:
Kháng nguyên và kháng thể kết hợp với nhau cũng không nhìn thấy được, kết
quả phản ứng được đánh giá theo thành phần thứ 3. Thành phần khi kết hợp trước với
kháng nguyên hoặc kháng thể sẽ làm mất đi sự biến đổi nhìn thấy được. Điển hình của
nhóm phản ứng này là các phản ứng loại ức chế ngưng kết hồng cầu HI
(Haemagglutination Inhibition).
1.3.2 Nhóm phản ứng loại phức tạp
Thường được dùng để phát hiện kháng nguyên hoặc kháng thể không hoàn
toàn. Khi tiến hành phản ứng chúng ta phải dùng nhiều thành phần, nhiều hệ thống phản
ứng mới phát hiện được kháng nguyên hoặc kháng thể. Điển hình là phản ứng kết hợp bổ
thể, phản ứng miễn dịch huỳnh quang.
Sự kết hợp kháng nguyên, kháng thể nhờ các lực sau:
- Lực hút phân tử (Vander Waals).
- Lực Coulomb (lực hút tỉnh điện giữa 2 nhóm ion trái dấu).
- Lực hút giữa các phân tử đồng hóa trị (S-S)
- Lực liên kết cầu nồi hydro của nhóm OH.
6


Trong phản ứng huyết thanh học thì những chất có cấu tạo bề mặt tương đối
giống nhau thường cho các liên kết giống nhau (trong các phản ứng chéo).
1.4 Tác động sinh học
Là phản ứng bảo vệ cơ thể
Mặt có lợi: loại bỏ các mầm bệnh, độc tố, các yếu tố lạ xâm nhập vào cơ thể hoặc
các chất của chính cơ thể bị biến đổi đi
Mặt có hại: phản ứng gây nên các bệnh lý miễn dịch. Đôi khi do phản ứng miễn dịch
mà cơ thể từ chối cả những yếu tố có lợi cho bản thân.

2 Các phản ứng miễn dịch học thường dùng trong chẩn đoán bệnh
2.1 Phản ứng ngưng kết
2.1.1 Khái niệm
Là phản ứng liên kết các tiểu thể có kích thước nhỏ (tính bằng Micromet)
thành một cấu trúc lớn quan sát được bằng mắt thường.
Ở đây, kháng nguyên là một cấu phần nằm trên bề mặt tiểu thể.
2.1.2 Các loại phản ứng ngưng kết
a. Phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính
Đây là phản ứng có tính chất định tính, cho kết quả sơ bộ. Thường sử dụng
kháng nguyên đã biết được nhuộm màu để phát hiện kháng thể tương ứng trong huyết
thanh. Thường dùng để chẩn đoán bệnh truyền nhiễm.
Ví dụ: Bệnh thương hàn gà Typhus avium
CRD (Chromic Respiratory Disease)

Hình 4
Phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính
7


Cách làm:
+ Dùng một phiến kính, một bên thí nghiệm, một bên đối chứng.
+ Bên thí nghiệm nhỏ 1 giọt huyết thanh cần chẩn đoán, sau đó nhỏ 1 giọt
kháng nguyên đã biết  trộn đều, sau 1- 2 phút đọc kết quả.
+ Nếu trong huyết thanh có kháng thể tương ứng  kháng nguyên + kháng
thể tạo thành đám ngưng kết.
b. Phản ứng ngưng kết chậm trong ống nghiệm
Phản ứng vừa có tính chất định tính, vừa có thể định lượng kháng thể, cho kết
quả tương đối chính xác.
Cách làm:

Dùng một loạt ống nghiệm, cho vào ống thứ nhất một lượng huyết thanh, rồi
pha loãng huyết thanh theo cơ số 2 (1/2; 1/4; 1/8...) hoặc theo cơ số 10. Sau đó cho vào
mỗi ống nghiệm một lượng kháng nguyên (lượng kháng nguyên tương đương với lượng
kháng thể). Trộn đều để ở nhiệt độ thích hợp (tủ ấm 37oC) sau 30 phút hoặc vài giờ, đọc
kết quả và tính được hiệu giá ngưng kết.
Hiệu giá ngưng kết: Là độ pha loãng cao nhất của huyết thanh mà ở đó vẫn
còn khả năng gây hiện tượng ngưng kết.
Phản ứng này thường được sử dụng để chẩn đoán bệnh xảy thai truyền nhiễm.

8


Hình 5
Phản ứng ngưng kết nhanh trong ống nghiệm
c. Phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động
Trong phản ứng ngưng kết, khi dùng kháng nguyên hoà tan để phát hiện một
kháng thể tương ứng phải cần đến tế bào mang làm giá đỡ, mang các phân tử kháng
nguyên hoà tan.
Thường dùng hồng cầu làm tế bào mang.
Nguyên lý:
- Kháng nguyên hoà tan trở thành kháng nguyên hữu hình bằng cách gắn
kháng nguyên hoà tan vào hồng cầu, như vậy hồng cầu làm giá đỡ cho kháng nguyên.
Phản ứng ngưng kết dễ dàng xảy ra.
- Có nhiều phương pháp gắn kháng nguyên hoà tan lên bề mặt hồng cầu:
Dùng một số hoá chất như axit tanic, benzidin, muối crom, glutaldehyt để xử lý hồng cầu.
Các chất này có một nhóm chức gắn với hồng cầu, một nhóm gắn với kháng nguyên.
- Khi kháng nguyên gặp kháng thể tương ứng, phản ứng ngưng kết xảy ra, ta
quan sát rõ.
Ngoài sử dụng hồng cầu làm giá đỡ, còn sử dụng các hạt chất dẻo như: hạt
latex, bentonít. Các hạt này có tác dụng hấp phụ kháng nguyên hoà tan vào trong đó.

2.1.3 Ưu, nhược điểm của phản ứng ngưng kết
Ưu điểm: Phản ứng đơn giản, dễ làm, độ nhạy cao, ít tốn kém, được sử dụng
rộng rãi.
9


Nhược điểm: Hay cho phản ứng dương tính giả, khó đạt trình độ chính xác
cao.
2.2 Phản ứng trung hòa
Dựa theo nguyên lý:
“ Phản ứng trung hòa là phản ứng huyết thanh học gián tiếp dựa trên tác động trung
hòa kháng nguyên bằng huyết thanh miễn dịch đặc hiệu. Phản ứng được sử dụng chủ yếu
để xác định các mầm bệnh phân lập được (đặc biệt là virus) hoặc định lượng hàm
lượng huyết thanh miễn dịch trong cơ thể sinh vật cần được chẩn đoán”.
Phản ứng trung hòa : xảy ra khi kháng thể bao vây, trung hòa ngoại độc tố vi khuẩn
hoặc bao vây virus. Kháng thể đặc hiệu có khả năng trung hòa độc tố, độc lực của vi sinh
vật, hoặc làm mất đi một tính chất nào đó của vi sinh vật hoặc sản phẩm của nó.
a. Phản ứng trung hòa độc tố
Độc tố của vi khuẩn khi được vô độc bằng formol thì trở thành giải độc tố, không
còn tính độc nhưng vẫn còn tính kháng nguyên cao, nên người ta thường dùng giải độc tố
làm vắc xin, và khi tiêm cho cơ thể, chúng kích thích cơ thể sinh kháng thể rất tốt. Khi
kháng thể đặc hiệu này gặp độc tố tương ứng chúng sẽ kết hợp và làm cho độc tố đó
không còn hoạt tính nữa hay còn gọi là độc tố đã bị trung hòa.
Huyết thanh chứa kháng thể kháng độc tố được gọi là huyết thanh kháng độc tố và
được sử dụng vào mục đích chữa bệnh. Khi tiêm huyết thanh kháng độc tố vào cơ thể,
nếu gặp độc tố, chúng sẽ kết hợp và trung hòa độc tố đó, đây là phản ứng trung hòa trên
cơ thể.
Nếu cho kháng độc tố (kháng thể đặc hiệu chống độc tố) kết hợp với độc tố tương
đương, thì phản ứng trung hòa sẽ xảy ra, nếu thực hiện in vitro trong ống nghiệm, sẽ thấy
phức hợp miễn dịch này biểu hiện như những cụm bông lơ lửng, vì vậy người ta gọi là

phản ứng lên bông.
b. Phản ứng trung hòa virus
Khi virus bị kháng thể đặc hiệu kết hợp sẽ không còn khả năng gây bệnh nên phản
ứng kết hợp giữa virus với kháng thể được gọi là phản ứng trung hòa virus.
Nguyên lý cơ bản của phương pháp này: trên đối tượng nuôi cấy (phôi gà, động vật
cảm thụ, môi trường tế bào) virus sẽ nhân lên và gây bệnh tích cho các đối tượng trên, còn
khi hỗn hợp virus với kháng thể đặc hiệu tương ứng, chúng sẽ bị trung hòa, không nhân
lên được và không gây bệnh tích.
Nếu pha loãng virus (theo cơ số 10) rồi hỗn hợp với một lượng tương đương huyết
thanh miễn dịch ở mỗi nồng độ, rồi thực hiện phản ứng trung hòa trên các đối tượng trên,
người ta gọi đó là phản ứng trung hòa theo phương pháp virus pha loãng, huyết thanh cố
định. Bằng phản ứng này người ta chuẩn độ được virus.
2.3 Phản ứng kết tủa
10


2.3.1 Nguyên lí chung
Kết tủa chỉ có thể sử dung được khi kháng nguyên hòa tan phản ứng với kháng
thể cũng hòa tan. Hiện tượng kết tủa miễn dịch xảy ra in vitro. Người ta không thể nói có
miễn dịch in vitro với cái nghĩa mà nó được mô tả ở đây. Hiện tượng tủa những phức hợp
phân tử do liên kết KN-KT là do hình thành một mạng lưới ba chiều các kháng nguyên
nối lại với nhau bởi các kháng thể (Marrack 1934).
Việc hình thành mạng lưới kết tủa phải cần nhiều điều kiện như sau:
- Kháng thể phải có ít nhất hai hóa trị (các mãnh Fab của kháng thể còn một
hóa trị nên không có khả năng này).
- Kháng nguyên phải đa hóa trị (các hapten không kết tủa được).
- Tính chất của kháng nguyên (chủ yếu là tính hòa tan) và thành phần của môi
trường (lực ion và pH) có vai trò nhất định trong việc xảy ra hiện tượng kết tủa.
- Các kháng thể IgG chỉ có chứa 3% glucid, là những chất gây kết tủa tốt nhất
còn kháng thể IgM chứa tới 10% nên dễ hòa tan hơn và ít gây kết tủa.

- Các kháng nguyên-kháng thể càng to thì càng dễ tủa.
2.3.2 Kết tủa trong môi trường lỏng
Phương pháp Heidelberger và Kendall
Lần đầu tiên phương pháp này cho phép định lượng một phản ứng miễn dịch,
đến nay vẫn còn được dùng để giải thích hiện tượng tủa tại sao khi xuất hiện khi không,
đó là do thay đổi tỉ lệ nồng độ tương đối giữa kháng nguyên và kháng thể. Trong một loạt
ống thí nghiệm.
2.4 Phản ứng kết hợp bổ thể
Phản ứng kết hợp bổ thể thực hiện được nhờ hai hệ thống: hệ thống dung khuẩn và
hệ thống dung huyết với sự tham gia của bổ thể, bởi vì hiện tương dung khuẩn không thể
quan sát được bằng mắt thường,do đó phải dùng hệ thống dung huyết để đánh giá kết quả.
Các bước tiến hành thí nghiệm:
- Cho hệ thống dung khuẩn (hệ thống 1) và ống nghiệm trước, gồm có kháng
nguyên đã biết và huyết thanh con vật cần chẩn đoán đã đun cách thủy lên 56o C trong 30
phút để diệt bổ thể, sau đó cho tiếp tục vào ống nghiệm một lượng bổ thể đã được chuẩn
độ vừa đủ lượng cần thiết (thường dùng huyết thanh tươi chuột lang) ủ ở 37o C trong vòng
20-30 phút.
- Sau đó cho tiếp tục vào ống nghiệm hệ thống hai (hệ thống dung huyết) gồm có
hồng cầu và huyết thanh miễn dịch chống hồng cầu cừu đã được đun 56 o C trong 30 phút
để diệt bổ thể, ủ tiếp cả hai hệ thống ở 37o C trong 20-30 phút rồi đọc kết quả.
- Đọc kết quả:
+ Nếu ở hệ thống 1 (hệ thống dung khuẩn), kháng nguyên và kháng thể tương ứng,
thì sự kết hợp kháng nguyên kháng thể sẽ chiếm lấy bổ thể, không còn bổ thể cho hệ
11


thống 2, nên không có sự dung huyết, hồng cầu đóng thành cục tròn dưới đáy ống
nghiệm. Phản ứng dương tính (tức con vật có kháng thể tương ứng với kháng nguyên).
+ Nếu ở hệ thống 1 không có sự kết hợp kháng nguyên kháng thể do trong huyết
thanh không có kháng thể tương ứng, thì bổ thể sẽ không được dùng cho hệ thống 1, bổ

thể còn sẽ tham gia vào hệ thống 2 làm tan hồng cầu, tạo nên huyễn dịch có màu đỏ. Phản
ứng âm tính (tức là trong huyết thanh không có kháng thể tương ứng).
2.5 Phản ứng KN- KT dùng kỹ thuật đánh dấu
Trong nhiều trường hợp để phát hiện phức hợp kháng nguyên kháng thể cần phải sử
dụng một số kỹ thuật mới nhìn thấy được. Người ta thường dùng những kỹ thuật sau đây:
- Phản ứng miễn dịch huỳnh quang: dùng thuốc nhuộm huỳnh quang để nhuộm
kháng thể rồi cho kết hợp với kháng nguyên (trực tiếp hoặc gián tiếp) và phát hiện phức
hợp kháng nguyên kháng thể bằng kính hiển vi huỳnh quang.
- Phản ứng miễn dịch đánh dấu enzyme hay gọi là phản ứng ELISA..
2.5.1 Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (Immuno-fluorescent test)
Dùng chất đánh dấu là thuốc nhuộm huỳnh quang (khi hấp thụ 1 ánh sáng có
bước sóng nhất định sẽ phát ra 1 ánh sáng có bước sóng dài hơn).
Nguyên lý:
Khi kháng thể hoặc kháng kháng thể được nhuộm màu bằng thuốc nhuộm
huỳnh quang rồi cho kết hợp với kháng nguyên cần chuẩn đoán, thì phức hợp kháng
nguyên-kháng thể khi soi dưới kính hiển vi huỳnh quang sẽ phát sáng.
Các loại thuốc nhuộm huỳnh quang:
- Fluorescent Isothiocyanat: cho màu xanh lục.
- Rodamin: màu đỏ gạch.
- Lixamin- Rodamin B (RB200): đỏ→ vàng da cam.
Thuốc nhuộm huỳnh quang phải đạt các tiêu chuẩn:
- Không làm tổn thương tới tính sinh miễn dịch của kháng thể.
- Kết hợp với kháng thể một cách bền vững.
- Với một lượng ít nhưng có màu sắc rõ rệt.
- Thuốc dễ sử dụng và dễ phân biệt với các màu khác.
Có 2 phương pháp: trực tiếp và gián tiếp

a. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
Trong phản ứng này thường dùng kháng thể đặc hiệu nhuộm màu để phát hiện
kháng nguyên chưa biết.

Nguyên lý: Làm tiêu bản với bệnh phẩm cần chuẩn đoán, cố định để kháng
nguyên gắn chặt lên phiến kính, sau đó cho một giọt kháng thể đặc hiệu đã nhuộm thuốc
12


nhuộm huỳnh quang lên tiêu bản, để tác động một thời gian (khoảng 30 phút), sau đó rửa
nước, để khô rồi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (ánh sáng tia tử ngoại).
Đọc kết quả:
- Phản ứng dương tính: Có hiện tượng phát sáng do có sự kết hợp kháng
nguyên kháng thể.
- Phản ứng âm tính: Không có hiện tượng phát sáng do kháng thể không tương
ứng với kháng nguyên thì sẽ không có kết hợp kháng nguyên- kháng thể, khi rửa nước
kháng thể sẽ bị trôi đi.
b. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
Dùng kháng kháng thể được nhuộm chất phát huỳnh quang để phát hiện kháng
nguyên cần chẩn đoán.
Phương pháp này còn gọi là kỹ thuật 2 lớp với 3 thành phần tham gia:
- Kháng nguyên cần chẩn đoán.
- Kháng thể đặc hiệu .
- Kháng kháng thể đặc hiệu đã nhuộm thuốc nhuộm huỳnh quang.
Trong đó kháng thể đặc hiệu có 2 chức năng:
- Là kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên cần chẩn đoán
- Là kháng nguyên của kháng kháng thể đã đánh dấu (kháng kháng thể là
kháng thể kháng globulin cùng loài).
Phương pháp thực hiện:
- Làm tiêu bản với bệnh phẩm cần chẩn đoán, cố định để kháng nguyên gắn
chặt trên tiêu bản.
- Nhỏ một giọt kháng thể đặc hiệu lên tiêu bản mang bệnh phẩm cần chẩn
đoán, để tác động 10-15 phút rồi rửa nước.
- Nhỏ tiếp 1-2 giọt kháng kháng thể đã nhuộm huỳnh quang, để tác động một

thời gian, rửa nước, để khô rồi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.
- Đọc kết quả:
+ Phản ứng dương tính:
Có hiện tượng phát sáng tức là có phức hợp kháng nguyên+ kháng thể +
kháng kháng thể→ Gia súc có mang mầm bệnh.
+ Phản ứng âm tính:
Không có hiện tượng phát sáng, tức là không có hiện tượng kết hợp kháng
nguyên+ kháng thể+ kháng kháng thể. Bởi vì kháng nguyên và kháng thể không tương
ứng, không có sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể, kháng thể bị rửa trôi → Gia súc
không mang mầm bệnh.
Phương pháp gián tiếp hay được sử dụng vì:

13


- Chỉ cần một lần gắn kháng kháng thể với chất huỳnh quang ta có thể sử dụng
để chẩn đoán nhiều kháng nguyên khác nhau, với điều kiện kháng thể đặc hiệu của chúng
phải được chế trên cùng một loài vật.
- Độ nhạy của phản ứng cao hơn, bởi vì 1 phân tử kháng nguyên có thể bị
nhiều kháng kháng thể bám vào → độ phát quang tăng lên, dễ phát hiện.
2.5.2 Phản ứng miễn dịch đánh dấu enzyme ( ELISA- Enzyme Linked
Immuno Sorbent Assay)
ELISA (Enzym Linked Immuno Sorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để
phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu cần phân tích. Hiện nay ELISA được sử
dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là
trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm thực phẩm.
a. Phản ứng ELISA trực tiếp tìm kháng nguyên
- Cố định kháng thể đặc hiệu vào các giếng của khay nhựa, rửa nước để loại bỏ
kháng thể không gắn. Sau đó cho huyết thanh hoặc huyễn dịch bệnh phẩm (nghi có chứa
kháng nguyên) đã chiết xuất thành dung dịch vào. Để khoảng một giờ, nếu có kháng

nguyên tương ứng chúng sẽ gắn với kháng thể đặc hiệu. Rửa nước để loại bỏ các thành
phần thừa.
- Tiếp tục cho kháng kháng thể đã gắn enzyme vào. Kháng kháng thể sẽ gắn
với kháng nguyên trong phức hợp kháng nguyên-kháng thể ở bước trên. Rửa nước để loại
bỏ các thành phần thừa của phản ứng.
- Tiếp tục cho cơ chất của enzyme vào để một thời gian 20-30 phút.
- Đọc kết quả:
+ Phản ứng dương tính: Có xuất hiện màu tức là có kháng nguyên tương ứng
với kháng thể đặc hiệu. So màu trong quang phổ kế để định lượng mức độ của phản ứng.
+ Phản ứng âm tính: Không có xuất hiện màu tức là không có kháng nguyên
tương ứng với kháng thể nên không có sự kết hợp kháng nguyên-kháng thể và kháng
kháng thể bị rửa trôi.
Phản ứng này tạo ra tập hợp kháng thể-kháng nguyên-kháng kháng thể nên còn
được gọi là phản ứng ELISA. Phản ứng này được sử dụng rộng rãi, đặc biệt trong trường
hợp lượng kháng nguyên quá ít không đủ để phát hiện bằng phương pháp gián tiếp.

14


Rửa nước

Rửa nước

Hình 6. Mô phỏng phản ứng ELISA trực tiếp

b. Phản ứng ELISA gián tiếp tìm kháng thể
Nguyên lý:
Các giếng của khay nhựa được phủ sẵn kháng nguyên. Kháng nguyên phải
được gắn chặt vào khay nhựa sao cho sau khi rửa phải còn một lớp kháng nguyên phủ
trong các giếng. Nhỏ huyết thanh (cần kiểm tra) vào các giếng, nếu trong huyết thanh có

kháng thể đặc hiệu thì kháng thể sẽ kết hợp với kháng nguyên được pha sẵn trong giếng.
Sau khi ủ và rửa để loại bỏ kháng thể không gắn với kháng nguyên, kháng thể đã kết hợp
với kháng nguyên được phát hiện bởi kháng thể đã được gắn enzyme, nhỏ cơ chất của
enzyme làm đổi màu thành phần phản ứng. Độ đậm của màu sắc tỉ lệ thuận với lượng
kháng thể gắn enzyme được gắn với kháng nguyên có trong giếng, tức là tỉ lệ thuận với
lượng kháng thể có trong huyết thanh. Kết quả của phản ứng được xác định bằng mắt
thường hoặc bằng máy đo quang phổ.

15


Hình 7. Minh họa phản ứng ELISA gián tiếp tìm kháng thể
2.5.3 Phương pháp Immunoperoxidase
Enzyme đã được gắn vào kháng thể hoặc kháng kháng thể được sử dụng để
phát hiện kháng nguyên có trong mô bào. Horseradish peroxidase là enzyme được sử
dụng rộng rãi nhất.
Có 2 phương pháp: trực tiếp và gián tiếp.
a. Phương pháp trực tiếp
Tiêu bản mô bào được xử lý bởi kháng thể gắn enzyme. Sau khi rửa, tiêu bản
được ủ với cơ chất enzyme thích hợp. Kháng thể được phát hiện nhờ có sự xuất hiện màu
khi có kết hợp kháng nguyên-kháng thể.
b. Phương pháp gián tiếp
Trong phản ứng này kháng thể được phát hiện nhờ kháng kháng thể được gắn
enzyme.
2.5.4 Phương pháp Western Blotting
Đây là một phương pháp để xác định kháng nguyên trong một hỗn hợp nhiều
loại kháng nguyên. Phương pháp này gồm 3 bước chính:
- Bước 1: Điện di trong gel- acrylamit để tách các peptit hoặc các phân tử
protein riêng biệt nhờ lực điện trường.
- Bước 2: Dùng màng nitroxenluloza thấm lên bản gel để tách các đa peptit ra

khỏi gel đi vào trong nitroxenluloza (giống như dùng giấy thấm), rồi tiếp tục điện di.
- Bước 3: Phát hiện kháng nguyên nhờ phản ứng miễn dịch enzyme.
Màng được ủ trong huyết thanh có chứa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên. Sau
khi rửa, kháng kháng thể gắn enzyme được bổ sung vào và màu sẽ xuất hiện (tại những

16


dãi có chứa kháng nguyên tương ứng với kháng thể) sau khi được gặp cơ chất enzyme
thích hợp.

Hình 8. Mô phỏng phương pháp
Western blotting

2.6 Phương pháp điện di miễn dịch
Đây là phương pháp kiểm tra sự hiện diện kháng thể đặc hiệu virus có bề mặt tích
điện âm mạnh và virus tích điện âm mạnh. Nếu cho kháng nguyên và huyết thanh cần
kiểm được điện di song song trong một bản gel agarose thì nếu trong huyết thanh có
kháng thể đặc hiệu sẽ xuất hiện vết kết tủa ở dãi giữa hai làn điện di. Phương pháp này
thường để kiểm tra bệnh cảm nhiễm virus Aleutian ở chồn mink.

17


TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Trần Ngọc Bích- Hồ Thị Việt Thu (2012). Giáo trình miễn dịch học đại cương. NXB
Đại học Cần Thơ.
2. Lê Huy Kim (1998). Bài giảng miễn dịch học thú y. Khoa nông nghiệp- Đại học Cần
Thơ.
3. Phạm Văn Ty (2001). Miễn dịch học. NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.

4. Miễn dịch học. Trường Đại học Y khoa Hà Nội-Hà Nội (1997)
5. Đỗ Ngọc Liên (1999). Miễn dịch học cơ sở. Đại học Quốc Gia
6. http//:www.benhhoc.com
7. />8. />
18