Phân tích thành phần điện di protein lá của giống đậu tương DT12 nhiễm bệnh gỉ sắt khi xử lý phức đất hiếm

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

DƢƠNG THỊ LỊCH

PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ĐIỆN DI PROTEIN LÁ
CỦA GIỐNG ĐẬU TƢƠNG DT12 NHIỄM BỆNH
GỈ SẮT KHI XỬ LÝ PHỨC ĐẤT HIẾM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2015
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

DƢƠNG THỊ LỊCH

PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ĐIỆN DI PROTEIN LÁ
CỦA GIỐNG ĐẬU TƢƠNG DT12 NHIỄM BỆNH
GỈ SẮT KHI XỬ LÝ PHỨC ĐẤT HIẾM
Chuyên ngành: Di Truyền Học
Mã số: 62 46 01 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Vũ Thanh Trà

THÁI NGUYÊN - 2015
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

LỜI CẢM ƠN
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Vũ Thanh Trà đã
tận tình hướng dẫn và truyền thụ cho tôi kiến thức cũng như lòng say mê khoa
học trong suốt quá trình học tập và thực hiện khoá luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới GS. Chu Hoàng Mậu vì những góp ý quý báu
cho quá trình làm luận văn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ trong Viện Bảo Vệ Thực
Vật đã nhiệt tình dạy bảo, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành
khoá luận.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân - những người
đã luôn động viên, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá
trình học tập và nghiên cứu.
Thái Nguyên, ngày 15 tháng 04 năm 2015
Học viên

Dƣơng Thị Lịch

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

i

/>

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi cùng gióa viên

hướng dẫn. Các nội dung nêu trong luận văn là kết quả làm việc củachúng tôi
và chưa được công bố trong bất cứ một công trình nào khác.
Thái Nguyên, ngày 15 tháng 04 năm 2015
Học viên

Dƣơng Thị Lịch

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

ii

/>

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN............................................................................................. ii
MỤC LỤC ....................................................................................................... iii
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT ......................................................... iv
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ v
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ vi
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 3
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 4
1.1. Cây đậu tương và tình hình sản xuất đậu tương ......................................... 4
1.1.1. Cây đậu tương.......................................................................................... 4
1.1.2. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam ........................ 4
1.2. Bệnh gỉ sắt đậu tương ................................................................................. 6
1.2.1. Lịch sử phát triển bệnh ............................................................................ 6

1.2.2. Triệu chứng .............................................................................................. 7
1.2.3. Tác hại ..................................................................................................... 8
1.2.4. Tác nhân gây bệnh ................................................................................... 8
1.3. Tính kháng của cây và kích thích tính kháng của cây trồng .................... 10
1.3.1. Khái niệm về tính kháng và cơ chế kháng ở cây .................................. 10
1.3.1.1. Khái niệm tính kháng ......................................................................... 10
1.3.1.2. Cơ chế kháng ở thực vật ..................................................................... 10
1.3.2. Kích thích tính kháng ở cây trồng ......................................................... 12
1.4. Tính kháng bệnh gỉ sắt hại đậu tương ...................................................... 15
1.5. Một số nghiên cứu ứng dụng kích thích tính kháng bệnh trên cây trồng . 16
1.5.1. Những nghiên trên thế giới .................................................................... 16
1.5.2. Nghiên cứu ứng dụng kích thích tính kháng bệnh trên cây trồng ở
Việt Nam ............................................................................................... 17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN iii

/>

1.6. Đất hiếm và khả năng kích kháng đối với cây trồng ................................ 19
1.6.1. Các nguyên tố đất hiếm ......................................................................... 19
1.6.2. Tác động của đất hiếm đối với cây trồng .............................................. 20
1.6.3. Nghiên cứu ứng dụng đất hiếm đối với cây trồng ở Việt Nam ............. 24
1.7. Protein ở lá cây đậu tương ........................................................................ 26
1.7.1. Thành phần protein ở lá cây đậu tương ................................................. 26
1.7.2. Những nghiên cứu protenin ở lá đậu tương ........................................... 26
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 28
2.1. Vật liệu...................................................................................................... 28
2.1.1. Vật liệu và phương pháp thu thập lá bệnh ............................................. 28
2.1.2. Hóa chất ................................................................................................. 28
2.1.3. Máy móc và thiết bị ............................................................................... 29
2.2. Phương pháp nhiên cứu ............................................................................ 29

2.2.1. Phương pháp nhiễm bệnh nhân tạo và thu mẫu lá................................. 29
2.2.2. Tách chiết protein từ lá đậu tương ......................................................... 31
2.2.3. Xác định hàm lượng protein .................................................................. 32
2.2.4 Điện di SDS-PAGE ................................................................................ 32
2.2.5. Điện di hai chiều 2DE ........................................................................... 33
2.2.6. Nhuộm protein và phân tích hình ảnh gel ............................................. 34
2.2.7. Nhận diện protein trên bản điện di 2DE ................................................ 34
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 36
3.1. Kết quả gây nhiễm bệnh và kiểm tra tính kháng bệnh ............................. 36
3.2. Kết quả tách chiết protein ......................................................................... 38
3.3. Kết quả điện di SDS-PAGE ..................................................................... 39
3.4. Kết quả điện di 2 chiều 2DE..................................................................... 41
3.5. Nhận diện các protein lá mẫu DT12 thí nghiệm ...................................... 43
3.6. So sánh mức độ biểu hiện của protein lá sau khi xử lý phức đất hiếm .... 45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................... 49
1. Kết luận ........................................................................................................ 49
2. Đề nghị......................................................................................................... 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................. 50
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN iv

/>

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Nghĩa của từ viết tắt

2DE

Two dimentional electrophoresis - điện di hai chiều

µl

Microliter

APS

Ammonium persulfate

CHAPS

3-[(3- Cholamidoppropyl)dimethylammonio]

DTT

Dithiothreitol

EDTA

Ethylendiamine tetra acetic acid

ESI-Q TRAP

-

IAA

Indole-3-acetamide

IEF

Isoelectric Focusing đẳng điện

IPG

-

kDa

Kilo Dalton

mA

MiliAmpe

ml

Mililiter

MS/MS

-

OD

-

pI

Isoelectric point - Điểm đẳng điện

PMSF

Phenylmethanesulphonylfluoride

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE

-

-

TCA

Trichloracetic acid

TEMED

N,N,N‟,N‟ Tetramethylethylenediamine

V

Volt - Vôn

w/v

Weight/volume - Khối lượng/thể tích

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN iv

/>

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phương pháp và nồng độ đất hiếm đối với một số cây trồng [32]........ 21
Bảng 1.2. Ứng dụng phân bón vi lượng đất hiếm ........................................... 22
Bảng 2.1. Nguồn gốc, đặc điểm của giống thí nghiệm ................................... 29
Bảng 2.2. Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE ............................ 32
Bảng 3.1. Nồng độ protein lá của các giống đậu tương .................................. 38
Bảng 3.2. Kết quả nhận diện của 8 điểm protein trên gel DT12 thí nghiệm .. 46

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

v

/>

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Diện tích trồng và sản lượng cây đậu tương tại Việt Nam
(2007 - 2013) ............................................................................5
Hình 1.2. So sánh các kiểu hình khác nhau của lá đậu tương khi nhiễm
bệnh (A) khi kháng bệnh (B) và khi miễn nhiễm với bệnh (C) ...8
Hình 1.3. Hình ảnh lá nhiễm bệnh với 2 vòng bệnh gỉ sắt (A). ..................9
Hình 1.4. Bảng phân bố các nguyên tố ................................................... 20
Hình 2.1. Các giống đậu tương được trồng trên đồng ruộng tại Viện bảo
vệ thực vật .............................................................................. 30
Hình 3.1. Đánh giá khả năng nhiễm bệnh và kháng bệnh của giống DT12 36
Hình 3.2. Kết quả điện di SDS - PAGE protein lá của 3 mẫu .................. 40

Hình 3.3. Kết quả điện di protein lá mẫu DT12 thí nghiệm sau khi xử lý
phức đất hiếm ......................................................................... 42
Hình 3.4. So sánh mức độ biểu hiện protein lá đậu tương ở mẫu DT12
đối chứng (A) và mẫu DT12 thí nghiệm (B) ............................ 45

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN vi

/>

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Trong chương trình khung về nghiên cứu khoa học, công nghệ nông
nghiệp giai đoạn 2013-2020, đậu tương đã được xác định là một trong những
cây công nghiệp chủ lực. Chọn tạo giống đậu tương năng suất cao, chất
lượng tốt, kháng sâu bệnh hoặc tăng cường khả năng chống chịu sâu bệnh là
một nội dung của chương trình.
Cây đậu tương là một trong những loại cây trồng được biết đến từ rất
sớm. Ở trung du Việt Nam đậu tương được trồng từ lâu đời, sớm nhất là các
tỉnh thuộc khu vực trung du, miền núi phía Bắc và miền đông Nam Bộ. Đậu
tương (Glycine max (L.) Merill) vừa là cây công nghiệp ngắn ngày vừa là
cây thực phẩm, thuộc họ đậu, có phổ thích nghi rộng. Hạt đậu tương có giá
trị dinh dưỡng cao. Các thực phẩm làm từ đậu tương được xem là một loại
"thịt không xương" vì chứa tỷ lệ đạm thực vật dồi dào, có thể thay thế cho
nguồn đạm từ thịt động vật. Tại các quốc gia như Nhật Bản, Trung Quốc,
60% lượng đạm tiêu thụ hằng ngày là do đậu tương cung cấp. Hàm lượng
chất đạm chứa trong đậu tương cao hơn nhiều so với lượng chất đạm chứa
trong các loại đậu khác. Các sản phẩm từ đậu tương được ứng dụng rộng rãi
cho nhiều mục đích khác nhau để làm thức ăn, dầu ăn, thực phẩm chức năng,
mỹ phẩm, nguyên liệu cho y học và công nghiệp…..
Cây đậu tương có khả năng thích nghi với nhiều vùng sinh thái khác

nhau.Với chu kì sinh trưởng phát triển ngắn, đậu tương trồng được nhiều
vụ/năm,
trị gia tăng, góp phần khai thác triệt để diện tích gieo trồng và nâng cao hiệu
quả kinh tế cho người sản xuất. Mặc dù diện tích gieo trồng đậu tương hàng
năm có tăng, tuy n
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

1

/>

gây ra bởi các yếu tố sinh
học, trong đó

đậu tương.

Bệnh gỉ sắt ở đậu tương do loài nấm Phakopsora pachyrhizi Sydow gây
ra và đang được coi là một trong những mối đe dọa chính trên cây đậu tương
[64]. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt (Phakopsora pachyrhisi
Sydow) ở đậu tương đã được tiến hành và thu được những kết quả đáng kể
trong những năm gần đây. Những đề tài, dự án tập trung nghiên cứu bệnh gỉ
sắt và đánh giá khả năng chống chịu bệnh gỉ sắt của cây đậu tương là cơ sở
để đánh giá và tuyển chọn giống đậu tương kháng bệnh. Các nghiên cứu,
đánh giá sâu hơn trên phương diện phân tử như sử dụng chỉ thị phân tử SSR
với các cặp mồi có vị trí liền kề với gen kháng gỉ sắt, để lập bản đồ gen
kháng hoặc nghiên cứu ở mức độ phân tử protein với phương pháp điện di
một chiều và hai chiều để so sánh và phát hiện sự khác nhau giữa điểm
protein của giống kháng với giống nhiễm.
Trên thực tế, một số giống kháng bệnh gỉ sắt được chọn tạo, xác định tính
kháng bệnh và đã phát huy hiệu quả rõ rệt trong sản xuất cũng như làm vật liệu

cho công tác chọn tạo giống kháng bệnh như giống đậu tương ĐT2000 [2], Cao
Bằng U8352, Vàng Hà Giang, Nhất tiến Hữu Lũng Lạng Sơn.... Các kết quả
nghiên cứu về bệnh gỉ sắt và nguồn gen kháng bệnh đều chứng tỏ sử dụng giống
kháng bệnh là biện pháp duy nhất có hiệu quả cho sản xuất [35] và phát triển
bền vững.
Tuy nhiên, tại các vùng ổ dịch, việc tuyển chọn giống kháng có lúc chưa
đáp ứng đựợc ngay với nhu cầu của sản xuất. Bởi vậy rất cần tìm ra các chế
phẩm có tác dụng làm tăng tính kháng của cây trồng để hỗ trợ cho các giống có
năng suất cao thích hợp với điều kiện sản xuất của mỗi vùng. Nghiên cứu khả
năng chống chịu của các nguồn gen, các dòng, giống đậu tương triển vọng, có
tính kháng với các nòi ký sinh gây hại tại một số vùng ổ địch và một số vùng
sinh thái khác nhau là nhiệm vụ trọng tâm; đồng thời tìm kiếm giải pháp nâng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

2

/>

cao tính kháng của cây đậu tương cũng như nghiên cứu ở mức độ phân tử
protein với phương pháp điện di để so sánh và phát hiện khả năng kích
kháng đối với cây trồng này là vấn đề bức xúc cần được giải quyết. Chúng tôi
lựa chọn và thực hiện đề tài: “Phân tích thành phần điện di protein lá của
giống đậu tương DT12 nhiễm bệnh gỉ sắt khi xử lý phức đất hiếm” nhằm
khảo sát khả năng kích kháng của phức đất hiếm trên khía cạnh sinh học như
một biện pháp hỗ trợ góp phần tăng năng suất và chất lượng đậu tương phục vụ
sản xuất nông nghiệp bền vững ở Việt Nam.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Nhằm khảo sát tính kháng của phức đất hiếm “thủy tiên” đối với cây
đậu tương DT12 nhiễm bệnh gỉ sắt, góp phần tăng năng suất và chất lượng
đậu tương phục vụ sản xuất nông nghiệp bền vững ở Việt Nam.

3. Nội dung nghiên cứu
Tiến hành tách chiết protein lá của giống đậu tương DT12 đối chứng
và thí nghiệm
Tiến hành điện di 1 chiều và 2 chiều 2DE protein lá của giống đậu
tương DT12 đối chứng và thí nghiệm
So Sánh mức độ biểu hiện của protein lá mẫu DT12 thí nghiệm với
mẫu DT12 đối chứng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

3

/>

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cây đậu tƣơng và tình hình sản xuất đậu tƣơng
1.1.1. Cây đậu tương
Đậu tương là một trong những loại cây trồng được biết đến từ rất sớm.
Các bằng chứng về lịch sử địa lý và khảo cổ học chỉ ra rằng cây đậu tương
được thuần hóa ở Trung Quốc và được đưa đến Triều Tiên, Nhật Bản, Nga,
sang Nam Á và Đông Nam Á qua con đường tơ lụa. Ở trung du Việt Nam
đậu tương được trồng từ lâu đời, sớm nhất là các tỉnh thuộc khu vực trung
du, miền núi phía Bắc và miền đông Nam Bộ.
Về phân loại học: Cây đậu tương hay còn gọi là đậu tương có tên khoa
học là Glycine max (L) Merrill, (2n = 40), thuộc chi Glycine, họ đậu
(Leguminoceae), họ phụ cánh bướm (Papilionoideae) và bộ Phaseoleae. Các
giống đậu tương trồng ở Việt Nam thuộc loài glycine max (L.) Merrill
(2n=40) trong giống phụ G.Soja, giống Glycine thuộc họ đậu
(Leguminoceae), họ phụ cánh bướm (Papilionoideae) [88].

1.1.2. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam
Trên thế giới cây đậu tương đã được trồng khắp năm châu lục, tập
trung nhiều nhất là châu Mỹ 75,68%, tiếp đến là châu Á 21,27% và một số
nước khác trên thế giới. Hiện nay Hoa Kỳ sản xuất khoảng 46% sản lượng
đậu tương cung cấp của thế giới và khoảng 40% diện tích đất để sản xuất
đậu tương. Braxin là nước thứ hai trên thế giới chiếm 20%; Argentina và
Trung Quốc xếp hàng thứ ba và thứ tư tương ứng với 14% và 9% sản lượng
đậu tương của thế giới. Nhiều quốc gia khác trên khắp thế giới sản xuất đậu
tương nhưng tổng sản lượng thì thấp hơn nhiều so với Hoa Kỳ, Braxin,
Argentina và Trung Quốc.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

4

/>

Tổng diện tích đậu tương trên thế giới khoảng 109,98 triệu ha, tăng
so với 108,16 triệu ha của năm 2012; năng suất đậu tương đạt bình quân
2,60 tấn/ha, tăng so với 2,48 tấn/ha của năm 2012. Sản lượng đậu tương của
các nước trong năm 2013 đạt (đơn vị: triệu tấn): Mỹ 93,08; Braxin 85,00;
Argentina 53,50; Trung Quốc 12,50; Ấn Độ 12,00; Paragoay 8,40; Canađa
5,30 và các nước khác 16,12. Tổng xuất khẩu đậu tương trên thế giới đạt
107,21 triệu tấn trong năm 2013, tăng so với 96,39 triệu tấn của năm 2012.
Trong đó, xuất khẩu của các nước đạt (đơn vị: triệu tấn): Braxin 41,50; Mỹ
39,46; Argentina 12,00; Paragoay 5,00; Canađa 3,45 và các nước khác 5,80.
Trung Quốc tiếp tục là nước nhập khẩu đậu tương lớn nhất thế giới trong
năm 2013, với khối lượng nhập khoảng 69,00 triệu tấn [90].
Ở Việt Nam, quy mô sản xuất vẫn còn tương đối nhỏ và chưa đáp ứng
được nhu cầu tiêu thụ trong nước, diện tích trồng đậu tương năm 2013 nước
ta tăng khoảng 80 nghìn ha so với năm 2011 và sản lượng đạt ở mức

350.000 tấn (hình 1.1). Theo số liệu thống kê chính thức, đậu tương đang
được trồng tại 28 trong số 63 tỉnh thành cả nước, với khoảng 65% tại các
khu vực phía Bắc và 35% tại các khu vực phía Nam.

(Nguồn: Tổng cục thống kê, 2013)
Hình 1.1. Diện tích trồng và sản lượng cây đậu tương tại Việt Nam
(2007 - 2013)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

5

/>

Quy hoạch tổng thể phát triển sản xuất ngành nông nghiệp đến năm
2020 và tầm nhìn đến năm 2030. Theo đó, diện tích đất quy hoạch khoảng
100 ngàn ha tận dụng tăng vụ trên đất lúa để năm 2020 diện tích gieo trồng
khoảng 350.000 ha, sản lượng 700.000 tấn; vùng sản xuất chính là đồng
bằng sông Hồng, trung du miền núi phía Bắc và Tây Nguyên.
1.2. Bệnh gỉ sắt đậu tƣơng
1.2.1. Lịch sử phát triển bệnh
Bệnh gỉ sắt là bệnh hại phổ biến và khá nghiêm trọng trên cây đậu
tương do nấm Phakopsora pachyrhizi Sydow, thuộc họ Melampsoracea, bộ
Uredinales, lớp Urediniomycetes [87]. Đây là loài ký sinh chuyên tính, chỉ
sống trên cây đậu tương. Nấm gỉ sắt đậu tương đầu tiên được phát hiện ở
Nhật Bản năm 1902. Bệnh lan rộng, phổ biến ở hầu hết các vùng trồng đậu
tương trên thế giới. Ở đông bán cầu bệnh có thể làm giảm năng suất trung
bình từ 10-30%, giảm năng suất là trên 50% [20]. Ở châu Phi, tại Zimbawea
thiệt hại năng suất có thể lên đến 80%, ở những vùng độc canh là 100%. Ở
Việt Nam có vụ bị hại nặng mất mùa đến 81% (trung tâm đậu đỗ Định

Tường, 1985).
Phản ứng của đậu tương đối với nấm P. pachyrhizi được nhiều hội
nghị quốc tế xác nhận là có 2 kiểu phản ứng chính là: 1.TAN: Vết bệnh mầu
nâu vàng có từ 2 đến 5 bào tử đặc trưng cho giống nhiễm bệnh; 2.RB: Vết
bệnh mầu nâu đỏ có từ 0 đến 2 bào tử biểu hiện giống kháng bệnh [21].
Qua nhiều năm đánh giá tại Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt
Nam cho thấy, xuất hiện thêm dạng trung gian giữa 2 phản ứng trên: Trên
mặt lá vừa có vết bệnh TAN vừa có vết bệnh RB [1], [66] được gọi là phản
ứng trung gian: MIX
Các nhà khoa học cũng đã xác định có 5 gen trội quyết định tính
kháng bệnh gỉ sắt là: Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4, Rpp5 ngoài ra cũng có thể
còn có những gen khác nữa [36]. Việc xác định các giống kháng bệnh đã
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

6

/>

được tiến hành từ nhiều năm nay ở nhiều nước trên thế giới, tuy nhiên số
giống kháng được phát hiện là rất ít.
- Đài Loan: Chỉ có 2 giống kháng trong hàng trăm mẫu giống thử
nghiệm của Mỹ
- Mỹ: 2 mẫu giống trong 110 mẫu giống địa phương có phản ứng RB
với cả 4 nguồn bệnh từ Australia, India, Taiwan và Tuerto Rico [20], [66].
- Việt Nam: 25 giống trong 400 lượt giống địa phương và nhập nội
kháng với nguồn bệnh (N.T.Bình 2005, 2009) tại Viện Khoa học kỹ thuật
Nông nghiệp Việt Nam, đã phát hiện giống đậu tương ĐT2000 kháng cao
với gỉ sắt có thời gian sinh trưởng 110 - 120 ngày và được đưa vào làm đối
chứng kháng trong các thí nghiệm quốc tế.
- CIP và ở nhiều nước trên thế giới đã áp dụng phương pháp sinh học

phân tử để phân tích đa dạng của quần thể ký sinh và đa dạng nguồn gen cây
trồng. Bằng công nghệ sinh học trường đại học Illinois đã xác định được 9
nòi nấm gỉ sắt đậu tương.
1.2.2. Triệu chứng
Cây bị nhiễm bệnh gỉ sắt trên lá xuất hiện những vết bệnh nhỏ
sau lớn dần và chuyển màu vàng rồi vàng nâu, đạt tới kích thước từ 2-5
mm với những hình đa dạng, có góc cạnh [19] [36]. Các vết bệnh có
thể phát triển rộng và liên kết với nhau thành từng mảng, làm cho phiến lá
giòn dễ bị rách. Ở mặt dưới phiến lá, nơi có các vết bệnh, xuất hiện lớp bột
màu nâu vàng đó là các bào tử hạ của nấm. Khi bị nấm gỉ sắt tấn công,
trong mỗi đốm bệnh của lá đậu tương bị tổn thương có nhiều vết nứt,
chứa các ổ bào tử hạ (uredinia) bên trong chứa các bào tử con (rediniospore)
màu nâu vàng là màu của các bào tử hạ.
Các ổ bào tử hình nón chứa đầy các bào tử. Ban đầu, nhũng ổ bào tử
rất nhỏ giống như vết phồng rộp nhỏ. Các ổ bào tử có thể nằm ở mặt dưới
của lá, nhưng cũng có thể được hình thành trên thân, vỏ quả và cuống lá.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

7

/>

Tuỳ thuộc vào nòi ký sinh gây bệnh và phản ứng bệnh khác nhau của các
giống mà thể hiện nên triệu chứng bệnh khác nhau: Vết bệnh có màu nâu đỏ
(RB), vết bệnh có màu nâu vàng (TAN) hoặc cả hai loại đều được thể hiện
trên cùng một lá (MIX) [1], [66].
1.2.3. Tác hại
Bệnh gỉ sắt là làm cho lá cây đậu tương giảm hoặc mất khả năng
quang hợp, tác động đến hệ protein lá hình thành tầng rời, gây rụng lá hàng
loạt dẫn đến giảm năng suất quả, tỷ lệ hạt lép cao (hình 1.2). Từ khi cây đậu

tương có 5-6 lá và nhất là khi bắt đầu ra hoa, bệnh xâm nhiễm mạnh nhất và
sau đó phát triển kéo dài tới khi thu hoạch. Nấm gỉ sắt xâm nhiễm cả vào
quả làm cho hạt không thể phát triển bình thường. Do đó, năng suất và
phẩm chất hạt đậu tương bị giảm sút nghiêm trọng. Những ruộng bị bệnh
nặng hầu như không cho thu hoạch. Bệnh gỉ sắt thường tập trung cao điểm
vào tháng 3 và tháng 4 khi nhiệt độ đạt từ 200C - 280C và cây đậu tương có
từ 3 lá kép đến khi thu hoạt quả.

Hình 1.2. So sánh các kiểu hình khác nhau của lá đậu tương khi nhiễm
bệnh (A) khi kháng bệnh (B) và khi miễn nhiễm với bệnh (C)
1.2.4. Tác nhân gây bệnh
Có 2 loài nấm được coi là tác nhân gây nên bệnh gỉ sắt đó là:
Phakopsora

pachyrhizi

Sydow

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

(Anamorph
8

Malupa

sojae)

là

/>

loài nấm gỉ sắt ở châu Á và loài có độc tính nhẹ hơn đó là loài
Phakopsora meibomiae (Arthur) (Anomorph Malupa vignae); loài này xuất
hiện ở vùng nhiệt đới, Mỹ Latinh hoặc vùng New World. Hai loài
nấm gỉ sắt này đều thuộc giống Phakopsora, họ

Melampsoracea,

bộ

Uredinales, lớp Urediniomycetes [86].
Chu kỳ gây bệnh
Vòng đời của 2 loài nấm này có điểm khác biệt so với các loài nấm
khác: Thay vì có 5 giai đoạn trong vòng đời như các loài nấm khác trong bộ
Urediales thì nấm P. pachirhizi có 2 giai đoạn hiện diện trong vòng đời đó là
bào tử đông và bào tử hạ [19]. Đảm và bào tử đảm cũng đã được quan sát
thấy ở điều kiện trong phòng thí nghiệm. P. Pachirhizi thường sinh sản theo
kiểu sinh sản vô tính thông qua giai đoạn bào tủ đông [70].
Đặc điểm hình thái

Hình 1.3. Hình ảnh lá nhiễm bệnh với 2 vòng bệnh gỉ sắt (A).
Hình ảnh phóng đại của vòng gỉ sắt dưới kính hiển vi soi nổi (B),
Hình ảnh bảo tử nấm gỉ sắt dưới kính hiển vi soi nổi (C).
Và hình ảnh bào tử trưởng thành của gỉ sắt dưới kinh hiển vi
Bào tử nằm trong các ổ bào tử, khi thuần thục, các ổ bào tử phát tán
ra ngoài vô số các bào tử con từ miệng của các ổ bào tử hình nón (hình
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

9

/>

1.3). Khối bào tử này nằm trên các lỗ mở của các ổ bào tử. Các bào tử hình
trứng, có gai, không màu, không có vách ngăn, kích thước 17-23 x 2739µm[5] [41],.
Đặc điểm sinh học
Không giống với hầu hết các nấm gỉ sắt khác là xâm nhiễm vào cây
ký chủ thông qua khí khổng và lỗ mở tự nhiên, bào tử đông của nấm P.
pachirhizi tạo ra đĩa áp bao quanh lớp biểu bì và xâm nhập trực tiếp qua lớp
vỏ cutin bằng sợi nấm sau 20 giờ lây nhiễm. [48], [49], [54] . Sự nảy mầm
của bào tử thích hợp nhất khi có giọt nước và ẩm độ bão hoà trong 12 giờ và
trong điều kiện che tối trong 24 giờ. Bệnh gỉ sắt phát triển thích hợp trong
điều kiện thời tiết mát với nhiệt độ từ 15-30o C. Bào tử xâm nhiễm 7 - 9 ngày
sau triệu chứng sẽ xuất hiện là những vết phồng rộp nhỏ nâu vàng, khi bào
tử đông nảy nầm trên lá, 9 ngày sau khi xâm nhiễm, bào tử đông có thể được
tạo ra và quá trình này có thể kéo dài trong 3 tuần. Bào tử đông thứ cấp có
thể phát triển bên viền của các bào tử ban đầu và có thể tồn tại trong vòng 8
tuần [19] [54],.
1.3. Tính kháng của cây và kích thích tính kháng của cây trồng
1.3.1. Khái niệm về tính kháng và cơ chế kháng ở cây
1.3.1.1. Khái niệm tính kháng

Trong tự nhiên, mọi cơ thể thực vật đều có tính kháng đối với sự xâm
nhập của tác nhân gây hại, đặc trưng cho cơ chế ngăn chặn thụ động hay
hoạt động của các hoạt chất đã được hình thành trong tế bào từ trước, nhằm
ngăn cản mầm bệnh xâm nhập hoặc phát triển [3]. Khi cây trồng bị mầm
bệnh tấn công, cây sẽ tạo ra các cơ chế tự vệ chống lại với mầm bệnh, hạn
chế sự sinh trưởng và phát triển của mầm bệnh, giúp cây không bị hại hoặc
thiệt hại không đáng kể [7], [73].
1.3.1.2. Cơ chế kháng ở thực vật

Đến nay kiến thức của nhân loại đã tiến khá sâu vào lĩnh vực miễn
dịch của thực vật đối với bệnh. Bên cạnh việc tiến rất sâu vào khía cạnh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 10

/>

phân tử của các gen kháng bệnh, các nhà khoa học còn đi sâu dần vào cơ chế
của sự kháng bệnh để từ đó đưa ra được biện pháp kích thích tính kháng
bệnh tự nhiên của cây trồng. Cơ chế kháng bệnh ở thực vật được phân thành
hai nhóm: Cơ chế thuộc về sinh hóa học và cơ chế thuộc cấu trúc mô học.
Cơ chế kháng bệnh thuộc về cấu trúc mô học
Có 4 cơ chế kháng bệnh về mặt mô học, tùy thuộc vào 4 cách xâm
nhập của mầm gây bệnh:
- Sự tạo ra lớp vách tế bào mới chung quanh vết thương để bao vây và
ngăn cản sự xâm nhập tiếp theo của các nấm có tính ký sinh yếu, chỉ xâm
nhập qua vết thương.
mầm hại xâm nhiễm.
- Sự hình thành papillae (vách dầy) bên dưới đĩa áp để ngăn cản sự
xâm nhập của mầm gây bệnh.
- Tích tụ hợp chất phenol dẫn đến phản ứng tự chết của tế bào để cô
lập mầm gây bệnh - là phản ứng kháng bệnh ở mức cao của thực vật.
Cơ chế kháng bệnh thuộc về sinh hóa học
Sau khi bị vi sinh vật tấn công gây hại, nơi bị xâm nhiễm của cây chủ
tiết ra một loạt các hợp chất chống vi sinh vật, các protein liên quan đến
bệnh, các enzyme

.

Về hợp chất chống vi sinh vật có thể chia ra 2 nhóm: Nhóm phytoanticipins
và nhóm phytoaleuxins [76]. Phytoaleuxins do ký chủ tiết ra để chống lại

với mầm bệnh, trong đó phytoanticipins không phải do ký chủ trực tiếp tiết
ra mà do sự tương tác giữa các chất của ký sinh và ký chủ tạo ra. Hai nhóm
này có thể tìm thấy trong các giống có tính kháng bệnh cao. Bên cạnh đó
một loạt các protein có liên quan đến bệnh cây cũng được tế bào tổng hợp
nên. Các protein này có vai trò làm giảm sự phát triển của mầm bệnh bằng
cách tác động lên vách tế bào, màng nguyên sinh chất hoặc lên ribosom của
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 11

/>

vi sinh vât. Các protein này được xếp vào 18 họ protein trong đó các protein
được biết đến là PR-1, PR-2, PR-3, PR-4, PR-5, PR-8, PR-11, protein bất
hoạt ribosom, protein chuyển hóa chất béo nsLTPs, AMPs , thionins...
Các protein này thể hiện chức năng và phát huy năng lực hoạt động
khi cây chủ bị xâm nhiễm: PR-2 (β-1,3-glucanase) có vai trò trong phân hủy
thành của vách tế bào vi sinh vật[26], [30]. Hai nhóm enzyme β-1,3glucanase và chitinase có tác động hỗ trợ nhau làm tăng hiệu quả trong sự
phân hủy vách tế bào của mầm bệnh. Bên cạnh đó một loạt các enzim khác
cũng được hình thành trong tế bào bị mầm bệnh xâm nhiễm với vai trò
chuyển hóa các chất độc do mầm bệnh tiết ra hoặc trung hòa độc tính của
các chất do tế bào cây tiết ra khi phản ứng lại mầm bệnh, các chất này khi ở
nồng cao có thể gây hại cho tế bào cây. Trong đó có thể kể đến 2 enzim có
liên quan đến bệnh cây như PAL (phenylalanine ammonia lyase), peroxidase
[39]. PAL có vai trò thúc đẩy sự sinh tổng hợp các hợp chất polyphenol, là
chất quan trọng trong sự chống bệnh của cây trồng. Còn peroxidase có nhiều
vai trò trong đó có vai trò khử H2O2 và vai trò phối hợp với PAL trong việc
giúp lignin hóa vách tế bào bị tấn công qua đó ngăn cản cơ học sự lan ra xa
hơn của nấm gây bệnh. H2O2 được tích tụ trong tế bào với nhiệm vụ oxy hóa
các chất độc do nấm tiết ra, oxy hóa các polyphenol làm cho các polyphenol
không còn độc đối với tế bào, nhưng H2O2 với nồng độ cao lại gây hại cho tế
bào. Do đó Peroxidase làm giảm bớt tính độc của H2O2 đối với tế bào ký

chủ. Bên cạnh sự gia tăng hoạt tính của các enzyme còn xuất hiện các tín
hiệu do sự kích kháng gợi lên. Các tín hiệu bao gồm: salycilic acid, jasmonic
acid và etylen.
1.3.2. Kích thích tính kháng ở cây trồng
1.3.2.1 Khái niệm
Kích kháng là kỹ thuật làm cho một giống cây trồng nào đó bị nhiễm
bệnh trở nên có khả năng kháng được bệnh sau khi được xử lý với một nhân
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 12

/>

tố kích kháng. Hiện tượng kích kháng là hiện tượng mà cây trồng biểu hiện
mức độ kháng lại tác nhân gây hại sau khi nhận được sự kích thích thích hợp
và là kết quả của quá trình phức tạp về sự thay đổi các chất trong mô cây
[72]. Phương pháp kích kháng không có tác dụng loại trừ trực tiếp mầm
bệnh như thuốc trừ dịch hại thông thường mà dựa trên sự kích thích những
cơ chế tự nhiên của cây trồng. Chất kích kháng có thể là một loài vi sinh vật
không gây bệnh, không mang tính độc đối với cây trồng hoặc có thể là một
loại hóa chất nào đó không độc và không có tác động trực tiếp tiêu diệt mầm
bệnh như hóa chất được dùng trong nông dược [8]. Hiệu quả của kích kháng
có thể thay đổi tùy theo mô, loại cây trồng, giống và tác nhân kích kháng
[16]. Có trường hợp sau một lần kích kháng cây có thể kháng với nhiều loại
bệnh cùng một lúc. Cũng có trường hợp sau khi kích kháng cây chỉ kháng
với một bệnh nào đó mà thôi. Tuỳ theo tác nhân kích kháng mà hiệu lực kích
kháng có thể ngắn hay dài.
1.3.2.2. Cơ chế kích kháng
Tương tự như cơ chế kháng ở thực vật nói chung, trong tế bào cây
trồng, có các gen giúp tế bào cây có khả năng kháng lại với một loại tác
nhân gây hại nào đó xâm nhập.
Trong điều kiện bình thường, các gen này luôn bị một gen ức chế nằm

bên cạnh ức chế. Khi chủ động tác động bởi các tác nhân gây kích kháng
bằng cách ngâm hạt, rễ, hay phun lên lá, tác nhân này tác động lên bề mặt lá,
rễ hoặc hạt kích thích các thụ thể này tạo ra tín hiệu (là những dòng ion hay
tín hiệu điện tử trong cây) [72], các tín hiệu này chuyển vào nhân của tế bào
và tác động vào gen ức chế, khống chế gen ức chế giúp tế bào cây tiết ra các
chất kháng bệnh. Nhờ các chất kháng bệnh này mà cây trồng từ nhiễm bệnh
trở thành kháng bệnh [8].
Khi mầm bệnh xâm nhiễm vào cây trồng, chúng sẽ sử dụng cơ chất
của cây, sinh ra cơ chất lạ, gây ra triệu chứng chết mô, hủy hoại tế bào cây;
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 13

/>

tất cả các tín hiệu này kích kích protein tế bào ký chủ tại vị trí mầm bệnh tác
động đến những gen bị khóa trong nhân làm các gen này trở nên hoạt động,
để sản xuất ra các chất ngăn chặn mầm bệnh tại điểm mầm bệnh tấn công.
Khả năng kích kháng của cây có thể biểu hiện về mặt cấu trúc hay sinh hóa,
có thể tác động tại chỗ hay lưu dẫn đến các bộ phận khác của cây. Căn cứ
vào hiệu quả kích kháng, chia ra hai loại kích kháng là kích kháng tại chỗ
(localized induced resistance) và kích kháng lưu dẫn (systemic acquired
resistance) [16].
1.3.2.3. Các loại kích kháng
Kích kháng tại chỗ (local induced restance - LIR): Hiệu quả kích thích
tính kháng chỉ xảy ra tại vị trí được xử lý bởi các tác nhân kích kháng. Có
nhiều nghiên cứu về hiện tượng này rất phong phú trên nhiều loại cây trồng
khác nhau. Sử dụng chất syringolin tiết ra từ vi khuẩn Pseudomonas syringae
pv. syringae kích thích tính kháng tại chỗ với nấm gây bệnh cháy lá lúa
Pyricularia oryzae [80]. Phun monopotassium phosphat (KH2PO4) 1% lên ớt
kích thích tính kháng với bệnh phấn trắng do Leveillula taurica gây ra [68].
Kích kháng lưu dẫn (systemic acquired resistance-SAR): Tính kháng

không chỉ thể hiện tại vị trí được xử lý bởi tác nhân kích kháng mà còn truyền
đến những tế bào lân cận hay được lưu dẫn trong mô cây cách xa nơi được xử
lý kích kháng [69]. Những tác nhân kích kháng có cả tác nhân sinh học và
không phải sinh học. Khi xử lý kích kháng bằng biện pháp ngâm hạt làm cho
cây có khả năng tự vệ kháng lại cả các bệnh trên lá thể hiện kích kháng lưu
dẫn trong cây. Kích kháng lưu dẫn khác với kích kháng tại chỗ ở những tín
hiệu có khả năng truyền đến các mô của cây khác cách xa điểm xử lý kích
kháng và làm nâng cao khả năng tự vệ trong cây [77]. Các hợp chất tín hiệu
kích thích sinh ra protein PR (các protein có liên quan đến sự phát sinh bệnh
(pathogensis-related-protein: PRs) là acid salicylic, Bion và các protein có liên
quan đến tính chống bệnh của cây PR1 [25] và một số chất khác.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 14

/>

1.4. Tính kháng bệnh gỉ sắt hại đậu tƣơng
Tính kháng đối với nấm gỉ sắt hại đậu tương được coi là một trong
những giải pháp mang lại hiệu quả trong phòng trừ bệnh gỉ sắt. Việc nghiên
cứu, xác định các gen kháng và cơ chế di truyền đã xác định được 5 gen trội
mang gen di truyền độc lập kháng với nấm P. pachirhizi là Rpp1, Rpp2,
Rpp3, Rpp4, Rpp5 trong các dòng PI 200692, PI 230970, PI 462312, PI
459025B và PI 200487 [20], [33], [34] [37].
Có 2 loại phản ứng kháng : RB (kháng) = Vết bệnh màu nâu đỏ (0,4
mm với 0-2 bào tử trên vết bệnh) và miễn dịch = không quan sát thấy triệu
chứng [34].
Tính kháng từng phần cũng được ghi nhận, trong đó các dòng mang
tính kháng này khi đánh giá trên đồng ruộng thấy rằng có một số ít các vết
bệnh, trên các vết bệnh này bào tử được sản sinh ra chậm hơn so với các vết
bệnh trên các dòng nhiễm với bệnh [79]. Tuy nhiên các vị trí trên nhiễm sắc
thể, hiệu quả về quan hệ di truyền của những gen này vẫn chưa được xác

định. Ngoài ra, chúng chỉ có hiệu quả đối với một số nòi xác định [61].
Bản chất của hiện tượng kháng là sự tương tác giữa cây trồng và tác
nhân gây hại. Trong môi trường sống sự tương tác giữa vật chủ và vật ký
sinh theo mô hình tương tác gen đối gen (gen for gen) [28]. Theo đó, để
xuất hiện tính kháng bệnh ở cây cần có gen trội hoặc bán trội ở cây
(dominant resistance gene) và cả gen không gây hại cũng mang tính trội
(dominat avirulence gene) ở vật ký sinh. Tuy nhiên cho đến nay, cơ chế
kháng bệnh gỉ sắt và sự tương tác giữa mầm bệnh và cây chủ đậu tương vẫn
cần nhiều nghiên cứu để làm sáng tỏ. Trên cơ sở cơ chế kháng bệnh tự
nhiên của cây trồng, theo giả thiết, sau khi bị nấm gỉ sắt xâm nhiễm, cây đậu
tương sẽ có các phản ứng tự vệ. Hiện tượng tự vệ có thể do hệ thống LIR
(Local induced restance) hoặc SAR (Systemic acquired resistance) với sự
tham gia của nhiều nhóm protein liên quan đến mầm bệnh (Pathogenesis

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 15

/>

related protein - protein PR) hoặc protein kháng (Resistant Protein - protein
R) đảm nhận [27]. Cụm gen R đã được phát hiện ở nhiều loài như lúa [71]
Arabidopsis [59], ngô [42], và đậu tương [29], [31], [46]. Cho đến nay, có
nhiều nhóm protein PR với các chức năng khác nhau đã được phát hiện
[52]. Các protein này thường xuất hiện trong mô tế bào sau khi bị bệnh xâm
nhiễm từ vài phút đến vài giờ, chúng đều là các chất kháng khuẩn, kháng
nấm và tham gia vào bảo vệ tế bào thực vật khỏi các tác động của mầm
bệnh [10], [27]. Khi có sự tương tác giữa nấm và tế bào thực vật, các protein
Avr (avirulence protein) được hình thành từ sợi nấm và từ giác mút sẽ được
chuyển vào nguyên sinh chất của tế bào thực vật bằng các con đường khác
nhau [27], [45], [52]. Protein Avr có nhiều loại và là các protein nhỏ có
trong giác mút của sợi nấm được tiết vào tế bào thực vật cùng với các

protein khác qua các màng giác mút. Protein R trong nguyên sinh chất của
cây chủ nhận biết protein Avr và hoạt hóa hệ thống tín hiệu bảo vệ của tế
bào thực vật [22].
Các nghiên cứu về gen trong cây đậu tương cho thấy năm gen Rpp1,
Rpp2, Rpp3, Rpp4 và Rpp5 đã được phát hiện và mô tả là có khả năng
liên quan đến tính kháng đối với một số chủng nấm P. pachyrhizi. Tuy
nhiên chưa có một giống đậu tương nào có phổ kháng rộng với tất cả các
chủng nấm P. pachyrhizi [60].
1.5. Một số nghiên cứu ứng dụng kích thích tính kháng bệnh trên cây trồng
1.5.1. Những nghiên trên thế giới
Trên thế giới việc nghiên cứu kích thích tính kháng bệnh bắt đầu từ
năm 1936 [38], [57], [58], sau đó rất nhiều tác giả đã nghiên cứu sâu vào cơ
chế kích kháng bệnh và ứng dụng thành công trên nhiều loài cây khác nhau
như dưa chuột, cà chua, lúa mạch, lúa nước, cẩm chướng, hồ tiêu, chè…
[43], [44], [51]. Nhiều tác nhân cả hóa học và sinh học có thể kích thích tính
kháng bệnh khác nhau trên cây trồng thể hiện về mặt cấu trúc mô học hoặc
sinh hóa học, có tác động tại chỗ hay lưu dẫn đến các bộ phận khác của cây
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 16

/>