Khảo sát tác động đối kháng của nấm trichoderma đối với nấm fusarium solani gây bệnh thối rễ trên cam quít tại đồng bằng sông cửu long

B GIÁO D C VÀ ÀO T O
TR
NG
I H C C N TH
_______

D

KH O SÁT TÁC
TRICHODERMA

NG MINH

NG

I KHÁNG C A N M

I V I N M FUSARIUM SOLANI

GÂY B NH TH I R TRÊN CAM QUÍT
T I

NG B NG SÔNG C U LONG

LU N ÁN TI N S NÔNG NGHI P

C n Th - 2010


B GIÁO D C VÀ ÀO T O
TR

NG
I H C C N TH
_______

D

KH O SÁT TÁC
TRICHODERMA

NG MINH

NG

I KHÁNG C A N M

I V I N M FUSARIUM SOLANI

GÂY B NH TH I R TRÊN CAM QUÍT
T I

NG B NG SÔNG C U LONG

CHUYÊN NGÀNH B O V TH C V T
MÃ S : 62 62 1001

LU N ÁN TI N S NÔNG NGHI P

NG

IH

NG D N KHOA H C:
PGS. PH M V N KIM

C n Th - 2010


ii

C ng Hòa Xã H i Ch Ngh a Vi t Nam
c l p - T do - H nh phúc
-----

L I CAM OAN
Tôi xin cam đoan công trình nghiên c u “Kh o sát tác đ ng đ i kháng c a
n m Trichoderma đ i v i n m Fusarium solani gây b nh th i r trên cam quít
t i đ ng b ng sông C u Long” này là c a riêng tôi. Các s li u, k t qu nêu
trong lu n án là trung th c và ch a t ng đ

c ng

i khác công b trong b t

k công trình nào khác.

Tác gi lu n án
D

ng Minh

iii

TRANG C M T
Xin chân thành bi t n Th y h

ng d n khoa h c:

- PGs Ph m V n Kim, đã t n tình ch b o và h
ph

ng d n các n i dung,

ng pháp và k ho ch tri n khai thành công các thí nghi m;
Lu n án này không th hoàn thành n u không có s giúp đ , h

ng d n

khoa h c và đ ng viên c a Th y.
Xin chân thành c m n H i đ ng đánh giá lu n án c p C s :
1. PGs.Ts. Nguy n B o V

Tr

ng

i h c C n Th

2. PGs.Ts. Cao Ng c i p

Tr

ng

i h c C n Th

3. Ts. L u H ng M n

Vi n Nghiên c u lúa BSCL

4. PGs.Ts. Nguy n V n Hu nh

Tr

ng

i h c C n Th

5. PGs.Ts. Tr n V n Hai

Tr

ng

i h c C n Th

6. Ts. Lê ình ôn

Tr

ng

i h c Nông Lâm Tp. HCM

7. PGs.Ts. Lê V n Hòa

Tr

ng

i h c C n Th

Xin chân thành c m n H i đ ng ch m lu n án Ti n s :
1. PGs.Ts. Lê V n Hòa

Tr

ng

i h c C n Th

2. PGs.Ts. Ph m V n D

C c Tr ng tr t

3. PGs.Ts. Cao Ng c i p

Tr

ng

i h c C n Th

4. PGs.Ts. Hu nh Thanh Hùng

Tr

ng

i h c Nông Lâm Tp. HCM

5. Ts. Lê C m Loan

Vi n Nghiên c u lúa BSCL

6. PGs.Ts. Nguy n V n Bá

Tr

ng

i h c Tây ô

7. PGs.Ts. Tr n V n Hai

Tr

ng

i h c C n Th

Xin chân thành c m n:
- Ban Giám Hi u Tr

ng

i H c C n Th ;

- Ban Ch Nhi m Khoa Nông Nghi p và Sinh H c

ng D ng;

- Phòng Qu n Lý Khoa H c và Phòng ào T o;
- Các Phòng Ban ch c n ng khác c a Tr

ng

i H c C n Th ;


iv

ã t o đi u ki n t t cho công tác đào t o nghiên c u sinh.
- Ban ch nhi m B môn B o v Th c v t, đã t o m i đi u ki n đ tôi
hoàn thành các n i dung h c t p và lu n án. Các thành viên trong B môn và
nhóm nghiên c u đã h tr tích c c trong vi c th c hi n các thí nghi m.
- Ts H V n Chi n, Ts Lê H u H i đã nhi t tình c ng tác th c hi n các thí
nghi m t i Ti n Giang;
- Xin c m n s tài tr kinh phí đ th c hi n đ tài t s Nông Nghi p
V nh Long và các s Khoa h c Công ngh Ti n Giang, C n Th , H u Giang.

S

ng h nhi t tình đ tri n khai các thí nghi m ngoài đ ng c a các s Nông

Nghi p t nh Ti n Giang, V nh Long, Trà Vinh,

ng Tháp, C n Th , H u

Giang và Sóc Tr ng.
- Xin trân tr ng ghi nh nh ng s

ng h , y m tr c a các c quan, nông

dân và b n bè t i các n i.
- Sau cùng, xin ghi nh s chia s và đ ng viên c a gia đình đã góp ph n
không nh vào s hoàn t t c a lu n án.
D

ng Minh


v

TÓM L

C

B nh vàng lá th i r là m t trong các b nh đã gây nhi u thi t h i trên cây
có múi

đ ng b ng sông C u Long ( BSCL). Tác nhân gây b nh đ

nh n do n m Fusarium solani gây ra. Vi c s d ng các lo i nông d
phòng tr b nh th

c ghi
c nh m

ng cho hi u qu không cao và gây ô nhi m môi tr

ng,

trong lúc bi n pháp phòng tr sinh h c v i n m đ i kháng Trichoderma t ra có
nhi u tri n v ng.

tài "Kh o sát tác đ ng đ i kháng c a n m Trichoderma

đ i v i n m Fusarium solani gây b nh th i r trên cam quít t i đ ng b ng sông
C u Long" đã đ

c th c hi n nh m ch n l c, đánh giá kh n ng đ i kháng c a

t p đoàn n m ho i sinh Trichoderma b n đ a nh m tìm các ch ng n m thích h p
giúp phòng tr b nh th i r . K t qu nghiên c u c a đ tài đã đ t đ
- Trên các m u s u t p t các v

n đi u tra t i Ti n Giang,

V nh Long, C n Th và H u Giang đã phân l p đ

c nh sau:
ng Tháp,

c 318 ch ng Trichoderma

và 114 ch ng Fusarium t các ph n r cây b nh. F. solani đ

c xác nh n

(theo quy trình Koch) là tác nhân gây b nh vàng lá th i r trên cam quít t i
các t nh.
- Qua tr c nghi m s

kh i trên đ a petri đã ch n đ

Trichoderma phân l p t các v
- Ph

c 50 ch ng

n có kh n ng đ i kháng t t v i F. solani.

ng pháp sinh tr c nghi m nh m đánh giá kh n ng ti t chitinase

đ i kháng v i n m b nh t ra có hi u qu đ ch n ch ng n m đ i kháng cao
v i m m b nh ( c ch bào t n m b nh m c m m). Ph
đ

c 11 ch ng Trichoderma đ i kháng t t

ng pháp này đã ch n

pH 4,2 - 5,5, có ti m n ng giúp

phòng tr b nh th i r .
- Kh o sát ho t tính đ i kháng c a Trichoderma qua vi c ti t chitinase cho
th y các ch ng tri n v ng đ u có kh n ng s n sinh ra exo- và endo-chitinase
giúp đ i kháng t t v i n m b nh. Trên cây con quít Ti u, Trichoderma còn


vi

giúp cây t o đ
glucanase

c kh n ng kích kháng qua s hi n di n c a chitinase và

r và lá, giúp cây đ kháng l i v i F. solani. Ki m đ nh qua k

thu t PCR c ng cho th y các ch ng tri n v ng ti t ra endo- và exo-chitinase,
đ

c đi u khi n t 2 gene mã hóa là ech42 và chit73. K t qu gi i trình t

DNA c a vùng ITS và EF đã xác đ nh 5 ch ng tri n v ng thu c 2 loài T.
harzianum (T-BM2a, T-TO2a, T-TO2b) và T. asperellum (T-LV1a, TOM2a).
- Các nghiên c u v

dinh d

ng khoáng cho th y các ch ng

Trichoderma tri n v ng đ u c n N (d ng (NH4)2SO4), P, K (KH2PO4), Ca
(CaSO4) và Mg (MgSO4) v i các m c đ khác nhau. Trong khi đó, bón phân
hóa h c NPK cho các v

n cam quít đ u cho tác đ ng tích c c trong vi c

phát tri n c a Trichoderma trong đi u ki n thí nghi m. Kh n ng đ i kháng
v i n m b nh c a các ch ng b n đ a c ng t ra thích h p trên các n n đ t có
sa c u khác nhau, đ ng th i phù h p v i pH khá chua (4,2-5,5) c a BSCL.
- N m ch ng Trichoderma n i tr i đã đ

c nhân nuôi và ph i tr n đ s

d ng phòng tr b nh th i r cam quít qua 2 mô hình ng d ng có v t li u h u
c , th c hi n trên 13 v

n cam quít đang b b nh t i Ti n Giang,

ng Tháp,

V nh Long, C n Th và H u Giang. K t qu cho th y các ch ng Trichoderma
đ u có kh n ng kh ng ch F. solani gây b nh th i r cam quít trong đi u
ki n đ t v

n có pH th p (4,0 – 4,4). S ph i h p 5 ch ng (T-mix) cho th y

tính hi u qu cao và n đ nh qua các đi m thí nghi m (so v i thu c tr b nh).
Hi u qu tr b nh càng cao khi đ t v

nđ

c cung c p thêm ch t h u c .

Bi n pháp x lý b nh v i Trichoderma và phân h u c c ng giúp hình thành
thói quen s d ng phân h u c trong vi c canh tác cây có múi t i BSCL.
Các ch ng Trichoderma tri n v ng đã đ
ký s n xu t v i tên th

ng m i là Tricô- HCT.

c ph i tr n (T-mix) và đ ng


vii

SUMMARY
Root rot disease is an important pest of citrus orchards growing in the
Mekong Delta of Vietnam. Fusarium solani was considered the causal agent
of the disease. The disease management by applying chemical fungicides
often attained low efficiency and caused environmental pollution while a
biological control alternative by using Trichoderma fungus could give higher
prospects. The thesis entitled "Studies on the fungal antagonism of
Trichoderma on Fusarium solani, causal agent of the citrus root rot disease in
Mekong Delta" was carried out for selection and antagonistic evaluation of
local saprophytic Trichoderma population for controlling the root rot disease.
The results showed that:
- The surveys of fruit orchards in Tiengiang, Dongthap, Vinhlong,
Cantho and Haugiang provinces collected and isolated 318 Trichoderma and

114 Fusarium isolates from damaged roots of citrus trees. By Koch's
postulate test, F. solani was the causal agent of citrus root rot disease (with
yellow leaf symptom) in these provinces.
- The primary study on petri dishes in the laboratory further selected 50
isolates of Trichoderma that antagonised efficiently with F. solani.
- The bioassay method for antagonistic evaluation by chitinase release
was efficient for selecting Trichoderma isolates to control the germination of
pathogen spores. This technique helped to select 11 promising isolates to
antagonise root rot disease at the pH range 4.2 to 5.5.
- Studies of enzyme activity of Trichoderma by its chitinase release showed
that promising isolates can produce exo- and endo-chitinases for pathogen
antagonism. On citrus young trees, Trichoderma isolates also supported trees to
produce systemic acquired resistance by the presence of chitinases and


viii

glucanases in citrus roots and leaves to resist against F. solani. Analysing by
PCR techniques proved that these enzymes were controlled by two encoding
genes ech42 and chit73. The results of DNA sequence of ITS and EF region also
determined that five promising isolates of Trichoderma belong to two species T.
harzianum (T-BM2a, T-TO2a, T-TO2b) and T. asperellum (T-LV1a, T-OM2a).
- Studies of the effect of mineral nutrients on promising Trichoderma
isolates showed that they needed nitrogen (ammonium sulphate form),
phosphorus, potassium (mono-potassium phosphate), calcium (calcium
sulphate) and magnesium (magnesium sulphate) at different dosages, while
application of chemical NPK for citrus orchards affected actively on
Trichoderma growths in greenhouse condition. The antagonistic capacities
were also favourable to different soil textures and suitable to the acid soil (pH
from 4.2 to 5.5) of Mekong Delta.

- Five promising isolates of Trichoderma were propagated and combined
for biological control of root rot disease by applying in two types of models,
carried out on 13 citrus orchards at Tiengiang, Dongthap, Vinhlong, Cantho and
Haugiang provinces. Results showed that the isolates can control effectively the
root rot disease in soil under lower pH conditions (4.0 to 4.4). The combination
of 5 isolates (T-mix) gave high efficiency and good stability in all experiments
(comparing with chemical fungicides). The control effectiveness was promoted
when the soils of gardens were applied with organic matter or compost to
promote Trichoderma growing. The biocontrol method of applying Trichoderma
together with organic matter also created the habit of composting in fruit gardens
of Mekong Delta.
The combination product of 5 promising Trichoderma (T-mix) was
registered and commercialised with the trade name "Trico-DHCT".


ix

M CL C
Trang
C

v

SUMMARY

vii

M CL C

ix

TÓM L

DANH M C CÁC CH

xiii

VI T T T

DANH SÁCH B NG

xiv

DANH SÁCH HÌNH

xvii

M

1

U

CH

5

NG 1: T NG QUAN TÀI LI U

5

1.1. N m Fusarium
c đi m hình thái

1.1.1

5

1.1.2 Phân lo i

6

1.1.3 i u ki n và kh n ng gây h i c a Fusarium

7

1.1.4

c t c a Fusarium

9

1.1.5

c đi m c a m t s loài thu c chi Fusarium ph bi n t i Vi t Nam

10

1.1.6 Tác đ ng c a môi tr

ng đ n Fusarium

15
17

1.2 N m Trichoderma
c đi m c a Trichoderma

1.2.1

1.2.2. M i t

17

ng tác gi a Trichoderma và các tác nhân gây b nh cây

1.2.3 Kh n ng kích thích ho c c ch sinh tr
1.2.4 Các y u t nh h
Trichoderma

ng c a cây

¬

NG 2: V T LI U, N I DUNG VÀ PH

25
NG PHÁP NGHIÊN C U

a đi m và th i gian nghiên c u

2.1 Phân l p các ch ng F. solani gây b nh và Trichoderma đ i kháng trên
các v n cam quít t i các t nh vùng đ ng b ng sông C u Long
2.1.1

23

ng đ n s phát tri n và ho t đ ng đ i kháng c a

1.2.5. M i quan h ba thành ph n gi a Trichoderma - Th c v t - Ký sinh gây b nh
CH

18

i u tra tình hình b nh trên cam quít và công tác s u t p các ngu n
n m b n đ a gây b nh và đ i kháng

2.1.2 Xác đ nh tác nhân gây b nh th i r qua quy trình Koch
2.2 Kh o sát tác đ ng c a Trichoderma đ i v i F. solani

28
30
31
31
31
33
34


x

2.2.1 Tr c nghi m kh n ng đ i kháng c a các ch ng Trichoderma d a trên
kh n ng c ch s phát tri n s i n m c a các ch ng F. solani

34

2.2.2 Tác đ ng c a pH đ n kh n ng đ i kháng c a các ch ng Trichoderma
trong môi tr ng nuôi c y PDA

35

2.3 Kh o sát m i t ng tác gi a Trichoderma và F. solani trên khía c nh
hoá sinh và DNA

36

2.3.1 Tr c nghi m kh
Trichoderma

n ng ti t chitinase đ i kháng c a các ch ng
36

2.3.2 Kh o sát kh n ng c ch s m c m m c a đ i bào t F. solani t các
ch ng Trichoderma có tri n v ng (k thu t sinh tr c nghi m)

37

2.3.3 ánh giá kh n ng đ i kháng và kích kháng c a các ch ng Trichoderma
tri n v ng trên b nh th i r cam quít do F. solani gây h i

40

2.3.4 Xác đ nh s hi n di n c a các gene đi u khi n s t ng h p chitinase
các ch ng Trichoderma tri n v ng

42

2.4 Tác đ ng c a các dinh d ng khoáng N, P, K, Ca, Mg và sa c u đ t
đ n m i quan h gi a Trichoderma và F. solani

44

2.4.1 Nghiên c u in-vitro tác đ ng c a các dinh d ng khoáng N, P, K, Ca,
Mg lên s phát tri n và hình thành bào t c a Trichoderma

44

2.4.2 Tìm hi u tác đ ng c a dinh d ng đ t (N, P, K) đ n kh n ng đ i
kháng c a Trichoderma đ i v i n m b nh F. solani

46

2.4.3 Tìm hi u tác đ ng c a sa c u đ t đ n kh n ng đ i kháng c a
Trichoderma đ i v i n m b nh F. solani

47

2.5 Tìm hi u hi u qu kh ng ch b nh th i r F. solani c a các ch ng
Trichoderma trong các v n cam quít t i đ ng b ng sông C u Long

48

2.5.1

ánh giá kh n ng phân h y h u c c a Trichoderma t các ngu n
v t li u h u c s n có t i đ a ph ng

2.5.2 Tác đ ng c a các dinh d
Trichoderma

48

ng khoáng lên kh n ng phân h y r m c a
49

2.5.3 Tìm hi u nh h ng c a Trichoderma lên n ng su t c a n m r m
(Volvariella volvacea)

49

2.5.4 Mô hình v n ng d ng kh n ng đ i kháng c a các ch ng
Trichoderma tri n v ng đ phòng tr sinh h c b nh th i r do F. solani
trên các v n tr ng cam quít

50


xi

CH

54

NG 3: K T QU VÀ TH O LU N

3.1 Phân l p các ch ng F. solani gây b nh và Trichoderma đ i kháng trên
các v n cam quít t i các t nh vùng đ ng b ng sông C u Long

54

3.1.1 K t qu đi u tra tình hình b nh trên cam quít và công tác s u t p các
ngu n n m b n đ a gây b nh và đ i kháng

54

3.1.2 Tác nhân gây b nh th i r và m c gây h i qua quy trình Koch

58

¬ Trên cây con tr ng trong l đ t
¬ Trên cây con tr ng in-vitro
3.1.3 Nh n di n b nh vàng lá th i r do F. solani trên các v

58
60
n cây có múi

3.2 Tác đ ng c a Trichoderma đ i v i F. solani

65

66

3.2.1 Tr c nghi m kh n ng đ i kháng c a các ch ng Trichoderma d a trên
kh n ng c ch s phát tri n s i n m c a các ch ng F. solani

66

3.2.2 Tác đ ng c a pH đ n kh n ng đ i kháng c a các ch ng Trichoderma
trong môi tr ng nuôi c y PDA

71

3.3 M i t ng tác gi a Trichoderma và F. solani trên khía c nh hoá sinh
và DNA

74

3.3.1 Tr c nghi m kh
Trichoderma

n ng ti t chitinase đ i kháng c a các ch ng
74

3.3.2 Kh n ng c ch s m c m m c a đ i bào t F. solani t các ch ng
Trichoderma có tri n v ng (k thu t sinh tr c nghi m)

77

3.3.2.1 Sinh tr c nghi m kh n ng c ch bào t F. solani c a các ch ng
Trichoderma có tri n v ng

77

nh h ng c a pH môi tr ng nuôi c y đ n kh n ng c ch m c
m m bào t F. solani c a các ch ng Trichoderma

79

ng d ng ph ng pháp sinh tr c nghi m đ đánh giá kh n ng c
ch m c m m bào t F. solani c a các ch ng Trichoderma s u t p t i
các đ a ph ng

81

3.3.3 Hi u qu đ i kháng và kích kháng c a các ch ng Trichoderma tri n
v ng đ i v i F. solani gây b nh th i r cam quít

82

3.3.4 S hi n di n c a các gene đi u khi n s t ng h p chitinase
ch ng Trichoderma tri n v ng

93

3.3.2.2
3.3.2.3

các

¬ Xác đ nh loài c a các ch ng Trichoderma tri n v ng

95

3.4 Tác đ ng c a các dinh d ng khoáng N, P, K, Ca, Mg và sa c u đ t
đ n m i quan h gi a Trichoderma và F. solani

96

3.4.1 Nghiên c u in-vitro tác đ ng c a các dinh d ng khoáng N, P, K, Ca,
Mg lên s phát tri n và hình thành bào t c a Trichoderma

96


xii

3.4.2 Tác đ ng c a dinh d ng đ t (N, P, K) đ n kh n ng đ i kháng c a
Trichoderma đ i v i n m b nh F. solani

103

3.4.3 Tác đ ng c a sa c u đ t đ n kh n ng đ i kháng c a Trichoderma đ i
v i n m b nh F. solani

105

3.5 Hi u qu kh ng ch b nh th i r F. solani c a các ch ng Trichoderma
trong các v n cam quít t i đ ng b ng sông C u Long

106

3.5.1 Kh n ng phân h y h u c c a Trichoderma t các ngu n nguyên li u
h u c s n có t i đ a ph ng (thí nghi m trong phòng)

106

3.5.2 Tác đ ng c a các dinh d ng khoáng lên kh n ng phân h y r m c a
Trichoderma (thí nghi m trong phòng)

109

3.5.3 nh h ng c a Trichoderma lên n ng su t c a n m r m (Volvariella
volvacea)

110

3.5.4 Mô hình v n ng d ng kh n ng đ i kháng c a các ch ng
Trichoderma tri n v ng đ phòng tr sinh h c b nh th i r do F.
solani trên các v n tr ng cam quít

111

3.5.4.1 Mô hình 1: S d ng ngu n h u c t i ch đã hoai

111

3.5.4.2 Mô hình 2: S d ng ngu n v t li u h u c t i ch ch a hoai

120

¬ Th o lu n chung v hai d ng mô hình thí nghi m

124

K T LU N VÀ

128

NGH

K t lu n

128

ngh

130

Danh m c các công trình đã công b có liên quan đ n lu n án

131

TÀI LI U THAM KH O

133

PH CH

NG

xiii

DANH M C CÁC CH

VI T T T

---------

A.E:

Antagonistic efficacy (hi u su t đ i kháng).

CSB:

Ch s b nh.

BSCL:

ng b ng sông C u Long.

GSKC:

Gi sau khi ch ng n m

NSKC:

Ngày sau khi ch ng n m.

NSKXL:

Ngày sau khi x lý b nh.

PDA:

TE:

Potato Dextrose Agar (môi tr ng x p nuôi c y có th ch,
khoai tây và đ ng)
Potato Dextrose Broth (môi tr ng l ng nuôi c y có khoai
tây và đ ng).
Tris-HCl Ethylenediamine tetra-acetic acid (Tris-HCl EDTA)

TSKC:

Tu n sau khi ch ng n m.

TSKXL:

Tu n sau khi x lý b nh.

TSM-C:

Môi tr ng l ng TSM (Trichoderma selective medium) có b
sung chitin

PDB:


xiv

DANH SÁCH B NG
B ng

Tên b ng

Trang

2.1

Các thành ph n tham gia PCR

43

2.2

Các c p m i tham gia PCR

44

3.1

S hi n di n c a các ch ng F. solani và Trichoderma thu th p
đ c t i các vùng tr ng cam quít thu c đ ng b ng sông C u Long

56

T l cây quít con b b nh (%) 34 và 41 ngày sau khi ch ng
n m b nh F. solani (quy trình Koch) trên môi tr ng đ t cát c n
đã thanh trùng

58

Ch s b nh (%) và t l cây ch t (%) trên cây con quít Ti u 50
ngày sau khi ch ng F. solani v i các ch ng phân l p t Ti n Giang

61

Ch s b nh (%) và t l cây ch t (%) trên cây con quít Ti u 50
ngày sau khi ch ng F. solani v i các ch ng phân l p t C n Th và
H u Giang

63

Hi u su t đ i kháng (%) c a các ch ng Trichoderma đ i v i 4 ch ng
F. solani gây b nh th i r cam quít (4 ngày sau khi nuôi c y)

66

Hi u su t đ i kháng (%) đã hi u ch nh c a các ch ng Trichoderma
thu th p t i Ti n Giang đ i v i F. solani gây b nh th i r cam quít
(3 ngày sau khi nuôi c y)

68

Hi u su t đ i kháng (%) đã hi u ch nh c a các ch ng Trichoderma
thu th p t i V nh Long đ i v i F. solani gây b nh th i r cam quít
(3 ngày sau khi nuôi c y)

69

Hi u su t đ i kháng (%) đã hi u ch nh c a các ch ng Trichoderma
thu th p t i C n Th và H u Giang đ i v i F. solani gây b nh th i r
cam quít (3 ngày sau khi nuôi c y)

70

nh h ng c a pH môi tr ng đ n hi u su t đ i kháng (% A.E.)
c a sáu ch ng Trichoderma đ i v i hai ch ng Fusarium

72

Sinh kh i khô (g) và m t đ quang (O.D) c a các exo- và endochitinase do 18 ch ng Trichoderma ti t ra (sau 5 ngày nuôi c y)
trên môi tr ng l ng chuyên bi t có chitin

74

T l bào t F. solani m c m m trong d ch trích nuôi c y các
ch ng Trichoderma ba m c pH khác nhau

80

M t s (x 106 cfu/g đ t) c a các ch ng Trichoderma 12 tu n sau
khi ch ng Fusarium (4 tu n sau khi ch ng Trichoderma)

84

3.2

3.3

3.4

3.5
3.6

3.7

3.8

3.9
3.10

3.11
3.12


xv

M t s (x 106 cfu/g đ t) c a Fusarium trong hai ng n c a các nhóm
nghi m th c 12 tu n sau khi ch ng Fusarium (4 tu n sau khi
ch ng Trichoderma)

85

M t đ quang (OD) c a chitinase trong lá và r cây quít Ti u 12
tu n sau khi ch ng Fusarium (4 tu n sau khi ch ng Trichoderma)

87

M t đ quang (OD) c a β -1,3-glucanase trong lá và r cây quít

Ti u 12 tu n sau khi ch ng Fusarium (4 tu n sau khi ch ng
Trichoderma)

88

3.16

K t qu xác đ nh loài Trichoderma d a vào d li u c a NCBI

96

3.17

Tác đ ng c a các d ng N đ n đ ng kính khu n l c (cm) c a hai
ch ng Trichoderma T-BM2a và T-OM2a trong PDA sau 2 ngày
nuôi c y

97

Tác đ ng c a các d ng N đ n m t s (x 105 cfu/d a petri) c a hai
ch ng T-BM2a và T-OM2a trong PDA sau 7 ngày nuôi c y

98

Tác đ ng c a P, K, Ca và Mg đ n đ ng kính khu n l c (cm) c a
hai ch ng Trichoderma T-BM2a và T-OM2a trong môi tr ng
PDA sau 2 ngày nuôi c y

99

Tác đ ng c a P, K, Ca và Mg đ n m t s (x 105 cfu/d a petri) c a
hai ch ng T-BM2a và T-OM2a trong môi tr ng PDA sau 7 ngày
nuôi c y

99

Tác đ ng c a các d ng N trên sinh kh i khô (g/lít) c a hai ch ng
Trichoderma T-BM2a và T-OM2a trong môi tr ng PDB sau 7
ngày nuôi c y

100

Tác đ ng c a các d ng phân N đ n m t s (x 104 cfu/ml) c a hai
ch ng T-BM2a và T-OM2a trong môi tr ng PDB sau 7 ngày
nuôi c y

101

Tác đ ng c a P, K, Ca và Mg đ n sinh kh i khô (g/lít) c a hai
ch ng Trichoderma T-BM2a và T-OM2a trong môi tr ng PDB
sau 7 ngày nuôi c y

102

Tác đ ng c a P, K, Ca và Mg đ n m t s (x 104 cfu/ml) c a hai
ch ng T-BM2a và T-OM2a trong môi tr ng PDB sau 7 ngày
nuôi c y

103

M t s (x 103 cfu/g đ t) c a Trichoderma (ch ng T-TO2b) và F.
solani (F-OM2) th i đi m 8 và 12 tu n sau khi c y

104

M t s (x 103 cfu/g đ t) c a ch ng Trichoderma T-TO2b và F.
solani F-OM2 8 và 12 tu n sau khi c y

105

3.13

3.14
3.15

3.18
3.19

3.20

3.21

3.22

3.23

3.24

3.25
3.26

xvi

3.27

Hi u qu phân h y h u c (% tr ng l ng khô gi m) c a 2 ch ng
Trichoderma T-OM1 và T-TO2b trên 7 lo i nguyên li u th c v t
sau 9 tu n nuôi

107

Hi u qu phân h y r m (% tr ng l ng khô gi m) c a 2 ch ng
Trichoderma T-OM1 và T-TO2b trên các lo i dinh d ng khoáng
(sau 9 tu n nuôi )

109

3.29

Tác đ ng c a Trichoderma lên n m r m

111

3.30

C p r ph c h i (c p 0-5) sau khi x lý thu c và các ch ng
Trichoderma v i phân h u c đã hoai t i các mô hình Ti n Giang

112

C p r ph c h i (c p 0-5) sau khi x lý thu c và các ch ng
Trichoderma v i phân h u c đã hoai t i các mô hình V nh Long

114

M t s Trichoderma (x 105 cfu/g đ t khô) vùng r b nh sau khi
x lý thu c và các ch ng Trichoderma v i phân h u c đã hoai
t i các mô hình Ti n Giang

115

M t s Trichoderma (x 105 cfu/g đ t khô) vùng r b nh sau khi
x lý thu c và các ch ng Trichoderma v i phân h u c đã hoai
t i các mô hình V nh Long

116

pH đ t
vùng r b nh sau khi x lý thu c và các ch ng
Trichoderma v i phân h u c đã hoai t i các mô hình Ti n Giang

117

pH đ t
vùng r ph c h i sau khi x lý thu c và các ch ng
Trichoderma v i phân h u c đã hoai t i các mô hình V nh Long

118

C p r ph c h i (c p 0-5) sau khi x lý thu c và các ch ng
Trichoderma v i v t li u h u c ch a hoai t i các mô hình Ti n
Giang, V nh Long, C n Th và H u Giang

122

M t s Trichoderma (x 105 cfu/g đ t khô) sau khi x lý thu c và
các ch ng Trichoderma v i ngu n v t li u h u c ch a hoai t i
các mô hình Ti n Giang, V nh Long, C n Th và H u Giang

125

pH đ t
vùng r b nh sau khi x lý thu c và các ch ng
Trichoderma v i ngu n v t li u h u c ch a hoai t i các mô
hình Ti n Giang, V nh Long, C n Th và H u Giang

126

3.28

3.31
3.32

3.33

3.34
3.35
3.36

3.37

3.38


xvii

DANH SÁCH HÌNH
Hình
1.1
1.2
2.1
2.2
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9

Tên hình

Trang

Loài F. oxysporum (đ i bào t , ti u bào t , bào t đính trên môi tr ng)
Loài F. solani (đ i bào t , ti u bào t , bào t đính trên môi tr ng)
L u đ n i dung các v n đ c n gi i quy t c a lu n án

Thí nghi m trên l nh a 2 ng n
T l b nh h i (%) trên các v n cam quít đi u tra t i Ti n Giang,
C n Th và H u Giang
i u tra và thu th p m u các v n cây b b nh
Tri u ch ng b nh th i r trên quít Ti u do F. solani (Lai Vung, ng
Tháp)
Tri u ch ng b nh th i r trên chanh do F. solani (Ô Môn, C n Th )
Tri u ch ng vàng lá trên nhánh b i do F. solani (Cái Bè, Ti n Giang)
Tri u ch ng ch t cây trên b i do b nh th i r F. solani (Tam
Bình, V nh Long)
R quít Ti u b nhi m F. solani
R cam Sành b nhi m F. solani

11
13
30
40
54
57
57
57
57
57
59
59
59

3.11

Ch ng F. solani F-OM1 trên kính hi n vi v i th bình (phialide)

dài
i bào t F. solani m c m m, t o khu n ty và t o ti u bào t sau
18 gi trong dung d ch đ ng glucose (2‰)
Ch ng Trichoderma T-TO2b v i th bình m c thành chùm

3.12

Ch ng Trichoderma T-OM1 v i th bình m c rãi rác

59

3.13

Quy trình Koch th m c nhi m b nh v i ch ng F. solani F-BM2
trên cây quít Ti u con
Quy trình Koch th m c nhi m b nh trên quít Ti u v i ch ng
F.solani F-TB4
Quy trình Koch (in-vitro) th m c nhi m b nh v i 2 ch ng F. solani
F-CTTG5 và F-CG4
Quy trình Koch (in-vitro) th m c nhi m b nh v i ch ng F. solani
F-TN2
Kh n ng đ i kháng c a các ch ng Trichoderma v i F. solani
Kh n ng đ i kháng trên đ a petri c a ch ng Trichoderma T-OM1
đ i v i F. solani F-BM2

3.10

3.14
3.15
3.16

3.17
3.18

59
59

64
64
64
64
64
64


xviii

3.19
3.20
3.21
3.22
3.23

3.24
3.25

3.26
3.27
3.28
3.29
3.30

3.31

3.32
3.33
3.34
3.35
3.36
3.37
3.38

Kh n ng đ i kháng c a ch ng Trichoderma T-BM2a đ i v i F.
solani F-OM1 và F-OM2
Kh n ng đ i kháng c a ch ng Trichoderma T-CB8d đ i v i F.
solani F-CTTG2a
Cách t n công c a khu n ty Trichoderma trên s i n m F. solani
S i n m Trichoderma đang cu n F. solani
S khác bi t v màu s c c a d ch trích enzyme c a 2 ch ng
Trichoderma: T-TO2b s n sinh nhi u endo-chitinase và T-BM1a
ít endo-chitinase
Ly trích chitinase t môi tr ng TSM-C v i màng bán th m
(dialysis membrane) kích th c 12 KDa
Kh n ng c ch m c m m đ i bào t F. solani trong d ch ch a
chitinase trích t môi tr ng nuôi ch ng T-TO2b + chitin và F.
solani (F-OM 2)
Kh n ng c ch m c m m đ i bào t F. solani trong d ch trích
ch a chitinase c a các ch ng Trichoderma có tri n v ng
Thí nghi m chia r 2 ng n đ đánh giá kh n ng đ i kháng và kích
kháng c a Trichoderma đ i v i F. solani
R quít Ti u con b nhi m F. solani (F-OM2) 2 ng n và kh

n ng ph c h i sau khi x lý Trichoderma (T-OM2a) ng n 2
R quít Ti u con b nhi m F. solani (F-OM2) 2 ng n và kh
n ng ph c h i sau khi x lý Trichoderma (T-LV1a) ng n 2
Bi u hi n tri u ch ng b nh trên cây quít Ti u con khi b nhi m F.
solani (F-OM2) và kh n ng ph c h i sau khi x lý Trichoderma
(T-TO2b) ng n 2
T ng quan gi a m t s khu n l c F. solani (gây b nh th i r cam
quít) và ch s OD c a chitinase và β-1,3-glucanase trong lá và r
quít Ti u 84 NSKCF (28 NSKCT)
K t qu PCR (đi n di trên agarose gel 1,5%) nh n d ng gene chitinase
Ki m tra s n ph m PCR qua k t qu đi n di trên agarose gel (1,5%)
Kh n ng phân h y các v t li u h u c c a ch ng Trichoderma T-TO2b
M c đ phân h y r m c a Trichoderma v i các dinh d ng
khoáng sau 9 tu n nuôi
Kh n ng phân h y r m c a các ch ng Trichoderma
d th a th c v t v i Trichoderma trong v n cây n trái t i Cái
Bè (Ti n Giang)
phân h u c v i Trichoderma t i Tam Bình (V nh Long)

73
73
73
73

73
73

77
78
90

90
90
90

92
94
95
108
108
108
108
108


xix

3.39
3.40
3.41
3.42
3.43

Trichoderma đang phát tri n trên r m và c Vetiver t i Cai L y (Ti n
Giang)
H th ng r b i đ c kích thích sau khi x lý Trichoderma và bón
h u c (Cai L y, Ti n Giang)
H th ng r b i ph c h i sau khi x lý Trichoderma và bón h u
c (Cái Bè, Ti n Giang)
H th ng r quít ph c h i sau khi x lý Tricô- HCT và bón h u
c (Tam Bình,V nh Long)

Cây ph c h i và ra ch i m i sau khi x lý T-mix và bón h u c (Tam
Bình, V nh Long)

119
119
119
119
119


1

M
1. TÍNH C P THI T C A

U

TÀI

Trong s n xu t nông nghi p, vùng đ ng b ng sông C u Long ( BSCL)
có di n tích tr ng cây n trái chi m t l khá quan tr ng trong c n

c [1].

Tuy nhiên, do đ a hình th p và mùa m a kéo dài, vi c canh tác cây n trái
BSCL c ng g p tr ng i do mùa m a l h ng n m (t tháng 9 - 11 d
l ch).

c đi m này khi n m c n

trong mùa l th

c trong m

ng c a các v

ng

n cây n trái

ng quá cao nên cây n trái, đ c bi t là cam quít, r t d b

ng p úng làm t n th

ng đ n b r cây. M t khác, vi c canh tác

BSCL

còn ph m m t s sai l m do phòng tr d ch h i ch b ng thu c hóa h c và liên
t c bón quá nhi u phân hóa h c [3]. Canh tác b thi u phân h u c , đ t b
thi u vôi và pH đ t th p vì b tr c di do lên li p tr ng lâu n m [148]… đã t o
đi u ki n cho các m m b nh trong đ t nh Fusarium, Phytophthora… th a c
h i t n công làm r cây b h h i [118] và [119].
Trong nh ng n m g n đây, d ch b nh th i r đã gây nhi u thi t h i
nghiêm tr ng cho cây n trái thu c khu v c
(cam M t, cam Sành, cam Soàn, quít

BSCL trên nhóm cây có múi

ng, quít Ti u, các lo i b

i, chanh),

vú s a, nhãn, chôm chôm, xa bô… Tác nhân gây h i ch y u đã đ

c xác

đ nh do loài n m b nh Fusarium solani gây ra [117]. Vi c s d ng các lo i
nông d
th

c đ phòng tr b nh th i r (qua x lý đ t) trên nhóm cây có múi

ng cho hi u qu kinh t không cao và gây ô nhi m môi tr

ng. Trong khi

đó, trong t nhiên l i t n t i r t nhi u lo i vi sinh v t có l i, có kh n ng đ i
kháng v i các lo i n m gây h i trong đ t.

c bi t s hi n di n c a các lo i

m c xanh (green mold), trong đó có các loài n m thu c chi Trichoderma có
kh n ng đ i kháng v i các ngu n n m gây b nh cây đã giúp nhi u cá th


2

n cam quít ch ng ch u đ

trong v

c v i b nh th i r , giúp cây v n ti p t c

phát tri n t t bên c nh các cây ch t vì b nh.
Nhi u công trình nghiên c u c ng cho th y s hi n di n và vai trò c a
các dòng Trichoderma trong vi c kh ng ch Fusarium [60], [127], [64], c ng
là tác nhân chính gây b nh th i r trên các v

n cam quít t i

BSCL. Tuy

nhiên, ho t đ ng đ i kháng v i các lo i n m gây h i r cây c a Trichoderma
c ng nh m c đ gây h i c a Fusarium l i ch u tác đ ng b i nhi u y u t do
môi tr
l

ng đ t chi ph i nh : Sa c u đ t, pH [138], [19], m đ đ t và hàm

ng h u c [64] cùng các d

ng ch t nh h

ng đ n đ phì nhiêu c a đ t

(N, P, K, Ca...) [138].
Do đó, vi c nghiên c u và áp d ng bi n pháp sinh h c, s d ng các loài
n m thiên đ ch đ i kháng đ phòng tr b nh th i r trên cây có múi là đi u c n
thi t, nh m tìm ra gi i pháp góp ph n n đ nh v

n cây m t cách b n v ng và

kinh t .
2. M C TIÊU C A
S

TÀI

d ng n m Trichoderma làm công c đ qu n lý b nh th i r do

Fusarium solani gây h i trên cây có múi.
¬ M c tiêu c th :
- S u t p, phân l p và tách ròng các ch ng Trichoderma b n đ a làm
ngu n n m đ i kháng ch ng l i b nh th i r do F. solani gây h i trên cam quít.
- Kh o sát tác đ ng c a Trichoderma đ i v i F. solani và h th ng r c a
cam quít.
- Kh o sát m i t
hoá sinh và DNA.

ng tác gi a Trichoderma và F. solani trên khía c nh


3

- Xác đ nh các y u t t đ t (sa c u và phì nhiêu đ t) tác đ ng đ n m i quan
h gi a Trichoderma và F. solani trên cam quít.
-

ánh giá hi u qu c a các ch ng Trichoderma trong vi c kh ng ch

b nh th i r do F. solani trong các v

n cam quít trong đi u ki n canh tác t i

đ ng b ng sông C u Long.
3.

IT
-

NG VÀ PH M VI NGHIÊN C U
it

ng nghiên c u c a đ tài: Phòng tr b nh th i r trên cây có múi

do n m Fusarium solani gây h i b ng các ch ng n m đ i kháng Trichoderma
b n đ a.
- Ph m vi nghiên c u c a đ tài: S d ng n m Trichoderma đ qu n lý
b nh th i r trên các v

n cây có múi t i các t nh thu c đ ng b ng sông C u

Long (Ti n Giang, V nh Long, C n Th và H u Giang).
Th i gian th c hi n đ tài t 2002 - 2008.
4. NH NG ÓNG GÓP C A LU N ÁN
-

ã phân l p đ

c 318 ch ng Trichoderma và 114 ch ng F. solani

trong đó qua quy trình Koch, đã xác đ nh F. solani là tác nhân gây b nh vàng
lá th i r trên cam quít t i các t nh BSCL.
- Dùng ph

ng pháp sinh tr c nghi m đánh giá kh n ng ti t chitinase

đ i kháng v i n m b nh đã giúp ch n đ

c 11 ch ng Trichoderma có kh

n ng đ i kháng t t đ phòng tr sinh h c b nh th i r cam quít.
-.Tính đ i kháng b nh c a các ch ng Trichoderma có đ
n ng ti t các exo- và endo-chitinase, đ
ech42. Trichoderma còn giúp cây t o đ
di n c a chitinase và glucanase

c là nh kh

c đi u khi n t 2 gen mã hóa chit73 và
c kh n ng kháng b nh qua s hi n

r và lá, giúp cây đ kháng l i v i F solani.

K t qu gi i trình t DNA c a vùng ITS và EF đã xác đ nh 5 ch ng tri n


4

v ng thu c 2 loài T. harzianum (T-BM2a, T-TO2a, T-TO2b) và T. asperellum
(T-LV1a, T-OM2a).
- Mô hình ng d ng s d ng các ch ng Trichoderma tri n v ng đ tr
b nh th i r k t h p v i v t li u h u c cho th y có kh n ng kh ng ch b nh
th i r cam quít trong đi u ki n đ t v

n có pH th p (4,0 – 4,4). S ph i h p

các ch ng đã cho hi u qu cao và n đ nh qua 13 đi m thí nghi m t i 4 t nh
thu c
th

BSCL. Các ch ng Trichoderma ph i h p đã đ ng ký s n xu t v i tên

ng m i là Tricô- HCT. Vi c ng d ng s n ph m Tricô- HCT góp ph n

vào vi c qu n lý hi u qu b nh th i r trên cây có múi

BSCL.

5. GI THI T NGHIÊN C U
- Cây cam quít có th thoát đ

c b nh th i r do F. solani nh s hi n

di n và đ i kháng h u hi u c a các ch ng Trichoderma.
- S sinh tr

ng và ho t đ ng c a F. solani và Trichoderma có th b chi

ph i do tác đ ng c a các y u t t đ t nh : Sa c u đ t và dinh d

ng khoáng

trong đ t.
- Áp d ng bi n pháp bón phân h u c và cung c p Trichoderma cho đ t
có th giúp cây phòng tr đ
6. H N CH C A
Vi c

c b nh th i r trên cây có múi m t cách n đ nh.

TÀI

ng d ng r ng rãi bi n pháp phòng tr b nh th i r

Trichoderma còn g p h n ch do đ t v

n tr ng cây n trái

li p nhi u n m nên b thi u ch t h u c tr m tr ng. Nhi u nhà v
có t p quán bón phân h u c đ phòng tr b nh cây theo h

b ng

BSCL đã lên
n v n ch a

ng sinh h c.

5

CH

NG 1

T NG QUAN TÀI LI U
1.1. N m Fusarium
Vi c canh tác cây tr ng th

ng ph i đ i phó v i nhi u lo i sâu b nh gây

h i, trong đó nh ng b nh phát sinh t đ t (soilborne diseases) là các đ i t

ng

quan tr ng, làm t ng chi phí s n xu t, gây th t thu n ng su t, đ ng th i còn
làm gi m ch t l

ng và giá tr c a nông s n. Trong các lo i b nh trong đ t,

Fusarium là m t trong nh ng chi n m gây nhi u thi t h i trên di n r ng và
nh h

ng nhi u đ n n ng su t cây tr ng [11].

Chi Fusarium phân b r ng rãi kh p các vùng đ t canh tác nhi t đ i và bán
nhi t đ i. Chi này đã đ

c Leslie và Summerell (2006) [88] phân lo i đ n 70

loài, gây nhi u t n th t l n cho ngành rau, màu và hoa ki ng trên th gi i [11].
Trong chi Fusarium, ba loài F. oxysporum, F. solani và F. moniliforme
đ

c xem là quan tr ng nh t do kh n ng phân b r ng và m c đ gây h i

c a chúng đ n cây tr ng [11]. C 3 loài này đ u hi n di n ph bi n
Nam, trong đó F. oxysporum th

Vi t

ng gây h i trên các lo i rau c i, chu i...

[23], F. solani l i t n công các lo i hoa màu, h tiêu, cây n trái... [23], [5],
[4], còn F. moniliforme làm thi t h i cho lúa, b p, mía..., trong đó b nh lúa
Von gây thi t h i nghiêm tr ng cho các vùng tr ng lúa
1.1.1

Á châu [115], [23].

c đi m hình thái
Fusarium là lo i vi n m thu c ngành n m Mycota, l p n m B t Toàn

Deuteromycetes (hi n đ

c x p vào l p Hypocreales, Ascomycetes), b n m

Bông Moniliales, h Tuberculariaceae [31], [126], [8]. Giai đo n h u tính h u

h t đ u thu c chi Gibberella, m t s loài thu c chi Nectria [126].