GIÁO D C VÀ ÀO T O
B
NÔNG NGHI P VÀ PHÁT TRI N NÔNG THÔN
VI N KHOA H C NÔNG NGHI P VI T NAM
------------------HÙYNH V N NGHI P
D NG D U CHU N PHÂN T
PHÁT HI N GEN
KHÁNG B NH B C LÁ (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)
H T C A M T S GI NG LÚA TR NG
NG B NG SÔNG C U LONG
Chuyên ngành: Di truy n và ch n gi ng
Mã s : 62 62 05 01
LU N ÁN TI N S NÔNG NGHI P
n Th - 2012
i
GIÁO D C VÀ ÀO T O
B
VI N KHOA
NÔNG NGHI P VÀ PHÁT TRI N NÔNG THÔN
C NÔNG NGHI P VI T NAM
------------------HÙYNH V N NGHI P
D NG D U CHU N PHÂN T
PHÁT HI N GEN
KHÁNG B NH B C LÁ (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)
H T C A M T S GI NG LÚA TR NG
NG B NG SÔNG C U LONG
Chuyên ngành: Di truy n và ch n gi ng
Mã s : 62 62 05 01
LU N ÁN TI N S NÔNG NGHI P
Ng
ih
ng d n khoa h c:
GS. TS. Bùi Chí B u
n Th - 2012
ii
IC MT
Xin chân thành
m n:
- GS.TS. Bùi Chí B u và GS.TS. Nguy n Th Lang ã t n tình ch b o và h
n các n i dung, ph
ng
ng pháp và k ho ch tri n khai thành công các mơn h c,
th c hi n các thí nghi m và hoàn thi n lu n án.
- Các th y cô tham gia gi ng
Vi n Lúa
y l p nghiên c u sinh khóa 1
o Vi n Lúa
ng b ng sông C u Long ã giúp
thu n l i cho tơi trong su t th i gian
- Phịng Khoa
giúp
o sau
c t p, th c hi n
c và H p tác qu c t Vi n Lúa
i
c Vi n Khoa
tôi t n tình trong th i gian
- Các
ào
o
ng B ng Sông C u Long.
- Ban lãnh
Ban ào
ac s
và t o i u ki n
tài và hoàn thi n lu n án.
ng b ng sông C u Long và
c Nông Nghi p Vi t Nam ã h
ng d n và
c t p, nghiên c u và b o v lu n án.
ng nghi p B môn Công ngh H t gi ng và Phịng Hành chính T ch c.
- Gia ình cùng các
n bè thân h u,
cho tôi trong su t th i gian
ng nghi p ã luôn
c t p, th c hi n
ng viên, giúp
tài và hoàn thi n lu n án này.
Tác gi lu n án
Hu nh V n Nghi p
iii
ng Hòa Xã H i Ch Ngh a Vi t Nam
c L p – T Do – H nh Phúc
-------------
I CAM OAN
Tơi xin cam oan cơng trình nghiên c u “
d ng d u chu n phân t
phát hi n gen kháng b nh b c lá (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) t h t c a
t s gi ng lúa tr ng
ng b ng sông C u Long” này là c a riêng tôi. Các s
li u, k t qu nêu trong lu n án là trung th c và ch a t ng
c ai công b trong b t
công trình nào khác.
Tác gi lu n án
Hu nh V n Nghi p
iv
M CL C
TT
1.
2.
3.
4.
5.
I
1.1.
1.1.1.
1.1.2.
1.2.
1.2.1.
1.2.2.
1.2.3.
II
2.1.
2.1.1.
2.1.2.
2.1.3.
2.1.4.
2.1.5.
2.1.6.
2.2.
2.2.1.
2.2.2.
2.2.3.
2.3.
2.3.1.
2.3.2.
I DUNG
M
U
Tính c p thi t c a tài ………………………………………
M c tiêu c a tài ……………………………………………
Ý ngh a khoa h c và th c ti n c a tài …………………
i t ng nghiên c u ………………………………………..
Ph m vi nghiên c u …………………………………………..
CH
NG I: C S KHOA H C C A
TÀI VÀ T NG
QUAN TÀI LI U
C s khoa h c c a tài …………………………………….
C s v gen kháng b nh b c lá ……………………………...
C s d a trên xây d ng b n
gen kháng b nh b c lá …….
Tình hình nghiên c u trong và ngồi n c
Gi i thi u chung v b nh b c lá lúa ………………………….
ánh giá ki u hình tính kháng b nh b c lá c a các gi ng lúa ..
ng d ng MAS trong ch n t o gi ng lúa ……………………
CH
NG II: V T LI U, N I DUNG VÀ PH
NG PHÁP
NGHIÊN C U
t li u nghiên c u
B gi ng lúa chu n kháng nhi m và b gi ng th nghi m …..
Các nòi vi khu n b c lá Xoo ………………………………….
Ph ng ti n và hố ch t ni c y vi khu n …………………..
Ph ng ti n và hố ch t ly trích DNA ……………………….
Ph ng ti n và hoá ch t cho n di agarose gel ……………..
Ph ng ti n và hoá ch t cho PCR ……………………………
N i dung nghiên c u
ánh giá ki u hình các gi ng lúa th nghi m i v i b nh
c lá
ánh giá ki u gen kháng b nh b c lá lúa c a các gi ng lúa
th nghi m
T o các qu n th h i giao chuy n gen kháng b nh b c lá ……
Ph ng pháp nghiên c u
ánh giá ki u hình các gi ng lúa th nghi m i v i b nh
c lá
ánh giá ki u gen kháng b nh b c lá lúa c a các gi ng lúa
th nghi m
v
TRANG
1
1
2
3
3
3
4
4
4
6
9
9
14
20
40
40
40
40
41
41
42
43
45
45
45
45
46
46
47
2.3.3.
2.3.4.
III
3.1
3.1.1
3.1.2
3.1.3
3.2
3.2.1
3.2.2
3.3
3.3.1
3.3.2
3.3.3
IV
4.1
4.1.1.
4.1.2.
4.1.3.
4.2
T o các qu n th h i giao chuy n gen kháng b nh b c lá ……
Phân tích s li u ………………………………………………
CH
NG III: K T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N
ánh giá tính kháng b nh b c lá c a các b gi ng lúa th
nghi m ………………………………………………………..
ánh giá các gi ng ch th kháng v i các nòi b nh b c lá t i
BSCL ……………………………………………………….
ánh giá tính kháng b nh b c lá c a b gi ng lúa mùa ……...
ánh giá tính kháng b nh b c lá c a b gi ng lúa cao s n
ng n ngày……………………………………………………..
ng
ngàyki u gen kháng b nh b c lá c a các gi ng lúa th
ánhn giá
nghi m ……………………………………………………….
Phân tích m u b ng ph ng pháp SSR ………………………
Phân tích m u b ng ph ng pháp STS ……………………….
o các qu n th h i giao chuy n gen kháng b nh b c lá ……
t qu t o h t h i giao l n th nh t (BC1) cho các qu n th
t qu ánh giá các qu n th BC1 và t o h t h i giao l n 2
(BC2) …………………………………………………………
t qu ánh giá sàng l c cây mang gen kháng và ch n dòng
thu n t các qu n th h i giao mang gen kháng b nh b c lá ...
CH
NG IV: K T LU N VÀ
NGH
t lu n
ánh giá ki u hình
ánh giá ki u gen
t qu h i giao và so sánh ki u gen v i ki u hình
ngh
CÁC CƠNG TRÌNH Ã CƠNG B CÓ LIÊN QUAN
LU N ÁN
TÀI LI U THAM KH O
PH L C
vi
52
54
55
55
55
58
68
74
74
87
92
94
94
94
103
103
103
104
104
105
N
106
107
DANH SÁCH B NG
TT
1.1
1.2
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
2.9
3.1
TÊN B NG
TRANG
Thang ánh giá b nh b c lá lúa
20
Các lo i d u chu n DNA thông d ng
22
Môi tr ng nuôi c y vi khu n
41
Dung d ch ly trích DNA
42
Dung d ch TE
42
PCR buffer
43
Các STS và SSR ánh d u s d ng trong tài
44
Thành ph n h n h p cho m t m u DNA th c hi n ph n ng
50
PCR
Chu trình ho t ng c a máy PCR
50
Thành ph n h n h p cho m t m u DNA th c hi n ph n ng
51
PCR
Chu trình ph n ng PCR
51
ánh giá 13 nòi b nh b c lá trên b gi ng ch th cho gen
56
kháng b nh b c lá
3.2
Ph n ng c a các gi ng lúa mùa v i các nòi vi khu n gây
nh b c lá t i BSCL
60
3.3
ma tr n bi u hi n m i t ng quan gi a t ng nòi b nh
c lá v i 13 nòi b nh b c lá thu th p t i BSCL trên B
gi ng lúa mùa a ph ng
63
3.4
Ph n ng c a các gi ng lúa mùa v i các nòi vi khu n gây
nh b c lá
c thu th p t IRRI
65
3.5
Ph n ng chi u dài c a v t b nh qua các nòi vi khu n gây
nh b c lá lúa
69
3.6
ma tr n bi u hi n m i t ng quan gi a t ng nòi b nh
c lá v i 13 nòi b nh b c lá thu th p t i BSCL trên B
gi ng lúa cao s n ng n ngày
71
3.7
3.8
3.9
3.10
ánh giá alen c a các gi ng lúa mùa và các gi ng
ch ng b ng marker RM13
ánh giá alen c a các gi ng lúa mùa và các gi ng
ch ng b ng marker RM122
So sánh t ng quan gi a ki u hình và ki u gen
i
i
ánh giá s alen, ki u hình c a marker SSR có liên k t v i
gen xa-5 trên b gi ng lúa ng n ngày, cao s n
vii
77
80
81
90
3.11
3.12
3.13
3.14
ánh giá s alen, ki u hình c a marker STS có liên k t v i
gen Xa-21 trên b gi ng lúa ng n ngày, cao s n
Tóm t t quá trình t o các qu n th h i giao n th h BC4
cho các gi ng lúa nghiên c u
So sánh ki u gen và ki u hình trên 2 ch th phân t RM13,
RM 122 trên qu n th BC2F2 c a IR 24/ OM 2514
So sánh ki u gen và ki u hình trên 3 ch th phân t pTA
248 , RM 11 và RM 21 trên qu n th BC2F2 c a OM1490/
IRBB21
viii
91
93
99
102
DANH SÁCH HÌNH
TT
TÊN HÌNH
ch n l c trong su t quá trình h i giao nh d u
1.1
Ba m c
chu n
1.2
Ch ng gen kháng nh d u chu n c a hai gen kháng b nh.
Các cá th
ng h p t có th
c ch n l c t qu n th F2
1.3
2.1
2.2
3.1
3.2
3.3
3.4
Ph ng pháp ch n th h ban u
Máy Bio-rad
mơ t q trình t o các qu n th h i giao chuy n gen
kháng b nh b c lá.
Phân nhóm di truy n c a b gi ng lúa chu n nòi b nh b c lá
Vi n lúa Qu c t (IRRI) d a vào tính tr ng chi u dài v t
nh trên 13 nòi vi khu n b c lá thu th p t i BSCL b ng
ph n m m NTSYS pc2.1
Ph n ng b nh c a i di n gi ng lúa mùa Vàng Ngh trên
ph n ng b nh c a 13 nòi kháng b nh b c lá nòi thu t i
BSCL
Phân nhóm di truy n ki u hình c a b gi ng lúa mùa a
ph ng d a vào tính tr ng chi u dài v t b nh trên 13 nòi vi
khu n thu th p t i BSCL b ng ph n m m NTSYS pc2.1
t ng quan c a nịi b nh s 11 (Sóc Tr ng), nòi b nh s
12 (Cà Mau) và nòi b nh s 13 (H u Giang) v i 13 nòi b c
lá thu th p t i BSCL
TRANG
28
28
30
43
53
57
60
62
64
67
3.5
Bi u
ánh giá ph n ng gây kháng nhi m c a 13 nòi vi
khu n gây b nh b c lá thu th p
ng B ng Sông C u
Long lên các gi ng lúa mùa qua ki u hình
67
3.6
Bi u
ánh giá ph n ng gây kháng nhi m c a 11 nịi vi
khu n gây b nh b c lá có ngu n t IRRI lên các gi ng lúa
mùa qua ki u hình
Ph n ng c a gi ng chu n kháng T Tép và chu n nhi m
IR24 v i 13 nòi b nh thu th p
BSCL
Ph n ng b nh c a i di n gi ng lúa cao s n OM 6161 trên
ph n ng b nh c a 13 nòi kháng b nh b c lá nịi thu t i
BSCL
Phân nhóm di truy n ki u hình c a b gi ng lúa cao s n d a
vào tính tr ng chi u dài v t b nh trên 13 nòi vi khu n thu
th p t i BSCL b ng ph n m m NTSYS pc2.1
70
3.7
3.8
3.9
ix
72
73
3.10
3.13 (10): S n ph m khu ch
aragose 3 %
i c a primer RM13 trên gel
76
n ph m PCR v i primer RM 13 trên gi ng lúa mùa trên
gel agarose 3 %
78
3.11
n ph m khu ch i c a RM122 trên gel agarose 3 %
n ph m PCR RM 122 c a các gi ng lúa cao s n khu ch
i gen xa-5
n ph m PCR RM 13 c a các gi ng lúa cao s n kh ch i
gen xa-5
79
83
3.12
3.13
3.14
84
3.15
n ph m PCR v i primer RM13 trên các gi ng lúa cao s n
85
3.16
n ph m PCR trên gel agarose v i gen Xa-10 và các gi ng
lúa cao s n
c ánh giá trên marker RM 206
86
3.17
n ph m PCR s d ng ánh d u RG 136 liên k t v i gen
xa-13 trên các gi ng lúa mùa
87
3.18
n ph m PCR trên gel agarose v i gen Xa-21 và các gi ng
lúa cao s n
c ánh gía trên marker pTA 248
88
Các cá th kháng nhi m trên nòi vi khu n b c lá s 3 thu
th p t i C n Th c a các qu n th lai t t h p lai.IR24/ OM
2514
Ph n ng c a các cá th mang gen b nh b c lá trên qu n th
BC2F2 IR 24/ OM 2514
95
96
3.22
Các cá th kháng nhi m trên nòi vi khu n b c lá s 3 thu
th p t i C n Th c a các qu n th lai t t h p lai OM 1490/
IRBB 21
n ph m PCR c a RM 112 trên qu n th BC 2 F2 t c p lai
IR24/OM 2514
3.23
n ph m PCR c a RM 13 (nhi m s c th s 5) trên qu n th
IR 24/ OM2514//OM 2514
99
n ph m khu ch i PCR c a pTA248 trên qu n th BC2F2
a OM 1490 /IRBB 21 v i pTA248
n ph m khu ch i PCR trên qu n th BC2F2 c a OM
1490/IRBB 21 v i primer RM 11
n ph m khu ch i PCR trên qu n th BC2F2 c a OM
1490 /IRBB 21 v i primer RM 21
100
3.19
3. 20
3. 21
3.24
3.25
3.26
x
96
98
101
101
AFLP
ALP
AP-PCR
BC
CAPS
cM
CRRI
DAF
BSCL
DNA
dNTPs
X
EDTA
GEU
HT
IRRI
LK
LOD
LRR
MAB
MAS
MRDHV-DNA
NARES
NBS
ND
NIL
NPT
NST
OYT
PAU
PCR
PXO
QTL
RAPD
RFLP
RGRP
RIFCB
RIL
RYT
SAHN
NG LI T KÊ CÁC T VI T T T
Amplified fragment length polymorphism
Amplicon length polymorphism
Arbitrary primer-PCR
Backcross
Cleavable amplified polymorphic sequence
Centi Morgan
Central rice research institute (India)
DNA amplification fingerprinting
ng B ng Sông C u Long
Deoxyribose nucleic acid
Deoxyribonucleotide triphosphate
ông Xuân
Disodium ethylene diamine tetraecetate
Germplasm Evaluation and Utilization
Hè Thu
International rice research institute
Liên k t
Logarithmic odds
Leucine-rich repeat
Marker assisted backcrossing
Marker-assisted selection
Moderately repeated, dispersed, and highly variable DNA
(minisatellite)
National Agricultural Research Extension Systems
Nucleotide binding site
Not determined = Ch a xác nh
Near isogenic line
New plant type
Nhi m s c th
Observational yield trial
Punjab Agricultural University (India)
Polymerase chain reaction
Philippines Xanthomonas oryzae
Quantitative trait loci
Random amplified polymorphic DNA
Restriction fragment length polymorphism
Rice genome Research Programme
Research Instititue for food crop biotechnology
Recombinant inbred line
Replicated yield trial
Sequential Agglomerative Hierechical Nonoverlapping
xi
SDS
SES
SNP
SSCP
SSR
TAE
TE
Tris
UPGMA
UV
Xoo
Sodium dodecyl sulfate
Standard evaluation system for rice
Single nucleotide polymorphism
Single strand conformation polymorphism
Simple sequence repeat hay microsatellite
Tris-acetate-EDTA
Tris EDTA
Trizma base
Unweighted pair-group method with arithmetic mean
Ultra violet
Xanthomonas oryzae pv. oryzae
xii
1
U
1. Tính c p thi t c a
tài:
Cây lúa (Oryza sativa L.) là cây l
gi i v c di n tích và s n l
ng, lúa
ng th c quan tr ng
c gieo tr ng trên m t di n tích kho ng 158
tri u ha, v i n ng su t trung bình 4,32 t/ha và có t ng s n l
n/n m [27]. Lúa còn là l
ng th hai trên th
ng kho ng 685 tri u
ng th c chính cho h n phân n a s dân trên th gi i.
Tuy nhiên, h n 90% di n tích lúa trên th gi i
c t p trung tr ng và tiêu th t i
Châu Á.
Vi t nam, cây lúa c ng
do nó
c xem là cây l
c gieo tr ng trên di n r ng và
chính trong b a n hàng ngày. Lúa
c a s ng
40 tri u t n/n m [8]. Trong nh ng n m qua s n l
gia t ng trên m t n n di n tích có chi u h
c chi n l
c an ninh l
m 2010 kho ng 6 tri u t n,
Có
i dân dùng làm l
ng th c
c gieo tr ng trên m t di n tích h n 7,5 tri u
ha, v i n ng su t bình quân là 5,32 t/ha, và t ng s n l
o
ng th c quan tr ng b c nh t
ng c n m
ng lúa c a n
t kho ng g n
c ta không ng ng
ng suy gi m, chúng ta khơng ch
ng th c mà cịn duy trì l
ng g o
m
c xu t kh u
ng th hai trên th gi i sau Thái Lan [8].
c nh ng thành qu v s n xu t và xu t kh u lúa g o trong nh ng n m
qua, ngồi nh ng c ch m c a Chính ph , cịn có s
óng góp tích c c c a các
nhà khoa h c trong các l nh v c khác nhau nh : Di truy n ch n gi ng, công ngh
sinh h c, nông h c, khoa h c
nh ng thành t u khoa h c
i phát sinh và
nhi m môi tr
t, côn trùng và b nh cây ...Tuy nhiên, song song v i
c ng d ng vào th c ti n s n xu t, nhi u v n
t ra nh ng thách th c cho s n xu t ph i gi i quy t nh v n
Châu Á. B nh
t
u tiên
c ghi nh n
u nghiên c u b nh t 1901 và mãi
i
c xác
ô
ng, s b c phát c a các loài sâu b nh h i...Trong ó b nh b c lá,
t trong nh ng b nh h i lúa nghiêm tr ng nh t cho các qu c gia tr ng lúa
là
m i
c bi t
Nh t B n vào nh ng n m 1884-1885,
n n m 1922 nguyên nhân gây ra b nh
nh. B nh sau ó d n d n lây lan sang các n
c tr ng lúa khác
Châu Á, Châu Úc, Châu Phi, M La Tinh và Hoa K , b nh ã th t s
e do s n
2
xu t nh t là nh ng vùng có h th ng n
ct
i, th t thoát n ng su t có th lên
50% [48], th m chí có n i s th t thốt n ng su t cịn lên
n
n 80% [65].
Hi n nay vi c phòng tr b nh cháy bìa lá cịn nhi u h n ch vì ch a có thu c
c tr h u hi u, bi n pháp canh tác ch mang l i s phòng ng a nh t
nh, gi i
pháp t t nh t v a d áp d ng, ti t ki m chi phí s n xu t và khơng nh h
mơi tr
ng
n
ng s ng ó là s d ng gi ng kháng b nh b c lá. Vì v y, công tác ch n t o
gi ng kháng b nh
c th c hi n th
ng xuyên,
ng th i v i chi n l
c s d ng
gen kháng h p lý nh m kéo dài th i gian s d ng gi ng kháng và h n ch s thích
nghi c a vi sinh v t gây b nh trên các gi ng kháng.
Hi n nay có 30 gen kháng b nh b c lá ã
Gen Xa-21
[39],
c công b trên th gi i [53].
c tìm trên lúa hoang Oryza longistaminata có ngu n g c
Châu Phi
ng B ng Sông C u Long m t s gen kháng b nh b c lá c ng ã
th y trên các gi ng lúa mùa
a ph
ng b ng k thu t ánh d u phân t nh : xa-5
trên các gi ng Ba Túc Gi ng ôi, Koi Bo Teng; xa-13 trên các gi ng Cà
Túc, Th m Lung, V Phích, N p Hoa Vàng [5].
c lá
a vào các gi ng lúa c i thi n b ng ph
ng pháp lai t o c truy n, ịi h i
tr ng khó phân l p ki u hình nh gen kháng b nh b c lá.
tài: “
m t s tính
d ng d u
phát hi n gen kháng b nh b c lá (Xanthomonas oryzae pv.
oryzae) t h t c a m t s gi ng lúa tr ng
sung vào ph
ung, Ba
khai thác các gen kháng b nh
ph i m t nhi u th i gian, hi u qu ch n l c th p, khó thành cơng
chu n phân t
c tìm
BSCL”
c
ngh th c hi n nh m
ng pháp ch n t o gi ng lúa kháng b nh b c lá m t cách nhanh và
chính xác h n.
2. M c tiêu c a
Xác
nh
tài:
c m t s gi ng lúa mang gen kháng b nh b c lá b ng vi c ánh
giá ki u hình và ki u gen kháng b nh b c lá
ph c v cho công tác ch n t o
gi ng.
o các dòng lai h i giao mang gen kháng b nh b c lá.
3
3. Ý ngh a khoa h c và th c ti n c a
tài:
3.1. Ý ngh a khoa h c
- Xác
nh v t li u di truy n mang các gen kháng b nh b c lá lúa làm c s
cho quá trình lai t o.
-
ng
ng d u chu n phân t trong nghiên c u ch n
gen kháng b nh
-
o gi ng lúa mang
c lá.
ng d ng lai h i giao
chuy n gen kháng b nh b c lá vào các gi ng lúa.
3.1. Ý ngh a th c ti n
- Ch n t o gi ng lúa mang gen kháng b nh b c lá ph c v s n xu t lúa t i
BSCL.
- H tr quá trình ch n gi ng lúa kháng b nh b c lá nhanh và chính xác.
- M t s k t qu c a
tài có th s d ng trong các cơng trình nghiên c u
ti p theo và trong gi ng d y.
4.
it
ng nghiên c u:
it
ng nghiên c u c a
tài là các b gi ng lúa mùa, b gi ng lúa cao
n, các isolate (ch ng phân l p) vi khu n b c lá và các d u chu n phân t thích h p
phát hi n b nh b c lá.
5. Ph m vi nghiên c u:
Ph m vi nghiên c u c a
tài là ánh giá ki u hình tính kháng b nh b c lá
a b gi ng lúa mùa, b gi ng lúa cao s n
c tr ng t i các t nh
BSCL
iv i
các nòi và isolate vi khu n b c lá thu th p t Vi n nghiên c u lúa Qu c t (IRRI) và
các t nh
BSCL. Ngồi ra,
tài cịn s d ng d u chu n phân t thích h p
phát hi n gen kháng b nh b c lá c a m t s gi ng lúa th nghi m.
Th i gian và
a
Phịng thí nghi m, nhà l
BSCL.
m nghiên c u: Th i gian 5/2006-5/2010;
a
m:
i, ru ng thí nghi m, B môn Di truy n gi ng – Vi n lúa
4
CH
S
KHOA H C C A
1.1. C s khoa h c c a
NG I
TÀI VÀ T NG QUAN TÀI LI U
tài
1.1.1. C s v gen kháng b nh b c lá:
Hàng ch c gen ã
c xác
nh kháng
i v i b nh b c lá và
o ơn trên
trang ch (www.gramene.org), qua ó có 13 clone t nh ng nhóm khác nhau, bao
m sáu gen kháng b c lá
c phân l p bao g m các gen nh Xa-1 s n xu t ra
protein NBS (nucleotide-binding site) và LRR (leucine rich repeat) [77]), Xa-3/Xa26 s n xu t ra leucine rich repeat và TM (transmembrane region) [69],[75]; xa-5 s n
xu t y u t phiên mã IIA [36], xa-13 ch a bi t protein [21], xa-5 s n xu t protein
TM kinase [67], và Xa-27 ch a bi t protein [32].
Ngoài ra, m t s gen kháng m nh ã
cl pb n
cung c p nhi u marker trình t DNA c a gen (th
ng
, s phát tri n này ã
c g i là các marker ch c
ng) ho c liên k t g n v i các gen ph c v cho ch ng gen thông qua ph
ng pháp
ch ng gen nh vào MAS.
i m c tiêu c i ti n c a lúa lai u tú, MAS ã
c ti n hành
du nh p
gen Xa-21 vào gi ng lúa Minghui63 và Shanyou63 [19]. Các tính tr ng nơng h c
c ki m tra trên
gi ng lúa thông th
nh. D
ng ru ng cho th y r ng gi ng lúa c i ti n mang gen Xa-21 và
ng
c xác
nh là t
ng
i gi ng nhau khi khơng có áp l c
i áp l c b nh n ng, gi ng lúa Minghui63 (Xa-21) bi u hi n tr ng l
ng
t và t l th ph n cao h n gi ng lúa Minghui63 bình th
ng, và gi ng lúa
Shanyou63 (Xa-21) c ng cao h n gi ng lúa Shanyou63 bình th
ng m t cách có ý
ngh a v s l
ng h t trên bông, tr ng l
Con lai c i ti n ã
Qu c. MAS c ng ã
ng h t, và n ng su t.
c s d ng trong s n xu t lúa th
ng m i
Trung
c áp d ng thành công trong ch ng b n gen kháng b c lá
(Xa-4, xa-5, xa-13, và Xa-21) theo nh ng s k t h p khác nhau [35]. K t qu các
dòng lúa cho th y tính kháng t ng c
ng trong
c hai m c: ph kháng và m c
5
nh, th hi n tính h u ích c a ph
phân t
ng pháp ch ng gen nh s tr giúp c a marker
phát tri n các gi ng lúa mang a gen kháng.
u quan tr ng là hi u
c ph gây b nh c a qu n th b nh
ánh d u
phát tri n c a tính kháng b nh trong ch n gi ng. Chen và ctv. [20] ã phân tích
các nịi b nh t 792 isolate c a Pyricularia grisea ch y u t i mi n Trung và mi n
Nam Trung Qu c. Nh ng isolate này
c th nghi m b ng cách
khác nhau t 6 loài Indica và 7 loài Japonica g n nh
mang h u h t các gen kháng bênh
bi t l n
o ôn tr
v i 13 ký ch
ng gen (NILs), t p h p
c ây. K t qu cho th y m t s khác
các t n s c a các isolate t o ra nh ng ph n ng t
ng thích trên các
dịng NILs, ví d t l r t nh (10% ho c ít h n) c a các isolate có th gây ra ph n
ng.
c dù MAS có hi u qu trong ch ng các gen kháng b nh, nh ng ph
ng
pháp chuy n gen v n có th có m t vai trò trong vi c s d ng các gen nhân b n. Ví
, gen Xa-26
ph i
này
c phân l p t các gi ng indica Minghui63 [69], nó kháng v a
i v i vi khu n b c lá
c
giai
n tr
ng thành. Khi gen
a vào m t s gi ng Japonica theo promoter t nhiên c a nó, cho th y
ng cây tr ng chuy n gen t ng c
c kháng lên
ng c
n cây con và giai
n giai
ng tính kháng, ph kháng
n t ng tr
c m r ng và t ng
ng kéo dài [17], nó ã ch ra r ng tính kháng
ng g n ch t v i s bi u hi n cao c a gen.
bi u hi n quá m c c a gen Xa-26 v i m t promoter m nh ti p t c t ng
ng tính kháng trong c hai lồi indica và japonica, trong khi s bi u hi n c a
gen l i do b i s suy y u c a promoter
th y r ng m c
i v i tính kháng. Nh ng k t qu này cho
bi u hi n t i u hóa các gen kháng qua ph
có th k t h p v i MAS
ng pháp chuy n gen
phát tri n các gi ng kháng.
Cùng v i s t ng lên c a các clone mang gen kháng s n có, hi n nay nh ng
chi n l
c m i có tính kh thi cho vi c phát tri n gi ng cây tr ng mang nhi u tính
kháng. Ví d , th c hi n clone nhi u gen kháng v i ph kháng khác nhau vào m t
gi ng duy nh t qua chuy n gen có th
c s d ng cho phát tri n gi ng có ph
6
kháng r ng và kháng b n v ng. So sánh v i ph
ph
ng pháp ch ng a gen s d ng
ng pháp MAS, chuy n m t c u trúc ch a nhi u gen không ch
nh h
phát tri n mà còn thu n ti n cho vi c chuy n giao và truy n nh m t
truy n duy nh t
gen
n
n v di
n nh ng ngu n g c di truy n khác và t m t c u trúc ch a nhi u
n nh ng th h khác, hi u qu c a các gen có th
riêng l .
ng
u này có th
c m r ng
c
c th nghi m
n các gen trong cùng m t nhóm
iv i
tính kháng sâu b nh c ng nh tính tr ng khác, cùng v i các gen kháng b nh. N u
c t i u hóa, chi n l
c này có th h a h n cho s phát tri n hi u qu c a gi ng
a kháng .
1.1.2. C s d a trên xây d ng b n
gen kháng b nh b c lá
Gen Xa-1: Gen Xa-1 th hi n tính kháng chun bi t v i nịi 1 (race1 Xoo)
i Nh t B n. Gen này
th s 4. Gen Xa-1
c tìm th y trong gi ng lúa Kogyoku,
c s d ng ph bi n trong ch
nh trên nhi m s c
ng trình c i ti n gi ng lúa
Nh t B n. Gen Xa-1 mã hoá chu i ký t 1802 amino acid, bao g m nhi u vùng có
tính ch t t
ng
ng v polypeptide c a nh ng gen kháng RPS2, RPM1, N, L6, nó
th hi n thành hai mơ típ NBS và LRR. Vùng giàu leucine c a Xa-1 bao g m sáu
n l p l i khá hồn ch nh, m i
n có 93 amino acid.
Gen Xa-3: Gen Xa-3 liên k t
locus XNpb 181 trên nhi m s c th s 11 v i
kho ng cách di truy n là 5,3 cM.
Gen Xa-4: Gen Xa-4 n m
nhi m s c th s 11 v i kho ng cách di truy n là
1,7 cM và n m gi a 2 RFLP marker: RZ536 và RG303. Gen Xa-4 là gen tr i.
Gen xa-5: Gen xa-5
nh v trên nhi m s c th s 5 [36] ã xây d ng b n
gen b ng RFLP, trong ó có 3 marker liên k t v i xa-5 là: RG556, RG207 và RZ
390 [77].
Gen Xa-10: Gen Xa-10
nh v trên nhi m s c th s 11 liên k t v i marker
RAPD locus 007 2000 v i kho ng cách di truy n 5,3cM.
7
Gen xa-13: Gen xa-13 là gen l n liên k t v i marker RG136 trên nhi m s c
th s 8.
Gen Xa-21: Gen Xa-21
longistaminata có ngu n g c
c tìm th y trong qu n th lúa hoang Oryza
Châu Phi, sau ó ng
phát sinh t lúa hoang này trên gi ng IR24 theo ph
gen, con lai ch a gen Xa-21 kí hi u là IRBB21.
nịi (race) vi khu n
t r ng, ng
Philipin và
i ta thi t l p b n
11. S d ng chi n l
n
i ta t o ra gi ng lúa tr ng
ng pháp t o dòng g n
ng
ánh giá ki u hình v i hàng lo t
, IRBB21 th hi n ph n ng v i ph kháng
gen này và ghi nh n nó
nh v trên nhi m s c th
c “map-base cloning” ã clone hoá phân t DNA
nh v
i locus Xa-21 và phát hi n ra r ng gen Xa-21 là m t thành ph n c a m t h
“multigene” ch a 8 thành viên. Gen này mã hoá protein là m t kinase ho t
nh m t receptor, v i m t
n l p l i có tính gi
nh r t giàu leucine
ng
m t ngoài
bào.
s d a trên xây d ng b n
gen kháng b nh b c lá ã ng d ng thành
cơng vi c ch ng các gen kháng b nh.
Có s l thu c gi a tính kháng b nh c a cây v i s l
di n trong cây, k t h p v i
u ki n môi tr
ng gen kháng hi n
ng c ng nh các nhân t khác. B nh
c lá cây lúa do nhi u nòi vi khu n gây nên, m t gi ng lúa có th ch a m t hay vài
gen kháng b nh.
Ti p t c phân tích v i b nh b c lá trên 66 gi ng lúa cao s n, bao g m 20
gi ng có tri n v ng ang tr ng ph bi n
pháp PCR marker
ng b ng sông C u Long, b ng ph
phát hi n gen m c tiêu. Gen m c tiêu
c ch n
th c hi n
trong nghiên c u này là gen Xa-4, xa -5 và Xa-21. Gen này có bi u hi n kháng
nh b c lá c hai giai
n sinh tr
ng
c
ng và phát tri n c a cây lúa, và trên nhi u khu
c khác nhau [42]. Gen Xa-4 n m trên nhi m s c th s 11 và liên k t ch t v i
marker RM 224 và RM 114. Gen xa-5 n m nhi m s c th s 5 và liên k t v i
marker RM 13, RM 122, RM164. Gen Xa-21 n m trên nhi m s c th s 11 và liên
t v i các marker RM 11, RM 21. Các marker này
c s d ng làm marker ánh
8
u, và
c dùng làm khuôn DNA
primer này s khuy ch
i
thi t l p các c p primer
c các
c bi t. Các c p
n DNA nh h n n m trong marker RM 13,
RM 114, RM 122 và RM 144 nh ph
ng pháp PCR. Các
n DNA l p l i n y
i là microsatellite. DNA các gi ng lúa cao s n có tri n v ng
i b ng các marker liên k t v i các gen
t qu phân tích PCR
c cho khuy ch
ki m tra tính a hình.
các SSR ánh d u RM 11, RM 21, RM 110, RM
224 s n ph m PCR không b t c p (deletion), các SSR ánh d u khác cho th y
các b ng
u có d ng
ng có kích th
t t
n hình, xu t hi n m t b ng duy nh t và a hình v i các
c khác nhau [7].
Xiang và ctv. [75] thu c
H Nông Nghi p Huazhong, Trung Qu c trình bày
ng quan v tính kháng b nh v i ph kháng r ng và tính kháng b n v ng. Các tác
gi
ã l y ví d trên b nh b c lá và b nh
trait loci)
u khi n tính kháng s l
ph r ng và kháng b n v ng
kháng nh v y
minh
minh ch ng. QTLs (quantitative
ng là ngu n di truy n áng giá cho tính kháng
i v i b nh h i lúa. Nhi u QTLs
i v i 2 b nh nói trên ã
ng vơ cùng ph c t p và các gen QTLs nh v y v n ch a
. Trung Qu c th c hi n chi n l
nghi m b sung v tính ch t
th c hi n l p b n
t
u khi n tính
c phân l p; nh ng chúng ch a ch ng
c tính hi u qu trong lai t o gi ng lúa, b i vì di truy n
tr ng s l
hi u qu
o ơn
i v i các tính
c hi u c n
c nghiên c u có thu t ng khoa h c là tr c
ng ch c n ng (co-functional complementary test) và
QTL các gen ng c viên. Chi n l
c này ã ch ng minh r ng:
c nhanh khi phân l p gen kháng th y u (minor genes). Ti p theo
ó, th c hi n ch ng 2-3 gen th y u (QTL pyramiding), s th hi n c a chúng có
th
c bi t, và các ch c n ng trong s ki n truy n tín hi u v i h th ng protein
TE (transcriptional elements) c a nó
ch n gi ng t o ra
mu n.
c quan sát c th .
u này cho phép nhà
c gi ng lúa kháng b nh b c lá và
o ôn theo nh mong
9
1.2. Tình hình nghiên c u trong và ngồi n
c
1.2.1. Gi i thi u chung v b nh b c lá lúa
1.2.1.1. S phân b b nh b c lá lúa
nh b c lá lúa là m t trong nh ng b nh nguy hi m nh t cho các vùng tr ng
lúa trên th gi i, b nh phân b r t r ng
trong l ch s b nh b c lá lúa
vùng nhi t
i và ôn
i, l n
c ghi nh n t i Nh t B n vào n m 1884. Trong
nh ng n m 1960, b nh b c lá ã tr nên ph bi n
nh ng vùng tr ng lúa c a Châu
Á do s du nh p c a nh ng gi ng lúa c i thi n nh TN1, IR 8 nhi m
n d n b nh b c lá ã v
n xa
u tiên
n các n
c
i b nh này,
Châu Úc, Châu Phi, M La Tinh,
vùng Caribê và Hoa k [48].
i Vi t Nam, b nh b c lá phát sinh, phát tri n m nh trong
nóng và th
u ki n m,
ng gây h i n ng trong v mùa, b nh xu t hi n t cu i tháng 3 tr
các t nh phía B c, vùng BSCL b nh b c lá ang có chi u h
trong nh ng n m t 1980
hi n nay m c
n 1995 m c
ng phát tri n m nh,
b nh không quá nghiêm tr ng, nh ng
b nh h i t ng liên t c hàng n m [25]. Ph n l n các gi ng lúa ch
c ang tr ng ph bi n, các gi ng tri n v ng
vi khu n ã
i
c thu th p
Vi t Nam,
u có ph n ng nhi m v i các dịng
n hình là gi ng lúa Jasmine85 b nh gây
i r t n ng trong v Hè Thu và m t s gi ng lúa ch t l
ng cao có b m là
Jasmine85 [26].
1.2.1.2. Tri u ch ng b nh b c lá lúa và s gây h i
Có hai tri u ch ng chính gây ra do b nh b c lá là cháy bìa lá và héo cây:
Cháy bìa lá là tri u ch ng r t ph bi n, th
tr
i. B nh th
i
t b nh
ng x y ra t giai
ng xu t hi n nh ng v t s c s ng n
c t vàng
n
n tr ng
nhánh
bìa lá.
u ki n thu n l i các v t b nh này s lan r ng ra và liên k t l i thành nh ng
n hình có màu vàng, v i rìa g n sóng
m t trên c a lá b b nh, ơi khi
tồn b lá có th chuy n sang màu tr ng b c và ch t. Các gi t d ch khu n có th
a
ra trên các v t b nh non. Lá già có th tr nên xám do s phát tri n c a n m ho i
10
sinh. Khi b nh n ng các v t b nh s ng n
c, trịn, nh c ng có th hình thành trên
tr u. Cây b b nh s sinh ra bơng ít h t, h t b l ng ho c lép [48].
Tri u ch ng héo cây (Kresek) là s bi u hi n tr m tr ng nh t c a b nh,
th
ng x y ra
vùng nhi t
i t giai
nm
n tr
c
nhánh. Lá cây b b nh
héo và cu n l i, màu lá chuy n t xanh sang vàng nh t, r i vàng
và ch t héo, d n
n vàng r m,
n toàn b cây b ch t, có th l m v i tri u ch ng do sâu
c thân
gây h i [58]. Cây còn s ng sót s b vàng và lùn, tri u ch ng héo cây có th d n
n
t mùa hồn tồn.
t tri u ch ng ph th ba là lá b vàng ho c vàng nh t, lá non nh t c a cây
tr nên vàng nh t
u, ho c có s c vàng r ng. V i tri u ch ng lá vàng, vi khu n có
th khơng hi n di n
lá, nh ng có th
c tìm th y
lóng ho c c thân lúa.
Th t thoát n ng su t do b nh b c lá có th lên
th t thốt n ng su t cịn lên
n 50% [48], th m chí có n i
n 80% [65].
1.2.1.3. Tác nhân gây b nh b c lá lúa
nh b c lá lúa gây ra b i vi khu n Xanthomonas oryzae pv. oryzae
(Ishiyama) (syn. X. campestris pv. oryzae (Ishiyama) Dye), vi khu n gram âm, háo
khí, hình que khơng hình thành bào t , kích th
chuy n b ng roi
n
c c. Trên mơi tr
c 0,5-0,75 x 1,35-2,17µm, di
ng Agar dinh d
ng, khu n l c lúc
u có
màu vàng tr ng, sau có màu vàng r m, hình trịn, l i và b m t nh n [48].
Vi khu n Xanthomonas oryzae pv. oryzae có th thay
ã
c t ng k t [55]. Nhi u nịi vi khu n ã
i
c mơ t ch y u
c r t l n và
Nh t b n và
Philippines. Horino và ctv [34] ã báo cáo r ng các nòi vi khu n t Nh t b n và
Philippines khác nhau hoàn toàn và Mew [47] ã th a nh n có hai d ng sinh h c
ho c hai d ng sinh thái vi khu n gây b nh b c lá
1.2.1.4. Các
u ki n nh h
ng
hai n
c Nh t và Philippines.
n b nh b c lá lúa
ng nh nhi u lo i b nh cây tr ng khác, b nh b c lá lúa mu n th hi n
tri u ch ng và gây thành d ch cho cây lúa ph i h i
các
u ki n c n thi t nh
11
môi tr
ng thu n l i cho vi khu n phát sinh phát tri n, có ký ch nhi m b nh và
ngu n b nh có m t
và
c tính cao.
nh b c lá lúa thích nghi
a nhi u, ru ng tr ng n
u ki n trên th
th
m t 25 - 300C, m
u ki n nhi t
c, ph bi n nh t là nh ng vùng
t m
cao,
t, n i mà các
ng xuyên x y ra. Gió m nh c ng là nh ng nguyên nhân gây t n
ng cho cây lúa, t o
u ki n thu n l i cho vi khu n xâm nhi m vào cây lúa
t cách d dàng [48].
Vi khu n Xanthomonas oryzae pv. oryzae có th l u t n trong các tàn d
th c v t nh r m r và trong h t gi ng,
t và n
ct
i [46], [48]. Ngoài ra vi
khu n c ng hi n di n trên các loài c d i nh Cenchrus ciliaris, Echinochloa crusgalli, Leersia hexandra và Panicum maximum [71], Leersia oryzoides, Zizania
latifolia, Leptochloa chinensis, Leptochloa panicea, Cyperus rotundis và lúa hoang
Oryza rufipogon và Oryza australiensis [48]. Bón th a phân
nh n ng thêm [24]. Tuy nhiên, bón K làm t ng s c
c
b b nh khơng ch ph thu c vào
ng r t l n qua các con
xúc gi a các cây, cơng c lao
m, bóng râm làm
kháng cho cây lúa [51].
c tính c a nịi gây b nh mà còn b
ng lan truy n b nh nh n
ct
i, n
nh
c m a, ti p
ng, và các thao tác trong quá trình nh m và c y
lúa.
1.2.1.5. Qu n lý b nh b c lá
nh b c lá có th gây t n th t n ng n v n ng su t, c n ph i phát tri n
chi n l
c qu n lý thân thi n v i mơi tr
ng và ít t n kém. Qu n lý b nh b c lá
ph i t p trung vào các bi n pháp nh m làm gi m ngu n b nh ban
tri n ngu n b nh sau này trên cây ch và
u này có th
u và s phát
c th c hi n thông qua
các bi n pháp khác nhau nh bi n pháp gi ng kháng, bi n pháp sinh h c và bi n
pháp hóa h c.
Bi n pháp gi ng kháng:
Trong tr
ng h p khơng có thu c
c tr ho c các tác nhân phòng tr khác
ch ng l i ngu n b nh b c lá, bi n pháp gi ng kháng t ra r t quan tr ng trong vi c
12
phòng tr b nh bác lá.
ã
i v i lúa, di truy n tính kháng
c nghiên c u t m . Tính kháng c a cây lúa
n sinh tr
ng khác nhau thay
cây m ( giai
nh ng nhi m
các giai
ng thành ( giai
n tr
ng thành,
n m ). Ph n ng v i m t ngu n b nh, cây ch bi u hi n các
c kháng khác nhau
ng. Kháng ch t l
tính kháng s l
i v i vi khu n Xoo
i tùy theo ki u gen c a cây lúa nh tính kháng
n m ) và tính kháng cây tr
giai
i v i nhi u ngu n b nh
c phân thành hai lo i là kháng ch t l
ng th
ng
ng
c ki m soát b i các gen chính, trong khi ó
c ki m sốt b i các y u t
Tính kháng ch t l
ng và kháng s
ng: Tính kháng ch t l
a gen.
ng là tính kháng
c quy cho là
n gen chính, nó có th là tr i ho c l n. S ki m sốt b nh b c lá ã thành cơng
qua vi c s d ng các gen chính nh Xa-4
ơng Nam Á và Nam Á, Xa-1 và Xa-3
Nh t và Hàn Qu c s d ng trong m t th i gian dài, nh ng cho
n hi n nay khi
nh ng gen này ã tr nên kém hi u qu do s b c phát các nòi b nh m i.
Tính kháng s l
ngang, có m c
ng: Tính kháng s l
kháng th p th
ng c ng
c bi t nh là tính kháng
ng khơng có bi u hi n chun hóa v nịi b nh
[12], [54]. D ng kháng này có l i do nó có th c n tr s phá v tính kháng c a
gi ng trong ch
ng trình ch n t o gi ng. Tính kháng s l
i v i b nh b c lá r t ph c t p
i v i vi c phân tích tính di truy n do chúng thay
i liên t c và khơng có phân lo i rõ ràng trong qu n th
ctv [73] l n
ang phân ly. Washio và
u tiên báo cáo m t d ng kháng có v t b nh phát tri n ch m (s
ng) t i Nh t
c ki m soát b i a gen.
Nhi u nhà nghiên c u c ng ã xác
kháng a gen
ng c n
ng c a các gi ng lúa
nh nh ng gi ng lúa bi u hi n tính
i v i b nh b c lá. M c dù c s d li u có s n, nhi u nghiên c u
c ti n hành
tìm hi u b n ch t tính kháng s l
ng
i v i b nh b c
lá [31].
Phòng tr sinh h c
Phòng tr b nh b c lá b ng bi n pháp sinh h c c ng ch a nh n
chú ý, m c dù có nh ng báo cáo s d ng vi sinh v t
c nhi u
i kháng phòng tr b nh
13
này [66]. Ch n t o gi ng kháng b nh b c lá b ng các gen kháng
n chính th
ra khơng m y thành cơng, vì qua th i gian s d ng lâu dài s d n
ng
n hình thành
các ti u qu n th ngu n b nh có th phá v tính kháng c a nh ng gen này. S thay
i ngu n b nh c ng gây c n tr cho s phát tri n nh ng hóa ch t phịng tr b nh
t cách thích h p. V ph
chi n l
ng di n này, phòng tr sinh h c d
c phịng tr thích h p thân thi n v i môi tr
ng
ng nh là m t
phòng tr và qu n lý
nh. Nh ng nghiên c u g n ây trong các phịng thí nghi m ã xác
khu n s ng xung quanh vùng r cây lúa
nh các vi
i kháng v i vi khu n gây b nh b c lá t
thí nghi m trong ng nghi m. Các vi sinh v t này có th làm h n ch b nh m t cách
có ý ngh a
thí nghi m ngồi
ng, các dịng vi khu n này có th
c
ngh s
ng nh là tác nhân phịng tr sinh h c.
Hàng lo t các nghiên c u ánh giá hi u qu phòng tr b nh c a dòng vi
khu n Pseudomonas putida V14i (m t tác nhân phòng tr sinh h c ch ng l i b nh
m v n (Rhizoctonia solani), nó c ng
c s d ng
ánh giá kh n ng phòng
tr b nh b c lá lúa. Nh ng k t qu c a các thí nghi m này cho th y r ng phun các
tác nhân phịng tr sinh h c qua lá có th kh ng ch t i a ch s b nh [37]. M i
liên h tr c ti p gi a s s ng sót vi khu n n i sinh Pseudomonas putida trong mô
cây lúa và m c
h n ch b nh c ng ã
phòng tr sinh h c là m t chi n l
c quan sát,
c phòng tr
áng
u ó cho th y r ng
c quan tâm
qu n lý
nh b c lá lúa.
Bi n pháp hóa h c
u quan tâm trong vi c s d ng bi n pháp hóa h c
lá lúa là s d ng thu c
n ng
th p
ho c là gi t ho c là c ch s nhân
nhanh ngu n b nh b ng cách ng n c n chu i ph n ng
Nó c ng s s n sàng di chuy n và n
i mơi tr
ng. Nh ng n l c
Bordeaux có ho c khơng
ngân-
ng ã
phịng tr b nh b c
ng hóa c a ngu n b nh.
nh trong cây và gây nh h
ng th p nh t
i
phòng tr b nh b c lá b ng hóa ch t nh h n h p
ng, h n h p xà phòng -
ng, thu c tr n m g c th y
c th c hi n. Phun thu c copper oxychloride [68] và dung d ch