Staphylococcus aureus Tụ cầu khuẩn

15 . Staphylococcus aureus
Tụ cầu khuẩn
Nhóm thực hiện :
1) Huỳnh Phương Anh
2) Lê Thị Khánh An
3) Ngô Thị Thúy An
4) Lê Minh Chí
5) Nguyễn Thị Kim Cương
6) Lê Minh Duy
7) Trương Thị Thanh Hiền
8) Dương Minh Hoàng
9) Trần Phâm Tuệ Hưng
10)Đỗ Thị Xuân Hương
11)Trần Đức Kiên
12)Bùi Thị Kim Phụng
13)Võ Đình Uy Viễn
I) GIỚI THIỆU

0918005
0918019
0918022
0918052
0918056
0918074
0918149
0918161
0918200
0918201
0918225
0918355
0918596

Chi Staphylococus là cầu khuẩn Gram dương, được giới thiệu trong cuốn Sổ tay Hệ
thống vi khuẩn học của Bergey. Được chia làm 2 nhóm: Hiếu khí (Micrococcus,
planococcus,

and

Deinococcus)

và

kị

khí

(Staphylococcus,

Stomatococcus,

Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus, Coprococus, và Sacina). Họ
Micrococcaceae gồm 4 loài: Micrococcus, Stomatococus, Planococus, và Staphylococus.
Thuộc tính khác biệt của cầu khuẩn Gram dương gồm sự sắp xếp của tế bào, hiếu khí bắt
buộc, hiếu khí tùy ý hoặc vi hiếu khí, kị khí bắt buộc, phản ứng catalase, sự hiện diện
của cytochrome, sản phẩm lên men kị khí chủ yếu từ carbohydrates, peptidoglycan, acid
teichois trên thành tế bào, menaquinones. Sự phân loại của Staphylococus aures như sau:

1


Giới: Procaryotae.

Ngành: Firmicutes.
Lớp: Firmibacteria.
Họ: Micrococaceae
Chi: Staphylococcus.
Loài: Aureus.
Hiện tại có 32 loài Staphylococcus được xác nhận. Một vài loài khác đang được nghiên
cứu. Bảng 1 là danh sách 332 loài được tìm thấy trong họ này. Tên Staphylococcus có
nguồn gốc từ tiếng Hi Lạp, Staphylo có nghĩa là chùm nho và cossus có nghĩa là quả
trong chùm, do đó Staphylococcus có nghĩa là “quả trong chùm nho”. Staphylococci là tế
bào hình cầu có đường kính từ 0.5 đến 1.5µm, nó có thể tồn tại như các tế bào đơn lẻ,
thành cặp hoặc thành cụm. Cụm hình thành chủ yếu khi tăng trưởng trên môi trường rắn
và là kết quả từ sự phân chia tế bào theo nhiều mặt phẳng, kết hợp với xu hướng các tế
bào con gần nhau. Sự hiển thị trong không gian 3 chiều thể hiện rõ sự gắn kết bao phủ lên
nhau của các tế bào, tuy nhiên, các tế bào màu thường mang lại sự xuất hiện của các
phiến bất thường của tế bào. Staphylococci là vi khuẩn Gram dương, không di động và
không sinh bào tử, nang có thể được hình thành trong nuôi cấy, nhưng nói chung là
không xuất hiện trong pha tĩnh tế bào. Sắc tố khuẩn lạc trên môi trường không chuyên
biệt như tryptic soy agar có thể nằm trong khoảng từ màu trắng kem đến mà cam sáng.
Hầu hết các chủng của Staphylococci được xem là nhóm các tác nhân gây bệnh mức II
(potential hazard). Staphylococcicus hyicus được xếp vào nhóm các tác nhân gây bệnh
mức IV (potential danger, cực kì nguy hiểm).
Loài Staphylococal là các vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tùy ý và có cả hô hấp và lên
men biến dưỡng. Staphylococci thông qua chu trình glycolysis, nối hexose
monophosphate, và chu trình tricarboxylic acid. Chúng thì dương tính với catalase va có
thể sử dụng một lượng lớn carbonhydrates.

2


Staphylococcicus aureus là loài phổ biến nhất trong chi Staphylococcicus. Nó cần sự có

mặt của amino acid và vitamin cho sự tăng trưởng hiếu khí, và ngoài ra : uracil, lên men
của amino acid và vitamin cần cho sự phát triển của sinh vật hiếu khí. Trong khi S.
aureus có khả năng tăng trưởng kị khí và tăng trưởng tốt nhất trong điều kiện hiếu khí.
Nhiệt đọ tối ưu cho sự tăng trưởng kà 35 0C và giới hạn chịu đựng là từ 10 đến 45 0C. Giới
hạn chịu đựng của độ pH cần cho sự phát triển là từ 4.5 đến 9.3, pH tối ưu là khoảng giữa
7.0 đến 7.5. Khi điều kiện môi trường trở nên khắt nghiệt hơn, giới hạn chịu đựng của độ
pH giảm.
Thành phần chủ yếu của thành tế bào S. aureus là peptidoglycan, và nó chiếm 50%
trọng lượng tế bào và quy định hình dạng bền vững. Peptidoglycan là một polymer
polysaccharide không phân nhánh, gồm các liên kết β(1-4), chuỗi có chứa xen kẻ các đơn
vị N-acetylglucosamine, với khỏang 60% N-acetylmuramic acid residues o-acetylated.
Luợng lớn O-acetylation giúp cho tế bào kháng được sự thủy phân của lysozyme.
Pentapeptide liên kết bên với lượng dư acid muramic, và liên kết đồng hóa trị của
pentaglycine với L-lysine của một chuỗi D-alanine khác. Phức hợp peptidoglycan là một
nhóm của chuỗi polymer phosphate với acid teichois. Acid Teichoic (chiếm 40% trọng
lượng vách tế bào) có thể liên kết cộng hóa trị với peptidoglycan hoặc màng tế bào.
Xương sống của thành tế bào teichoic acid là một chuỗi xen kẽ của ribitolphosphate liên
kết với D-alanine bởi sự liên kết α hoặc β-glycosidic xuyên qua N-acetylglucosamine.
Các thành phần chính của vỏ của S.aureus

là acid N-acetylaminouromic và N-

acetylfucosamine. Muời một kiểu nhóm huyết thanh đã được xác định, với các gen để sản
xuất vỏ nang nằm trong 1 operon. Kết nang vi khuẩn có khả năng chống thực bào. Một
vài chủng S.aureus có kết nang, và chúng có nguy cơ gây nguy hiểm hơn cho động vật.
Bao nang thường được phát hiện trong cơ thể sống nhưng lại không xuất hiện khi nuôi
cấy. Phạm vi màu sắc từ màu trắng xám, đến mà vàng cam và màu cam. Sổ tay của
Bergey nói rằng các sắc tố triterpenoid carotenoids hoặc các dẫn xuất của chúng nằm
trong màng tế bào. Sắc tố thường có sau 18-24 giờ của sự tăng trưởng ở 37 0C, nhưng có
màu rõ rệt hơn khi mẻ nuôi cấy được cất giữ ở nhiệt độ phòng trong vòng 24-48 giờ. Sắc

3


tố không được tạo thành trong quá trình tăng trưởng kị khí hoặc trong mẻ nuôi cấy lỏng.
Nói chung S. aureus tăng trưởng và cạnh tranh đàn áp các sinh vật hiện diện khác. Mặc
dù giá trị D khác nhau với các loài và nhiệt độ của dung môi, nhưng một giá trị D giảm đi
sau 3 phút tại 60oC cho thấy rằng S.aureus thì không chịu nhiệt. Khả năng chịu nhiệt chịu
ảnh hưởng của pH, Aw , và thời gian của mẻ nuôi cấy. Đun nóng các sản phẩm thịt đến
nhiệt độ khoảng 770C thường là đủ để giết hết S. aureus. S.aureus kháng với nhiệt độ
thấp. Nhưng lại rất nhạy cảm với môi trường có tính acid và một loạt các hợp chất hóa
học và thuốc kháng sinh.
II.

BỆNH NGOÀI ĐƯỜNG RUỘT :

Staphylococci là một phần bình thường của hệ vi sinh của cơ thể động vật, chúng được
tìm thấy trên bề mặt da và tóc, trong mũi, miệng và cổ họng. Staphylococcus epidermidi,
xâm chiếm hầu như tất cả các bề mặt biểu bì, trong khi S. aureus xâm chiếm chủ yếu
màng nhầy. Các sinh vật này xâm chiếm vào trẻ sơ sinh trong 1 vài ngày sau khi sinh.
Polledo et al đã nghiên cứu xử lý trên 300 mẫu thực phẩm. Họ phát hiện rằng có 83
(27.6%) là thể truyền bệnh có tụ cầu dương tính với coagulase (enzyme gây đông tụ) và
118 (39.3%) dương tính với coagulase – tụ cầu âm tính hốc mũi. Thú vị hơn là nam giới
được phát hiện có mang tụ cầu dương tính coagulase nhiều hơn so với nữ giới. Ba mươi
sáu cá thể được phát hiện có tụ cầu enterotoxigenic. Tỷ lệ này trái ngược với tỷ lệ 40-50%
theo báo cáo của Bergdoll. Thể truyền bệnh không có triệu chứng của tụ cầu có thể được
chia làm nhiều kiểu: thể truyền bệnh mạn tính, người mang bệnh nuôi dưỡng một loại S.
aureus trong thời gian kéo dài, thể truyền bệnh/ người mang bệnh cấp tính, họ không
thường xuyên mang Staphylococci gây bệnh, lúc có lúc không, họ mang một loại cho 1
thời gian nhất định, và sau đó mang 1 loại khác; người không mang mầm bệnh, là những
người hiếm khi hoặc không bao giờ mang mầm bệnh độc hại S. aureus. Người mang

bệnh/ thể truyền bệnh có triệu chứng nhiễm S. aureus là những người mang bệnh công
khai. Con người được coi là môi trường sống của S. aureus trong tự nhiên.

4


Staphylococci có thể gây bệnh ở hầu hết các mô trong cơ thể, S. aureus.là nguyên nhân
phổ biến nhất gây bệnh nhiễm trùng suppurating ( như mụn nhọt, nổi mụn) và là một
trong các vi khuẩn gây bệnh lâu nhất. Một trong các báo cáo đầu tiên công bố về bệnh do
S. aureus là vào năm 1871 với nhà bác học người Đức - Van Reclinhausen, người đã
quan sát khuẩn cầu, mà ông đã cô lập từ thận của 1 bệnh nhân đã chết sau một cơn sốt.
Các tụ cầu được coi là tác nhân gây bệnh cơ hội mà quá trình xâm nhiễm thường là qua
da hoặc qua màng nhày. Các tổn thương thường gặp nhất là 1 áp xe trong da hoặc vết
bỏng, mà vùng trọng tâm của nhiễm trùng thường có mũ một phần hoặc hoàn toàn, có
vách bao quanh xuất phát từ các mô xung quanh. Các vùng của sự hình thành áp xe
thường là nang long và tuyến mồ hôi. Nhọt là một loạt các áp xe kết nối với nhau. Sự lây
của nhiễm trùng trong cơ thể, các cơ quan chính và các mô có thể xảy ra bằng cách lây
lan qua các mô tiếp giáp hoặc lây lan qua hệ bạch huyết và máu. Tổn thương di căn được
tạo ra trong một loạt các mô.
Nhiễm trùng nghiêm trọng hơn có thể xảy ra ở những người nhạy cảm như: trẻ em,
người bị bỏng hoặc chấn thương, và người rối suy nhược mạn tính (ung thư, xơ nang
vv…). Bệnh tụ cầu nghiêm trọng thường được gây ra bởi tụ cầu khuẩn âm tính coagulase.
Chúng xâm nhập vào cơ thể qua các vết thương hở ở các mô biểu bì như: tiêm chích, ống
thông, hoặc các dụng cụ y tế khác. Một hệ thống bạch cầu bình thường giúp cơ thể có thể
chống lại sự xâm nhập của các vi khuẩn này, sự bất thường của các miễn dịch dịch thể có
thể góp phần làm cho cơ thể dễ mắc bệnh. Bệnh tụ cầu có thể được lây lan bằng hai cách
là thông qua hô hấp và do tiếp xúc với da và quần áo của người bệnh. Bệnh tụ cầu thường
có ở bệnh viện với 90% các biến thể có đặc tính kháng peniciline. Các biến thể xuất hiện
nhanh chóng trong một vài bệnh nhân sau khi được điều trị bằng liệu pháp kháng sinh.
Một số kháng sinh khác tới nơi một vài biến thể kháng được erythomycin, neomycin,

streptomycin, gentamicin, tetracycline, và chloramphenicol. Cả plasmics và nhiễm sắc
thể ở staphylococus được tìm thấy mã hóa cho khả năng kháng kháng sinh. Một số bệnh
nghiêm trọng gây ra bởi chúng bao gồm: nhiễm trùng máu, viêm màng tim, viêm tủy

5


xương, viêm phổi. Một số bệnh khác như: triệu chứng shock do độc, viêm ruột kết, và
ngộ độc thực phẩm.

III. ĐẶC TÍNH
S.areus là một loài vi khuẩn được quan tâm trong công nghiệp thực phẩm. Ngộ độc thực
phẩm do Staphylcocus là nguyên nhân hàng đầu trong các vụ ngộ độc thực phẩm không
chỉ riêng ở Hoa Kỳ, mà còn ở rất nhiều quốc gia khác. Nó gần như có thể so sánh với
Samonella như là một trong những tác nhân gây ngộ độc thực phẩm phổ biến nhất và
được cho rằng là dẫn đầu các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm. Ngộ độc do
Staphylcocus diễn ra là kết quả của việc tiêu thụ độc tố enterotoxin chịu nhiệt được sản
xuất bởi các vi khuẩn trong suốt quá trình sinh trưởng.
A. Các hoạt động trong nước
Một lý do mà S.aureus được quan tâm nghiên cứu là do khả năng phát triển ở 0.83 a w
tức là rất thấp so với sự phát triển của các loài vi khuẩn. Phần lớn các biến thể S.aureus
thì có khả năng chịu đựng cao trong môi trường muối hoặc đường có thể phát triển trong
điều kiện vượt quá 0.83 đến 0.99 a w. S.areus phát triển mạnh nhất trong điều kiện khoảng
lớn hơn 0.99 và sự sinh trưởng ở điều kiện a w thấp phụ thuộc vào các điều kiện tăng
trưởng khác một cách thích hợp. Chỉ số aw thấp nhất cho sự phát triển của chúng lớn hơn
điều kiện kị khí (0.90). S.aureus có thể phát triển tốt trong điều kiện nước muối 16%
(0.88aw) và đường 50% (0.97 aw).
B. Enzymes ngoại bào
S.aureus sản xuất một lượng lớn enzyme ngoại bào. Iandolo (8) cho rằng S.areus có khả
năng sản xuất ít nhất 34 loại protein ngoại bào khác nhau, mặc dù không có dòng đơn nào

sản xuất tất cả các loại protein. Có ý kiến cho rằng sản xuất protein ngoại bào giúp cho
các vi khuẩn có thể xâm nhập vào các mô khỏe mạnh và tránh khỏi bộ máy miễn dịch của

6


cơ thể. Một vài dạng enzyme này có giá trị nhận diện vi khuẩn. Bjorklind và Arvidson
phát hiện ra phần lớn các protein ngoại bào được sản xuất vào cuối quá trình tăng trưởng.
1. Coagulase
Bảng 2: Protein và độc tố ngoại bào của Staphylococcus aureus
Coagulase
Endopeptidase
Fibronolysin
Enterotoxins A-E

Metalloprotease

Độc tố gây hội chứng

Elastase

Penicillinase

shock

Protein A

Serine Protease

Độc tố tróc da A và B

Lipase

Nuclease

Staphylococcal

Leukocidin

Pyrogenic exotoxin

Nhân tố Sucinic oxidase

Collagenase

Staphylokinase

Lysostaphin

Phospholipase

Acid phosphatase

Thiol protease

Hemolysins

Alkaline phosphataseotein

Fibrinogen biding protein

lysozyme

Fibronectin – binding proetin a Elastin binding protein
Colagen Binding protein

Fibronectin binding B

Nhân tố Clumping

Nhân tố Matrix Adhesin

Coagulase là một trong những enzyme quan trọng được sản xuất bởi S.aureus. Hai loại
của enzyme coagulase gồm một dạng tự do và một dạng nằm trong tế bào. Hai loại khác
nhau về đặc tính miễn dịch và một số hoạt động nhỏ. Coalgulase ngoại bào có thể tồn tại
trong tự nhiên và có nhiều kiểu đã được nhận dạng. Có 93-100% tương hợp giữa sản
phẩm của Coagulase và enterotoxin. S.aureus dương tính với coagulase có khả năng hình
thành các cục máu đông. Enzyme này được sản xuất bởi các biến thể độc được biết đến
có khả năng gây bệnh do hình thành các cục máu đông... Tuy nhiên, tầm quan trọng của
hàng rào chống lại sự lây nhiễm thì không toàn vẹn, bởi vì những dòng S.aureus âm tính
với coagulase cũng có thể là nguyên nhân gây bệnh. Sự đóng cục của máu trong cơ thể
liên quan đến số lượng của các thành phần. Một cách vắn tắt, một cục máu đông được
định hình bởi các yếu tố đông máu có trong huyết thanh và được chuyển hóa thành một
7


mạng lưới có tên là fibirn, Staphylococus aureus hoạt động bằng việc chuyển đổi
fibrinogen thành fibrin.
Một trong những lí do cho việc sử dụng rộng rãi coagulase để xác nhận dương tính với
S.aureus là kiểm tra thực hiện khá dễ dàng và dễ nhận biết. Tế bào của loài sinh vật nghi

ngờ được trộn với huyết tương của người hoặc của thỏ (được thêm vào citrate, oxalate,
EDTA để khử ion Ca, yêu cầu đông máu invivo), hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm
ống, hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm dựa trên bản mẫu trên kính hiển vi. Slide hay
ống xét nghiệm được ủ ở 370C trong 1 – 3 gi.
Tuy nhiên, các phương thức hiện tại được mô tả trong Bacteriological Analytical
Manual (10), yêu cầu một khối kết đông bền chắc hiện diện trong ống xét nghiệm trút
ngược thì được xem là dương tính. Kết quả của phương pháp bản mẫu, nơi nào tế bào kết
thành khối thì được xem là dương tính. Weer-Pothoff al.(11) so sánh bảy coagulase test
của phương pháp nhận dạng staphylococus. Nhìn chung, các thử nghiệm thương mại cho
kết quả nhạy hơn các ống xét nghiệm thông thường hay xét nghiệm bản mẫu.
2. Nuclease chịu nhiệt
Nuclease chịu nhiệt là một trong những chẩn đoán quan trọng của S.aureus. Những
Nuclease này được sản xuất trong quá trình tăng trưởng bình thường có khả năng tấn
công cả ribonucleic và deoxyribonucleic. S.aureus cũng có khả năng sản xuất nuclease
ngoại bào có khả năng chịu nhiệt. Sự hiện diện của hai loại nuclease (chịu nhiệt và nhạy
nhiệt) có thể là nguyên nhân tạo nên sự khác biệt trong các chủng loại. Gudding cho biết
đó là S.aureus. S.intermedius and S.hylius Subsp. Tất cả Hyicus đều sản xuất nuclease
chịu nhiệt. Như tên gọi của nó, neclease chịu nhiệt vô cùng bền vững trong điều kiện
nhiệt độ cao và có thể bền vững trong nước sôi trong vòng 30 phút mà không có bất kì
một biến đổi nghiêm trọng nào. Một bài test đã diễn tả các hoạt động của nuclease chịu
nhiệt. Phương pháp dùng Toluidine blue deoxyribonucleic acid agar có thể dùng để nhận
dạng. Trên một khối agar (trên đó có khuẩn lạc S.aureus được cô lập phát triển) được lấy
mẫu được cấy vào một môi trường ống mẫu được đun sôi trong 15phút. Tiêu bản được
8


làm bởi việc lấy mẫu Toluidine blue deoxyribonucleic acid agar cộng với một chút agar
tốt chứa khuẩn lạc. Mẫu được đun sôi được thế chỗ và được ủ trong môi trường ẩm ướt
trong 4 giờ ở 350C. Kết quả dương tính cho thấy vùng màu hồng sáng của DNA được
thủy phân. Giống như coagulase, việc sản xuất nuclease chịu nhiệt và enteroxigenicity

giống nhau đến 95 tới 100%. Ratner và Strattion cho biết không có sự đối lập giữa một
thử nghiệm giữa thermonuclease và coagulase trên 250 mẫu máu người. Tuy nhiên,
Adekeye cho biết thermonuclese không có hiệu quả nhận biết S.aureus được cô lập từ
động vật (không phải người). Ngược lại với Staphylcococal ngoại bào, nuclease chịu
nhiệt được sản xuất trong suốt quá trình tăng trưởng của tế bào.
3. Các loại Enzyme khác.
S.aureus sản xuất nhiều loại enzyme ngoại bào khác nhau có giá trị chẩn đoán và giúp
đỡ thể sinh bệnh. Staphylokinase gây ra sự tan khối khi một vài lipase có khả năng tạo ra
những vòng tan trên thạch trứng đục. Hyaluronidase được sản xuất bởi hầu hết các dòng
của S.aureus, là một loại enzyme thúc đẩy sự lan tỏa trong mô bởi việc khử trùng hợp của
hyaluronic acid. Những loài enzyme khác được sản xuất bởi S.aureus bao gồm cả
penicillinase, protease (collagenase, elastase, endopeptidase, metalloprotease, serine
protease, thioprotease), lipase (phospholipase và phosphatase – acid và alkaline),
fibrinolysin (biến đổi fibin thành các sản phẩm hòa tan), protein A (dạng phức hợp của
lớp màng ngoài của thành tế bào làm suy yếu oposin hóa bởi huyết thanh, và lytic
enzyme (staphylcococal lysozyme và lysostaphin).
C. Toxins – Hemolysins và các loại khác
Hemolysin, cũng tương tự như staphylolysin, được sản xuất bởi S.aureus và được đặt
tên là alpha, beta, gamma và delta; mỗi dòng đơn sẽ sản xuất một hay nhiều emolysins.
Những protein ngoại bào khác biệt bởi khả năng dung giải hồng cầu của chúng trên
những loài động vật khác nhau. Gamma hemolysin và Panton- Valentine leukocidin
(phân giải leukocyte) được hợp thành từ hai cấu tử, một trong số đó có ở cả hai. Tất cả
ngoại trừ delta-hemolysins tạo ra vòng tan bao quanh khuẩn lạc S.aureus khi phát triển
9


quanh thạch máu. Staphylococi sinh mủ phân giải hemoglobin đều phản ứng dương tính
với coagulase. Một số độc tố khác được sản xuất bởi S.aureus là exfoliatin, leukocidin,
pyrogenic exotoxin (29,30). Sự tương phản với enterotoxins vi khuẩn gram âm ( được sản
xuất bởi protein chuyên chở đặc biệt) là một phần của operon mã hóa độc tố.

SEs được xem là exotoxins kết hợp của protein với phần không có phi protein (31). SEs
hoàn chỉnh kết hợp của chuỗi polypeptide đơn với 230 – 239 amino acid, sắp xếp thành
phân tử nặng từ 26,360 tới 28,494 và có thắt nút (loop) disulfide gần giữa phân tử (Bảng
4). Phân tích amino acid của SEs cho thấy sự giàu lysine, asparatate và glutamic acid(6) .
(Bảng 5). Ngoài ra, sự tích điện dương của chúng có thể đóng vai trò quan trọng trong
gây nôn mửa.

IV.

CÁC ĐỘC TỐ TRONG RUỘT
1) Cấu trúc.

Trình tự nucleotide của các gen mã hóa cho SEA, SEB, SEC 1, SEC3, SSD, SEE ( sea,seb,sec1,
sec3 ,sed và see) (32-37) và trình tự amino acid của SEA, SEB, SEC 1 (38-40) đã được báo cáo.
SEs thuộc về một họ enterotoxins lớn gọi là pyrogenic toxins ( PTs), gồm có pyrogenic toxins A
và B, TSST-1 , và streptococal pyrogenic toxins A-C ( SPE A-C) (41-47). PTs tiết lộ những giá
trị về mặt sinh học, bao gồm các tác nhân của sự nguyên phân tế bào lympho, sự chặn miễn dịch,
sự sốt, và làm tăng tính nhạy cảm với endotoxin. So sánh giữa các PTs có thể nhận ra 43- 85 %
trình tự nucleotid đặc trưng( 33). Nucleotid đặc biệt và amino acid tương đồng giữa entC1, entB
và SPE A đã được nhận ra, trong khi entC1 và entB gióng nhau hơn với SPE A(36). Couch và
Betley (33) báo cáo rằng SEC 3 có 98% trình tự nucleotide tương đồng với SEC 1, trong khi SEC1
và SEB thể hiện 68% amino acid tương đồng. Cả SEB và SEC 1 có tương đồng cấu trúc cực kỳ
cao, đặc biệt là vùng đầu amino và carboxy, với tính chất quyết định kháng nguyên của nó, trọng
lượng phân tử tương đồng, cầu disulfile đơn và không có nhóm sulhydryl tự do (41,51,55,56).
Vùng đầu amino ở SEB và SEC1 thể hiện tính kháng nguyên – chịu trách nhiệm cho phản ứng
chéo với kháng thể huyết thanh (57), trong khi mức độ cao của sự không tương đồng ở đầu
amino của SEA có thể giải thích lý do kháng huyết thanh SEA không có phản ứng chéo với SEB
hay SEC1 (38).

10

SEA

SEB

SEC1

SEC2

SEC3

SED

SEE

(Độc tố hoàn toàn)

233

239

239

239

238

228

230

(Gen enterotoxin)

257

266

266

266

266

258

257

(Độc tố hoàn toàn)

27078

28494

27500

27531

27438

26360

26425

(Gen enterotoxin)

29700

31400

30511

30608

_

_

29358

Điểm đằng điện

6.8

8.6

8.6

7.0

8.15

7.4

7.0

Tỉ lệ Nitrogen

16.5

16.1

16.2

16.0

_

_

_

µg/ khỉ

5

5

5

5-10

<10a

20

10-20

Hấp thụ tối đa( nm)

277

277

277

277

_

278

277

Điểm gây chết (Em)

14.3

14.0

12.1

12.1

_

10.8

12.5

Hệ số lắng( Sow), S

3.04

2.78

3.00

2.90

_

_

2.60

Amino acid

Trọng lượng pt

Liều gây nôn ( ED50

a

mỗi os 0.05mg/kg bởi IV phần (19)

Ngoài ra, Huang và cộng sự (38) đã có thể chứng minh sự tương đồng cấu trúc đặc biệt ở
SEA bởi cystein bán phần tại vị trí 106 với SEB và SEC 1. Huang at al (58) đặt ra giả
thuyết rằng cystein bán phần này có thể gây nôn mửa và chịu trách nhiệm cho sự viêm dạ
dày. SEA hoàn chỉnh có 82, 72, 74 và 34 amino acid phổ biến giống với SEB, SEC 1,
SPEA và TSST-1 ( 37, 39, 59-61).

11


Amino acid

SEA

SEB

SECs

SED

SEE

Alanine

1.9

1.3

1.7

2.0

2.4

Arginine

4.0

2.7

1.7

3.4

4.5

aspartic acid

15.5

18.1

18.2

16.7

15.1

Cysteine

0.7

0.7

0.7

0.7

0.8

glutamic acid

12.6

9.5

8.6

13.2

12.2

Glycine

1.0

1.0

3.1

2.7

4.1

Histidine

3.2

2.3

2.9

2.7

3.0

isoleucine

4.1

3.5

3.8

6.0

4.3

leucine

9.8

6. 9

6.4

9.3

10.1

lysine

11.3

14.9

14.0

12.9

10.8

methionine

1.0

3.5

3.5

1.1

0.5

phenylalanine 4.3

6.2

5.4

408

4.5

proline

1.4

2.1

2.2

1.4

1.9

serin

3.0

4.1

5.0

5.1

4.7

threonine

6.0

4.5

5.7

4.5

6.4

tyrosine

10.6

11.5

10.1

7.2

9.8

trytophan

1.5

1.0

1.0

0.6

1.7

valine

4.9

5.7

6.0

4.1

4.4

amide NH2

1.8

1.7

1.5

1.7

1.7

Bảng 5: Thành phần amino acid ( g/100 g protein) của Staphylococcal Enterotoxin

Betley và Mekalanos (34) đã có thể lai đầu dò DNA lấy từ dòng gene entA với các type
khác của SE, điều này gợi ý rằng tỉ lệ cao của các trình tự khác biệt có thể có giữa SEC 1
và SEB ở vùng đầu carboxyl. Trình tự nucleotid của SPE A tiết lộ sự tương đồng đặc biệt
với entB và entC1 (55,56), trong khi Bloomster- Hautamara và cộng sự (59) báo cáo
12


TSST-1 có sự tương đồng trong hoạt tính sinh học nhưng không có trình tự amino acid
nào tương đồng với SPE A , entB và entC1. Couch và Betley (33) cũng báo cáo sự so
sánh giống nhau giữa các gene entC3, entC1 và entB, điều này gợi ý rằng gen giống entC1
cổ được hình thành bằng sự tái tổ hợp giữa gene entC3 và entB. Couch và cộng sự (35)
báo cáo rằng gene entE có 84 % trình tự nucleotid tương đồng với gene entA. Họ cũng
báo cáo rằng SEE có quan hệ gần với SEA hơn SEB, SEC1 hay SPE A.
Nhìn chung, tỉ lệ phần trăm của trình tự tương đồng các amino acid giữa các dạng
protein hoàn chỉnh của eterotoxins khác nhau từ 29% tới 82 % , với SEA và SEE là có

quan hệ gần nhất (35) . Bohach và Schlievert (36) đã gợi ý rằng sự tương đồng giữa các
PTs yêu cầu những chức năng sinh học thông thường, trong khi ngược lại những vùng đa
dạng khác nhau quy định tính độc đặc biệt. Ngoài ra, Bohach và Schlievert (62) đã nhận
ra những sự tương đồng khi so sánh trong các nghiên cứu khác về trình tự amino acid của
PT thể hiện rằng: một vài đầu carboxyl và vùng trung tâm của trình tự sơ cấp được bảo
tồn đồng đều trong họ PT. Ví dụ, Họ có thể khám phá thêm bằng chứng về khu vực
carboxyl của tụ cầu khuẩn và liên cầu độc tố gây sốt được dùng chung hoạt tính sinh học
và nhiều phản ứng chéo epitopes. Hầu hết công việc đã được thực hiện vào việc xác định
thành phần acid amin, gen ent, những thuộc tính hóa sinh giống nhau, sự giống nhau
thông thường ,và các hoạt động của thuộc sinh hóa, công việc liên quan đến các phân tử
trung gian ảnh hưởng của SEs vẫn còn tương đối chưa được biết đến. Kể từ khi những
cuộc triển lãm giống nhau của Sec đáng chú ý, Singh và Betley đã đề nghị rằng các trình
tự cần thiết để cụ thể cấu trúc lớn và dư lượng axit amin cần thiết cho chức năng sinh học
thường được bảo tồn trong Sec.
2) Tính chất
• Tính chịu nóng
Tính chịu nóng của SE là phụ thuộc vào sự tinh khiết của sự điều chế, các loại độc tố, số
lượng ban đầu, độ pH, dung môi đốt nóng, và phương pháp của sự dò tìm. Độc tố ruột
non B đã được thể hiện bằng cách giữ lại hoạt động trên 16 giờ ở 60 oC và pH 7.3. Làm
ấm cho SEB ngâm ở trong nước sôi 30 đến 40 phút không được phá hủy hoàn toàn khả
13


năng tạo ra nôn mửa ở mèo và khỉ. Borja và Bergdoll chuẩn bị đốt nóng SEC trong 30
phút ở 60oC với không có sự thay đổi trong huyết thanh, trong khi đốt nóng SEA ở 80 oC
trong 30 phút hoặc ở 100oC trong 1 phút làm mất hoạt tính của nó để phản ứng
serologically. Nói chung, tính chịu nóng của SEA, SEB và SEC là SEC>SEB>SEA. Tuy
nhiên, điều cần lưu ý là nhiệt độ bất hoạt của nó nhanh hơn bộ đệm thời gian trong các
hệ thống phức tạp hơn trong các tín hiệu truyền đi của thực phẩm.Ví dụ, Denny và cộng
sự của mình đã phát hiện tính ổn định nhiệt tốt hơn của SEA trong nước dung thịt bò so

với đệm phosphate, Fung và các cộng sự báo cáo rằng tại 60 oC, SEC trong đệm
phosphate đã được bất hoạt trong 60 phút so với 180 phút trong môi trường nuôi cấy.
D121 của SEB có phạm vi từ 9.9 đến 11.4 phút và một giá trị của Z là 25.8 tại 32 oC.
Tibana và các cộng sự, và Bennett và Berry cung cấp bằng chứng cho thấy rằng SEA,
SEB, SEC, và SED có thể tồn tại trở lại trong điều kiện đúng về nhiệt độ và thời gian.
• Khả năng kháng phóng xạ
Các độc tố xuất hiện khả năng kháng phóng xạ gamma. Read và Brashaw đã chứng
minh nhiều hơn so với 2.7 và 9.7 là cần để giảm tác dụng phụ của SEb trong sữa và đệm
tương ứng. Gần đây Modi và các cộng sự đã kiểm tra ảnh hưởng của chiếu xạ trong SEA
bằng cách sử dụng hệ thống elisa nhạy. Trong đệm galatin phosphate, SEA hoàn toàn bất
hoạt bởi phóng xạ ở 8.0 kGy. Tuy nhiên, ở 15% (mince slurry) 27-37% của SEA vẫn ở
8.0kGy. Thật thú vị, tác dụng bảo vệ của (the mince slurry) đã được nhìn thấy tập trung
của 30%, trong khi tác dụng bảo vệ giảm khi (the slurry) tăng trên 30%.
• Khả năng kháng enzyme
SES có khả năng chống lại hoạt động của enzyme thủy phân protein như trypsin,
chymotrypsin, rennin, và papain (ph>2.0). Tuy nhiên, SE dễ bị ảnh hưởng với pepsin ở
giá trị pH nhỏ hơn 2.0. Đây là khả năng chịu được sự tấn công của những sự thủy giải
protein hỗ trợ khả năng của chúng vẫn hoạt động sau khi uống hoặc hoạt động duy trì
thực phẩm trong nhiều năm.
3) Sản xuất

14


Các tụ độc tố tụ cầu khuẩn được sản xuất trong nguồn giàu dinh dưỡng và các nơi
truyền nguồn dinh dưỡng khó khăn. Theo Smith và các cộng sự các yếu tố sau ảnh hưởng
đến cả sự phát triển và sản xuất độc tố: kích cỡ của chủng, nồng độ oxy, nhiệt độ, pH,
nồng độ natriclorua, Aw, các ion khoáng, và thành phần truyền tín hiệu. Sự sản xuất của
SEs là khác nhau thành hai nhóm dựa trên đặc điểm sản xuất. Đầu tiên các nhóm bao
gồm SEB và SECs, khi chúng được sản xuất với số lượng lớn và phụ thuộc vào điều kiện

ấp trứng hoặc điều kiện nuôi. Điều kiện thứ hai bao gồm các nhóm của SEA, SED, và
SEE, khi chúng được sản xuất với số lượng nhỏ hơn, quá trình sản xuất liên quan chặt
chẽ đến sự tăng trưởng của sự căng thẳng chứ không phải điều kiện ủ bệnh. Nói chung,
một số yếu tố hiện diện trong thực phẩm xác định có hay không SE có thể được sản xuất.
Bất kỳ thực phẩm nào có môi trường thuận lợi và bị ô nhiễm với một loại enterotoxigenic
của S.aureus là có khả năng gây ngộ độc thực phẩm do tụ cầu khuẩn. Các yếu tố ảnh
hưởng đến sự tăng trưởng và sản xuất của tụ cầu và độc tố ruột đã được xem xét và sẽ
được đề cập vắn tắt ở đây. Người đọc muốn tìm hiểu xa hơn nữa về sự phát triển của
S.aureus và sản xuất của SEs điều đó vượt ra ngoài phạm vi của chương này.
Mức độ ô nhiễm của việc sản xuất SE là đáng kể.Mức độ cấy cao hơn sẽ cho kết quả sản
xuất SE cao hơn. Ngoài ra mức độ cấy cao hơn sẽ giảm thiểu được áp lực với môi trường.
SEs đã được chứng minh được sản xuất ở giới hạn nhiệt độ 10 oC-45oC mà tại đó S.aureus
có thể phát triển. Nói chung nhiệt độ hỗ trợ kích thích sự phát triển độc tố trong thực
phẩm. Phạm vi pH sản xuất SE là hơi hạn chế so với sự tăng trưởng và đã được báo cáo
pH ở giữa 5.2-9.0. Ở trong giới hạn pH mà tại đó S.aureus không phát triển tốt, ít có khả
năng sản xuất độc tố ruột non. Phạm vi tối ưu cho việc sản xuất độc tố ruột non chịu ảnh
hưởng bởi Aw. SEA (0.90) được sản xuất ở giá trị Aw thấp hơn so với SEB(>0.90). Sự
sản xuất của SEs có thẻ chịu ảnh hưởng bởi điều kiện tăng trưởng kỵ khí hay hiếu khí.
Staphylocci có thể phát triển dưới cả hai điều kiện. Tuy nhiên phát triển dưới điều kiện
kỵ khí khí sẽ chậm hơn, và tế bào thường không đạt được những cái mà dưới điều kiện
hiếu khí. Mặc dù độc tố ruột non thỉnh thoảng được phát hiện được sản xuất dưới điều
kiện hiếu khí, những sự quan sát này có thể thay đổi. Hiện nay điều đó không thể chứng
minh cho giả thuyết rằng độc tố ruột non có thể được sản xuất trong thực phẩm đóng gói.
15


Sự xuất hiện của SEs trong thực phẩm đã được thông báo(94). Xấp xỉ 25% dòng
S.aureus được phân lập ngẫu nhiên trong thực phẩm đã cho thấy sự sản xuất các chủng
khác nhau của SEs(95). Gourama et al.(96) cho biết rằng sự phát triển của S.aureus đạt
mức tối ưu trong số Chowder với số lượng tế bào đếm được lớn hơn 10 8 cfu/g sau 12 giờ

ở nhiệt độ 42oC. Sự sản sinh của SEs và SED bắt đầu sau 3 tiếng. Thêm vào đó, sự phát
triển trong nước luộc nghêu sản sinh ra lượng SEA và SED với nồng độ lần lượt là 21.9
và 36.3ng/mL, sau 24 giờ ở 37oC. Tuy nhiên, Daoud và Debevere tìm ra sự sản xuất của
độc tố enteretoxin chỉ ở mức thấp mặc cho sự tăng trưởng tốt của S.aureus trong các loại
rau quả được đun nóng.
Độc tố enteretoxin là các protein ngoại bào được biểu hiện ở mức cao và có thể được
sản xuất ở mức vượt ngưỡng 100ug/mL, trong lúc những độc tố khác được sản xuất ở
ngưỡng thấp (thường vào khoảng một vài ug/mL)(2). Bất chấp điều đó, phần lớn các vụ
bùng phát nhiễm độc thực phẩm xảy ra do các kiểu huyết thanh A và D. Một nhân tố
chính trong nhiễm độc thực phẩm bởi độc tố enteretoxin bởi tất cả các type của khuẩn
cầu là do khả năng chịu nhiệt nội bào cao của chúng, thứ mà cho phép các độc tố tồn tại
được qua các phương pháp xử lý nhiệt có thể giết chết sinh vật trong quy trình sản xuất.
Vậy nên, không hiếm thực phẩm độc hại được tìm thấy trong đó mà không có
staphylococci có thể được phục hồi.
Về mặt di truyền, các nội độc tố khá đa dạng. Gene (sea) của nội độc tố A(SEA) được
hình thành từ một nhóm các thực khuẩn thể ôn hòa, tái tổ hợp với nhiễm sắc thể trong các
gen beta-độc tố (hlb) bất hoạt nó và chuyển đổi thụ thể thành một kiểu hình Hlb - SEA+.
Một số bộ phận của nhóm thực khuẩn thể này cũng mang gene cho staphylokinase (sak)
và đồng thời chuyển đổi thụ thể thành kiểu hình Hlb - Sak+ SEA+ (98-100). Gene (seb) của
nội độc tố B (SEB), ngược lại, là gene nhiễm sắc thể, là một phần của yếu tố riêng biệt
lúc đầu được cho là thực khuẩn thể khiếm khuyết cao(101) nhưng nhiều những bằng
chứng gần đây(102; R.P.Novick, personal communication) liên kết các gene thành nhóm
gây bệnh di động. Hơn nữa, các yếu tố của tst và sab nằm trên cùng một locus và loại trừ
lẫn nhau. Các gen của nội độc tố C(SEC), E(SEE), G(SEG) và H(SEH) đều được cho là

16


thuộc về nhiễm sắc thể(26), và dù có khả năng, người ta không biết nó liệu có phải là một
phần của các nhân tố di truyền lớn hơn như là các gen nội độc tố A và B.

Nội độc tố D (SED) được mã hóa bởi một gene nằm trên một staphycococal plasmid lớn
(pIB485 là plasmid nguyên mẫu), thứ mà đồng thời cũng mang gene (sej) của nội độc tố
J(SEJ) (103), thứ định vị trực tiếp ngay trên mạch trên của sed và được sao chép theo
hướng ngược lại. Không có gene nội độc tố nào là gene thiết yếu được đòi hỏi cho sự
tăng trưởng của S.aureus. Vì nguồn gốc của chúng có thể bắt nguồn từ các yếu tố di
động, chúng thường được xem là vật liệu di truyền phụ. Ngoại trừ SEA, biểu hiện của các
gene nội độc tố được điều hòa dương bởi protein ngoại bào tổng thể tụ cầu kiểm soát
mạch agr(gene điều hòa phụ) (102). Sự biểu hiện của bộ điều biến này được kích hoạt
trong pha lôgarit muộn, và chức năng của nó thì đặc biệt cần thiết cho sự phiên mã của
các gene của protein ngoại bào. Chính vì vậy, sự hoạt hóa của agr trong pha lôgarit muộn
giải thích vì sao các nội độc tố (ngoại trừ SEA) được sản xuất trong pha cân bằng của sự
tăng trưởng. SEA được sản xuất trong pha lôgarit của sự tăng trưởng, sự phiên mã của
gene không nằm dưới sự ảnh hưởng của mạch điều khiển agr(8).
4) Dấu hiệu nhận biết
Việc phát hiện các nội độc tố trong thực phẩm vẫn luôn là một vấn đề. Chỉ một vài động
vật có thể thông qua phản ứng nôn để loại bỏ các chất độc đã được dùng, và đáng tin cậy
nhất trong số này là loài khỉ(20). Mô hình nhiễm độc nội độc tố này thì tốn kém, phức tạp
và đòi hỏi việc xây dựng các trung tâm chăm sóc động vật. Tuy nhiên, phương pháp
chuẩn của việc dò tìm là có tính miễn dịch và dựa vào các phản ứng kết tủa được quan sát
trong nhiều những thí nghiệm khuếch tán gel khác nhau. Mặc dù nhiều các độc tố có
phản ứng miễn dịch chéo, nhưng phương pháp xét nghiệm Ouchterlony định lượng và
định chất chất độc tinh khiết chuẩn thường được sử dụng để nhận biết huyết thanh cụ thể
hiện diện. Nước chiết từ những món thực phẩm có nghi vấn được sử dụng trong xét
nghiệm này, nhưng trong thực tế hiếm khi có đủ nguyên liệu còn sót lại sau một đợt bùng
phát để có thể thực sự tiến hành được xét nghiệm này, và một chẩn đoán về nhiễm độc
thực phẩm thường được thực hiện một cách truy lại.
17


Khi một thực phẩm bị ngờ rằng gây nhiễm độc thực phẩm bởi tụ cầu phải được xét

nghiệm để tìm kiếm sự hiện diện của S.aureus còn hoạt tính và sự hiện diện của SE. Điều
này là vì khả năng chịu nhiệt của SE tốt hơn nếu so sánh với S.aureus, nó có thể là thực
phẩm đóng vai trò là nguồn gốc của một dịch ngộ độc do thực phẩm nhiễm staphycococal
nhưng không có sự hiện diện của sinh vật hữu hiệu. Để xác nhận một đợt bùng phát
nhiễm độc thực phẩm do tụ cậu, điều cần thiết ở đây là chỉ ra sự hiện diện của SE trong
món thực phẩm liên quan. Các quy trình truyền thống để phát hiện SE thì tốn thời gian,
vất vả và thiếu độ nhạy. Thử nghiệm thành công lúc trước cho sự hiện diện của SE sử
dụng mẫu nôn của khỉ vẫn còn được sử dụng đến ngày nay. Một mẫu thực phẩm đồng
chất với nghi vấn (thường là 50 mL) được đưa vào dạ dày của những con khỉ nâu trẻ
(Macaca mulatta). Những con vật này sẽ được theo dõi liên tục trong năm giờ tiếp đó.
Những kết quả dương là sự ói mửa của các con vật. Những con mèo ( Một mẫu kết quả
tích cực trong nôn mửa của con vật. Mèo con (đưa vào màng bụng hoặc tiêm tĩnh mạch)
đã được dùng để thay thế cho những chú khỉ trong dò tìm SE. Những xét nghiệm trên các
động vật chịu nhiều những rắc rối như kinh phí và nhân công tham gia trong việc duy trì
một bầy động vật, sự thất thường, độ nhạy với những động vật khác nhau, và sự hiện diện
của các chất gây nhiễu trong mẫu.
Các phương pháp hiện được dùng để dò tìm SE thì khá nhạy nhưng bị ảnh hưởng bởi
việc thu hồi độc tố không hiệu quả sau khi tách chiết từ thực phẩm, đặc biệt là khi nồng
độ độc tố trong thực phẩm thấp. Nói chung, hầu hết các loại thực phẩm liên quan đến
việc bùng phát nhiễm độc thực phẩm do staphycocal đều chứa lượng độc tố ở ngưỡng
thấp (<1ug)(19). Lượng độc tố tối thiểu cần thiết cho các triệu chứng lâm sàng được cho
là vào khoảng 0.1ug/100g thực phẩm(64). Vì vậy, để xác định độ an toàn của thực phẩm
được cung cấp, các phương pháp dò tìm phải phát hiện được ít nhất 1ngSE /g thực phẩm
(104).
Các phương pháp sử dụng kiểm nghiệm huyết thanh trong ống nghiệm đã được phát
triển để đáp ứng các tiêu chí về độ nhạy với SE. Các xét nghiệm có liên quan đến những
phương pháp với độ nhạy cao bao gồm các xét nghiệm thụ động và vón cục thụ động dự
trữ (PHA và RPHA), xét nghiệm ngưng kết thụ động dự trữ (ELISA), và xét nghiệm
18

miễn dịch phát quang (LIA). Sự phát hiện SE trong các thực phẩm có truyền thống sử
dụng các kháng thể hình thành trong cơ thể chống lại sự tiêm nhập của các kháng nguyên
hòa tan, ví dụ như nội độc tố. Những kháng thể này sau đó có thể phản ứng in vitro với
kháng nguyên đó để tạo thành kết tủa. Hệ thống dựa trên xét nghiệm. Hệ thống dựa trên
thử nghiệm liên quan đến huyết thanh học có thể được phân thành ba loại: (a) xét nghiệm
gel khuếch tán miễn dịch, (b) xét nghiệm ngưng kết , (c) xét nghiệm đánh dấu miễn dịch.
TIÊU BẢN HIỂN VI
Phương pháp truyền thống như khảo nghiệm microslide, khảo nghiệm immunodiffusion
gel được sử dụng cho phát hiện của SE. Khảo nghiệm microslide là dựa trên sự hình
thành kết tủa trên một ma trận thạch và các thủ tục đang được đề nghị cho phát hiện của
SE. Thí nghiệm khuyếch tán microslide gel này được sử dụng để hình dung kết tủa và
được mô tả chi tiết trong Tài liệu Phân tích Vi khuẩn học (10)..
Như thể hiện trong hình. 1, microslide được chuẩn bị với sự trợ giúp của một mẫu,
chẳng hạn có năm giếng được hình thành trong agar Noble tinh khiết cao Kháng huyết
thanh được thêm vào trung tâm, và độc tố tham chiếu được đặt trong giếng 3 và 5 (Hình
2).
Mẫu chuẩn bị được thêm vào các giếng 2 và 4. Các slide sau đó được ủ trong một căn
phòng độ ẩm ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Kháng nguyên (enterotoxin) và kháng huyết
thanh khuếch tán từ các giếng, các hình thức kết tủa nơi tập trung của kháng nguyên và
kháng thể có tỷ lệ tối ưu. Slide sau đó được đọc bằng cách giữ nó trên một nguồn ánh
sáng và chống lại một nền tối. Những sự kết tủa được xác định xuyên qua sự kết tụ của
nó với tuyến cơ sở (của) sự kết tủa. (Hình 2).
Ít nhất là 0,1 mg / ml hoặc ít hơn của SE có thể được phát hiện bằng cách sử dụng
phương pháp này. Tuy nhiên, mức độ nhạy cảm là khó để đạt được (21), trong khi những
người khác đã báo cáo một số bất cập trong kỹ thuật này. Ví dụ, Pereira et al. (105) đã
phát hiện ra rằng sự sinh ra ở mức độ thấp của SED (ng / mL) chủng S. aureus cụ thể trên
các phương tiện truyền thông phòng thí nghiệm, không phát hiện được bằng phương pháp
khuếch tán gel, có thể sản xuất đủ SED (ng/g) trong thực phẩm gây ra ngộ độc thực
19

phẩm. Ewald và chris-tensen (106) báo cáo rằng 51% của 47 chủng S.aureus thử nghiệm
sản xuất SE bằng kỹ thuật ELISA, trong khi chỉ 35% dược phát hiện bằng kỹ thuật
khuếch tán miễn dịch microslide.
MÀU XANH
Việc sử dụng của PHA và RPHA đã được đề xuất khoảng 30 năm trước (107.108). PHA
sử dụng các kháng thể cụ thể ở nồng độ không đổi trong khi mẫu được kiểm tra khác
nhau. Sau ủ bệnh, xử lý kháng nguyên từ tế bào máu đỏ của cừu (SRBC) được thêm vào.
Hemagglu tination (HA) xảy ra khi kháng thể không bị ràng buộc với kháng nguyên. Là
một thay thế, RPHA utiizes kháng thể cụ thể được gắn trực tiếp vào SRBC
Hemagglutinstion thường xảy ra trong thời gian ủ bệnh 2 giờ. Độ nhạy của những kỹ
thuật này nằm trong một giới hạn phát hiện 1 ng / mL. Tuy nhiên, do những khó khăn
liên quan đến ngưng kết SRBC và lớp phủ không đặc hiệu gây ra bởi các thành phần thực
phẩm, các xét nghiệm này đã không được phổ biến. Để khắc phục những vấn đề này,
Igarashi et al. (109) đã phát triển RPLA. Khảo nghiệm này sử dụng các hạt cao su phủ
các kháng thể cụ thể. Tuy nhiên, khi một bộ RPLA thương mại được so sánh với một kit
ELISA thương mại, RPLA không thể phát hiện các yêu cầu 0,1 mg SE/100g phản lưới
thực phẩm (110). Fujikawa và Igarashi (111) sau đó đã cải thiện RPLA bằng cách sử
dụng hạt cao su mật độ cao, đạt được mức độ phát hiện yêu cầu.
Các xét nghiệm huyết thanh học cho thấy nhiều hứa hẹn đánh dấu đăc hiệu immunoassays, trong đó bao gồm RIA, ELISA và LIA. Những xét nghiệm đánh dấu đặc hiệu có thể
được định nghĩa là một loại xét nghiệm ràng buộc sử dụng phản ứng kháng nguyên kháng
thể cơ sở và một đồng vị phóng xạ, phản ứng enzyme hoặc phản ứng phát quang như
điểm đánh dấu.
RIA, cung cấp độ nhạy cao và khả năng để xác định mức độ của SE, là một trong những
đánh dấu đặc hiệu đầu tiên xét nghiệm miễn dịch ultized SE phát hiện. Tuy nhiên, RIA đã
không được sử dụng rộng rãi vì những rủi ro và chi phí sản xuất và xử lý đồng vị phóng
xạ.
Một giải pháp thay thế cho RIA cho phát hiện của SE, trong đó cho thấy triển vọng rất
lớn, là phương pháp ELISA. ELISA được phân loại là một trong hai đồng nhất, nơi mà

20


các xét nghiệm miễn dịch bị ràng buộc vào một ma trận rắn. Khảo nghiệm heterogeneou
là tiếp tục chia nhỏ thành các bánh sandwich ELISA (hình 3 và 4) và ELISA trực tiếp
(Hình 5 và 6). Các thử nghiệm ELISA dựa trên hai giả định hợp lệ: (a) các kháng thể
hoặc kháng nguyên có thể được gắn liền với một sự hỗ trợ vững chắc pha và vẫn còn giữ
lại hoạt động, và (b) hoặc các kháng nguyên hoặc kháng thể có thể được gắn liền với một
enzyme và phức tạp giữ lại cả hai immuological và các hoạt động enzyme của nó. Các
kháng nguyên, cũng như các kháng thể có thể được gắn liền với một loạt các vật thể rắn,
chẳng hạn như đĩa giấy, polyvinyl hoặc polystyrene, duy trì hoạt động và độ đặc hiệu.
Tương tự một số các enzyme (perox-idase, β-galactosidase, vv) đã thành công trong gắn
liền với cả hai kháng nguyên và kháng thể. Các xét nghiệm cạnh tranh sau đó có thể được
thực hiện cho cả hai định lượng và xác định số lượng kháng nguyên hiện diện.
(hình vẽ và kí hiệu)
Ký hiệu số 3 Kháng thể thuận (kỹ thuật ELISA). Kháng nguyên được bổ sung vào màng
lai với kháng thể chuyên biệt; rửa sạch các kháng nguyên không bắt cặp; phức hợp kháng
thể thứ cấp với một enzyme được thêm vào; rửa lần hai và bổ sung cơ chất không màu,
nếu tiếp xúc với enzyme tạo sản phẩm có màu
Một thử nghiệm đề xuất cho SE phát hiện liên quan đến một kháng thể, ELISA bánh
sandwich gấp đôi. Trong kỹ thuật này, một khay polystyrene được bao phủ với các kháng
thể chống lại SE và khay rửa để loại bỏ những kháng thể không bắt cặp. Một vấn đề được
đặt ra từ thực phẩm nghi ngờ có chứa SE, và sau đó được ủ với màng lai kháng thể bằng
vật liệu tổng hợp. SE còn đính lại được kháng thế giữ cố định trên màng lai, trong khi rửa
các chất không bắt cặp. Một phức hợp (kháng thể chống lại SE phức hợp với enzyme
peroidase) được hình thành trên màng. Rửa những phức hợp thừa. Cuối cùng, H 2O2 (cơ
chất peroxidase) được bổ sung. Tỉ lệ H 2O2 oxi hoá phụ thuộc vào số của enzyme được
gắn trên kháng thể, và thế cũng tuỳ thuộc vào số lượng của kháng nguyên trên mẫu kiểm
tra. Sự phản ứng enzyme được xác nhận thông qua vạch phổ theo điều kiện của màu sắc
biến đổi do thuốc thử 5-amino-salicylic acid.

(hình vẽ và kí hiệu)

21


Ký hiệu số 4 Kháng thể gián tiếp (kỹ thuật ELISA). Kháng nguyên được bổ sung vào
màng lai với kháng thể chuyên biệt; sau khi rửa, kháng thể thứ cấp được thêm vào; rửa
lần 2 được trình diện và phức hợp của kháng thể có hình thái đối ngược và enzyme được
thêm vào; sau lần rửa cuối thì 1 cơ chất không màu được bổ sung; nếu tiếp xúc enzyme
tạo sản phẩm có màu.
(hình vẽ và kí hiệu)
Ký hiệu số 5 Kháng thể cạnh tranh (ELISA trực tiếp). Kháng nguyên được kiểm tra và
kháng nguyên – enzyme chuẩn được thêm vào màng lai cùng một lúc với kháng thể
chuyên biệt; màng được rửa và bổ sung cơ chất không màu; nếu tiếp xúc enzyme tạo sản
phẩm có màu.
Phương pháp chẩn đoán bằng kháng thể thuận được sử dụng đầu tiên bởi Saunders
and Barlett (115) phát hiện ra SEA trong thức ăn. Tới nay, phương pháp đó đã được
chỉnh sửa và đánh giá một cách chính xác cho tất cả SE (116). Freed et al (116) đã hạn
định 0.1ng của SE/mL trong mẫu thực phẩm sử dụng giọt polystyrene như chất hỗ trợ.
Ocasio và Martin (104) đã thu được hạn định là 0.5 ng SEB/mL trong 1 mẫu thực phẩm
bất kì. Thêm vào đó, Gomez-Lucia et al. (117) đã tìm ra hạn định là 0.625 ng SEA/mL
sữa và 1 ng SEB/mL sữa, trong khi đó Fey et al. (118) so sánh sự giống nhau của các
phương pháp chuẩn đoán ELISA và kết luận rằng phương pháp chuẩn đoán bằng kháng
thể thuận là cách tốt nhất.
(hình vẽ và ký hiệu)
Ký hiệu số 6 Kháng thể liên tiếp (ELISA trực tiếp). Kháng nguyên được bổ sung vào
màng lai với kháng thể chuyên biệt; sau khi sự bắt cặp hoàn thành, màng được rửa và bổ
sung cơ chất không màu, sự tạo màu tương xứng với sự có mặt của kháng nguyên tại đó.
Một cách thức mới có liên quan và có khác biệt tiếp cận tới việt định lượng sự hiện diện
của SE trong thực phẩm là LIA. Kỹ thuật LIA sử dụng gắn chemiluminescent cũng như

là diazoluminol (119), isoluminol và các dẫn xuất mang tính kiềm của nó, và acridium
esters (120-122). Tuy nhiên, hàm lượng thấp (1%) luminescent có ảnh hưởng (tỷ lệ
photon phát ra cho số lượng phân tử được hình thành) đến giới hạn việc sử dụng LIA để
nhận diện SE trong thực phẩm (123). Từ khi kỹ thuật LIA được giới thiệu, nhiều sự cải
22


tiến đã được ứng dụng. Ví dụ như 1 dẫn xuất của isoluminol [N-(4-aminobutyl)-Nethylisoluminol hemisuccinamid; ABEI-H3], chất này sản xuất ra một số lượng lượng tử
cao khi tạo phức hợp với proteins (124,125), được sử dụng bởi Lohneis et al. (126) để
kiểm tra SE trong thực phẩm. Thí nghiệm immunoluminometric của họ (ILMA), được sử
dụng vào tiếp hợp ABEIH-IgG, chỉ có thể phát hiện 0.40 ng SEB/mL, trong khi ELISA
có thể phát hiện thấy 0.15 ng/ML. Tuy nhiên, Sử dụng ILMA cho 30 phút mẫu ủ bệnh
tương đương với 90 phút sử dũng ELISA. Một ví dụ khác là sự lựa chọn hợp chất hiệu
ứng phát quang cho các phản ứng. Cách chọn lựa này sử dụng enzyme horseradish
peroxidase (HRPO), hoạt động như chất xúc tác hoặc một cofactor trong phản ứng oxi
hóa của luminal H2O2. Sự tiếp hợp enzyme horseradish peroxidase với kháng thể thì ổn
định và đã được sử dụng trong các xét nghiệm LIA cũng như ELISA. Cũng như các phản
ứng phát quang, phản ứng luminal-H2O2 còn là phản ứng lượng tử thấp (1%). Vấn đề này
được giải quyết bằng các sử dụng các enhancer của phản ứng luminal-HPRO-H 2O2. Các
enhancer như các chất phenol thay thế (vd: p-iodophenol) được cung cấp nhiều gấp 2500
lần trong ánh sáng phát quang hơn phản ứng không có enhancer. Ocasio và Martin (129)
đã từng sử dụng phản ứng này để cải tiến kĩ thuật xét nghiệp hệ miễn dịch bằng hiệu ứng
phát quang enhancer (CLIA) cho SEB trong thực phẩm.
V. CÁC TỔN THƯƠNG GÂY TỬ VONG
Ngành công nghiệp thực phẩm thường tận dụng một số các dạng quá trình hoặc tích lũy
ở nhiệt độ thấp nhằm kéo dài thời gian bảo quản chất lượng của các thực phẩm dễ hỏng
(130). Quy trình bảo quản thực phẩm, bao gồm các chất bảo quản hóa học, sấy khô, đông
lạnh, giữ nhiệt, phóng xạ hoặc kết hợp các phương pháp trên, được thiết kế để giảm thiểu
hoặc loại trừ các tế bào thực vật gây bệnh và các loài sinh vật gây thối rửa trong các sản
phẩm thức ăn. Mặc dù hầu hết các sinh vật có kích thước micro bị tiêu diệt, nhưng các tế

bào bị tổn thương hoặc bị stress có thể còn sống sót và phục hồi sau đó. Các tế bào này
thường dễ gây hại ngược lại cho môi trường hơn hoặc các kháng thể kháng tế bào trên.
Các kháng thể này cũng có thể bị tác động bởi các tác nhân chọn lọc đã được kể trên.

23


Những hiện tượng của sự tái phục hồi các tế bào tổn thương hay bị stress được tìm thấy
trong một số hàng hóa, vật phẩm. Các điều kiện gây tổn thương tế bào khuẩn tụ cầu bao
gồm sốc nhiệt (132,133), đông lạnh và đông lạnh khô (134), bức xạ (135), giảm hút
nước(136) và tiếp súc với một số hóa chất khác nhau như axit và muối (137,138). Một
vài vị trí bị tổn thương đã được tiến hành trong các tế bào này. Các báo cáo phổ biến nhất
là ở màng tế bào chất với sự thất thoát tổng hợp của các chất cấu thành tế bào chất
(132,136,139,140) và sự thoái hóa của các ribosome và RNA (141,142). Các vị trí tổn
thương khác gồm sự biến chất của protein và sự bất hoạt enzyme.
1. Nucleic Acids
Sự ảnh hưởng của RNA lần đầu tiên được tìm thấy khi các nhà xét nghiệm tìm thấy các
một ít huyền phù nhiệt của S.aureus bị mất 260 nm vật liệu hút nước. Iandolo và Ordal
(132) cho rằng 260 nm vật liệu hút nước trên đã thoát ra từ S.aureus bị sốc nhiệt là RNA
hoặc các Rnu. Các nghiên cứu sau đó cho thấy rằng các vật liệu trên do sự thoái hóa của
RNA ribosome và các thành phần trong tế bào (141,133).
Sự thoái hóa ribosome và RNA ribosome trong invivo là kết quả của sự sốc nhiệt trên
S.aureus (141,144,145). Phân tích gradient nồng độ của sucrose trong ribosome từ tế bào
sốc nhiệt cho thấy rằng tiểu đơn vị 30S bị tiêu diệt có chọn lọc. Hiện tượng chuyển điện
tử trong gel polyacryamide của RNA ribosome chiết xuất từ tế bào sốc nhiệt cho thấy
RNA 16S bị thoái hóa trong khi RNA 26S thì bình thường. Rosenthal và Iandolo (141)
cho rằng suốt thời gian sốc nhiệt, RNA 16S hầu như bị thoái hóa hoàn toàn và RNA 23S
thì biến đổi. Sự sốc nhiệt trong tế bào vi khuẩn với sự có mặt của các ion phosphate quy
định thì thúc đẩy sự thoái hóa RNA bởi sự kích thích của hoạt động ribonulease và bởi sự
phá vỡ của sự ổn định ribosome do chelation của Mg 2+ nội bào. Vì vậy, sự thoái hóa này

của ribosome vi khuẩn là do các cầu nối hidro bị phá vỡ. Sự phục hồi các tổn thương
tương ứng với giai đoạn tái phục hồi của tế bào. Vì tổn thương ribosome và sự thoái hóa
RNA ribsome là thương tổn chủ yếu trong các sinh vật stress nhiệt, có thể thấy sự tổng
hợp RNA ribosome và đơn vị ribosome là chủ yếu trong quá trình phục hồi (130).
Iandolo và Ordal (144) co rằng sự tổng hợp RNA là cần thiết cho sự phục hồi. Họ còn
24


khẳng định sự tổng hợp RNA xảy ra trước cả sự tổng hợp protein và diễn ra ngay cả khi
sự tổng hợp protein bị ức chế. Ở thí nghiệm tiếp theo, Rosenthal và Iandolo (141) tìm
thấy chỉ tiểu đơn vị 30S và 16S của RNA bị thoái hóa trong quá trình sốc nhiệt. Tuy
nhiên, tiểu đơn vị 50S, cũng như 30S, được tái sinh suốt quá trình phục hồi trong sự tổng
hợp protein. Flowers và Martin (148) xác định quá trình đơn vị ribosome suốt sự phục
hồi của tế bào sốc nhiệt S.aureus. Các tế bào phục hồi được tìm thấy có chứa 3 phân tử
ribonucleoprotein (49S, 26S và 30S). Hiệu ứng chuyển điện tử gel polyacrylamide cho
thấy phân tử 49S chứa RNA 23S, phân tử 36S chứa RNA 16S và tiền 16S. Các phân tử
với đặc tính lắng đọng tương tự được tìm thấy trong các tế bào không bị sốc nhiệt.
2. Độc tố Oxygen
Phân tử oxy chỉ hoàn tan một lượng nhỏ trong nước, với chỉ 9mg/L được hòa tan ở 20 oC
và 1atm (130,149). Chỉ 7mg O2/L hòa tan trong chất dinh dưỡng nước hầm thịt ở 30 oC.
Tuy nhiên, các phân tử oxy hoàn tan gấp từ 7 đến 8 lần trong dung dịch hửu cơ, ví như nó
hầu như trở nên cô đặc trong màng tế bào hút mỡ (150). Phân tử oxy là thuận tử vì hai
trong các electron hóa trị không bắt cặp với nhau. Dạng phân tử oxy này các cấu hình
năng lượng ít nhất với các electron không bắt cặp song song và chuyển điện tử cho đất
hoặc Ozon. Ozon có thể cung cấp năng lượng cho các Oxy đơn phân, mà có hai e tự do
trong vòng xoay không đối xứng. Hai dạng oxy đơn phân tồn tại trong năng lượng bất đối
xứng. Đầu tiên, một trong hai phân tử có năng lượng yếu hơn biến đổi khi các e tự do của
trạng thái ổn định trở nên bắt cặp trong cùng một quỹ đạo và trong vòng xoay vất đối
xứng. Phân tử còn lại biến đổi khi một e bị đưa vào vòng xoay nghịch chuyển, với hai e
tự do còn lại trong quỹ đạo khác. Oxy đơn phân là phản ứng đặc biệt và vì thế đe doa cho

toàn bộ thành phần của tế bào (150). Trong khi nó có đời sống ngắn trong môi trường
nước, nó có thể gây tổn thương nhất cho các vùng lipid/protein., ví như màng tế bào, nơi
nó tiếp xúc với cầu nối C-C trong polyunsaturated fatty acids, và là nơi oxy đơn phân
không bị ngăn chặn và có thể tồn tại lâu hơn (149)

25