Bài giảng vai trò xét nghiệm SHPT (phần text)

Kinh nghi m xây d ng và phát tri n PCR/real-time PCR và m t s
k thu t sinh h c phân t khác trong nghiên c u và ch n oán
T các yêu c u th c t ph i ti p c n n n y h c hi n
1.

i trong ch n oán và i u tr

C n m t gi i pháp toàn di n v ch n oán sinh h c phân t

b nh viêm gan

virus B và viêm gan virus C m n tính
B nh viêm gan virus B và viêm gan virus C m n tính là h u qu c a tình tr ng
nhi m virus viêm gan B (HBV=Hepatitis B virus) và virus viêm gan C (HCV=hepatitis
C virus) gây ra. B nh nhân có th b nhi m HBV và HCV qua

ng máu nh tiêm

chích, truy n máu, nh r ng, châm c u, làm móng, hay các th thu t xâm l n... b i các
d ng c b nhi m virus. Ngoài ra, nhi m trùng HBV và HCV còn có th xãy ra qua con
ng tình d c, m truy n qua con khi sinh n ...
Theo các thông tin t T Ch c Y T Th Gi i và m t s nhà nghiên c u trong và
ngoài n

c, Vi t Nam là m t trong nh ng qu c gia

ng hàng

u v t n su t nhi m

HBV qua xét nghi m phát hi n kháng nguyên b m t c a virus (HBsAg) trong máu,

v i t l ng

i bình th

nhiên c a m t ng

ng có HBsAg d

th

nh n

c a h

ng di n ti n t

i b nhi m HBV là a s t kh i do h th ng mi n d ch t o

kháng th b o v là kháng th
c

ng tính là 10-30%. Th

c hi u HBsAg. Ch có m t s ít, h th ng mi n d ch

không th

di n

c

kháng

nguyên b m t c a virus là
có th

kháng nguyên l
t o

c áp ng mi n d ch

do v y mà các ng

i này b

mang HBV trong c th lâu
dài và lúc nào xét nghi m
phát
d

hi n

HBsAg

c ng

ng tính. N u không có

các tác nhân nguy c

gây

t n h i t bào gan (nh u ng
r

u, béo phì, gan nhi m

c

S

4:

H ng d n các ch nh xét nghi m
i u tr và theo dõi
i u tr
c hi u b nh nhân b b nh viêm gan
hi u qu
virus B m n tính

144


m , hay b các tác nhân lý hoá khác) thì HBV ch nhân b n thành các virus không hoàn
ch nh (ch có v capsid mà không có lõi DNA) và t o
các virus hoàn ch nh, do v y h ch là các ng

cm ts l

ng r t gi i h n

i lành mang HBV mà thôi (carrier) ch

không phát tri n thành viêm gan m n tính. Tuy nhiên n u có các nguy c th

ng t n t

bào gan xãy ra thì HBV s phát tri n nhi u h n trong t bào gan, do v y l

ng virus

5

hoàn ch nh s

c phóng thích nhi u h n vào trong máu ( 10 copies/1ml máu)

th i gây t n h i t bào gan

tr thành b nh viêm gan m n tính. N u không ki m soát

c s nhân b n c a HBV thì viêm gan m n tính s d n
x gan r i có th d n
Do v y, tr

n ung th gan hay i th ng

c m t ng

nh t thi t ph i cho ch

ng

n ung th gan.

i có xét nghi m HBsAg d

nh làm th nghi m xác

n h u qu khó tránh kh i là

ng tính thì các nhà lâm sàng

nh xem trong máu c a ng

i nhi m

có mang HBV hoàn ch nh hay không b ng xét nghi m PCR phát hi n HBV-DNA, và
n ud

ng tính thì ph i bi t s l

không b ng xét nghi m qPCR
d

ng HBV hoàn ch nh có trên 105 copies/1ml hay
ng HBV-DNA. N u l

nh l

i 10 thì không c n thi t ph i i u tr vì HBV v n còn nhân b n r t gi i h n trong t

bào gan và ch a gây t n h i t bào gan. Nh ng n u l
xét gan có b t n th
v
còn

ng HBV trong máu

5

t quá bình th
n bình th

ng virus 105 thì c n ph i xem

ng ch a thông qua xét nghi m men gan ALT. N u l

ng (1,5 hay t i a là 2 l n bình th
ng là 19IU) thì ph i cho ch

ng,

nam bình th

ng ALT

ng là 33UI

nh i u tr b ng thu c kháng virus

nh lamivudine, adefovir, entecavir, interferon.. hay s d ng ngay t ban

u li u pháp

k t h p lamivudine v i adefovir, v i entecavir, hay v i interferon. N u l

ng ALT v n

còn bình th
có b th

ng thì ph i làm sinh thi t gan

làm xét nghi m gi i ph u b nh xem gan

ng t n mô h c không, hay n u không mu n làm sinh thi t gan thì có th làm

fibroscan gan c a b nh nhân và giá tr fibroscan c ng có th cho bi t tình tr ng t n h i
mô gan dù không chính xác b ng sinh thi t gan. Ngoài ra, c ng c n thi t ph i làm thêm
th nghi m

nh l

ng AFP (alpha foeto-protein) trên các b nh nhân này vì ch c n có

b ng ch ng mô h c có t n th
thì v n ph i cho ch

ng gan hay l

ng AFP v

t quá gi i h n bình th

ng

nh i u tr b nh nhân b ng thu c kháng virus nh trên. Hi n nay

các nhà i u tr không còn o v ng tr s ch

c HBV ra kh i c th b nh nhân vì

nhi m HBV r t d dàng b tái phát sau khi ng ng i u tr . Lý do chính y u là vì HBV
luôn t n t i trong nhân t bào gan d

i d ng cccDNA (covalently closed circular
145


làm ngu n g c di truy n c a virus, và d ng này không h b tác

DNA)

ng b i các

thu c kháng virus là các nucleosides analogs hi n nay. Tuy nhiên vì có nhi u b ng
ch ng cho th y n u không ki m soát mà

l

ng HBV hoàn ch nh trong máu lên quá

cao thì b nh viêm gan m n tính s có nguy c di n ti n
ti n tri n ho c ung th gan. Do v y, sau khi ã b t
virus B m n tính, các nhà i u tr ph i th

xét nghi m qPCR
c) hay PCR
hi n

nh l

nh l

u i u tr b nh nhân b viêm gan

ng xuyên theo dõi hi u qu

ã cho trên b nh nhân b ng cách ph i

mà h

n suy gan m t bù, hay x gan

ng HBV-DNA (n u l

n khi nào l

ng HBV-DNA v n còn

ng HBV-DNA d

i ng

ng virus d

ng phát

kh ng ch

i m c phát hi n do v y mà ph i luôn theo dõi s tái xu t hi n virus

tháng. N u sau m t th i gian i u tr

c hi u (th

không gi m quá 2 log (100 l n), hay không
i u tr , xét nghi m HBV-DNA d
n ng virus kháng thu c,

và phát hi n các

t

n ng

nh k m i 3

ng là 3 tháng) mà l

ng virus

ng 103/ml, hay trong quá trình

ng tính tr l i, bác s

i u tr ph i ngh

n kh

c bi t là kháng lamivudine. Lúc này xét nghi m sinh h c

phân t mà bác s nên ch

nh th c hi n trên b nh nhân là xét nghi m

nh genotype

t bi n kháng lamivudine, adefovir và entecavir trên virus HBV c a

tu thu c

vào genotype
mà có th

ng

ng phát hi n. Quan i m

b ng xét nghi m PCR phát hi n HBV-DNA trong máu c a b nh nhân

b nh nhân

nh l

i ng

c a các nhà i u tr hi n nay là ph i liên t c duy trì li u pháp kháng virus
l

c hi u

nh k m i 3 tháng cho b nh nhân làm

nh tính phát hi n HBV-DNA (n u HBV-DNA d

ng) cho

i u tr

t bi n

i u ch nh

li u pháp kháng virus
thích h p. Tr
các
th
qu

nhà
ng

c

lâm

ây,
sàng

ánh giá hi u

i u tr

c hi u

qua xét nghi m mi n
d ch cho bi t có d u
hi u chuy n

o huy t
S

thanh trên b nh nhân,

5: S
h ng d n ch nh và theo dõi hi u qu
b nh nhân viêm gan virus C m n tính

146

i u tr

c hi u


ngh a là HBeAg (kháng nguyên ti t c a HBV - m t thông s cho bi t có tình tr ng
virus nhân b n) tr nên âm tính và xu t hi n kháng th kháng HBe. Tuy nhiên vì HBV
có th có

t bi n precore làm cho virus không th t o ra

v n có

c kháng th kháng HBe nên mu n xác

nh

c kháng nguyên HBe mà
c ch c ch n có chuy n

huy t thanh th t s hay không thì các nhà lâm sàng ph i ch

o

nh xét nghi m phát hi n

t bi n precore trên các b nh nhân HBeAg [-], có kháng th kháng HBeAg, mà HBVDNA v n còn [+]. Ngoài ra, các nghiên c u g n ây c ng cho bi t r ng

t bi n

precore (v trí 1896) và

n di n

c bi t là core-promoter (v trí 1762/64) có liên quan

ti n viêm gan m n tính, x gan, và ung th gan trên b nh nhân. Do v y xét nghi m
sinh h c phân t phát hi n
các nhà i u tr . S

t bi n precore hi n nay c ng là m t yêu c u th c ti n t

4 là m t tóm t t qui trình cho các ch

nh xét nghi m

i u tr

và theo dõi i u tr viêm gan B m n tính.
Ngoài viêm gan B, nhi m viêm gan virus C c ng là m t v n
tâm hi n nay,
t l ng

r tc n

c quan

c bi t t i Vi t Nam. Theo ghi nh n v tình hình nhi m viêm gan C thì

i bình th

ng

Vi t Nam nhi m virus viêm gan C là kho ng 2-10%, xem

nh là thu c nhóm các qu c gia có t l nhi m virus viêm gan C cao th nhì trên th
gi i. Khác v i nhi m viêm gan B v i a s các tr
kháng th b o v lo i tr
n 85% ng

trùng; có

xu t hi n kháng th

i nhi m t o

c virus hay là m t s ít h n tr thành ng

c

i lành mang

i nhi m viêm gan virus C không có mi n d ch b o v , dù có
c hi u (anti-HCV [+]), b di n ti n

n x gan v i 20% trong s
t l ng

ng h p ng

ó có nguy c di n ti n

n viêm gan m n tính r i

n ung th gan. Do v y mà dù

i nhi m viêm gan C t i Vi t Nam th p h n nhi m viêm gan B nh ng tình

tr ng b nh t t do nhi m virus viêm gan C mang l i là khá cao, không thua mà th m chí
còn h n viêm gan B. Nguy hi m nh v y nh ng b nh viêm gan C m n tính l i là m t
b nh mà d

i ánh sáng c a y h c hi n

toàn v i xác su t thành công có th
i u tr

i l i là m t b nh có th ch a kh i
n 60%. Tuy nhiên,

c hi u viêm gan C m n tính b ng interferon

chu n nh t hi n nay, bác s c n ph i xác
gan C trong máu b ng xét nghi m

có th cho

c hoàn

c ch

nh

ph i h p v i ribavirin là phát

nh là b nh nhân ang mang virus viêm

nh tính HCV-RNA vì xét nghi m anti-HCV ch là

xét nghi m sàng l c trong cho và truy n máu ch không ph i là xét nghi m trong ch n
oán lâm sàng, h n n a m t ng

i có k t qu anti-HCV [+] v n có th không mang
147


virus viêm gan C mà ch là k t qu c a tình tr ng nhi m m m b nh tr
kh i. Sau khi xác

nh

c ng

i b nh d

ng tính HCV-RNA, tr

i u tr bác s c n ph i làm thêm hai xét nghi m n a là

nh l

c khi cho ch

nh

ng HCV-RNA và

nh

genotype c a virus. Lý do là vì bác s c n ph i ánh giá hi u qu
cho trên b nh nhân sau 1 tháng r i sau 3 tháng i u tr và ph
nh l

ng l i HCV-RNA. N u k t qu

nh l

c ó và nay ã

i u tr mà mình ã
ng pháp ánh giá là

ng cho th y virus bi n m t sau 1 tháng

i u tr thì ây là áp ng siêu vi nhanh v i d h u thành công trong i u tr r t t t.
N ul

ng virus gi m trên 100 l n (trên hay b ng 2 log) sau 3 tháng b t

ây là áp ng siêu vi s m và có th
t c. N u l

ánh giá i u tr

khác có d
quy t

ã cho là hi u qu và có th ti p

ng virus không gi m quá 2 log thì có th ph

b nh nhân là không hi u qu và c n ph i cân nh c
c

ng và d

u i u tr thì

ng pháp i u tr

ã cho trên

i u ch nh (dùng lo i interferon

c l c t t h n, b t bu c b nh nhân ph i tuân th h n...).

nh th i gian i u tr là bao lâu thì bác s c n ph i bi t genotype c a HCV trên

b nh nhân, n u là genotype 1 thì c n ph i duy trì th i gian i u tr là 48 tu n hay h n,

còn n u thu c genotype khác thì th i gian i u tr có th ng n h n là 24 tu n. Sau khi
hoàn t t th i gian c n ph i i u tr trên b nh nhân, tr
bác s c n ph i xác

c khi quy t

nh ng ng i u tr ,

nh xem b nh nhân ã s ch HCV-RNA ch a b ng xét nghi m

nh tính HCV-RNA và ch ng ng i u tr khi HCV-RNA hoàn toàn âm tính. Sau khi
ã ng ng i u tr vì b nh nhân ã s ch virus, bác s v n ph i khuy n cáo b nh nhân
làm xét nghi m

nh ính HCV-RNA m i 3 tháng m t l n

có b tái phát không. B t c lúc nào HCV-RNA d

theo dõi xem b nh nhân

ng tính l i thì ó là d u hi u tái

phát và khi y có th bác s ph i xem xét i u tr l i cho b nh nhân và c ng ph i theo
th c hi n l i qui trình xét nghi m nh trên. S
2.

C n xét nghi m k p th i và nh y c m h n
vi sinh gây b nh mà các ph

5 tóm t t qui trình nêu trên.

ch n oán phát hi n các tác nhân

ng tiên vi sinh hay mi n d ch không h u hi u

Bên c nh b nh viêm gan m n tính do virus B và virus C, y h c Vi t Nam c ng còn
ph i

i phó v i các b nh nhi m trùng khác mà v n

gây b nh r t c n thi t ph i có ph

phát hi n các tác nhân vi sinh

ng ti n xét nghi m nh y c m h n, k p th i h n, và

an toàn h n.
Theo ánh giá c a t ch c y t th gi i, Vi t Nam chúng ta là m t trong 22 n

c

mang gánh n ng nhi m lao cao nh t trên th gi i. Ngoài ra v i tình tr ng gia t ng t l
148


nhi m HIV/AIDS hi n nay t i Vi t Nam (có th quá 300.000 theo d
T ) thì nguy c chúng ta ph i
ng. Do v y mà v n

oán c a B Y

i phó v i tình tr ng nhi m lao t ng cao trong c ng

nâng cao n ng l c c a các phòng thí nghi m lâm sàng trong

xét nghi m phát hi n lao là m t v n

mà y h c Vi t Nam ph i

pháp nhu m tìm tr c khu n kháng acid (AFB),

t ra vì v i ph

nh y phát hi n ch

ng

t 64% trong lao

ph i, 27% trong lao ngoài ph i, và ch 9% trong lao màng não; h n n a nhu m kháng
acid b ph thu c khá nhi u vào k n ng c a ng
th xác

nh

i

c lame và k t qu c ng không

c b nh nhân có th t s nhi m lao hay không vì có th có nhi u tr c

khu n kháng acid khác không ph i vi khu n lao hi n di n trong b nh ph m. V i
ng pháp nuôi c y thì

ph

nh y có th cao h n là 77% trong lao ph i, 67% trong lao

ngoài ph i và 39% trong lao màng não nh ng th i gian
tr

c 2 tu n n u chúng ta s d ng ph

có

c k t qu không th

ng pháp c y nhanh v i môi tr

ph i trên 1 tháng n u chúng ta s d ng ph

ng pháp c y v i môi tr

ng MGITT hay
ng Lowenstein

Jensen. Chính vì v y nên t i các b nh vi n hay phòng khám, có r t nhi u tr

ng h p

b nh nhân có d u hi u lâm sàng và X-quang r t nghi ng lao ph i, và h u h t các

tr

ng h p lâm sàng ch n oán nghi ng lao ngoài ph i hay lao màng não mà k t qu

xét nghi m bác s nh n

c v n th

ng là soi không th y, c y không ra. Th c t này

ã òi h i các nhà lâm sàng ph i yêu c u xét nghi m PCR phát hi n lao trong các b nh
ph m khác nhau vì theo nhi u nghiên c u trên th gi i, PCR ã c i thi n áng k
nh y phát hi n lao không ch trong lao ph i mà c trong lao ngoài ph i và lao màng
não. H n n a k t qu PCR c ng cho phép xác
ph i làm thêm các xét nghi m vi sinh xác
kháng acid hay nuôi c y, vì v i PCR ng
là ch

nh ngay là nhi m lao mà không c n

nh nh là

i v i ph

ng pháp nhu m

i làm xét nghi m phát hi n o n DNA ích

c hi u cho vi khu n lao ch không ph i cho các mycobacteria khác không ph i

lao.
M t b nh nhi m khác mà th c t

òi h i ph i tri n khai xét nghi m khu ch

nucleic acid trên c s c a k thu t PCR

i

phát hi n tác nhân gây b nh, ó là b nh s t

Dengue gây s t xu t huy t. D nhiên vi c ch n oán lâm sàng m t b nh nhân có ph i
ang b s t Dengue gây s t xu t huy t hay không th t s không khó m y m t khi b nh
nhân ã xu t hi n các b t th

ng v s l

ng ti u c u (gi m ti u c u) và dung tích

h ng c u (t ng dung tích h ng c u) hay ã có các tri u ch ng i vào shock. Tuy nhiên
149


có th phát hi n
trong nh ng ngày

c b nh nhân có ph i s t Dengue hay s t xu t huy t Dengue
u c a b nh th t s là c m t v n

nan gi i vì

giai o n s m

này v m t lâm sàng hay c n lâm sàng, b nh nhân không có bi u hi n gì
là m t s t siêu vi. Th nghi m mi n d ch h c phát hi n kháng th
th m chí là kháng th IgM, c ng ch có th b t

ud

c hi u h n

c hi u Dengue,

ng tính vào ngày th 4 hay 5

c a b nh và lúc này thì k t qu xét nghi m không còn h u d ng lâm sàng n a vì các
bi u hi n lâm sàng c a s t Dengue hay s t xu t huy t Dengue ã khá rõ. Vì không th
ch n oán xác

nh

c s t Dengue hay s t xu t huy t Dengue trong nh ng ngày

c a b nh nên có th có hai tình hu ng: (1) Ho c là b nh nhân không
i u tr k p th i và do v y khi vào

u

c theo dõi

n b nh vi n ã vào b nh c nh shock quá n ng và

bác s s ph i r t v t v m i c u

c b nh nhân hay s tr tay không k p; (2) Ho c là

trong mùa d ch s t xu t huy t b nh vi n s b tràn ng p b nh nhân vì lâm sàng nghi
ng s t xu t huy t mà ch a có b ng c ch ng minh b nh nhân ang b s t Dengue hay
s t xu t huy t Dengue. Do v y th c t hi n nay òi h i các phòng thí nghi m lâm sàng
ph i có m t ph
nh ng ngày

ng ti n

s c

u c a b nh, và ph

có th ch n oán phát hi n Dengue s m trong
ng ti n y không có gì khác h n là th nghi m RT-

PCR phát hi n RNA c a virus Dengue trong máu b nh nhân nh l
r t cao trong máu trong nh ng ngày

ng virus xu t hi n

u c a b nh, th m chí ngay trong ngày

u tiên

c a b nh.
Trong s n ph khoa hi n nay, các nhà lâm sàng c ng nh nghiên c u y h c c ng
r t c n thi t ph i có k t qu phát hi n và xác
sinh thi t c t cung

nh

c genotype HPV t các qu t hay

phát hi n s m nguy c sinh ung th c t cung trên ph n vì

khoa h c ã ch ng minh

c tác nhân gây ung th c t cung trên ph n là m t s

genotype HPV nguy c cao (nh 16, 18...). Xét nghi m nh v y không th th c hi n
c b ng các ph

ng pháp t bào h c hay mô h c mà ph i

thu t sinh h c phân t khu ch
và sau ó xác

nh trình t

i m t o n DNA

c th c hi n b ng k

c hi u trên vùng gene L1 c a virus

c hi u genotype c a virus, ó chính là k thu t PCR theo

sau là lai phân t .
Hi n nay ngành y t c a chúng ta c ng còn ph i

i phó thêm v i các b nh có

nguy c gây d ch cao nh cúm gà H5N1, và m t trong các bi n pháp
d ch b nh này trên ng

i phó v i

i là ph i làm sao phát hi n s m tác nhân H5N1 trên các m u
150


b nh l y t ng

i nghi ng nhi m b nh

nh s m phát hi n

c

b nh nhân s m

d ch lây cho ng

i

c i u tr

s m cách ly và

trong phát hi n H5N1, chúng ta không th xây d ng các ph

c hi u c ng

i phó. Tuy nhiên

ng pháp virus h c nh

nuôi c y t i các phòng thí nghi m lâm sàng vì i u này không h u d ng lâm sàng do
k t qu nuôi c y không th có nhanh

c, và

phòng thí nghi m lâm sàng nào

cc p

t

nghi m thích h p và h u d ng nh t

ng th i c ng không an toàn vì khó có
3 v an toàn sinh h c. Do v y xét

có th th c hi n

c t i các phòng thí nghi m

lâm sàng không có gì khác h n là xét nghi m RT-PCR phát hi n H5N1 vì xét nghi m
ch

òi h i ph i th c hi n trong phòng thí nghi m có trang b an toàn sinh h c c p 2 và

k t qu xét nghi m không ch nh y c m mà còn có th

n tay lâm sàng ch trong vòng

không quá 3 gi sau khi l y m u.
i phó v i

i d ch HIV/AIDS, ngoài vi c ph bi n các ki n th c tránh lây

nhi m hay tránh các hành vi có nguy c cao b lây nhi m trong c ng
tr

ng, v n

c hi u và có hi u qu cho b nh nhân nhi m HIV/AIDS c ng là v n

qu n lý y t c n ph i th c hi n vì có

c i u tr

nhi m HIV/AIDS m i có th tr l i v i c ng
nh l

mà các nhà

c hi u và hi u qu thì b nh nhân

ng và s gi m thi u nguy c lây nhi m

ng virus trong máu và d ch c th c a b nh nhân s b kh ng ch d

phát hi n.

có th

i u tr

có th thay

i ng

ng

c m t cách hi u qu cho b nh nhân nhi m HIV/AIDS,

các nhà y h c c n ph i có ph
b nh nhân

i u

ng ti n xét nghi m

i ngay phát

nh l

ng

c virus trong máu

i u tr m i khi m t khi l

hay xu t hi n tr l i trong quá trình i u tr . Do v y xét nghi m

ng virus t ng lên

nh l

ng virus HIV

là m t xét nghi m r t c n thi t ph i tri n khai và k thu t d ti p c n nh t hi n nay
th c hi n xét nghi m này là k thu t real-time PCR. Ngoài vi c theo dõi hi u qu
tr

c hi u, xét nghi m phát hi n và

cho các tr s sinh
yêu c u mà ph
ng

nh l

i u

ng HIV còn có giá tr trong ch n oán

phát hi n cháu có b nhi m b nh t m truy n qua không, m t

ng pháp mi n d ch phát hi n kháng th

c hi u HIV không th

c vì có th tr có k t qu HIV [+] qua mi n d ch nh ng kháng th

áp

c hi u

HIV phát hi n trong máu tr có th ch là kháng th t m truy n qua nhau trong th i
k bào thai.
V i ti n b hi n nay v ghép t ng t i Vi t Nam, xét nghi m phát hi n CMV là m t
xét nghi m r t c n thi t ph i th c hi n trên ng
151

i cho c quan

tránh nguy c ng

i


nh n b nhi m r i bùng phát b nh ang ph i nh n li u pháp c ch mi n d ch sau ghép.

N u ch d a vào xét nghi m phát hi n kháng th
ng

c hi u CMV trong huy t thanh c a

i cho t ng thì k t qu ch c ch n s không

c hi u

nói lên

hãy còn mang CMV và s truy n tác nhân gây b nh sang ng

c ng

i cho

i nh n vì kháng th có

th t n t i r t lâu sau khi b nh nhên kh i b nh. Do v y c n ph i có m t xét nghi m
phát hi n tr c ti p tác nhân CMV trong b ch c u c a máu ng
áp ng

i cho, và xét nghi m

c yêu c u này chính là xét nghi m PCR/real-time phát hi n/ nh l

ng

CMV-DNA.

Ngoài ra, th c t c a n n y h c hi n
òi h i các nhà lâm sàng
l

i mà chúng ta ang ti p c n hi n nay c ng

c ph c v các yêu c u xét nghi m phát hi n và/hay

ng nhi u tác nhân gây b nh khác b ng ph

ng pháp khu ch

s c a k thu t PCR và real-time PCR. Ví d

nh

i nucleic acid trên c

phát hi n nguyên do hi m mu n trên

ph n , nhà lâm sàng c n ph i có xét nghi m PCR phát hi n C. trachomatis và N.
gonorrhoeae trong các m u qu t c t cung và n

c ti u.

phát hi n tác nhân viêm

não màng não do virus, xét nghi m PCR phát hi n HSV hay RT-PCR phát hi n
Enterovirus 71 trong d ch não tu r t c n

c tri n khai.

phát hi n H. pylori trong

các m u sinh ti t v t loét d dày tá tràng thì xét nghi m PCR phát hi n tác nhân này
c ng là xét nghi m không th thi u

c. Hay ngay c trong giám sát nhi m khu n

b nh vi n, xét nghi m PCR phát hi n S. aureus kháng methicillin (MRSA) t tay và
qu t m i tr

c c a nhân viên y t và ng

c n thi t ph i

c th c hi n do

c ng nh k t qu có

i ch m sóc b nh nhân c ng là xét nghi m r t

nh y c m cao và qui trình th c hi n khá

n gi n

c nhanh h n nhi u so v i xét nghi m vi sinh truy n th ng.

n th c t tri n khai k thu t PCR, real-time PCR
1.

Các rào c n
V y là th c t

ã òi h i các nhà khoa h c,

c bi t là các nhà y h c ph i nhanh

chóng phát tri n và ng d ng các k thu t sinh h c phân t hi n

i, nh t là PCR và

real-time PCR vào ch n oán và h tr cho theo dõi i u tr b nh nhân t i Vi t Nam.
Tuy nhiên cho

n hi n nay nhi u nhà khoa h c c ng nh qu n lý y t trong n

c hãy

còn khá ng n ng i v i kh n ng này. Các lý do h cho là: (1) các th nghi m này r t
khó th c hi n

c m t cách chu n m c t i các phòng thí nghi m lâm sàng; (2) giá
152


thành th nghi m có th khá cao v

t ngoài kh n ng c a ng

i b nh. Chúng ta hãy

th phân tích có úng nh v y không?
Th nghi m PCR và real-time PCR có th t s khó th c hi n

2.

c m t cách

chu n m c t i các phòng thí nghi m lâm sàng?
PCR và real-time PCR là k thu t nhân b n DNA trong ng nghi m d a vào các
chu k nhi t

nh nguyên li u là các dNTP, enzyme polymerase ch u nhi t, và m t

c p m i là các o n oligonucleotide

n dài kho ng 20-25 base có trình t b sung

c

hi u v i hai

u c a o n DNA ích c n nhân b n. Nh các chu k nhi t này mà o n

DNA ích

c nhân b n theo c p s nhân

sau 30

c nhân b n thành hàng t b n sao d dàng

xác

c phát hi n. V i ph

c g i là PCR kinh i n), k t qu PCR

(ngày nay

nh kích th

c và/hay d a vào lai v i dò

c a s n ph m khu ch
ích không. V i ph

n 40 chu k , o n DNA ích
ng pháp PCR

c phát hi n d a vào i n di

c hi u

i xem có trùng kh p v i kích th

xác

nh trình t

c và/hay trình t

ng pháp real-time PCR thì k t qu PCR

c

c hi u
o n DNA

c ngay trong quá

trình ch y PCR mà không c n ph i th c hi n giai o n phân tích sau PCR nh kh
n ng phát hu nh quang c a ng ph n ng trong quá trình ch y PCR m t khi có s n
ph m khu ch
l

i xu t hi n trong PCR mix. Hu nh quang s càng s m xu t hi n khi s

ng o n DNA ích ban

u trong m u th cho vào PCR mix càng nhi u, chính nh

nguyên lý này mà real-time PCR không ch
l

ng

c DNA ích ban

Nh khu ch
th nói cho

c dùng

phát hi n mà còn

nh

u có trong m u th .

i r i m i phát hi n nên PCR và real-time PCR

t

c

nh y có

n nay ch a có m t k thu t nào có th so sánh n i: Gi i h n th p nh t có

th phát hi n

c là m t phân t . Chính vì v y, PCR và real-time PCR là m t công c

r t h u d ng trong phát hi n các tác nhân vi sinh v t gây b nh. Tuy nhiên m t câu h i
c nhi u ng
c
m t khi

i

t ra là li u PCR và real-time PCR có

c hi u không m t khi

nh y quá cao nh v y? Vì theo lý lu n th ng kê thông th
t

nh y cao thì

chúng ta ph i so sánh

c hi u s th p xu ng.

tr l i

t

ng thì xét nghi m
c câu h i này,

c hi u c a PCR so v i nuôi c y trong phát hi n tác nhân vi

sinh v t gây b nh. Nuôi c y là xét nghi m

c hi u nh t

v t gây b nh vì ch có nuôi c y chúng ta m i xác

nh

phát hi n tác nhân vi sinh
c s hi n di n tác nhân vi

sinh v t gây b nh có m t trong m u th . Qua cái nhìn phân t thì chúng ta s th y nuôi
153


c y ch ng qua là phân l p r i khu ch
hàng t b n sao r i sau ó xác

i b gen c a vi sinh v t gây b nh t m t thành

nh b gen

c khu ch

vào các ki u hình sinh v t hoá h c mà b gen ó qui

i là c a vi sinh v t nào d a
nh. Xét nghi m PCR và real-

time PCR phát hi n tác nhân vi sinh v t gây b nh c ng không khác gì nuôi c y, nh ng
không ph i là nuôi c y b gen mà ch là m t o n gen
b nh (không ph i trong các môi tr

c hi u c a vi sinh v t gây

ng phân l p và nuôi c y vi sinh ph c t p và khác

n gi n trong m t ng ph n ng ch a PCR mix) thành hàng t b n sao

nhau mà ch
r i sau ó

nh danh các b n sao này xem có úng c a vi sinh v t mu n tìm không d a

vào kích th

c và/hay trình t các nucleotide trên các b n sao này. Do ó, n u chúng ta

ã th a nh n nuôi c y là

c hi u nh t thì chúng ta c ng ph i th a nh n PCR

c hi u

ch ng khác gì nuôi c y mà l i nh y c m h n nuôi c y r t nhi u vì nuôi c y b ph
thu c r t nhi u trong các khâu l y m u, chuyên ch m u, th i gian trì hoãn t khi l y
m u
tr

n khi b t

u ti n hành nuôi c y, và

c bi t nh t là ph i ch n l a cho úng môi

ng thích h p cho khâu phân l p; mà các y u t này l i th

ng hi m khi

c th c

hi n m t cách chu n m c t i các phòng thí nghi m lâm sàng t i các qu c gia có thu
nh p th p nh chúng ta.
V y thì t i sao chúng ta l i ng n ng i khi phát tri n và ng d ng xét nghi m PCR
và real-time t i các phòng thí nghi m lâm sàng
b nh vì cho r ng khó có th th c hi n

phát hi n tác nhân vi sinh v t gây

c các xét nghi m này m t cách chu n m c?

Trong khi xét nghi m PCR và real-time PCR l i d th c hi n chu n m c h n xét
nghi m vi sinh r t nhi u vì: (1) Khi không làm xét nghi m ngay thì không c n ph i
c gi trong môi tr

ng chuyên ch trong th i gian có h n nh vi sinh, b nh ph m

xét nghi m PCR có th gi
ch

i u ki n l nh 2-8oC hay gi

n phòng thí nghi m, và n u gi d

ông trong th i gian chuyên

i -70oC thì m u th v n còn nguyên giá tr

làm xét nghi m PCR sau nhi u n m. (2) N u các thu c th
c pha ch d
hoá: Tr

i d ng kit thì các b

c làm xét nghi m PCR r t

u

c cung c p hay
n gi n và d chu n

c h t tách chi t nucleic acid t m u th b ng các kit tách chi t thích h p; sau

ó cho tách chi t này vào các ng ph n ng ch a PCR mix thích h p
chu k nhi t cho khu ch
khu ch

th c hi n các

i nucleic acid ích; và cu i cùng là phát hi n s n ph m

i c a nucleic acid ích (n u là real-time PCR thì b

cn y

c th c hi n

trong quá trình ch y PCR). Trong khi ó, quá trình làm xét nghi m vi sinh ph c t p và
154


khó chu n hóa h n nhi u vì òi h i ng

i làm xét nghi m ph i có

chu n b , l a ch n qui trình v i thu c th và môi tr
sinh v t ích,

ki n th c

ng nuôi c y thích h p cho t ng vi

c bi t là ph i có ki n th c và kinh nghi m

có th b t

c vi sinh

v t ích hi n di n trong b nh ph m.
PCR và real-time PCR còn có nhi u u i m v

t tr i khác so v i xét nghi m vi

sinh nh : (1) K t qu chung cu c s

n tay bác s lâm sàng nhanh h n xét nghi m vi

sinh, không quá 5 gi k t khi b t

u làm xét nghi m. (2) Phát hi n

c các tác

nhân vi sinh v t gây b nh mà phòng thí nghi m lâm sàng không có kh n ng phát hi n
v i các xét nghi m vi sinh hay mi n d ch truy n th ng nh các tác nhân virus (HCV,
HBV, HPV...), tác nhân vi sinh không th tri n khai nuôi c y

c t i phòng thí

nghi m lâm sàng vì kh n ng gây d ch cao (H5N1) hay khó nuôi c y (C. trachomatis,
L. pneumophila), hay có m t r t ít trong b nh ph m (M. tuberculosis trong lao ngoài
ph i, tác nhân viêm màng não m c t

u...), hay là các tác nhân có th nuôi c y

c

nh ng th i gian có k t qu chung cu c quá lâu (M. tuberculosis).
Ngoài ra, m t m i lo ng i n a mà nhi u ng
s n ph m khu ch
và d dàng d n
tay ng

i quan tâm, ó là v n

ngo i nhi m

i, r t d xãy ra trong phòng xét nghi m lâm sàng vì nguy c tích t
n ngo i nhi m vào các thu c th và b nh ph m qua d ng c và qua

i làm xét nghi m. Ngày nay, nh s d ng h th ng ch ng ngo i nhi m s n

ph m khu ch

i b ng men UNG và dUTP cho vào các PCR mix (

ph m khu ch

i có nhi u v trí T b thay th b ng U nh v y mà b khác bi t v i các

DNA nguyên thu

r i s b men UNG phá hu tr

làm cho s n

c khi i vào quá trình khu ch

i) mà th nghi m PCR và real-time PCR r t d dàng tri n khai th c hi n

c t i các

phòng thí nghi m lâm sàng ch c n b trí các vùng làm vi c tách bi t, không c n ph i
trong các phòng tách bi t nh tr
3.

c ây.

Th nghi m PCR và real-time PCR có th t s
Trang b

t ti n không?

t ti n nh t cho m t phòng thí nghi m lâm sàng làm

c xét nghi m

PCR và real-time PCR là máy PCR và máy real-time PCR. Tuy nhiên nh công ngh
ngày càng ti n b và ngày càng có nhi u công ty cung c p máy nên các thi t b này
ngày càng có nhi u tính n ng h n c ng nh ho t
càng ngày càng r h n, không h v

ng h u hi u h n mà giá thành l i

t quá kh n ng trang b c a nhi u phòng thí

155


nghi m lâm sàng. N u tính kh u hao các thi t b này trong giá thành xét nghi m thì
m i tháng ch kho ng 800USD v i th i gian s d ng thi t b là 5 n m.
V y thì t i sao xét nghi m PCR và real-time PCR hi n nay t i các qu c gia tiên
ti n l i quá

t, b nh nhân ph i tr ti n cho m i xét nghi m không d

do ch y u là vì các phòng thí nghi m lâm sàng t i các n i này th

i 100USD? Lý
ng ph i mua các

kit xét nghi m PCR và real-time PCR t các công ty s n xu t kit ch n oán (nh
Roche Diagnostic) v i giá thành r t

t

m b o xét nghi m

c th c hi n m t

cách chu n m c. T i các qu c gia thu nh p th p nh Vi t Nam chúng ta, n u làm nh
v y thì ch c ch n xét nghi m PCR và real-time PCR s ch ng th nào áp d ng

c dù

th c t r t c n ph i có các xét nghi m này.
Chúng ta c ng bi t PCR và real-time PCR là m t k thu t hoàn toàn m cho phép
nhà nghiên c u có th ti p c n

t pha các thu c th th c hi n xét nghi m và ch u

trách nhi m v k t qu xét nghi m mà mình th c hi n (th
nhiên n u làm nh v y thì ch c ch n chúng ta s

ng g i là homebrew). Tuy

i phó v i v n

ch t l

ng c a xét

nghi m PCR và real-time PCR s r t khác bi t gi a các phòng thí nghi m lâm sàng v i
nhau. Do v y gi i pháp hay nh t ó là ph i có kit PCR và realtime PCR s n xu t trong
n

c cung c p

và

c hi u cao, mà còn ph i có

th ki m soát
l

n các phòng thí nghi m lâm sàng. Các kit không ch
y

các chu n m c

ng

t

c

nh y

i làm xét nghi m có

c các s sót xãy ra trong quá trình làm xét nghi m. Nh v y, ch t

ng xét nghi m PCR và real-time PCR

c chu n m c,

u trong các phòng thí nghi m lâm sàng, và

t m c cao m t cách

ng

ng th i giá thành xét nghi m là hoàn

toàn có th ch p nh n.
4.

Th c t tri n khai PCR và real-time PCR
Xu t phát t các nh n

nh trên, trong th i gian qua chúng tôi ã liên t c phát tri n

và hoàn thi n các kit PCR và real-time PCR

a vào ng d ng t i nhi u phòng thí

nghi m lâm sàng có trang b PCR t i Vi t Nam. Nh
ch t l

ng cao m t các

ng

ã nói

trên,

mb o

c

u c a xét nghi m PCR và real-time PCR th c hi n

c t i phòng thí nghi m lâm sàng áp d ng cho ch n oán, th nghi m c ng nh các
kit do chúng tôi cung c p
sau: (1) Kit khu ch
thông qua ch ng [+]

i

làm th nghi m ph i luôn luôn có
t

c

y

nh y cao và có b ng ch ng

c cung c p v i s copies xác
156

nh

ng

các chu n m c
xác

nh

nh y

i s d ng có th


ki m tra

c. (2) Có ch ng n i t i s d ng chung m i v i nucleic acid ích

cung c p v i hàm l

ng copies t i thi u

ng

c

i th c hi n thí nghi m có th cho vào

m u ch ng âm [-] là m u th t và th t s âm tính r i th c hi n xét nghi m cùng v i các
m u th nh v y mà ki m tra

c quá trình xét nghi m có b ngo i nhi m không

trong su t quá trình thao tác xét nghi m c ng nh ch ng minh
tách chi t c ng nh kit khu ch

i. (3) Ng

c

i th c hi n thí nghi m còn có th cho

ch ng n i t i vào PCR mix cùng v i tách chi t c a m u th

có th xác

m u âm tính là âm tính th t s mà không ph i âm tính vì PCR b
th ng ch ng ngo i nhi m b ng dUTP và UNG
ph m khu ch
PCR

ng, ngoài các chu n trên,

chu n bi t rõ hàm l

yêu c u ng

nh

c pha chung vào PCR mix

m b o xét nghi m

ng copies DNA ích c ng

c cung c p

nh l

làm xét nhi m

nh l

t oc x

ng c ng nh xây d ng
nh l

c

s n

i. (5) Trong
ng, các m u

d ng b n v ng v i

i làm xét nghi m ph i t cho vào các PCR mix nh m ánh giá

tác pipetting khi làm

c

c ch . (4) Có h

i b phá hu không cho tham gia vào quá trình khu ch

nh l

nh y c a kit

c thao

ng chu n trong m i l n

nh chính xác.

n hi n nay, chúng tôi ã tri n khai th c hi n các xét nghi m PCR và real-

Cho

time PCR c ng nh s n xu t

c các kit t

ng ng

t

c t t c các chu n m c

trên, ó là:
(1) Xét nghi m và kit PCR phát hi n HBV-DNA (hình 69) d a trên khu ch
ích 259bp trên gen S,
t

ng ng

ch ng d

i bình th

t

i

nh y 10 copies/ml huy t thanh. Có ch ng âm là huy t

ng, và

ng 100 copies/ml là

plasmid chèn úng o n DNA
ích

ch ng minh

nh y c a ph n

ng

c
úng nh

khai báo. Có ch ng n i t i là
plasmid chèn DNA tái t h p
s

d ng cùng m i nh ng cho

s n ph m khu ch
l

ng t i thi u

Hình 69: K t qu xét nghi m PCR phát hi n HBV-DNA
NK
th c hi n v i HBV-PCR kit

i khác bi t DNA ích v i kích th
ki m soát

ngo i nhi m, và xác

c 195bp,

nh y c a tách chi t, khu ch

nh m u có b âm tính vì c ch không.
157

c

c cung c p

i c ng nh ki m tra


(2) Xét nghi m và kit RT-PCR phát hi n HCV-RNA (hình 70) d a trên khu ch
i m t o n 240bp trên vùng 5 NC,

t

nh y 50 copies/ml huy t thanh mà ng

i

s d ng có th ki m ch ng nh
ch ng [+] ch a 200copies/ml là
plasmid chèn DNA

ích. Có

ch ng n i t i là RNA phiên mã
t plasmid chèn DNA tái t h p

kích th

c 195bp khác bi t v i

DNA ích nh ng s d ng cùng
m i. Ch ng n i t i
c p

n ng

Hình 70: K t qu xét nghi m RT-PCR phát hi n HCV-RNA
NK
th c hi n v i HCV-RTPCR kit

c

c cung

t i thi u

ng

i làm thí nghi m cho vào cùng v i m u th

tách chi t RNA cùng v i m u th nh v y ki m tra
t ng m u th và phát hi n

c

c hi u qu tách chi t RNA trên

c c ch trên các m u th k t qu âm tính. Ch ng âm là

m u huy t thanh th t s âm tính c ng

c cung c p ki m tra nguy c ngo i nhi m khi

thao tác xét nghi m.
(3) Xét nghi m và kit PCR phát hi n MTB-DNA (hình 71) dùng trong ch n oán
lao d a trên khu ch

i o n DNA ích 249bp trên o n chèn IS6110 hi n di n t 16

n 30 copies trên genome
c a vi khu n M. tuberculosis,
nh

v y

nh y c a xét

nghi m có th

t

n m c

phát hi n 1fg (1/10 genome vi
khu n) trong th tích m u th
cho vào ng ph n ng. C ng

nh các xét nghi m PCR khác,
có ch ng âm là huy t t
ng

i bình th

Hình 71: K t qu xét nghi m PCR phát hi n MTB-DNA
NK
hi n v i MTB-PCR kit

ng

ng, và có ch ng d

DNA ích nh v y ng

c th c

ng ch a 100 copies/ml plasmid chèn úng o n

i làm xét nghi m có th ki m ch ng

c

c

nh y c a

PCR mix. Có ch ng n i t i là plasmid chèn DNA tái t h p s d ng cùng m i nh ng
cho s n ph m khu ch

l

ng t i thi u

i khác bi t DNA ích v i kích th

ki m tra

c 195bp

c cung c p

c hi u qu tách chi t DNA c a kít tách chi t DNA,
158


minh m u âm tính là không b

c ch , c ng nh ch ng minh

nh y c a PCR

mix.
(4) Xét nghi m và kit RT-PCR phát hi n và

nh type virus Dengue (hình 72) hay

s t Dengue và s t xu t huy t Dengue. Xét nghi m và kit này c ng ch a
ch ng d

ng, ch ng n i t i

y

các

t các chu n m c c a xét nghi m PCR dùng trong ch n

oán nh các xét nghi m và
kit mà chúng tôi phát tri n.
ây là xét nghi m và kit
RT-PCR duy nh t hi n nay
có kh n ng v a phát hi n
v a

nh

c type virus

Dengue ch qua m t vòng
PCR a m i mà k t qu

t

c luôn nh y h n các ph

Hình 72: K t qu xét nghi m RT-PCR phát hi n và nh type virus
Dengue gây s t Dengue và s t xu t huy t Dengue

ng pháp d a trên qui trình kinh i n c a Lanciotti c n

ph i qua hai vòng PCR v i vòng 2 làm t bên trong vòng 1 m i có th

nh

c type

virus. Áp d ng trên th c t lâm sàng, xét nghi m và kít này ã ch ng t có kh n ng
phát hi n và

nh type Dengue r t s m, ngay trong nh ng ngày

u c a b nh, tr

c khi

có d u hi u gi m ti u c u.
(5) Xét nghi m và kit PCR-ELISA phát hi n và

nh type HPV (hình 73) trong

các mãnh sinh thi t hay qu t
c

t

cung.

ây là xét

nghi m và kit do chúng tôi
phát tri n d a trên nguyên
t c s

d ng m i

c hi u

gen L1 c a virus

khu ch

i m t

o n DNA dài

450bp b

ánh d u b i

digoxygenine nh

s

d ng

PCR mix có thêm dig-dUTP.
Sau

ó

Hình 73: Nguyên t c c a xét nghi m và kit NKHPV-PCR-ELISA phát
hi n và nh type HPV

nh genotype c a

HPV b ng cách lai s n ph m khu ch

i trên các gi ng ELISA có các dò
159

c hi u


g n trên gi ng qua n i hoá h c streptavidine-biotin (streptavidine ph trên
gi ng

n i v i các dò

ph m khu ch

i∀ s

c hi u ã g ng biotin

u 5 ). S n ph m lai !probe-s n

c phát hi n b ng c ng h p là kháng th

n dòng

c hi u

digoxygenine ánh d u men peroxidase và tá ch t TMB. Xét nghi m và kit PCRELISA này c a chúng tôi có kh n ng phát hi n và sau ó
genotype th

nh

c genotype c a 10

ng g p nh t c a HPV là: 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, và 58. Hi n xét

nghi m và kit này

c b nh vi n Ph S n T D s d ng thành xét nghi m dùng t m

soát và sàng l c ung th s m c t cung trên ph n .
(6) Các xét nghi m và kit PCR

phát hi n các tác nhân vi sinh v t gây b nh khác

nh PCR phát hi n HSV, CMV, multiplex PCR phát hi n

ng th i N. gonorrhoeae và

C. trachomatis, L. monocytogenes,
nonstop nested PCR phát hi n H5....
T tc

u

t các chu n m c PCR

dùng trong ch n oán (hình 74).
(7) Xét nghi m và kit realtime PCR phát hi n và

nh l

ng

HBV-DNA trong huy t thanh b nh
nhân nhi m HBV d a trên PCR
khu ch

im t o n

c hi u dài

kh ang 190bp t gene polymerase
c a HBV-DNA. Xét nghi m và kit
này

t

nh y 10 copies/ml huy t

thanh. Có ch ng n i t i là plasmid
chèn DNA tái t h p s d ng cùng
m i nh ng cho s n ph m khu ch
i có trình t khác bi t DNA ích

nh v y s

c phát hi n v i dò

Hình 74: K t qu các xét nghi m PCR v i các kit NKHSV-PCR
phát hi n Herpes simplex virus (trên), NKCMV-PCR
NK
phát hi n cytomegalo virus (gi a), và NGRCHLmultiplex PCR phát hi n N. gonorrhoeae và C.
trachomatis (d i)

taqman g n màu hu nh quang
TexasRed, Hex, hay Joe khác bi t v i dò taqman g n màu FAM phát hi n s n ph m
khu ch

i c a DNA ích. Ch ng n i t i

PCR mix cùng v i tách chi t c a m u th nh
160

c cung c p

l

ó ki m tra

ng t i thi u
c

cho vào

c c ch n u có


n các m u âm tính. Có ch ng âm là huy t t

ng ng

i bình th

ng, và ch ng d

ch a 100 copies/ml plasmid chèn úng o n DNA ích nh v y ch ng minh
nh y c a ph n ng úng nh khai báo. Các n ng
c p

d ng b n v ng nh v y mà

PCR efficiency luôn

DNA ích chu n c ng

ng chu n luôn

c xây d ng

ng
c

c cung

t R 0.990 và

t 90-105%.

(8) Xét nghi m và kit RT real-time PCR phát hi n và

nh l

ng HCV-RNA trong

huy t thanh b nh nhân nhi m HCV d a trên PCR khu ch

i m t o n

vùng 5 -NC c a genome c a HCV. Xét nghi m và kit này

t

c hi u

nh y 50 copies/ml

huy t thanh. Có ch ng n i t i là RNA phiên mã t plasmid chèn DNA tái t h p s
d ng cùng m i nh ng cho s n ph m khu ch
v ys

i có trình t khác bi t cDNA ích nh

c phát hi n và phân bi t v i s n ph m khu ch

i t DNA ích v i cùng

nguyên t c kit real-time PCR phát hi n HBV. Ch ng n i t i này
l

ng t i thi u

cho vào cùng v i m u th nh

RNA và phát hi n
ch ng d

ó ki m tra

c c ch . Ch ng âm là huy t t

c cung c p

c hi u qu tách chi t

ng ng

i bình th

ng, và có

ng ch a 100 copies/ml plasmid chèn úng o n DNA ích nh v y ch ng

minh

c

c ng

c cung c p

nh y c a ph n ng úng nh khai báo. Các n ng

DNA ích chu n

d ng
A

b n v ng nh v y mà
chu n luôn

ng

c xây d ng

t

R 0.990 và PCR efficiency
t 90-105%

luôn

C

(9) Xét nghi m và kit RT

real-time PCR

nh l

B

ng

HIV1-RNA trong huy t thanh
b nh nhân nhi m HIV/AIDS
dùng trong theo dõi hi u qu
i u tr

c hi u. Xét nghi m

d a trên PCR khu ch
o n

c hi u

im t

NK

Hình 75: K t qu xét nghi m nh genotype HBV v i kit
HBV
genotype-PCR (A), xét nghi m phát hi n
t bi n YMDD
NK
kháng lamivudine c a HBV v i kit HBVlamiR-PCR (B),

NK
nh genotype HCV v i kit
HCVinoLIPA
xét nghi m
genotype-core PCR (C).

vùng gag

gene c a genome c a HIV1. Xét nghi m và kit này

t

nh y 100 copies/ml huy t

thanh. Có ch ng n i t i là RNA phiên mã t plasmid chèn DNA tái t h p s d ng
161


ng m i nh ng cho s n
ph m khu ch

i có trình t

khác bi t cDNA ích nh v y
s

c phát hi n và phân bi t

v i s n ph m khu ch
DNA

i t

ích v i cùng nguyên

t c kit real-time PCR phát
hi n HBV. Ch ng n i t i này
c cung c p
thi u

l

ng t i

cho vào cùng v i

m u th nh

ó ki m tra

c

hi u qu tách chi t RNA và
phát hi n
âm là huy t t
th

c c ch . Ch ng
ng ng

i bình

ng, và có ch ng d

ng

ch a 100 copies/ml plasmid
chèn

úng

o n DNA

nh v y ch ng minh

ích
c

nh y c a ph n ng úng nh
khai báo. Các n ng

DNA

ích chu n c ng
c p

c cung

d ng b n v ng nh v y

mà

ng chu n luôn

xây d ng

c

t R 0.990 và

PCR efficiency luôn

t 90-

Hình 76: M t s các b xét nghi m PCR và RT-PCR phát hi n các
tác nhân virus gây b nh trên tôm. Các b xèt nghi m này
t y
các chu n m c k thu t cho xét nghi m PCR
và RT-PCR dành cho ch n oán

105%.
(10) Ngoài ra,

có th cung c p thêm gi i pháp toàn di n v các xét nghi m sinh

h c phân t dùng trong ch n oán và theo dõi hi u qu

i u tr viêm gan virus B và

viêm gan virus C m n tính, chúng tôi c ng ã phát tri n các xét nghi m và kit nh :

Nested multiplex PCR
v trí 204 và 180

nh genotype HBV, PCR-RFLP phát hi n

kháng lamivudine c a HBV, PCR core kit
162

t bi n YMDD t i
nh genotype HCV


ng ph

ng pháp lai v i các dò trên thanh inoLIPA (hình 75). Các xét nghi m và kit

này hoàn toàn có th tri n khai

c t i các phòng thí nghi m có trang b ph

ng ti n

PCR.
(11) Trong l nh v c th y s n, công ty Nam Khoa c ng là m t công ty
hàng

u phát tri n

u tiên và

c các b xét nghi m PCR và realtime PCR phát hi n và xác

nh t l tôm nhi m virus WSSV, MBV, HPV, IHHNV, GAV, YHV, TSV, và MrNV
v i

y

các chu n m c dành cho ch n oán. Công ty là nhà tiên phong trong phát

tri n ph
thu t

ng pháp xác

nh l

ng t

ng

Nam Khoa phat tri n

nh t l tôm nhi m b nh b ng ph

ng pháp real-time b ng k

i. Hình 76 minh h a m t s kit PCR và RT-PCR do công ty
phát hi n các virus gây b nh cho tôm.

Và th c t tri n khai k thu t các k thu t sinh h c phân t khác

Th t s cho
ch

n hi n nay, nhu c u

n t các nhà lâm sàng và nghiên c u y h c không

òi h i ph i phát tri n và ng d ng các k thu t PCR và real-time PCR, mà còn òi

h i các nhà khoa h c ph i s m

a các k thu t sinh h c phân t hi n

i khác vào ng

d ng. M t trong các k thu t mà chúng tôi nh n th y r t c n ph i th c hi n

c ó là k

thu t gi i trình t . Quan i m c a chúng tôi là ng d ng k thu t này không ch trong
nghiên c u mà ph i ph c v cho ch n oán lâm sàng. Chính vì v y mà trong n m 2005,
chúng tôi ã

u t máy gi i trình t CEQ8000 có 3 ch c n ng: gi i trình t , phân tích

o n, và phát hi n SNP. N m 2007 chúng tôi ã nâng c p thêm ch c n ng th c hi n
nghiên c u bi u hi n gen và

ng th i

u t thêm thi t b gi i trình t ABI 3130XL có

16 capillaries. V i ch c n ng gi i trình t , chúng tôi ã thành công trong tri n khai các
xét nghi m: (1)
thu nh n
TQPCR; (2)

nh genotype HCV b ng k thu t gi i trình t tr c ti p s n ph m PCR

c t

xét nghi m

nh l

ng HCV-RNA b ng kit

nh genotype và phát hi n các

NK

t bi n kháng lamivudine, adefovir và

entecavir b ng k thu t gi i trình t tr c ti p s n ph m PCR khu ch
HBV; (3) Phát hi n

t bi n precore c a HBV

HCV RT realtime

i t gene rt c a

tiên oán d h u viêm gan virus B m n

tính; (4) Phát hi n M. tuberculosis kháng rifampicine, INH, và ethambutol tr c ti p t
các b nh ph m v i k t qu ch trong vòng 72 gi ... Ngoài ra, các ch c n ng khác c a
CEQ8000 nh ch c n ng phân tích o n c ng ã
nghi m xác

c chúng tôi tri n khai trong xét

nh quan h huy t th ng, ch c n ng phát hi n SNP c ng ang

163

c tri n


khai

phát hi n tính a d ng loài và

c u ung th và hi u qu

t bi n, ch c n ng bi u hi n gene trong nghiên

i u tr các thu c tr ung th ..

K t lu n
ã là m t nhà khoa h c, chúng ta ai c ng có nh ng tri th c nh t

n t các sách v hay các ph
ti p c n.
làm

ng ti n tra c u mà ngày hôm nay chúng ta r t d dàng

ã là nhà nghiên c u trong l nh v c y h c thì chúng ta ai c ng có mong mu n

c m t i u gì ó t các ki n th c mà mình ang có

trong gi i quy t m t s nh ng th c t
n

nh. Các tri th c này

c. V n

chính y u là làm sao

có th

ng d ng

òi h i c a ch n oán và nghiên c u y h c trong
tri th c mà chúng ta có không ch là tri th c suông

mà ph i bi n thành s n ph m? ây là câu h i mà tôi ngh chúng ta r t nhi u ng
bi t làm sao

c vào

i mu n

tr l i. Chúng tôi ngh có 2 câu th c a Goethe có l s giúp chúng ta có

m t kim ch nam

tr l i câu h i trên:
!Knowing is not enough, we must apply
Willing is not enough, we must do∀

V i l i phóng d ch c a m t ng

i b n c a chúng tôi:

!Tri th c s ch ng bao gi
N u không em trãi nghi m v i

i

c v ng c ng tr thành vô ngh a
N u c ng i ôm m ng gi a ch i v i∀
Ngoài ra,
cho là

tránh b các nhà s n xu t n

c ngoài chê bai v m t ch t l

ng có t thua cu c vì cho là TI N NÀO C A

tri th c

v

n

n các

Ó, mà ph i tr l i b ng trau d i

nh cao khoa h c vì TRI TH C

N Ó.

164

ng, chúng tôi

N

ÂU CH T L

NG


ng d ng sinh h c phân t trong ch n óan viêm gan siêu vi
Các câu h i th

ng g p

Viêm gan siêu vi B
Tôi i th máu có k t qu d

ng tính HBsAg, v y là có b gì không?

là kháng nguyên b m t c a virus viêm gan B. M t ng
ng tính t c là ng

HBsAg d

i th máu th y

i ó ang b nhi m virus viêm gan B

Nh v y là có b nguy hi m không? có c n ph i i u tr hay không?
a s ng
s t o

i b nhi m virít viêm gan B thì s có

c kháng th ch ng HBsAg (g i là anhti-HBsAg) và tiêu di t

gan B. Ng

i ó khi th máu s d

mi n d ch l i không th t o ra
d

c áp ng mi n d ch b o v , t c là

ng tính anti-HBsAg. Tuy nhiên có m t s ng

i ó có m t s

mi n d ch và virus. N u h mi n d ch cân b ng

u tranh qua l i gi a h

c hay u th h n thì s ki m hãm

c thành các virus hoàn ch nh do v y mà s không có hay s

có r t ít virus hoàn ch nh vào trong máu. Nh ng tr
mang virus, n u th máu s th y HBsAg d

ng h p này

c g i là ng

i lành

ng tính nh ng d u hi u cho th y có virus

hoàn ch nh là HBV-DNA, t c là acid nhân c a virus, th
s l

ih

c kháng th b o v này nên th máu lúc nào c ng

ng tính v i HBsAg. Trong c th c a ng

không cho virus nhân b n

c virus viêm

ng âm tính hay d

ng tính v i

ng (s copies) r t th p (<105/ml). Nh ng n u h mi n d ch không ki m hãm

mà

virus th ng th thì chúng s nhân b n

c nhi u trong t bào gan t o ra

nhi u virus hoàn ch nh vào máu c a b nh nhân và lúc này th máu s th y HBsAg d
tính

ng th i có virus hoàn ch nh hi n di n trong máu v i s l

qua xét nghi m HBV-DNA cho k t qu d
Trong tr

ng h p này c n ph i xác

ng tính và s l

nh gan ng

ó có b viêm gan m n tính không? N u xác
i u tr

c hi u. Do v y, n u m t ng

ph i th máu xem HBV-DNA có b d
DNA d

ng tính v i s l

ng là 19 IU

ng v

ng

t trên 105 copies/ml.

nh là b viêm gan m n tính thì ph i

i
c

ng tính, chúng ta c n ph i c n

ng tính không và s l

ng bao nhiêu? N u HBV-

ng quá 105/ml thì ph i ti p t c xem men gan (là th nghi m

ALT hay SGPT) c a h có cao không? N u cao v
bình th

c

ng cao phát hi n thông

i b nh có b t n h i không, t c là ng

i b HBsAg d

c

n và 33 IU

i u tr . N u men gan bình th

nam) thì

t ng

ng 2 l n bình th

c coi là viêm gan m n tính và ph i

ng thì c n ph i ch c ch n là t bào gan có b th
165

ng (ALT

ng t n


không thông qua xét nghi m v hình thái t bào gan nh sinh thi t gan hay fibroscan.
N u k t qu cho th y có th
tính và ph i c n i u tr

ng t n thì h c ng ph i

c xem là ang b viêm gan m n

c hi u cho b nh nhân dù men gan bình th

Nh v y là n u b HBsAg d

ng.

ng tính thì c n ph i làm xét nghi m HBV-DNA. V y thì

xét nghi m HBV-DNA là gì? Làm sao th c hi n

c?

Virus viêm gan B có ph n lõi c a nó là DNA t c là acid nhân ch a

ng các thông tin

di truy n c a virus. Virus viêm gan B m t khi nhân b n hoàn ch nh thì s t o

cm t

virus hoàn ch nh t c là bên trong ph n v c a nó ( ó là kháng nguyên v hay kháng
nguyên b m t HBsAg) có ch a

c ph n lõi HBV-DNA. Xét nghi m HBV-DNA t c

là xét nghi m tìm xem trong máu c a b nh nhân có mang virus hoàn ch nh hay không.
ây là xét nghi m sinh h c phân t , thông th

ng

c th c hi n b ng k thu t PCR

(polymerase chain reaction) là k thu t nhân b n DNA trong ng nghi m qua các chu k
nhi t

. Trong xét nghi m này, máu c a b nh nhân sau khi l y s

hay huy t t
huy t t

ng và sau ó phòng thí nghi m s tách chi t DNA c a virus trong các m u

ng và huy t thanh này

a vào m t ng nghi m r i nhân b n các DNA này

trong ng nghi m thành hàng t b n sao

phát hi n. Nh nhân b n lên t m t b n g c

thành hàng t b n sao r i m i phát hi n nên xét nghi m này có
s c

nh y c m c c k cao

phát hi n DNA c a virus có trong m u th dù v i s l

ngày hôm nay v i xét nghi m PCR ng
ban

c tách huy t thanh

i ta còn có th

m

ng r t th p. Ngoài ra,

cs l

u có trong m u th là bao nhiêu d a vào k thu t PCR

nh l

ng b n g c DNA
ng,

c g i là

qPCR hay real-time PCR. V m t nguyên t c qPCR c ng gi ng nh PCR nh ng có thêm
m t tính n ng n a là có th

m

c có bao nhiêu b n g c DNA tr

b n nh m t h th ng quang h c có kh n ng phát hi n

c khi

c nhân

c ph n ng xãy ra trong ng

nghi m trong khi nhân b n xãy ra.
Tôi bi t

c là hi n nay có nhi u n i làm xét nghi m phát hi n và

nh l

ng HBV-

DNA nh ng k t qu có khi l i khác nhau dù th trên cùng m t b nh nhân!! Do v y làm

th nào

tin t

ng

c m t k t qu xét nghi m HBV-DNA vì ây là m t xét nghi m mà

chi phí b nh nhân ph i tr c ng không ph i là ít?
úng là nh v y. Xét nghi m HBV-DNA là xét nghi m d a trên k thu t PCR là m t
k thu t hoàn toàn m nên ng

i làm xét nghi m có th t pha thu c th

làm xét

nghi m mà không ph i b l thu c và các kit xét nghi m mua t các hãng n

c ngoài r t

166


ti n. Tuy nhiên vì là h th ng m nên mu n k t qu xét nghi m
ng

i làm xét nghi m ph i th c hi n

các ch ng

c chính xác thì

ki m soát không cho các s sót xãy

ra trong quá trình làm xét nghi m và các ch ng này ph i hi n th trên k t qu xét nghi m.
V i m t xét nghi m phát hi n HBV-DNA, k t qu ph i hi n th : (1) m t ch ng d
ch ng minh khâu khu ch

i trong quá trình xét nghi m

ng

nh y c m, (2) m t ch ng âm

ch ng minh quá trình thao tác xét nghi m không b ngo i nhi m gây ra k t qu d
tính gi , (3) m t ch ng n i t i trong ch ng âm
m u th

t

nh y, (4) và

ch ng minh khâu tách chi t DNA t

ng th i m u âm tính ph i có chúng n i t i

âm tính là th t s âm tính ch không ph i là âm tính gi .
HBV-DNA thì trong k t qu ph i hi n th
thao tác

nh l

ng

c

t chu n thông qua h s t

t trên 0.990 và hi u qu ph n ng (E) ph i
qu

nh l

ng là

ng bi u di n chu n

ng tính

ng

ch ng minh

t 90-105% và

ng th i ch ng minh k t
c ch y song hành

c tính toán t m t công th c có s n. Ngoài ra,

c v i ch ng n i t i

nh l

ng ph i hi n th

c

m b o âm tính này là âm tính th t s ch

không ph i âm tính gi vì ph n ng khu ch
N u tôi b xác

nh l

ng quan (R) c a các m u chu n ph i

n u mu n k t lu n m t k t qu âm tính thì trong k t qu
m u ód

ch ng minh

i v i xét nghi m

c tính toán t k t qu c a các m u chu n

cùng v i m u th ch không ph i là

ng

ib

c ch .

nh là viêm gan virus B m n tính thì có nh t thi t ph i i u tr không?

N u không i u tr thì có b sao không?
M t ng

i ã b xác

nh là b viêm gan virus B m n tính n u không

c i u tr

c

hi u thì virus s không b kh ng ch mà s liên t c nhân b n trong t bào gan và s tàn
phá t bào gan v i h u qu s d n
b

id n

n x gan và t th

ng t n x gan, b nh nhân có th

n tình tr ng x gan m t bù r i ch t, hay t x gan có th b d n

gan. C ng có tr

n ung th

ng h p b nh nhân b ung th gan mà không c n thi t ph i b qua giai

o n x gan, ây chính là nh ng tr

ng h p b nh nhân tình c qua khám s c kho th y

b kh i u trong gan (qua siêu âm ch n oán) r i sau ó b xác
nghi m máu cho th y HBV-DNA d

nh là ung th gan, xét

ng tính v i s copies cao (>105). Chính vì v y mà

n u ã b ch n oán là b viêm gan B m n tính (tiêu chu n ch n oán là HBV-DNA trên
105 copies/ml, ALT cao g p 2 l n bình th
th y t ch c gan b t n th
không cho virus nhân b n

ng hay xét nghi m sinh thi t ho c fibroscan

ng) thì nh t thi t ph i
gây t n th

c i u tr

c hi u

ki m ch

ng gan. Nhi u nghiên c u ã cho th y n u
167


không

c i u tr

d

ng phát hi n thì nguy c x gan hay ung th gan

i ng

kh ng ch s l

V y thì làm th nào

ng virus hoàn ch nh trong máu b nh nhân luôn

có th bi t tôi

nh ng ng

i này s r t cao.

c i u tr có hi u qu ? và tôi c n ph i

c

i u tr trong bao lâu?
Sau khi b t
b nh nhân

u i u tr
ms l

c hi u kho ng 3 tháng, bác s s cho xét nghi m l i máu c a
ng virus viêm gan B (xét nghi m

trong máu là bao nhiêu. N u l

nh l

ng HBV-DNA) có

ng HBV-DNA trong máu gi m h n tr

trên 100 l n thì có ngh a là i u tr có hi u qu , và xét nghi m này ph i
c m i 3 tháng m t l n cho
ng

n khi xét nghi m

ng phát hi n. K t bây gi tr

DNA mà không c n ph i

nh l

t

ng HBV-DNA cho k t qu d

ng n a và c ng c m i 3 tháng 1 l n

quá trình i u tr mà DNA c a chúng b
t bi n

t bi n

vùng kh i

d ng cccDNA

ng b i thu c kháng virus. M t i u

ch c ch n là n u virus viêm gan B trong b nh nhân ngay t tr

t bi t là khi có

theo dõi xem

c virus không cho nhân

c virus vì chúng t n t i trong t bào gan

(covalently closed circular DNA) không b tác

và

i

c hi u có th s kéo dài trong nhi u n m vì cho

n thành công là kh ng ch

b n ch r t hi m khi lo i tr

c làm liên t c

i thì bác s ch c n cho xét nghi m phát hi n HBV-

có tái phát không. Th i gian i u tr
n nay các nhà y h c ch

nh l

c khi i u tr

c khi i u tr hay trong

vùng gen ti n lõi (precore mutation),

ng (promoter mutation), thì nguy c b nh

nhân s b x gan và/hay ung th gan r t cao, nên trên nh ng b nh nhân này, bác s ph i
i u tr

c hi u cho h su t

i mà không

Xin c t ngh a cho tôi rõ h n

t bi n precore/core promoter là gì? Làm sao

c tôi có mang virus viêm gan B b
i u tr

c phép ng ng i u tr .

t bi n precore/core promoter? Tr

c hi u, tôi có c n làm xét nghi m

bi t

c khi b t

u

bi t mình có mang virus viêm gan B b

t

bi n precore/core promoter không?
Trong b gen (DNA) c a virus viêm gan B có m t gene

hoá thông tin di truy n giúp virus sinh ra
nguyên này

c g i là gene ti n lõi, mã

c kháng nguyên e (HBeAg) và kháng

c virus ti t ra ngoài khi nó nhân b n. Do v y n u trong máu b nh nhân có

s xu t hi n HBeAg thì có ngh a là có s nhân b n c a virus trong c th . N u h th ng
mi n d ch c a b nh nhân th ng th thì virus s b ch n l i và không nhân b n
th i trong máu b nh nhân xu t hi n
Tr

ng h p này y h c g i là có chuy n

c

ng

c kháng th ch ng HBeAg (g i là anti-HBeAg).
i huy t thanh ch ng minh
168

c h mi n d ch