Thử tính kháng khuẩn của FLAVONOID trên ADN GYRASE của STAPHYLOCOCCUS AUREUS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC


VÕ THỊ HỒNG HẠNH

THỬ TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA FLAVONOID
TRÊN ADN GYRASE CỦA STAPHYLOCOCCUS
AUREUS

KHÓA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC
NGÀNH SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: SINH HÓA

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. TRẦN CÁT ĐÔNG

Tp. Hồ Chí Minh, 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC


THỬ TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA FLAVONOID

TRÊN ADN GYRASE CỦA STAPHYLOCOCCUS
AUREUS

KHÓA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC
NGÀNH SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: SINH HÓA

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. TRẦN CÁT ĐÔNG

Tp. Hồ Chí Minh, 2012


LỜI CẢM ƠN
Đề tài khóa luận này được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi Sinh Công Nghệ
Dược, Khoa Dược, Đại học Y Dược Tp. HCM, dưới sự hướng dẫn của: PGS.TS.
Trần Cát Đông và ThS. Vũ Thanh Thảo.
Kính gửi đến PGS. TS. Trần Cát Đông và Th.S. Vũ Thanh Thảo lời biết ơn chân
thành vì sự quan tâm, kiên nhẫn và tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho
em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Kính gửi đến Quý Thầy Cô trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp. HCM lòng biết
ơn về những kiến thức quý báu đã truyền đạt cho em, là nền tảng để thực hiện đề
tài.
Gửi đến chị Nguyễn Thị Linh Giang, anh Nguyễn Minh Thái, các anh chị cùng
các bạn ở Phòng thí nghiệm Vi sinh Công nghệ Dược lời cảm ơn về sự nhiệt tình
giúp đỡ về mọi mặt để tôi hoàn thành tốt đề tài này.
Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình đã luôn bên cạnh và là nguồn động lực giúp tôi
vượt qua khó khăn.
Xin chân thành cảm ơn !
Sinh Viên

Khóa luận cử nhân khoa học

Chuyên ngành sinh hóa

MỤC LỤC
CHỮ VIẾT TẮT.................................................................................................ii
DANH MỤC HÌNH .........................................................................................iii
DANH MỤC BẢNG.........................................................................................iii
ĐẶT VẤN ĐỀ...............................................................................................iv
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN..............................................................................vi
1.1. SƠ LƯỢC VỀ TÌNH TRẠNG ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH..............vii
1.2. TỔNG QUAN VỀ STAPHYLOCOCCUS AUREUS...........................xi
1.3. TỔNG QUAN VỀ FLAVONOID........................................................xiii
1.4. ENZYM ADN GYRASE (TOPOISOMERASE II).............................xix
1.5. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN.....xxiv
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................xxvi
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU...........................................................xxvii
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................xxx
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ
VÀ BÀN LUẬN...................................................................................xxxviii
3.1. Đường cong sinh trưởng của MRSA, MSSA...................................xxxix
3.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của các chất thử.................................xli
3.3. Kết quả chiết tách sơ bộ enzym gyrase..............................................xliv
3.4. Kết quả tách chiết plasmid ..................................................................xliv
3.5. Thử nghiệm tính siêu xoắn gyrase......................................................xlvii
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN
VÀ ĐỀ NGHỊ..................................................................................................l
4.1. Kết luận....................................................................................................li

4.2. Đề nghị.....................................................................................................li
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................lii

i


Khóa luận cử nhân khoa học

Chuyên ngành sinh hóa

CHỮ VIẾT TẮT
ADN
ARN
ATCC
CFU
DMSO
MHA
MIC
LB
TSA
TSB
MRSA
MSSA
MHA
MHB
SDS
BLB
OD
VRSA

Acid Desoxyribonucleic
Acid Ribonucleiic
American Type Culture Collection
Colony froming unit – đơn vị hình thành khuẩn lạc
Dimethylsulfoxid
Môi trường thạch Muller-Hinton
Nồng độ ức chế tối thiểu
Môi trường Luiria-Bertani
Môi trường Tryptic Soy Agar
Môi trường Tryptic Soy Broth
Staphylococcus aureus kháng methicillin
Staphylococcus aureus nhạy methicillin
Thạch Mueller-Hinton
Mueller-Hinton broth
Natri Dodecyl Sulfat
Bacillus Lysic Buffer
Optical density - Mật độ quang
Staphylococcus aureus kháng vancomicin

ii


Khóa luận cử nhân khoa học

Chuyên ngành sinh hóa

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh Staphylococcus aureus.......................................................xi
Hình 1.2. Nguồn gốc flavonoid........................................................................xiv
Hình 1.3.Khung cơ bản flavonoid....................................................................xiv

Hình 1.4. Khung chalcon...................................................................................xv
Hình 1.5. Hoạt động của topoisomerase II tại chạc ba sao chép......................xx
Hình 3.6. Các chất thử sử dụng trong đề tài.....................................................xli
Hình 3.7. Kết quả kháng MRSA và MSSA của các chất thử...........................xli
Hình 3.8. MIC của các chất thử với MRSA.....................................................xlii
Hình 3.9. MIC của các chất thử với MSSA.....................................................xlii
Hình 3.10. MIC của ofloxacin đối với MRSA và MSSA..............................xliii
Hình 3.11. Kết quả điện di các mẫu protein trên gel polyacrylamide............xliv
Hình 3.12. Điện di plasmid trên gel agarose....................................................xlv
Hình 3.13. Tháo xoắn plasmid bằng NaOH.....................................................xlv
Hình 3.14. Tháo xoắn plasmid bằng H2O2....................................................xlvi
Hình 3.15. Plasmid được tháo xoắn bởi topoisomerase I và tinh chế ..........xlvii
Hình 3.16. Thử nghiệm tính siêu xoắn plasmid của enzym gyrase ............xlviii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Cấu trúc cơ bản một vài flavonoid đặt trưng [21]...........................xiv

iii


Khóa luận cử nhân khoa học

Chuyên ngành sinh hóa

Bảng 3.2. Tăng trưởng của MRSA, MSSA theo thời gian..........................xxxix
Bảng 3.3. Kết quả định tính sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn các chalcon...........xli
Bảng 3.4. Kết quả xác định MIC của các chất thử..........................................xlii

ĐẶT VẤN ĐỀ
Phát minh ra thuốc kháng sinh là một trong những đột phá lớn của y học hiện

đại. Nhờ đó, rất nhiều căn bệnh nhiễm trùng đã trở nên có thể kiểm soát được một
cách hữu hiệu. Tuy nhiên, sự gia tăng trong tiếp thị và sử dụng thuốc kháng sinh đã
khiến hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc trở thành một vấn đề nghiêm trọng trong y
học hiện đại. Tốc độ phát triển của các loại thuốc kháng vi khuẩn mới cũng không
thể bắt kịp sức căng của vi khuẩn kháng thuốc. Rất nhiều nhà khoa học đã bắt đầu
lo lắng về nó, và họ rất nỗ lực tìm cách giải quyết vấn đề nan giải này.
Tại Việt Nam, hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn là một thách thức lớn cho
công tác chăm sóc và bảo vệ sức khỏe. Theo thông báo của trung tâm theo dõi sự đề
kháng kháng sinh của vi khuẩn – Antibiotic Susceptibility Test Surveillance
(ASTS) – thường gặp ở Việt Nam, năm 2004 [11]: có 15.262 chủng vi khuẩn được
phân lập tại 6 cơ sở (bệnh viện và viện), đại diện cho 3 miền Bắc, Trung, Nam của
Việt Nam. Kết quả phân lập cho thấy tại mỗi nơi cũng khác nhau [11]. Trong các
loại vi khuẩn kháng thuốc thường gặp, 4 chủng nguy hiểm có mức đề kháng cao,
thường là yếu tố góp phần làm thất bại trong điều trị tại bệnh viện là
Satphylococcus

aureus,

Pseudomonas

aeruginosa,

Escherichia

coli

và

Streptococcus faecalis.
Các hãng dược phẩm và các cơ quan nghiên cứu khắp thế giới đang nỗ lực tìm

kiếm các chất kháng khuẩn mới chống lại chúng. Mỗi năm đều có vài kháng sinh
mới được chấp nhận để góp phần đẩy lùi bệnh truyền nhiễm. Mặc dù vậy, để có
được một kháng sinh mới cần nhiều thời gian nghiên cứu và chi phí cao. Do đó, một
xu hướng mới ngày nay là phối hợp những kháng sinh có sẵn trong thiên nhiên để
tìm ra tác dụng chống lại vi khuẩn. Phương pháp này giúp tiết kiệm thời gian và chi
phí. Bên cạnh đó việc sử dụng các hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên cũng tránh
được những độc tính của thuốc khi chúng được sử dụng trên cơ thể người.

iv


Khóa luận cử nhân khoa học

Chuyên ngành sinh hóa

Flavonoid là một hợp chất tự nhiên phân bố rộng rãi trong thực vật. Những
năm gần đây khi nghiên cứu, sàng lọc các chất không phải là kháng sinh có nguồn
gốc từ dược liệu, các nhà khoa học đã phát hiện apigenin, luteolin, và dẫn chất
flavon có hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus đề kháng methicillin [22].
Staphylococcus aureus là nguyên nhân gây ra một số bệnh nhiễm trùng trên
người và động vật. Mặc dù hiện nay đã phát hiện ra nhiều kháng sinh mới nhưng
chúng không tác động trên Staphylococcus aureus đề kháng methicillin.
Vancomycin là phương kế cuối cùng trong điều trị Staphylococcus aureus kháng đa
thuốc, nhưng gần đây đã có báo cáo Staphylococcus aureus đề kháng vancomycin
[19].
Do đó, việc nhiễm khuẩn đang là vấn đề nghiêm trọng trong lâm sàng và việc
nghiên cứu những kháng khuẩn mới và xác định cơ chế tác động của chúng là mục
tiêu của việc nghiên cứu khoa học liên tục và ứng dụng từ nghiên cứu. Từ thực tế
đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“THỬ TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA FLAVONOID TRÊN ADN

GYRASE CỦA STAPHYLOCOCCUS AUREUS”
Với các mục tiêu cụ thể như sau:
-

Khảo sát đường cong tăng trưởng để xác định thời gian thu nhận
ADN gyrase

-

Tách chiết sơ bộ ADN gyrase

-

Thử hoạt tính ADN gyrase có mặt chất kháng khuẩn flavonoid

v


Khóa luận cử nhân khoa học

Chuyên ngành sinh hóa

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

vi


Khóa luận cử nhân khoa học

Chuyên ngành sinh hóa

1.1. SƠ LƯỢC VỀ TÌNH TRẠNG ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh và một số khái niệm liên quan
Theo quan niệm cũ, kháng sinh là những chất hay hợp chất có cấu trúc hóa
học xác định, chiết xuất từ vi sinh vật (vi khuẩn, xạ khuẩn, vi nấm…) dùng với liều
lượng nhỏ (hàng µg) có tác động ngăn sự phát triển các vi sinh vật khác. Định nghĩa
này do Waksman đưa ra vào năm 1940 để phân biệt các loại thuốc mới được khám
phá là penicillin (một sản phẩm của loại nấm Penicillum) với các chất sulfamid tổng
hợp đã được phát hiện vào những năm 30. Sau đó khi các chất kháng khuẩn khác
được bán tổng hợp từ tác nhân tự nhiên hay tổng hợp toàn phần thì định nghĩa này
không còn phù hợp nữa [31].
Ngày nay, khái niệm “kháng sinh” được dùng để chỉ những hợp chất có nguồn
gốc tự nhiên, bán tổng hợp hay tổng hợp có tác động kháng khuẩn nồng độ thấp
[27]. Chính vì vậy mà phạm vi tìm kiếm các kháng sinh mới được mở rộng nhiều.
Chỉ một số ít kháng sinh được sử dụng như tác nhân hóa trị liệu, còn đa số
những kháng sinh khác thì do độc tính cao hoặc không có tác động trong cơ thể
người và động vật. Ngoài ra, một số kháng sinh được sử dụng không nhằm mục
đích điều trị, ví dụ nisin được dùng làm chất bảo quản thực phẩm [31].
1.1.2. Tình trạng đề kháng kháng sinh
Kháng sinh là một trong những phát hiện quan trọng nhất đối với sức khỏe con
người trong thế kỉ XX, giúp cứu nhiều mạng sống. Điều quan trọng hiện nay là bảo
vệ sự hiệu quả của kháng sinh để điều trị nhiều bệnh do vi khuẩn gây ra ở người.
Khi penicillin được sử dụng rộng rãi trong chiến tranh thế giới lần thứ hai,
penicillin là một “phép màu”, nhanh chóng làm biến mất những vết thương nhiễm
khuẩn. Tuy nhiên, chỉ 4 năm sau khi các công ty bắt đầu sản xuất hàng loạt vào năm
1943, các loại vi khuẩn kháng thuốc cũng xuất hiện [9].
Sự đề kháng kháng sinh là một vấn đề thường gặp đối với vi khuẩn. Sự đề
kháng kháng sinh vô cùng nguy hiểm vì có thể tạo ra ra các chủng vi khuẩn kháng
thuốc (lờn thuốc) trong cộng đồng. Một số kháng sinh tỏ ra rất hữu hiệu trong điều
trị nghiễm khuẩn như ampicillin, tetracillin, chloramphenicol…hiện nay đã bị

kháng bởi các vi khuẩn có thể đến 90 - 95%. Vì vậy, đề kháng kháng sinh đang là

vii


Khóa luận cử nhân khoa học

Chuyên ngành sinh hóa

vấn đề báo động và báo động đã chuyển sang màu đỏ, khi các loại vi khuẩn bệnh
viện kháng loại kháng sinh mạnh nhất hiện nay đã xuất hiện một cách độc lập tại ít
nhất ở tám quốc gia khác nhau [8].
Có hại loại đề kháng kháng sinh
• Đề kháng tự nhiên
Là sự đề kháng của tất cả các chủng trong cùng một loài hoặc cùng một chi
đối với một loại kháng sinh hay nói cách khác nó là phổ kháng sinh thông thường
của một kháng sinh.
-

Enterococcus đề kháng tự nhiên với lincomycin

-

Trực khuẩn mủ xanh Pseudomonas aeruginosa và Escherichia coli đề
kháng tự nhiên với Penicillin G do kháng sinh này không thể thâm nhập
vào tế bào vi khuẩn đó.

Cơ sở di truyền đề kháng loại này chủ yếu là nhiễm sắc thể. Sự đề kháng tự
nhiên có tính di truyền theo loài [9].
• Đề kháng thu nhận

Là đề kháng xuất hiện do có sự đột biến nhiễm sắc thể từ một chủng vi khuẩn
bình thường nhạy cảm hoặc vi khuẩn nhận được gen đột biến đề kháng từ bên
ngoài. Đặc điểm của loại đề kháng này là phát triển và thay đổi theo thời gian, cách
sử dụng kháng sinh, có tính chất khu vực [9].
1.1.3. Nguyên nhân vi khuẩn đề kháng kháng sinh
Nguyên nhân của sự đề kháng có thể do tự nhiên nhưng sự góp phần của con
người cũng không kém phần quan trọng do việc sử dụng bừa bãi và lạm dụng kháng
sinh ngày cành một nhiều của người sử dụng và ngay chính người thầy thuốc làm
mức độ đề kháng ngày càng trầm trọng hơn.
Có bốn nguyên nhân chính:
Sử dụng kháng sinh không hợp lý
Sử dụng không đúng kháng sinh để điều trị những bệnh không phải do vi
khuẩn gây ra đang góp phần vào sự lan rộng của vi khuẩn kháng thuốc. Theo ước
tính của Trung tâm kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh Mỹ, 1/3 tổng số đơn thuốc
kháng sinh dành cho bệnh nhân ngoại trú là không cần thiết. Kháng sinh không gây

viii


Khóa luận cử nhân khoa học

Chuyên ngành sinh hóa

hại cho virus. Khi mọi người uống kháng sinh để điều trị các bệnh do virus gây ra
chẳng hạn như cúm hoặc cảm lạnh, chúng tấn công vi khuẩn ''tốt'' trong cơ thể. Hậu
quả là số vi khuẩn có lợi giảm và cơ thể người uống cung cấp điều kiện thuận lợi để
vi khuẩn ''xấu'' sinh sôi [8] .
Không tuân thủ phác đồ điều trị
Mặc dù kháng sinh có hiệu quả trong việc tấn công vi khuẩn nhạy cảm song
một số vẫn có thể sống sót đặc biệt là nếu bệnh nhân không uống đủ lượng thuốc

cần thiết để làm việc đó. Những loại vi khuẩn kháng thuốc còn sống này nhân lên
và việc tiêu diệt chúng trở nên khó khăn hơn nhiều. Vi khuẩn kháng thuốc cũng có
thể lây truyền từ người này sang người khác. Lời khuyên của bác sĩ là nếu được kê
đơn một loại kháng sinh, hãy uống tất cả thuốc theo chỉ dẫn ngay cả khi cảm thấy
tốt hơn. Không nên sử dụng kháng sinh còn thừa để điều trị một dạng bệnh khác
[8].
Sử dụng kháng sinh cho gia súc và thực vật
Kể từ những năm 1950, nông dân đã sử dụng kháng sinh, kể cả các kháng sinh
dành cho người, trong chăn nuôi gia súc, gia cầm. Họ bổ sung kháng sinh vào thức
ăn để trung hòa hiệu ứng của các điều kiện nuôi nhốt chật chội, vệ sinh kém, cũng
như làm động vật tăng trưởng nhanh.
Tại Mỹ, mỗi năm có tới 1/3 tổng lượng kháng sinh được sản xuất được bổ
sung vào thức ăn động vật. Lượng kháng sinh nhiều khi không đủ để chữa bệnh cho
vật nuôi và dẫn tới tình trạng kháng kháng sinh ở mầm bệnh lây truyền qua thực
phẩm, gây ra vấn đề sinh thái lớn cũng như đe doạ sức khoẻ con người. Những vi
khuẩn kháng kháng sinh thông thường đó tồn tại trong quá trình giết mổ và chế
biến, khiến người tiêu dùng có nguy cơ nhiễm chúng khi ăn hoặc thậm chí chạm
vào thịt hoặc động vật sống. Nếu chúng gây ra các bệnh nghiêm trọng ở người,
kháng sinh thông thường sẽ không có hiệu quả.
Ngoài ra, kháng sinh còn được sử dụng để phun lên thực vật để tiêu diệt vi
khuẩn. Dư lượng kháng sinh trên các quả và rau này có thể tấn công vi khuẩn có lợi
trong ruột người và tiếp tay cho vi khuẩn có hại, kháng thuốc sống sót.

ix


Khóa luận cử nhân khoa học

Chuyên ngành sinh hóa

Vì vậy, sử dụng kháng sinh hợp lí, ngăn chặn việc sử dụng kháng sinh không
theo đơn thuốc trong chăn nuôi và thực vật đang là một vấn đề phức tạp, cần một
giải pháp nhiều mặt [8] .
Sự lạm dụng kháng sinh không kê đơn
Nhiều người đã uống kháng sinh để trị cảm lạnh mà không biết rằng nó chỉ có
hiệu quả đối với bệnh nhiễm khuẩn. Sử dụng quá liều cũng dẫn tới sự xuất hiện của
nhiều dạng vi khuẩn kháng thuốc.
Theo các nhà khoa học, kháng kháng sinh là không thể tránh khỏi song có
nhiều biện pháp khả thi để làm chậm tốc độ của vấn đề này. Các biện pháp trên
nhiều công trình nghiên cứu đang được thực thi, bao gồm cải thiện việc kiểm soát
bệnh truyền nhiễm, bào chế kháng sinh mới và sử dụng thuốc hiệu quả hơn. Barbara
Murray thuộc Đại Học Texas cho biết cả các biện pháp đơn giản cũng có tác dụng,
chẳng hạn như nhân viên y tế rửa tay thường xuyên hơn, xác định và nhanh chóng
cách ly bệnh nhân có các bệnh nhiễm khuẩn kháng thuốc, cải thiện hệ thống thoát
nước cũng như đảm bảo nước sạch ở các nước đang phát triển.
Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), các quốc gia cần chia sẻ thông tin về tình
trạng kháng kháng sinh cũng như nâng cao ý thức của công chúng, bác sĩ, bác sĩ thú
y và nông dân về vấn đề này bằng nhiều hình thức chẳng hạn như thảo luận trực
tiếp hoặc phát tờ rơi. Các chuyên gia cũng yêu cầu WHO, Tổ chức Nông Lương
Liên Hợp Quốc (FAO) và Văn phòng Bệnh dịch Động vật Quốc tế phối hợp để thu
thập dữ liệu, tiêu chuẩn hoá các phương pháp kiểm tra và soạn thảo quy tắc sử dụng
kháng sinh ở vật nuôi [8] .
1.1.4. Cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn
Sản xuất enzym để phá hủy hoạt tính của thuốc
Staphyloccoci kháng penicillin G là do sản xuất được β-lactam, một số trực
khuẩn Gram (-) cũng sản xuất được enzym này. Các vi khuẩn Gram (-) kháng được
aminoglycoside là nhờ các enzym adenylylase, phosphorylase hay acetylase, còn
kháng với chloramphenicol là do vi khuẩn tiết chloramphenicol acetyltransferase
[6].
Thay đổi khả năng thẩm thấu của màng tế bào đối với thuốc

x


Khóa luận cử nhân khoa học

Chuyên ngành sinh hóa

Tetracycline tích tụ bên trong những vi khuẩn nhạy cảm, trong khi đó ở
những vi khuẩn đề kháng thì thuốc không tích tụ bên trong tế bào được. Các vi
khuẩn kháng polymyxin, amikacin và một số aminoglycoside khác cũng là do thiếu
khả năng thẩm thấu của màng tế bào [6].
Điểm gắn của thuốc có cấu trúc bị thay đổi
Một số vi khuẩn kháng aminoglycoside do đột biến nhiễm sắc thể làm mất
hoặc thay đổi một loại protein đặc biệt ở tiểu đơn vị 30S của ribosome vi khuẩn,
được sử dụng như là điểm gắn của thuốc ở những vi khuẩn nhạy cảm. Những vi
khuẩn kháng erythromycin cũng là do những thụ thể trên tiểu đơn vị 50S đã bị thay
đổi, còn kháng penicillin là do vi khuẩn có thể mất hay đã làm thay đổi các PBP
(penicillin bingding protein) [6].

1.2. TỔNG QUAN VỀ STAPHYLOCOCCUS AUREUS
1.2.1. Đặc điểm
Staphylococcus aureus là những cầu khuẩn Gram dương sắp xếp dạng chùm
nho, hoặc xếp thành từng đôi hay chuỗi ngắn tùy thuộc môi trường nuôi cấy, đường
kính 0,7-1,2 µm, không di động, không sinh bào tử và thường không có vỏ [9].

Hình 1.1. Hình ảnh Staphylococcus aureus
S. aureus thuộc loại hiếu – yếm khí tùy ý, mọc dễ trên nhiều loại môi trường
có nồng độ muối cao lên đến 15%. Trên môi trường thạch thông thường S. aureus
tạo khuẩn lạc S (Smooth-trơn) đường kính 1-2 mm, nhẵn. Sau 24 giờ ở 37°C khuẩn

lạc thường có màu vàng chanh (do sản xuất hai loại sắc tố carotenoid, δ-carotenoid
và rubixanthene). Trên môi trường thạch máu, S. aureus phát triển nhanh gây tiêu
huyết, tiết ra năm loại hemolysin (α, β, γ, δ, ε), S. aureus làm đục môi trường canh
thang, để lâu nó có thể lắng cặn.

xi


Khóa luận cử nhân khoa học

Chuyên ngành sinh hóa

S. aureus có khả năng đề kháng với nhiệt độ (phụ thuộc vào khả năng thích
ứng với nhiệt độ tối đa 45°C) và hóa chất cao hơn các vi khuẩn không có bào tử
khác (bị diệt ở 80°C trong 1 giờ trong khi các vi khuẩn khác thường bị diệt ở 60°C
trong 30 phút). S. aureus cũng có thể gây bệnh sau một thời gian dài tồn tại ở môi
trường [9].
S. aureus thường kí sinh tai, mũi, họng. Có khoảng 40-50% người có mang S.
aureus ở mũi và có thể ở da. Vi khuẩn này thường gây bệnh cho người giảm đề
kháng hoặc chúng có thể có nhiều yếu tố độc lực. S. aureus là vi khuẩn gây bệnh
thường gặp nhất và có thể gây ra nhiều bệnh khác nhau như: nhiễm khuẩn ngoài da,
nhiễm khuẩn huyết, viêm da, viêm tai, viêm xoang, viêm phổi, viêm màng não,
nhiễm độc thức ăn, viêm ruột cấp, hội chứng da phồng rộp, hội chứng sốc nhiễm
độc.
Staphylococcus aureus là mối đe dọa lớn cho sức khỏe cộng đồng vì nó là tác
nhân hàng đầu gây bệnh mắc phải ở bệnh viện. Loài vi khuẩn gram dương này có
yếu tố độc lực quyết định gây nhiều bệnh trong lâm sàng, bao gồm mụn nhọt thông
thường, ngộ độc thức ăn, hội chứng sắc tố độc, viêm xương tủy, viêm phổi hoại tử
và viêm nội mạc tim.
Các chủng S. aureus kháng methicillin (MRSA) thường đề kháng đa thuốc và

chỉ nhạy với vancomycin, là thách thức trong việc điều trị và kiểm soát nhiễm trùng
trong bệnh viện. Từ khi được công bố vào những năm 1960, nhiễm MRSA tăng đều
trong các bệnh viện ở Mỹ, Theo hệ thống giám sát nhiễm trùng bệnh viện quốc gia,
của trung tâm kiểm soát và phòng bệnh ở Mỹ, MRSA chiếm 51,7% của chủng S.
aureus phân lập từ bệnh nhân ở hơn 300 đơn vị chăm sóc đặc biệt khắp Mỹ trong
năm 2002. Tỉ lệ MRSA tại Hàn Quốc năm 1988 là 46% nhưng đến năm 2000 là
74%, tại Đài Loan năm 1981 là 20% và 2002 là 69%. Vào tháng 6/2002 một mẫu
đầu tiên của S. aureus đề kháng vancomycin (VRSA) được phân lập ở Mỹ và tính
đến tháng 5/2004, đã có tất cả 03 trường hợp VRSA được phát hiện, từ 1996-2002
phát hiện tổng cộng 24 trường hợp nhiễm S.aureus đề kháng trung gian với
vancomycin [35].

xii


Khóa luận cử nhân khoa học

Chuyên ngành sinh hóa

1.2.2. Cơ chế đề kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus
Sự đề kháng penicillin và cephalosporin là do S. aureus có khả năng tiết βlactam. Tính kháng thuốc được truyền bởi plasmid bằng cơ chế chuyển nạp hay
giao phối [6].
Kháng nafcillin, methicillin, oxacillin thì không phụ thuộc vào β-lactam (do
Staphylococcus aureus đột biến nên thay đổi một loại penicillin bingding protin
(PBP) nên thuốc không gắn vào vi khuẩn được) [6].
Cơ chế đề kháng của Staphylococcus aureus đối với berberin liên quan đến
bơm đa đề kháng thuốc ở vi khuẩn (MDRs-Multi Drug Resistance pumps) [6].

1.3. TỔNG QUAN VỀ FLAVONOID
1.3.1. Định nghĩa, nguồn gốc, cấu trúc, phân loại

Flavonoid là một hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật. Flavonoid
có nguồn gốc từ flavus trong tiếng latinh có nghĩa là màu vàng, tuy nhiên một vài
flavonoid có màu đỏ, xanh, tía hay màu trắng [10].
1.3.2. Nguồn gốc
Flavonoid (hay bioflavonoid) là một nhóm hợp chất rất thường gặp trong thực
vật, có trong hơn nửa các loại rau quả dùng hàng ngày, được khám phá bởi một
trong những nhà sinh hóa nổi tiếng nhất của thế kỉ 20: Albert Szent-Gyorgyi (18931986). Ông nhận giải Nobel năm 1937 với những khám phá quan trọng về các đặc
tính của vitamin C và flavonoid [3].
Phần lớn các flavonoid có màu vàng. Ngoài ra, còn có những chất màu xanh,
tím, đỏ, hoặc không màu.
Flavonoid có mặt trong tất cả các bộ phận của các loài thực vật bậc cao, đặc
biệt là ở hoa, tạo cho hoa những màu sắc rực rỡ để quyến rũ các loại côn trùng giúp
cho sự thụ phấn của cây. Trong cây, flavonoid giữ vai trò là chất bảo vệ, chống oxy
hoá, bảo tồn acid ascorbic trong tế bào, ngăn cản một số tác nhân gây hại cho cây
(vi khuẩn, virus, côn trùng,…), một số còn có tác dụng điều hoà sự sinh trưởng của
cây cối [21].

xiii


Khóa luận cử nhân khoa học

Chuyên ngành sinh hóa

Hình 1.2. Nguồn gốc flavonoid
1.3.3. Cấu trúc
Flavonoid là một chuỗi polyphenolic gồm có 15 nguyên tử cacbon và hai vòng
benzene A, B liên kết bởi một đường thẳng có 3 carbon, hay nói cách khác
flavonoid là những chất có cấu tạo khung theo kiểu diphenyl propan C6-C3-C6 [2].

Hình 1.3.Khung cơ bản flavonoid
1.3.4. Phân loại [10]
Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ
oxy hóa vòng 3C. Đó là:
-

Euflavonoid là các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-2

-

Isoflavonoid có gốc ary ở vị trí C-3

-

Neoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C-4

-

Biflavonoid là những flavonoid được cấu tạo từ hai monomer flavonoid

-

Triflavonoid cấu tạo bởi 3 monomer flavonoid

-

Flavolignan là những flavonoid mà phân tử có một phần cấu trúc lignan

Flavonoid có thể tồn tại ở dạng glycon (gồm khung cơ bản) hay ở dạng
glycosis (gồm khung cơ bản gắn với đường ở vị trí khác nhau).

Bảng 1.1. Cấu trúc cơ bản một vài flavonoid đặt trưng [21]

xiv


Khóa luận cử nhân khoa học

Chuyên ngành sinh hóa
EUFLAVONOID

Flavone

Chalcone

Flavanol

Flavanone

Flavanonol

Flavonol

ISOFLAVONOID

NEOFLAVONOID

Cấu trúc hóa học chalcon được các nhà khoa học nghiên cứu chuyên sâu trên
toàn thế giới. Đặc biệt quan tâm đến các phương pháp tổng hợp và hoạt tính sinh
học của chalcon. Danh pháp “chalcon” được dề nghị bởi Kostanecki và Tambor [6].
Chalcon có 2 vòng A và B nối với nhau bởi một mạch hở 3C, không có dị

vòng C như các flavonoid khác. Đây là những chất có màu vàng đến màu cam.

Hình 1.4. Khung chalcon

xv


Khóa luận cử nhân khoa học

Chuyên ngành sinh hóa

Chalcon có chủ yếu trong một số hoa của họ Cúc (Asteraceate) và cũng có thể
có trong các bộ phận khác của cây như vỏ, lá, quả, rể.
1.3.5. Hoạt tính sinh học của flavonoid và chalcon
Các dẫn chất flavonoid có khả năng chống lại các gốc tự do, chống oxy hóa…
vì flavonoid làm bền thành mạch, khả năng chống oxy hóa của flavonoid còn mạnh
hơn các chất khác như vitamin C, E, selen và kẽm [4].
Tác dụng chống độc: làm giảm thương tổn gan, bảo vệ được chức năng gan
[7].
Trên bộ máy tiết niệu, nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon, flavanon, flavonol
thể hiện tác dụng thông tiểu rõ rệt [7].
Tác dụng chống lở loét của flavanon và chalcon-glycoside của rể cam thảo
được dụng để chữa đau dạ dày [10].
Flavonoid làm bền thành mạch, giảm sức thẩm thấu các ứng dụng trong chữa
trị các rối loạn chức năng tĩnh hồng cầu qua thành mạch, giãn hay suy yếu tĩnh
mạch,rối loạn tuần hoàn võng mạc [4].
Tác dụng của flavonoid trên vi khuẩn đã được chứng minh. Flavonoid có tác
dụng yếu trên MRSA, nhưng khi phối hợp một số kháng sinh sẽ làm giảm MIC của
các kháng sinh này do các flavonoid làm tăng tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với
kháng sinh. Trên E. coli sản sinh ESBL (Extended Spectrum β-Lactamase) cũng có

tác dụng tương tự [5] [6].
Chalcon tuy là một nhóm phụ của flavonoid nhưng gần đây có nhiều dẫn chất
được báo cáo có tác dụng sinh học rất đa dạng. Nhiều hợp chất nhóm này có tác
dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chống khối u, và có các đặc tính kháng viêm [10]
[26]. Chúng cũng là dẫn chất trung gian của quá trình sinh tổng hợp flavonoid, vốn
là những hợp chất rất phổ biến trong thiên nhiên và có nhiều tác dụng sinh học.
Bên cạnh nhóm chalcon truyền thống, các nghiên cứu gần đây về hoạt tính
sinh học của các dẫn chất chalcon dị vòng như quinolinyl chalcon, các chalcon chứa
vòng 1,4-dioxan đã thể hiện tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm khá tốt.

xvi


Khóa luận cử nhân khoa học

Chuyên ngành sinh hóa

Chalcon và các dẫn chất của chalcon đã được tổng hợp và thử nghiệm invitro
với hoạt tính kháng nấm tương đối mạnh so với amphotericin B và Ketoconazol
[26].
Một số hợp chất và dẫn xuất chalcon hoạt tính mới được nghiên cứu như là
2’,6’-dihydroxy-4’-methoxydihydrochalcon được chứng minh có tác dụng với dòng
tế bào ung thư biểu mô và hoạt tính kháng khuẩn chủng Bacillus subtilus và
Micrococus luteus [25].
1.3.6. Cơ chế kháng khuẩn của flavonoid
Ức chế tổng hợp acid nucleic
Sự nhân đôi ADN bắt đầu bằng phản ứng tách chuỗi ra làm hai, mỗi bên là
một khuôn để gắn nucleotide thích hợp theo nguyên tắt bổ sung. ADN polymerase
xác tác sự tổng hợp các liên kết giữa các nucleotide, ADN gyrase nối các ADN
trong quá trình tổng hợp và tạo thành các vòng xoắn. Các flavonoid ức chế mạnh sự

tổng hợp ADN trong giai đoạn nhân đôi do ức chế enzym ADN gyrase. Cơ chế tác
động này hiệu quả trên cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Vì vậy Mori và cộng
sự chỉ ra rằng quá trình tổng hợp ADN ở Proteus vulgaric hay tổng hợp ARN ở S.
aureus bị ức chế mạnh bởi flavonoid. Tổng hợp protein, lipit cũng bị ảnh hưởng
nhưng với mức độ rất ít. Tác giả cho rằng các vòng B của flavonoid có thể đóng vai
trò quan trọng trong liên kết đan xen hay sắp xếp hidro tổng hợp acid nucleid của vi
khuẩn, vì vậy có thể giải thích cơ chế ức chế sinh tổng hợp ADN, ARN của
flavonoid [18].
Ohemeng và cộng sự đã sàng lọc được 14 loại flavonoid ức chế ADN gyrase
của Staphylococcus epidermidis, S. aureus, E. coli, S. typhymurium và
Stenotrohpomonas maltophilia.
Gần đây, Plaper và cộng sự đã báo cáo rằng quercetin có tác dụng trên tiểu
đơn vị gyrB của ADN gyrase E. coli, ức chế hoạt động ATPase của enzym này. Hay
sự ức chế xảy ra trên topoisomerase IV bằng cách thay thế amino acid tại vi trí 410
gyrB. Điều này càng chúng tỏ hoạt động kháng khuẩn của flavonoid bằng cách ức
chế lên ADN gyrase [18].
Ức chế chức năng màng tế bào chất

xvii


Khóa luận cử nhân khoa học

Chuyên ngành sinh hóa

Một nhóm nghiên cứu trước đây đã tìm thấy sophorafla vanone G có khả năng
kháng S. aureus và Streptococci thông qua ức chế chức năng màng tế bào chất. Cơ
chế tác động flavanon lên màng tế bào chất đã được báo cáo gần đây. Ảnh hưởng
của sophoraflavanon G được nghiên cứu trên màng liposom có cấu trúc tương tự
màng tế bào vi khuẩn, màng này có nhiệm vụ bao bọc và ngăn cách dịch tương bào

với vỏ tế bào, điều hòa sự trao đổi với môi trường bên ngoài. Kết quả nghiên cứu
cho thấy rằng sophoraflavanon G kháng khuẩn bằng cách làm giảm tính linh động
lớp trong và lớp ngoài của màng [18].
Ikigai và cộng sự đã nghiên cứu tính kháng khuẩn mạnh mẽ của catechin
được tìm thấy trong trà xanh. Catechin thuộc họ flavonoid có tác dụng kháng cả vi
khuẩn Gram (+) hơn Gram (-). Nhóm nghiên cứu đi đến kết luận catechin chủ yếu
hoạt động làm tổn thương màng tế bào vi khuẩn. Giả thiết đưa ra nhằm giải thích
kết luận trên. Đầu tiên, catechin có thể xâm nhập và phá vỡ chức năng hàng rào lớp
đôi photpholipit, sau đó là dung hợp màng, kết quả là sự thất thoát vật liệu di truyền
trong lớp màng vi khuẩn. Và nhóm cũng đã chứng minh sự thất thoát màng xảy ra
bởi catechin được giảm đáng kể khi màng liposom có hiện diện chất béo tích điện
tích âm. Vì thế tính nhạy cảm catechin có thể thấp vi khuẩn Gram âm so với Gram
dương [25].
Hoạt động trên màng tế bào chất bởi quercetin được phát hiện bởi Mirzoeva
chính là một trong cơ chế kháng khuẩn mới được nghi ngờ và góp phần thử nghiệm
các hợp chất flavonoid trên ADN gyrase của Ohenmeng và cộng sự.

Sự ức chế chuyển hóa năng lượng
Haraguchi và các đồng nghiệp gần đây đã tiến hành khảo nghiệm hoạt động
kháng khuẩn của hai retrochalcon (licochalcone A và C) từ rể cây cam thảo. Những
chất flavonoid này được chứng minh là có tác động ức chế đối với S. aureus và
Micococcus luteus nhưng không tác động trên vi khuẩn E. coli. Trong một thử
nghiệm sơ bộ, licochalcon kết hợp các chất tiền phóng xạ ức chế các đại phân tử
(ADN, ARN và protein), qua đó đưa ra giả thuyết các licochalcon có thể can thiệp
vào quá trình chuyển hóa năng lượng tương tự thuốc kháng sinh kháng khuẩn bằng

xviii


Khóa luận cử nhân khoa học

Chuyên ngành sinh hóa

cách ức chế hô hấp vi khuẩn mục tiêu, vì năng lượng cần thiết cho hoạt động hấp
thu của các chất chuyển hóa khác nhau và sinh tổng hợp các đại phân tử [18].
Các licochalcon còn ức chế mạnh mẽ sự hấp thụ oxy trong S. aureus và
Micococcus luteus nhưng không ức chế đối E. coli. Licochalcone còn tác dụng tốt
lên phổ kháng khuẩn các nhóm vi khuẩn trên.
Haraguchi và cộng sự cũng chứng minh rằng licochalcon A và C có hiệu quả
ức chế NADH-cytochrom C reductase, nhưng không tác dụng trên cytochrom C
oxidase hoặc NADH-CoQ reductase. Vì thế nhóm đưa ra đề xuất rằng vị trí ức chế
của retrochalcone là giữa CoQ và cytochrom C trong chuỗi chuyển điện tử hô hấp
của vi khuẩn [18].

1.4. ENZYM ADN GYRASE (TOPOISOMERASE II)
1.4.1. Tổng quan về ADN gyrase
Trong quá trình sao chép, trước tiên chuỗi xoắn ADN phải được tách rời và
giữ dưới dạng mạch đơn. Việc tách mạch do các ennzym có lên là helicase thực
hiện bằng cách phá vỡ liên kết hydro giữa các base nhờ năng lượng giải phóng từ
các nucleoside 5’triphosphat. Mạch tách ra được ổn định bởi protein SSB (Single
Strand Binding). Mặt khác, một vấn đề dặt ra cho nhiễm sắc thể dạng vòng khi sao
chép là làm sao giảm áp lực xoắn ở đầu mỗi chĩa ba sao chép đang tiến tới. ADN
topoisomerase chính là giải pháp [3].
ADN gyrase (topoisomerase II) hay gọi đơn giản là gyrase, được phát hiện
1976 bởi Gellert và cộng sự [27], là enzym mở vòng xoắn ADN, giúp cho sự sao
chép và phiên mã. Nó có khả năng tháo các nút nảy sinh do các biến đổi cấu trúc
của chuỗi xoắn kép bằng cách cắt cả hai mạch của phân tử ADN khi không có mặt
ATP [3]. Tại vị trí đã được đánh dấu bởi protein B, gyrase sẽ tác động, cắt ADN;
làm tháo xoắn ra 2 phía protein B. Với cơ chế là cắt tạm thời hai chuỗi của ADN, có
tác dụng sắp xếp lại siêu soắn, tạo ra siêu xoắn trái của chuỗi xoắn kép và phản ứng

này cần 1 ATP.

xix


Khóa luận cử nhân khoa học

Chuyên ngành sinh hóa

Hình 1.5. Hoạt động của topoisomerase II tại chạc ba sao chép
Gần đây, các nhà khoa học đã nghiên cứu thành công nhóm thuốc dẫn xuất từ
quinolon, các kháng sinh bán tổng hợp, tác dụng do ức chế enzym ADN gyrase,
ngăn sự sao chép nhiễm sắc thể, không cho vi khuẩn sinh sản như ciprofloxacin,
ofloxacin, norfloxacin, perfloxacin [11].
Với tình trạng lạm dụng kháng sinh, sử dụng kháng sinh bừa bãi của người
dùng thuốc và cả thầy thuốc gây ra tình trạng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn.
Chính vì vậy nghiên cứu những kháng khuẩn mới và xác định cơ chế tác động của
chúng là mục tiêu của việc nghiên cứu khoa học liên tục và ứng dụng từ nghiên cứu.
Hợp chất tự nhiên flavonoid đã được nghiên cứu và nhiều ứng dụng rộng rãi
trong hoạt động kháng khuẩn đặc biệt vi khuẩn Gram (+). Ví dụ như galangin,

xx


Khóa luận cử nhân khoa học

Chuyên ngành sinh hóa

pinocembrin, ponciretin, genkwanin, sophoraflavanon G và các dẫn xuất của nó.
[18].

1.4.2. Tổng quan về phương pháp tách chiết và tinh sạch enzym gyrase
Thu nhận chế phẩm enzym thô
Ngoại trừ một số trường hợp enzym quan tâm là enzym ngoại bào từ vi sinh
vật (enzym được tiết vào môi trường trong quá trình nuôi cấy tế bào) và các enzym
ngoại bào từ các dịch của động vật và thực vật, các trường hợp còn lại, bước đầu
tiên trong nghiên cứu enzym là phải thu nhận dịch chiết enzym từ nguyên liệu. Để
thu dịch chiết mô hoặc tế bào chứa enzym, trước hết phải phá vỡ tế bào. Có nhiều
cách để phá vỡ như dùng siêu âm, dùng enzym (lysozym, mutanolizin), máy nén,
sốc nhiệt (làm đông đá-tan đá liên tục), nghiền với cát thủy tinh, hay kết hợp tác
dụng va đập trong môi trường có cát thủy tinh…
Chế phẩm thu được ở các bước ban đầu này thường chứa rất nhiều protein và
các hợp chất không mong muốn, nồng độ enzym quan tâm thấp.
Dịch chiết có thể được cô đặc ở nhiệt độ thấp để làm tăng nồng độ enzym,
hoặc được bổ sung tác nhân gây kết tủa protein/enzym để loại bỏ một số chất không
mong muốn, sau đó hòa tan enzym trong một thể tích nhỏ dung dịch đệm thích hợp.
Để kết tủa enzym từ dịch chiết thô, người ta có thể dùng một số muối trung
tính, thường dùng nhất là ammonium sulfat, do muối này có mức độ hòa tan rất cao
trong nước (có thể đạt tới 720g/l, ở nhiệt độ 25°C), ít làm mất hoạt tính enzym,
thậm chí còn có tác dụng làm bền enzym. Một ưu điểm nữa của muối này là khả
năng kết tủa chọn lọc protein, do đó loại bỏ được nhiều protein không mong muốn
trong dịch chiết. Cần loại bỏ muối khỏi chế phẩm khi chuyển sang bước tinh sạch
tiếp theo [2].
Tách từng phần và tinh sạch enzym
Để tách từng phần và tiến tới tinh sạch hoàn toàn enzym người ta phải dùng
đến nhiều phương pháp khác nhau. Tùy theo nguồn enzym, loại enzym, mục đích
sử dụng enzym mà người ta có thể sử dụng phương pháp này hay phương pháp
khác. Dưới đây là các phương pháp thường dùng nhất để tinh sạch enzym.
Sắc kí trao đổi ion

xxi

Khóa luận cử nhân khoa học

Chuyên ngành sinh hóa

Có hai loại gel trao đổi ion là: trao đổi anion (anionit) và trao đổi cation
(cationit). Gel trao đổi ion được tổng hợp bằng cách gắn một nhóm chức tích điện
dương như DEAE (diethylaminoethyl) hoặc nhóm chức tích điện âm như SP
(sulphopropyl) lên chất nền cellulose, sephadex hay sepharose… tùy thuộc nhóm
chức tích điện gì mà chúng sẽ có ion trao đổi điện tích trái dấu với nhóm chức. Sắc
kí trao đổi ion thường được dùng ở bước tinh sạch ban đầu để sơ bộ phân chia các
protein khác nhau do sự khác nhau về độ tích điện. Tùy theo pH của môi trường sắc
kí mà protein sẽ tích điện dương hay âm, khi được cho lên cột trao đổi ion, chúng sẽ
thay thế ion trao đổi của gel nếu các phân tử mẫu có cùng điện tích với ion trao đổi.
Ái lực liên kết giữa các protein/enzym với gel trao đổi ion phụ thuộc mức độ tích
điện của các phân tử mẫu và chúng được đẩy hay rửa chiết (eluted) ra khỏi gel nhờ
vào sự thay đổi nồng độ muối hay pH của môi trường. Phương pháp sắc kí trao đổi
ion còn được dùng để thu nhỏ thể tích của mẫu nghiên cứu. Điều này rất hữu ích khi
việc kết tủa các protein bằng dung môi hữu cơ hay bằng ammonium sulfat có những
bất tiện [2].
Sắc kí lọc gel hay còn gọi là sắc kí lọc rây phân tử
Nguyên tắc của phương pháp là dựa vào mức độ dịch chuyển khác nhau của
các phân tử có kích thước khác nhau trong hệ thống mạng lưới phân tử của gel sắc
kí. Gel thường dùng là sephadex, sepharose. Các phân tử mẫu khi đi qua một hệ
thống các hạt gel nếu có kích thước nhỏ hơn kích thước của lổ gel thì có thể chui
vào trong các hạt gel và do đó thời gian đi qua cột gel sẽ lâu hơn các phân tử có
kích thước lớn chỉ đi được vào khoảng trống giữa các hạt gel. Nhờ vậy, phương
pháp cho phép phân chia các đại phân tử khác nhau về khối lượng hay kích thước
phân tử. Phương pháp sắc kí lọc gel không áp dụng được với lượng thể tích mẫu

lớn, vì vậy ít được dùng cho bước tinh sạch ban đầu. Tuy vậy, nếu lượng mẫu được
cô đặc lại thành thể tích nhỏ thì vẫn có thể dùng phương pháp lọc gel [2].
Ly tâm siêu tốc
Phương pháp này cho phép phân chia các hợp chất khác nhau về khối lượng
và kích thước phân tử, liên quan đến tỉ trọng của chúng trong dung dịch. Tuy nhiên
nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên nguyên tắc trường lực ly tâm của các
chất theo tỉ trọng. Để phân chia các hợp chất có tỷ trọng khác nhau người ta tạo ra

xxii