Đánh giá đa dạng di truyền của một số mẫu bạch đàn trắng có khả năng kháng bệnh đốm lá khác nhau bằng chỉ thị phân tử RAPD

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN VĂN QUỲNH

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ MẪU
BẠCH ĐÀN TRẮNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH
ĐỐM LÁ KHÁC NHAU BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên – 2013
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN VĂN QUỲNH

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ MẪU
BẠCH ĐÀN TRẮNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH
ĐỐM LÁ KHÁC NHAU BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60 42 0201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. CHU HOÀNG HÀ

Thái Nguyên – 2013
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn này hoàn toàn được thực hiện bằng sự
nghiên cứu của bản thân dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Chu Hoàng Hà,
Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Công nghệ Sinh học. Các hình ảnh,
số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực, đã thu được trong quá trình
nghiên cứu của mình và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình
nghiên cứu nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong
khóa luận đều đã được chỉ rõ nguồn gốc.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

ii
LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn thạc sĩ này, ngoài sự nỗ lực phấn đấu của bản
thân, tôi còn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của các cá
nhân, tập thể và đơn vị khác.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS. Chu Hoàng Hà, Phòng
Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học – người thầy đã tận
tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và hoàn
thành khóa luận này.

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới TS. Lê Văn Sơn, KS. Hồ Mạnh
Tường cùng với tập thể cán bộ phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công
nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi
trong suốt thời gian làm luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn phòng đào tạo và các thầy cô giáo tại Cơ sở
đào tạo sau Đại học khoa học – Đại học Thái Nguyên đã luôn quan tâm, tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi quá trình học tập.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người
luôn bên cạnh động viên, quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập
và thực hiện đề tài này.
Thái Nguyên, ngày tháng năm 2013
Học viên
Nguyễn Văn Quỳnh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN....................................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN........................................................................................................................ii
DANH MỤC CÁC BẢNG....................................................................................................iv
DANH MỤC HÌNH...............................................................................................................v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT...................................................................................vi
MỞ ĐẦU................................................................................................................................1
Rút ngắn thời gian đánh giá dòng, giảm bớt khối lượng công việc lai tạo trên vườn ươm,
kết hợp các phương pháp đánh giá vườn ươm sẽ nhanh chóng xác định, chọn lọc tổ hợp lai
cho năng suất cao..................................................................................................................3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................................4
1.1. Tổng quan về cây bạch đàn.........................................................................................4
1.1.1. Đặc điểm phân loại...............................................................................................4
1.1.2. Đặc điểm hình thái...............................................................................................5
1.1.3. Đặc điểm phân bố.................................................................................................6
1.1.4. Đặc điểm kinh tế...................................................................................................6
1.2. Những nghiên cứu về chọn tạo giống bạch đàn và cây lâm nghiệp............................7
1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới...............................................................................7
1.2.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam..............................................................................10
1.3. Một số đặc điểm và tình hình nghiên cứu bệnh đốm lá ở bạch đàn.........................13
1.3.1. Triệu trứng và đặc điểm hình thái của nấm bệnh..............................................13
1.3.2. Tình hình nghiên cứu bệnh đốm lá ở bạch đàn.................................................14
1.4. Các loại chỉ thị phân tử trong chọn giống.................................................................16
1.4.1. Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)........................16
1.4.2. Chỉ thị AFLP (Amplified fragment length polymorphism)...............................17
1.4.3. Chỉ thị SSR (Single Sequence Repeat hay Microsatelite)..................................20
1.4.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA).................................20
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................24
2.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.........................................................................24
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ...........................................................................................24
2.1.2. Hóa chất và thiết bị.............................................................................................25
2.2 Phương pháp nghiên cứu...........................................................................................27
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số của bạch đàn...............................................................27
2.2.2. Phương pháp đo nồng độ DNA bằng quang phổ kế ..........................................28
2.2.3. Phương pháp PCR với các mồi RAPD .............................................................28
2.2.4 Phương pháp điện di trên gel agarose................................................................29
2.2.5 Phương pháp phân tích số liệu RAPD.................................................................30
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU..........................................................................31
3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số................................................................................31
3.3. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa mẫu bạch đàn nghiên cứu...............38

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.....................................................................47
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................................49
PHỤ LỤC.............................................................................................................................58

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

iv
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Ký hiệu các mẫu bạch đàn sử dụng trong nghiên cứu........................24
Bảng 2.2. Tên và trình tự 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu....................26
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng RAPD – PCR...................................................28
Bảng 3.1. Kết quả đo độ hấp thụ bước sóng 260 nm, 280 nm và nồng độ DNA
tổng số của 20 mẫu Bạch đàn trắng......................................................................33
Bảng 3.2. Sự đa hình của 10 mồi RAPD nhận được sau khi chạy PCR với DNA
tổng số của 20 mẫu bạch đàn trắng......................................................................38

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

v
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh cây bạch đàn trắng mọc trong tự nhiên.......................................4
Hình 1.2. Bào tử nấm Cryptosporiopsis eucalypti được soi trên kính hiển vi........13
Hình 1.3. Hình ảnh lá bạch đàn bị bệnh đốm lá do nấm Cryptosporiopsis
eucalypti gây ra........................................................................................................14
Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số 20 giống bạch đàn trắng...........................32
Hình 3.2. Điện di sản phẩm PCR-RAPD của các giống bạch đàn trắng với mồi

OPG13 (M: Marker 1 kb, giếng 1-20: tương ứng giống BD1-BD20)....................34
Hình 3.3. Điện di sản phẩm PCR-RAPD của các giống bạch đàn trắng với mồi
OPB10 (M: Marker 1 kb, giếng 1-20: tương ứng giống BD1-BD20).....................35
Hình 3.4. Điện di sản phẩm PCR-RAPD của các giống bạch đàn trắng với mồi
OPR08 (M: Marker 1 kb, giếng 1-20: tương ứng giống BD1-BD20).....................35
Hình 3.5. Sản phẩm PCR-RAPD 20 giống bạch đàn trắng với mồi RA31 (M:
Marker 1 kb, giếng 1-20: tương ứng giống BD1-BD20)........................................36
Hình 3.6: Điện di sản phẩm PCR-RAPD của các giống bạch đàn trắng với mồi
RA50 (M: Marker 1 kb, giếng 1-20: tương ứng giống BD1-BD20).......................37
Bảng 3.3. Bảng hệ sống tương đồng di truyền giữa 20 giống bạch đàn trắng.........40
Hình 3.7. Biểu đồ quan hệ di truyền giữa các giống bạch đàn trắng (gồm 4 nhóm
chính và 4 phân nhóm phụ)......................................................................................42

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

vi
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DNA

Deoxyribonucleic acid

RAPD

Random Amplified Polymorphic DNA

SSR

Simple Sequence Repeat

AFLP

Amplified Fragment Length Polymorphism

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

PCR

Polymerase chain reaction

PIC

Polymorphic Information Content

EtBr

Ethidium Bromide

cs

Cộng sự

kb

kilo base

CTAB

Cetyltrimethyl amoniumbromide

EDTA

Ethylene Diamin Tetra Acetate

dNTP

Deoxynucleosid triphosphat

TAE

Tris-acetate-EDTA

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Bạch đàn là một trong số các loài cây rừng được trồng chính ở Việt
Nam, nó được trồng ở hầu hết các tỉnh thành trên cả nước. Trong đó, bạch đàn
trắng Eucalyptus camaldulensis có phân bố tự nhiên rộng nhất trong số các
loài bạch đàn. Theo số liệu kiểm kê rừng Việt Nam tính đến tháng 12 năm
2006 cả nước có 2.333.000 ha rừng trồng các loại trong đó diện tích rừng
trồng các loài bạch đàn chiếm 348.001 ha.
Bạch đàn được trồng để phủ xanh đồi trọc ở các vùng núi và trung du

hoặc để cải tạo đầm lầy, có thể trồng bạch đàn xen kẽ với cây họ Ðậu như keo
lá tràm, keo tai tượng hoặc keo giậu để bù đắp chất đạm cho đất. Gỗ bạch đàn
được sử dụng để đóng đồ gia dụng, trong công nghiệp được dùng làm nguyên
liệu giấy. Ngoài ra, bạch đàn trắng Eualyptus camaldulensis rất giàu cineol (lá
có tinh dầu: 1,3 - 2,25%). Lá bạch đàn trắng hoặc bạch đàn liễu để thay thế lá
bạch đàn xanh (E. globulus) là loại đã được sử dụng rất lâu đời ở các nước châu
Âu. Dạng dùng: thuốc hãm, thuốc xông, hoặc pha chế thành các dạng bào chế
như xiro cồn lá bạch đàn, dùng để chữa ho, sát khuẩn đường hô hấp, chữa các
bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp, ho, hen, v.v... Tinh dầu bạch đàn được dùng
trong kỹ nghệ hương liệu để sản xuất nước hoa và các loại chất thơm khác có
mùi thơm tự nhiên của hoa, có thể thay thế tinh dầu sả Java (Cymbopogon
winterianus Jowitt). Do vậy, việc trồng bạch đàn trắng không những giúp phủ
xanh đồi trọc đất trống mà còn mang lại hiệu quả kinh tế rất lớn.
Tuy nhiên, từ cuối những năm 1980, đầu những năm 1990 đến nay đã
có nhiều dịch bệnh do một số loại nấm bệnh (như nấm Cryptosporiopsis
eucalypti, Cylindrocladium quinqueseptatum – một trong những loài nấm
nguy hiểm nhất đối với bạch đàn ở Việt Nam) gây ra đối với cây bạch đàn ở
các tỉnh thuộc vùng Đông nam bộ (Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước), các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

2
tỉnh miền trung (Quảng Nam, Đà Nẵng và Thừa Thiên Huế) hay các tỉnh
miền bắc (Phú Thọ, Tuyên Quang) do vậy diện tích rừng trồng bạch đàn đã bị
suy giảm. Đã có một số công trình nghiên cứu khảo nghiệm để chọn ra các
giống/dòng bạch đàn kháng bệnh và đến nay đã đạt được một số kết quả nhất
định như đã xác định được các dòng bạch đàn SM16, SM23, SM7, EF24,
EF39, EF55 vừa có sinh trưởng nhanh vừa có tính kháng bệnh và đã được
công nhận giốn tiến bộ kĩ thuật hoặc giống quốc gia. Tuy nhiên, việc khảo

nghiệm ngoài hiện trường có thời gian dài (từ 5-10 năm) do vậy sẽ tốn kém về
thời gian và kinh phí. Ngược lại, chọn giống kháng bệnh bằng chỉ thị phân tử
sẽ tiết kiệm được thời gian và kinh phí rất nhiều.
Trong lĩnh vực lâm nghiệp việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên
cứu còn rất hạn chế, cho đến nay chưa có một công trình nghiên cứu nào sử
dụng phương pháp chỉ thị phân tử để chọn giống bạch đàn hay bất kỳ một loài
cây rừng nào kháng bệnh ở Việt Nam. Trên thế giới đã có rất nhiều công trình
ứng dụng chỉ thị phân tử như RAPD, AFLP, SSR... để chọn giống cây trồng
kháng bệnh ở cả cây nông nghiệp và lâm nghiệp. Trong đó kỹ thuật RAPD là
một công cụ hữu hiệu bước đầu để chọn các giống cây trồng mang những tính
trạng mong muốn, Vì vậy chỉ thị phân tử RAPD thích hợp cho chọn tạo giống
bạch đàn trắng kháng bệnh đốm lá.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá đa
dạng di truyền của một số mẫu bạch đàn trắng có khả năng kháng bệnh
đốm lá khác nhau bằng chỉ thị phân tử RAPD”.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

3
2. Mục tiêu nghiên cứu
+ Xác định đa dạng và mối quan hệ di truyền của các giống bạch đàn
nghiên cứu.
3. Nội dung nghiên cứu
+ Tách chiết DNA tổng số của 20 mẫu bạch đàn khác nhau.
+ Sử dụng kỹ thuật RAPD phân tích các mẫu DNA tổng số thu được
với 10 mồi RAPD.
+ Xây dựng biểu đồ biểu diễn mối tương quan di truyền của các xuất
xứ bạch đàn bằng phần mềm NTSYSpc 2.1.

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa khoa học
Đề tài nghiên cứu được thực hiện chi tiết, các vấn đề liên quan đến việc phân
tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD với mong muốn cung cấp thêm số
liệu thông tin và khả năng ứng dụng chỉ thị trong công tác chọn tạo giống lai
trong điều kiện cụ thể ở Việt Nam.
Ý nghĩa thực tiễn
Rút ngắn thời gian đánh giá dòng, giảm bớt khối lượng công việc lai tạo
trên vườn ươm, kết hợp các phương pháp đánh giá vườn ươm sẽ nhanh chóng
xác định, chọn lọc tổ hợp lai cho năng suất cao.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

4

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cây bạch đàn
1.1.1. Đặc điểm phân loại
Ngày nay bạch đàn là một trong những loài cây gỗ lâm nghiệp rất quan
trọng, được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia trên thế giới đặc biệt là ở các
vùng nhiệt đới và ôn đới, giữa các vĩ độ 45 0N và 400B như: Braxin, Trung
Quốc, Ấn Độ, … với diện tích canh tác khoảng 12 triệu hecta.[24].

Hình 1.1. Hình ảnh cây bạch đàn trắng mọc trong tự nhiên
Cây bạch đàn không phải là loại cây mọc tự nhiên ở Việt Nam. Loài
này xuất xứ từ nước Úc được dẫn giống bằng hạt đem về trồng ở đất nước ta
vào khoảng thập niên 1950 và cho thấy một số loài rất thích hợp với thổ
nhưỡng và khí hậu của Việt Nam, nhất là có thể trồng tập trung thành rừng

thuần hay trồng phân tán trong đất thổ cư của nhân dân từ vùng đồng bằng
cho đến các vùng bình nguyên và cao nguyên .
Ở miền Nam, cây Bạch đàn mới du nhập được gọi là cây Khuynh diệp
vì có lá cong cong hình lưỡi liềm. Sau đó ngành lâm nghiệp chế độ cũ đặt tên
là cây Bạc hà vì lá có mùi dầu Bạc hà.
Năm 1975, cây Khuynh diệp hay còn gọi là cây Bạc hà được Bộ Lâm
Nghiệp đặt tên là cây Bạch đàn, có tên khoa học là Eucalyptus spp thuộc họ
thực vật Sim (Myrtaceae). Tại Úc, bạch đàn chi eucalyptus (tức chi Bạch đàn)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

5
gồm ít nhất hơn 70 loài (species) mọc từ các vùng đồng bằng có độ cao ngang
mực nước biển cho đến các vùng bình nguyên cao nguyên, từ các thung lũng
đến đèo núi cao.
Ở Việt Nam bạch đàn đã được trồng từ những năm 1930 ở cả hai miền
Nam, Bắc. Hiện nay có 10 loài bạch đàn đang được trồng phổ biến là:
+ Bạch đàn urô Eucalyptus urophylla, thích hợp với vùng đất đồi trung du.
+ Bạch đàn trắng Eucalyptus camaldulensis, thích hợp với vùng đồng bằng.
+ Bạch đàn trắng Eucalyptus alba, thích hợp với vùng gần biển.
+ Bạch đàn lá nhỏ Eucalyptus tereticornis, thích hợp với vùng đồi Thừa
Thiên Huế.
+ Bạch đàn liễu Eucalyptus exserta, thích hợp với vùng cao miền Bắc Việt
Nam.
+ Bạch đàn chanh Eucalyptus citriodora, thấp, lá có chứa tinh dầu mùi sả.
+ Bạch đàn lá bầu Eucalyptus globules, thích hợp với vùng cao nguyên.
+ Bạch đàn to Eucalyptus grandis, thích hợp với vùng đất phù sa.
+ Bạch đàn ướt Eucalyptus saligna, thích hợp với vùng cao nguyên Đà Lạt.
+ Bạch đàn Mai đen Eucalyptus maidenii, thích hợp với vùng cao Lâm

Đồng.
1.1.2. Đặc điểm hình thái
Cây bạch đàn thuộc loại đại mộc, cao 25 – 50m, có cây cao tới 100m.
Đường kính thường đạt 120-180 cm. Vỏ ngoài màu xám trắng hoặc nâu, đỏ
nâu, xám xanh…, bong mảng hoặc nứt dọc, vỏ thân chứa tinh dầu
Eucalyptone thơm mùi dầu tràm. Lá đơn, khi cây còn non lá thường mọc đối,
sau đó có dạng lá đơn mọc cách, không có lá kèm; mép lá nguyên, phiến lá
dày, gân phụ thường nối với nhau ở đầu gân thành một đường song song với
mép lá. Hoa lưỡng tính, nụ hình thoi. Khi hoa nở nửa trên hình chóp nón rụng
đi, để lộ nhị và nhụy. Nhị nhỏ, rời nhau, rất nhiều, màu trắng vàng. Nhuỵ có
bầu trung, một phần gắn liền với ống đài, một phần nhô lên. Quả khô, khi
chín nứt ở đỉnh. Hạt nhiều, thường có góc cạnh, rất nhỏ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

6
Cây bạch đàn là loài dễ trồng, ít kén đất tăng trưởng nhanh nhưng hấp
thụ nhiều nước và dưỡng chất trong đất. Loài bạch đàn nói chung rất mau lớn,
tán lá hẹp thưa, trồng trong vòng 5, 6 năm thì có chiều cao trên 7m và đường
kính thân cây khoảng 9-10 cm.
1.1.3. Đặc điểm phân bố
Chi Bạch đàn Eucalyptus thuộc họ Sim Myrtaceae có hơn 700 loài,
hiện đã được trồng ở hơn 30 nước trên thế giới từ vĩ độ 58 0 Bắc đến 460 Nam.
Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis Dehnh) có phân bố tự nhiên rộng
nhất trong số các loài bạch đàn, và có mặt ở hầu hết khắp đất nước Úc, trừ
phần phía Tây Nam của Úc. Loài này được xem là cây bản địa của Úc [49]
phân bố từ vĩ độ 12.5- 380 Nam và ở độ cao 20- 700 mét so với mực nước
biển. Loài này có mặt trong nhiều điều kiện khí hậu khác nhau: từ ấm tới
nóng, từ nửa ấm tới nửa khô hạn. Nhiệt độ trung bình tháng nóng nhất trong

phạm vi 27-400C và nhiệt độ trung bình tháng lạnh nhất nằm trong phạm vi 3150C. Lượng mưa bình quân vào khoảng 250-600 mm, nhưng cũng có nơi
lượng mưa cao tới 1250 mm và thấp đến 150 mm [17]. Đấy là loài bạch đàn
điển hình mọc ven sông suối song vẫn gặp chúng trên vùng khô.
1.1.4. Đặc điểm kinh tế
Bạch đàn trắng có khả năng cung cấp gỗ với năng suất cao trên các
dạng lập địa nghèo và khô, có khả năng chịu hạn và nắng nóng, sinh trưởng
mạnh khi đủ nước, chịu được ngập úng theo mùa và chịu mặn, khả năng tạo
chồi mạnh và gỗ có nhiều công dụng. Bạch đàn có công dụng làm cột điện,
cột chống lò, ở Úc người ta sử dụng gỗ của loài này làm đồ gia dụng như gỗ
ván sàn, ốp tường, lát cầu thang, đóng tủ... ngoài ra gỗ được dùng làm củi và
than củi. Là loài cây có tốc độ phát triển và sinh trưởng nhanh, kích thước
lớn, thông thường chiều cao từ 20-30 m, đường kính từ 20-30 cm, nhiều nơi
chiều cao của cây bạch đàn E.camaldulensis có thể tới 40-50 m, cá biệt như ở
Tasmania, nước Úc, có cây có chiều cao tới trên 100 m, đường kính trên 3 m
[62] do vậy loài Bạch đàn trắng được gây trồng với qui mô lớn và nhỏ từ khắp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

7
các châu lục, từ Bắc Mỹ đến vùng Đông Á, từ vùng Địa Trung Hải của Nam
Mỹ và Châu Phi…
1.2. Những nghiên cứu về chọn tạo giống bạch đàn và cây lâm nghiệp
1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Chọn giống bạch đàn kháng bệnh: trên thế giới các nhà khoa học đã
tiến hành khảo nghiệm loài/dòng/gia đình/xuất xứ bạch đàn để chọn giống
kháng bệnh. Tại Úc các nhà khoa học đã khảo nghiệm các loài bạch đàn tại
bang Queensland và đã tìm ra loài Eucalyptus pellita có khả năng kháng bệnh
cháy lá bạch đàn do nấm Cylindrocladium reteaudii gây ra [18]. Tại Ấn Độ,
các nhà khoa học của Viện nghiên cứu Lâm nghiệp Kerala đã tiến hành khảo

nghiệm các loài bạch đàn ở Kerala và đã tìm ra loài E. brassiana cũng có khả
năng kháng bệnh cháy lá do nấm Cylindrocladium reteaudii gây ra [54]. Tại
Braxin, bệnh loét thân bạch đàn loài nấm Cryphonectria gây bệnh nghiêm
trọng cho nhiều loài bạch đàn trồng ở nước này, do đó các nhà khoa đã tiến
hành khảo nghiệm các dòng bạch đàn để tìm ra dòng có khả năng kháng bệnh
này, kết quả cho thấy dòng bạch đàn lai giữa E.grandis x E.urophylla có khả
năng kháng rất cao. Các nhà chọn giống cũng tiến hành khảo nghiệm các
dòng lại giữa các loài bạch đàn để tìm ra dòng kháng bệnh loét thân do nấm
Coniothyrium zuluense gây ra, kết quả chỉ ra các dòng lai giữa E.grandis x
E.camaldulensis và E.grandis x E.urophylla có khả năng kháng bệnh rất cao.
Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng kháng bệnh trên
thế giới: đã có rất nhiều công trình nghiên cứu chọn giống kháng bệnh bằng
chỉ thị phân tử trên thế giới trên cả cây nông nghiệp và lâm nghiệp.
+ Các nghiên cứu tại Mỹ:
Từ năm 1991 nhóm nghiên cứu của Rick Kesseli đã phát triển phương
pháp phân tích sự phân ly tính trạng theo nhóm BSA (Bulked Segregant
Analysis, phân tích phân ly dạng mẫu lớn) để xác định nhanh các chỉ thị phân
tử có liên kết với các gen hay các vùng đặc hiệu trên bộ gen. Phương pháp
này dựa trên việc so sánh sự đa hình của các mẫu DNA của các cá thể đã
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

8
được phân nhóm từ một quần thể phân ly bằng việc sử dụng các kĩ thuật
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) và RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism).. Sau khi phân tích kết quả các nhà khoa
học đã xây dựng thành công bản đồ liên kết và xác định được ba chỉ thị phân
tử có liên quan đến tính kháng bệnh mốc sương (downy mildew) ở cây rau
diếp (Lactuca sativa L.) [34]. Từ các nghiên cứu trước, các nhà khoa học tại

trường Washington State (Hoa Kỳ) đã chứng minh được tính kháng với các
triệu chứng đốm và rỉ sắt ở lá cây Bạch dương (Populus trichocarpa Torr.)
được quy định bởi một gen trội. Bằng kết hợp các kĩ thuật RAPD và RFLP
với kĩ thuật STS (Sequence-Taggeds-Site), Newcombe và cs (1996) [44] cũng
đã tìm được gen Mmd1 kháng bệnh đốm lá ở cây Bạch dương (Populus
trichocarpa Torr.) gây ra bởi Melampsora medusae f. sp. Deltoidae. Từ các
nghiên cứu này một bản đồ liên kết đã được thiết lập bao gồm số lượng tương
đối lớn các chỉ thị RAPD và RFLP, và STS 343 cho thế hệ cây lai F2. Bên
cạnh những ứng dụng rất hữu hiệu trong việc xác định các chỉ thị phân tử liên
quan đến tính chịu bệnh ở cây, kĩ thuật RAPD và RFLP còn được ứng dụng
mạnh trong các nghiên cứu xây dựng bản đồ di truyền liên kết, ví dụ trên cây
bạch đàn [34]. Nhằm tìm hiểu rõ hơn bản chất phân tử của tính kháng bệnh
Harkins và cs (1998) cố gắng lập bản đồ liên kết di truyền và phân lập các gen
liên quan đến tính kháng bệnh phồng rộp (blister rust – Cronartium ribicola
Fisch) ở cây thông đường (Pinus lambertiana). Đây là những nguyên liệu rất
tốt cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm xây dựng bản đồ di truyền có độ phân
giải cao tiến tới việc phân lập gen kháng bệnh. Tương tự với những thí
nghiệm của Harkins và cs (1998)[35], một nhóm nghiên cứu tại trường Đại
học Iowa State cũng phân lập được gen Lrd1 quy định tính trạng chống chịu
bệnh đốm lá gây ra bởi Melampsora medusae f. sp. deltoidae ở một loài bạch
dương khác là Populus deltoid.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

9
+ Các nghiên cứu tại Bỉ:
Ở châu Âu, những chương trình nhân giống cây Bạch dương trước đây
cũng đã thành công trong việc tạo ra những dòng cây kháng hoàn toàn với

Melampsora larici-populina - loài nấm gây bệnh gỉ sắt, đốm lá. Tuy nhiên do
sự tiến hoá rất nhanh của Melampsora larici-populina nên nhiều loài nấm đã
có thể gây bệnh trở lại ở cây Bạch dương. Chính vì vậy việc tìm ra và phân
lập các đoạn gen quy định tính kháng trở nên cần thiết để tạo ra các dòng cây
kháng nấm Melampsora larici-populina. Các nhà khoa học tại Bỉ đã phát hiện
ra rằng các nhóm gen kháng bệnh có thể phân thành 5 lớp chính, dựa trên cấu
trúc bậc 1 của protein tương ứng. Hầu hết các protein này được phân vào
nhóm gắn nucleotide/giàu leucine (NBS/LRR) và chúng tham gia vào một
chu trình truyền tín hiệu dẫn tới tính kháng ở cây. Kỹ thuật chủ yếu được sử
dụng cho công việc này là kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length
Polymorphism). Trong các thí nghiệm này, trên 556 tổ hợp mồi AFLP đã
được dùng với hy vọng phát hiện được khoảng 5000 chỉ thị chứa locus kháng
Melampsora. Dựa trên bản đồ di truyền xây dựng được các tác giả này thông
báo rằng đã phân lập được 11 chỉ thị AFLP từ quần thể bao gồm 512 cá thể
lai. Khi phân lập và đọc trình tự các chỉ thị này cho thấy chúng có độ tương
đồng rất cao với các gen mã hoá cho các protein thuộc nhóm NBS/LRR.
+ Các nghiên cứu tại Brazil:
Tại Brazil, Junghans và cs (2003) [37] đã nghiên cứu sử dụng chỉ thị
phân tử để nhận biết loài bạch đàn Eucalyptus grandis kháng bệnh rỉ sắt
(Puccinia psidii Winter). Bệnh rỉ sắt là một trong những bệnh bạch đàn nguy
hiểm nhất ở Brazil và cũng được xem như là loại bệnh nguy hiểm tiềm năng
trên toàn thế giới. Trong công trình nghiên cứu này, nhóm tác giả đã sử dụng
một tổ hợp gồm 10 gia đình cây bạch đàn được lai chéo nhau giữa cây bạch
đàn kháng bệnh và cây bạch đàn mẫn cảm với bệnh rỉ sắt để nghiên cứu. Các
cây bạch đàn lai ở thế hệ F1 được nhiễm bệnh rỉ sắt nhân tạo để xác định tỷ lệ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

10

phân ly theo tính trạng kiểu hình trong gia đình, kết quả quan sát khẳng định có
gen điều khiển sự kháng bệnh rỉ sắt và nhóm tác giả đã tìm ra được một gia đình
(G38xG21) có tính trạng phân ly theo kiểu hình tuân theo quy luật của Melden
(tỷ lệ 1:1). Để xác định các chỉ thị phân tử liên quan đến đoạn gen (locus) kháng
bệnh, nhóm tác giả đã sử dụng 1000 cây con bạch đàn E. grandis của gia đình
phân ly chuẩn (G38xG21) và 980 mồi để phân tích nghiên cứu. Phương pháp
phân tích đa hình RAPD và phân tích bằng phương pháp BSA được sử dụng.
Một bản đồ liên kết (giữa các chỉ thị RAPD và gen kháng bệnh rỉ sắt) được xây
dựng xung quanh đoạn gen Ppr1 (gen kháng bệnh Puccina psidii), nhóm này
bao gồm 6 chỉ thị RAPD với 1 cửa sổ gen dài 5 cM. Chỉ thị RAPD AT9/917
cùng phân ly với gen Ppr1 mà không có sự tái tổ hợp nào trong tổng số 994
phân bào. Từ đây các tác giả đã xây dựng lên chỉ thị STS dùng để nhận biết gen
kháng bệnh rỉ sắt đối với bạch đàn Eucalyptus grandis.
1.2.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam
Công việc chọn giống bạch đàn theo tiêu chí kháng bệnh ở Việt Nam
được bắt đầu từ những năm 1990, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt nam kết
hợp với CSIRO của Úc thực hiện dự án “Minimising Disease Impacts on
Eucalypts in South East Aisa’’ giai đoạn 1996 - 2000. Kết quả của dự án đã
xác định được các loài sinh vật gây hại chính đối với bạch đàn ở Việt Nam và
các nước thành viên tham gia dự án ( Úc, Thái Lan và Việt Nam), kết quả này
cũng chỉ ra rằng nấm bệnh Cryptosporiopsis eucalypti cùng với nấm bệnh
Cylindrocladium quinquesetptatum là những nấm bệnh nguy hiểm nhất đối
với bạch đàn ở Việt Nam và đã xây dựng được phương pháp nhiễm bệnh nhân
tạo cho cây con bạch đàn ở trong nhà kính với hai loài nấm bệnh là C.
eucalypti và C. quinquesetptatum để đánh giá các dòng mẫn cảm và kháng
bệnh bằng kiểu hình, trong lĩnh vực cải thiện giống, đã thiết lập được khu
khảo nghiệm bạch đàn ở Chơn Thành (Bình Phước - năm 1996) với diện tích
3.5 ha của 150 gia đình cây bạch đàn và khu khảo nghiệm 50 dòng bạch đàn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

11
vô tính tại Sông Mây (Đồng Nai – năm 1998) nhằm đánh giá sinh trưởng và
khả năng kháng bệnh của chúng. Kết quả này cho thấy các xuất xứ bạch đàn
của Kennedy Creek, Laura River và Kennedy River là những xuất xứ có sinh
trưởng và tính kháng bệnh tốt nhất [6].
Viện Khoa học Lâm ngiệp Việt Nam thực hiện các đề tài nghiên cứu
tiếp theo về chọn giống kháng bệnh các loài bạch đàn và keo, bao gồm các đề
tài “Nghiên cứu chọn giống kháng bệnh có năng suất cao cho một số loài
bạch đàn và keo” giai đoạn 2001-2005 và đề tài “Nghiên cứu chọn các dòng
keo và bạch đàn chống chịu bệnh có năng suất cao cho trồng rừng kinh tế”
giai đoạn 2006-2010. Kết quả đã xây dựng được 17 khu khảo nghiệm bạch
đàn các loại tại nhiều vùng trên cả nước (Đồng Nai, Bình Dương, Bình
Phước, Huế, Vĩnh Phúc), từ đây đã chọn ra được các loài Bạch đàn trắng
SM16, SM23, SM7, EF24, EF39, EF55 (Nguyễn Hoàng Nghĩa và cs tuyển
chọn và khảo nghiệm) có tốc độ sinh trưởng nhanh, có tính chống chịu bệnh,
các dòng này đã được công nhận giống tiến bộ kỹ thuật, kết quả đã xác định
được các loại sinh vật gây bệnh cho bạch đàn trên các vùng sinh thái khảo
nghiệm và đã xác định được các nấm bệnh nguy hiểm đối với bạch đàn ở cả
giai đoạn vườn ươm và rừng trồng trên các vùng trồng, trong đó đáng chú ý
nhất là các loại nấm bệnh Cryptosporiopsis eucalypti, Cylindrocladium
quinquesetptatum và Phaeopheospora destructans.
* Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống kháng bệnh ở Việt Nam:
Trong lĩnh vực lâm nghiệp việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên
cứu còn rất hạn chế. Cho đến nay chưa có một công trình nghiên cứu nào sử
dụng phương pháp chỉ thị phân tử để chọn giống bạch đàn hay bất kỳ một loài
cây rừng nào kháng bệnh ở Việt Nam. Hiện nay mới chỉ có một số ứng dụng
về chỉ thị phân tử/phương pháp phân tử trong lĩnh vực lâm nghiệp ở Việt
Nam. Một số các công trình nghiên cứu về cây lâm nghiệp đã sử dụng chỉ thị

phân tử (RAPD và DNA lục lạp) để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

12
cây trội để lựa chọn các cặp bố mẹ nhằm xây dựng vườn giống Keo tai tượng
Acacia mangium [7]. Kết quả nghiên cứu cho thấy các dòng Keo tai tượng có
mức độ đa dạng di truyền rất thấp. Một nghiên cứu khác của Nguyễn Hoàng
Nghĩa và cs (2006) sử dụng chỉ thị phân tử để phân tích đa dạng di truyền của
các loài Sao lá hình tim thuộc họ Dầu để đề xuất các biện pháp bảo tồn thích
hợp. Kết quả nghiên cứu cho thấy không có sự đa hình các gen lục lạp đã
nghiên cứu do các quần thể nghiên cứu rất gần nhau về địa lý. Ngoài ra
Nguyễn Hoàng Nghĩa và cs (2005) [5], đã sử dụng chỉ thị RAPD và DNA lục
lạp để đánh giá đa dạng di truyền của ba xuất xứ Lim xanh. Kết quả nghiên
cứu ở đây chỉ ra sự khác biệt rất rõ rệt đối với 3 xuất xứ Lim xanh, các xuất
xứ từ Cầu Hai, Nghệ An và Quảng Ninh. Trong các nghiên cứu khác trong
lĩnh vực lâm nghiệp, có các nghiên cứu về sử dụng chỉ thị phân tử trong đánh
giá mức độ thụ phấn chéo của các quần thể chọn giống của Keo tai tượng,
Thông nhựa, Bạch đàn urô [10], đánh giá chất lượng hạt giống tại các vườn
giống, xác lập mối tương quan với sinh trưởng của cây con của Keo tai tượng.
Trong lĩnh vực nông nghiệp, đã có rất nhiều các công trình nghiên cứu
sử dụng chỉ thị phân tử để chọn giống cây trồng, đặc biệt là với đối tượng cây
lúa. Năm 2005 nhóm nghiên cứu của Nguyễn Vĩnh Phúc và Nguyễn Thị Lang
[8] đã ứng dụng thành công hai kĩ thuật chỉ thị phân tử SSR và STS trong việc
chọn tạo các giống lúa kháng bệnh đạo ôn gây ra bởi nấm Pyricularia grysea.
Phương pháp này cho thấy khả năng dự đoán kiểu gene kháng bệnh và kiểu
hình kháng bệnh rất cao, do đó có thể áp dụng để chọn lọc những giống kháng
bệnh đạo ôn bằng các kĩ thuật SSR và STS.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

13
1.3. Một số đặc điểm và tình hình nghiên cứu bệnh đốm lá ở bạch đàn
1.3.1. Triệu trứng và đặc điểm hình thái của nấm bệnh
Đặc điểm của nấm bệnh:

Hình 1.2. Bào tử nấm Cryptosporiopsis eucalypti được soi trên kính hiển
vi
Quả thể hình chén màu nâu đen nằm trên các tổ chức bị bệnh. Quả thể
của nấm chủ yếu nằm sâu trong phần mô của lá, nhưng có trường hợp thể quả
nổi ngay trên bề mặt của lá, rất dễ dàng quan sát được bằng kính lúp cầm tay
ngay tại hiện trường. Trên những lá và chồi ướt, từ những thể quả hình thành
đám bào tử vô tính màu kem. Quan sát bào tử vô tính trên kính hiển vi quang
học có vật kính phản pha, bào tử vô tính hình trứng không màu màu hoặc màu
vàng nhạt. Khi quan sát bào tử vô tính trên các vật kính lớn hơn, bào tử vô
tính hình trứng có một đầu tròn và một đầu hơi bằng. Đây là một đặc điểm
quan trọng có tính chất đặc trưng của chi nấm Cryptosporiopsis. Bào tử vô
tính có kích thước chiều dài từ 11 đến 26 µm, chiều rộng từ 4,5 đến 10 µm.
Nấm Cryptosporiopsis eucalypti gây ra các triệu chứng khác nhau như:
Đốm lá, khô cành nhỏ và ngọn cây. Loài nấm này thường gây hại cho các loài
Bạch đàn ở các nước Đông Nam á, đặc biệt là Bạch đàn trắng Eucalyptus
camaldulensis và Bạch đàn uro E. urophylla. Những đốm bệnh rải rác trên lá
và có hình dạng bất định, thường là màu nâu tối. Trong một số trường hợp,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

14
đặc biệt ở những lá già, vùng bị bệnh lớn có màu hơi đỏ, các mô bị nứt làm
cho mặt lá gồ ghề. Đỉnh ngọn bị nhiễm bệnh và biến dạng và chết sau đó sẽ
hình thành nhiều đỉnh sinh trưởng từ đó mọc các lá có kích thước nhỏ hơn lá
bình thường rất nhiều vào cuối mùa mưa. Những đỉnh sinh trưởng này cũng
sẽ bị bệnh và làm tán lá bẹt lại, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng về chiều cao
của cây. Khi bị bệnh nặng, rừng bạch đàn bị rụng lá, chỉ còn một số ít tập
trung trên phía ngọn, số lá còn lại bị sần sùi và biến dạng.

Hình 1.3. Hình ảnh lá bạch đàn bị bệnh đốm lá do nấm Cryptosporiopsis
eucalypti gây ra
1.3.2. Tình hình nghiên cứu bệnh đốm lá ở bạch đàn
1.3.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Quy mô trồng rừng bạch đàn trên thế giới ngày càng tăng, song song
với việc phát triển về diện tích, các rừng trồng bạch đàn trên thế giới ngày
càng đối mặt với dịch bệnh hại gây ra bởi nấm bệnh, côn trùng, vi khuẩn,
virus, phyto-plasma và tuyến trùng [50]. Bệnh hại lá bạch đàn gây ra bởi
nhiều loại nấm bệnh, chúng là một vấn đề rất lớn đối với các rừng trồng bạch
đàn, và đã có rất nhiều ví dụ về các dịch bệnh gây chết hàng loạt rừng trồng
bạch đàn ở Úc, New Zealand, Nam Phi, Braxin và Ấn Độ [46]. Ví dụ ở Úc,
bệnh đốm lá bạch đàn gây ra bởi nấm bệnh Aulographina eucalypti đã gây ra
đại dịch bệnh ở rừng trồng bạch đàn Eucalyptus nitens ở Errinundra Plateau,
bang Victoria năm 1974 đã dẫn đến sự dụng lá hoàn toàn ở rừng trồng và gây
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

15
chết trên một diện tích rất lớn [43]. Sau đó dịch bệnh này cũng được ghi nhận
ở các rừng trồng bạch đàn ở Taggerty, Toolangi và Noojee bang Victoria

[55]. Dịch bệnh bạch đàn thường gây ra ở các rừng trồng bạch đàn đơn dòng
hơn là các rừng trồng bạch đàn hỗn giao. Nấm Mycosphaerella nubilosa cũng
đã từng gây ra 90% số lá rụng của một số xuất xứ bạch đàn E. globulus và các
rừng trồng bạch đàn kinh tế E. globulus và E. nitens ở bang Tasmania [62]. Ở
New Zealand, một loài nấm thuộc chi Mycospharella đã xuất hiện [46] và gây
dịch bệnh ở rừng trồng bạch đàn kinh tế E. delegatensis trên diện tích 1000
ha. Ở Nam Phi loài nấm Mycosphaerella juvenis cũng gây dịch bệnh trên
rừng trồng E. globulus và một số xuất xứ của E. nitens [26]. Ngoài ra nấm
Cylindrocladium gây ra dịch bệch cháy lá, tàn rụi đối với các rừng trồng bạch
đàn non ở Braxin [27] ở Ấn Độ [54], ở Nam Phi [31] và ở Việt Nam [8]. Loài
nấm gây bệnh rỉ sắt Puccinia psidii cũng gây dịch bệnh ở các rừng trồng bạch
đàn ở Braxin [27].
Nấm Cryptosporiopsis eucalypti Sankaran & B.sutton gây ra bệnh đốm
lá, khô ngọn và loét thân trên một số loài bạch đàn ở rất nhiều nước, chủ yếu
các vùng nhiệt đới ẩm [54]. Loài nấm này gây ra bệnh đốm lá bạch đàn ở
Indonesia, Braxin [27] Thái Lan, Việt Nam, Lào, Nhật Bản, Trung Quốc, Sri
Lanka, Hawaii [54] và New Zealand [44]. Ngoài ra còn gây bệnh đốm lá ở
bạch đàn ở Úc, Ấn Độ và Mỹ [54]. Loài nấm này có thể tồn tại trong thân cây
bạch đàn dưới dạng loét thân trong những tháng khô hạn, song ở độ ẩm cao
(trong và sau mùa mưa) và nhiệt độ thích hợp (20-250C) nó sẽ bùng phát trở
lại, gây bệnh cho lá (đốm lá) và ngọn bạch đàn [8].
1.3.2.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam
Từ cuối những năm 1980, đầu những năm 1990 đến nay dịch bệnh (do
các

loài

nấm

Cryptosporiopsis

eucalypti,

Cylindrocladium

quinqueseptatum ... gây ra) thường xuyên xảy ra đối với các rừng trồng bạch
đàn ở Việt Nam, đặc biệt là ở các vùng Đông Nam Bộ (các tỉnh Đồng Nai,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

16
Bình Dương, Bình Phước) và miền Trung (các tỉnh Quảng Nam, Đà Nẵng và
Thừa Thiên Huế). Theo kết quả điều tra đánh giá của các tác giả Nguyễn
Hoàng Nghĩa (2000, 2003) diện tích rừng trồng bạch đàn ở Việt Nam bị bệnh
lên tới 50% tổng diện tích với các mức độ khác nhau. Các tác giả đều cảnh
báo nguy cơ gây hại lớn của các loại dịch bệnh này đối với rừng trồng tập
trung, đặc biệt là rừng trồng Bạch đàn trắng Eucalyptus camaldulensis có xuất
xứ Petford.
Nấm Cryptosporiopsis eucalyti gây bệnh đốm lá ở Việt Nam: cùng với
nấm bệnh Cylindrocladium quinquesetptatum, nấm Cryptosporiopsis
eucalypti được đánh giá là một trong những loài nấm bệnh gây hại nguy hiểm
nhất đối với rừng trồng bạch đàn ở Việt Nam. Khi gây bệnh trên cây bạch
đàn, nó gây ra triệu chứng điển hình trên lá cây là đốm lá, đôi khi các lá bị
bệnh hình thành các u nhỏ, trên bề mặt lá sần sùi, làm cho lá bị rụng, khi tấn
công lên cành hoặc ngọn bạch đàn nó làm cho cành ngọn bị khô héo, sau đó
mọc lên các chồi và lá non với kích thước rất nhỏ vào cuối mùa mưa, đôi khi
còn làm cho ngọn và cành ngọn bị chết.
1.4. Các loại chỉ thị phân tử trong chọn giống
1.4.1. Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)

Kĩ thuật RFLP là kĩ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các
phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt các enzim giới hạn (Restriction enzym,
RE). Khi ủ DNAvới enzyme giới hạn ở dung dịch đệm thích hợp ở PH, nhiệt
độ thích hợp sẽ sẽ tạo ra những phân đoạn DNA với kích thước khác nhau, từ
đó lập nên các bản đồ gen. Kỹ thuật này được sử dụng phổ biến từ thập niên
80 đến nay.
Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt
giới hạn (restriction enzyme -RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA
bộ gen. Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt
khác nhau.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

17

Ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật RFLP
- RFLP có ưu điểm là marker đồng trội cho phép phân biệt được cá thể
đồng hợp và dị hợp. Do kích thước DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số
lượng dấu phân tử (marker) tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu.
- Tuy nhiên do qui trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đối với sức khoẻ người nghiên cứu (sử dụng phóng xạ
đánh dấu), và DNA yêu cầu có chất lượng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này. Hơn nữa hiện nay, ở nước ta
nhà nước chưa cho phép nhập các chất phóng xạ.
- Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn. Một cặp mồi oligonucleotide có
thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát, sau đó đoạn DNA được khuếch đại được cắt bằng các RE, điện di và
phân tích trên gel nhuộm ethidium bromide hoặc bạc. PCR-RFLP bỏ qua bước lai nên giá thành rẻ hơn và ít nguy hiểm
hơn phương pháp RFLP.

1.4.2. Chỉ thị AFLP (Amplified fragment length polymorphism)
Kĩ thuật AFLP được phát triển bởi công ty KeyGene trong đầu những

năm 1990 và đã trở thành một trong những công nghệ in dấu vân tay di truyền
(fingerprinting) phổ biến nhất trên thế giới.
Kĩ thuật AFLP dựa trên nguyên lý kết hợp giữa kĩ thuật RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphism) và PCR để khuếch đại những
đoạn DNA có chiều dài giới hạn sau khi được cắt hạn chế bởi enzyme cắt hạn chế.
Kĩ thuật AFLP được cấp bằng sáng chế vào năm 1991 và tại thời điểm
này được ban hành ở nhiều quốc gia như Canada, Châu Âu, Nhật Bản, Úc và
Mỹ. Hiện nay đã được ứng dụng rộng rãi trên thế giới.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>