Nghiên cứu biến tính Dendrimer polyamidoamine bằng polymer tương hợp sinh học ứng dụng mang thuốc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
------------------

NGUYỄN THỊ TRÂM CHÂU

NGHIÊN CỨU BIẾN TÍNH DENDRIMER
POLYAMIDOAMINE BẰNG POLYMER
TƯƠNG HỢP SINH HỌC (PEG VÀ PLURONIC)
ỨNG DỤNG MANG THUỐC

Chuyên ngành: Vật liệu cao phân tử và tổ hợp
Mã số: 62.44.01.25

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU

TP. Hồ Chí Minh - 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
------------------

NGUYỄN THỊ TRÂM CHÂU

NGHIÊN CỨU BIẾN TÍNH DENDRIMER
POLYAMIDOAMINE BẰNG POLYMER
TƯƠNG HỢP SINH HỌC (PEG VÀ PLURONIC)
ỨNG DỤNG MANG THUỐC
Chuyên ngành: Vật liệu cao phân tử và tổ hợp
Mã số: 62.44.01.25

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS. TS. NGUYỄN CỬU KHOA
2. TS. TRẦN NGỌC QUYỂN

TP. Hồ Chí Minh - 2016


i

LỜI CAM ĐOAN
Cơng trình được thực hiện tại phịng Hóa dược - Viện Khoa học Vật liệu ứng
dụng - Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tại Thành phố Hồ Chí Minh;
và phịng thí nghiệm Hóa Hữu cơ trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí
Minh - Cơ sở Quảng Ngãi.
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tơi và được sự hướng dẫn
khoa học của PGS. TS. Nguyễn Cửu Khoa và TS. Trần Ngọc Quyển. Các nội dung
nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực, được hoàn thành dựa trên các
kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho
bất cứ luận văn cùng cấp nào khác.
Tác giả luận án

Nguyễn Thị Trâm Châu


ii

LỜI CÁM ƠN
Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Cửu Khoa
và TS. Trần Ngọc Quyển, những người Thầy đã dành cho tôi sự động viên giúp đỡ
tận tình và những định hướng khoa học hiệu quả trong suốt quá trình thực hiện
luận án này.
Tơi xin cảm ơn sự giúp đỡ và khích lệ của các cán bộ, đồng nghiệp khác trong
trường Đại học Công Nghiệp TP HCM.
Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Viện Khoa học vật
liệu đối với tơi trong q trình thực hiện luận án.
Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của trường Đại học Công
Nghiệp TP HCM đối với tơi trong q trình thực hiện luận án.
Luận án này được hỗ trợ kinh phí của đề tài nghiên cứu cơ bản của Quỹ Phát
triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED), mã số 106.YS.99-2013.29.
Sau cùng, tôi xin cảm ơn và thực sự không thể quên được sự giúp đỡ tận tình
của các thầy cơ, bạn bè, anh em xa gần và sự động viên, tạo điều kiện của những
người thân trong gia đình trong suốt q trình tơi hồn thành luận án này.
Tp. HCM, tháng 10 năm 2015
Tác giả

Nguyễn Thị Trâm Châu


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................3
1.1. DENDRIMER ......................................................................................................3
1.1.1. Giới thiệu dendrimer .........................................................................................3
1.1.2. Tính chất của dendrimer ...................................................................................7
1.1.3. Yếu tố ảnh hưởng lên dendrimer ....................................................................10
1.1.4. Phương pháp tổng hợp dendrimer ...................................................................14
1.2. DENDRIMER POLYAMIDOAMINE ..............................................................16
1.2.1. Khái niệm dendrimer polyamidoamine ..........................................................16
1.2.2. Phương pháp nang hóa thuốc của dendrimer PAMAM ..................................20
1.3. Ý NGHĨA CỦA VIỆC BIẾN TÍNH CHẤT MANG NANO DENDRIMER
PAMAM LÀM CHẤT MANG THUỐC ..................................................................21
1.4. CÁC CHẤT BIẾN TÍNH NHÓM AMINE TRÊN BỀ MẶT CỦA
DENDRIMER PAMAM ...........................................................................................23
1.4.1. Polyethylene glycol .........................................................................................23
1.4.2. Pluronic ...........................................................................................................24
1.5. Ý NGHĨA ỨNG DỤNG DENDRIMER PAMAM LÀM CHẤT MANG
THUỐC CHỐNG UNG THƯ ...................................................................................27
1.5.1. Dendrimer phân phối thuốc tới đích thụ động ................................................28
1.5.2. Dendrimer phân phối thuốc tới đích chủ động................................................29
1.5.3. Thuốc 5-Fluorouracil (5-FU) .........................................................................29
1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC HỆ NANO DENDRIMER MANG THUỐC
...................................................................................................................................31
1.6.1. Các nghiên cứu biến tính dendrimer PAMAM nhằm giảm độc tính ..............31
1.6.2 Các nghiên cứu tăng cường hiệu quả mang và giải phóng thuốc của hệ
dendrimer PAMAM biến tính với PEG và Pluronic .................................................34

iv

1.6.3. Các nghiên cứu của dendrimer PAMAM biến tính với polymer khác ...........41
Chương 2. NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM...........................................................44
2.1. HÓA CHẤT .......................................................................................................44
2.2. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ .................................................................................45
2.3. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM ..................................................................46
2.3.1. Tổng hợp dendrimer PAMAM đến thế hệ G5.0 từ tâm ethylenediamine
(EDA) ........................................................................................................................46
2.3.2. Biến tính dendrimer PAMAM thế hệ G2.0, G3.0, G4.0 và G5.0 bằng các
PEG4K, PEG6K, PEG10K và PEG12K ...................................................................51
2.3.3. Biến tính dendrimer PAMAM thế hệ G2.0, G3.0, G4.0 và G5.0 bằng các
Pluronic P123, F68, F127 và F108. ..........................................................................55
2.3.4. Tổng hợp chất mang nano PAMAM G4.0-F127 với các tỷ lệ mol PAMAM
G4.0 : F127 khác nhau ..............................................................................................59
2.3.5. Nang hóa thuốc 5-Fluorouracil (5-FU) lên các loại dendrimer PAMAM-PEG
...................................................................................................................................60
2.3.6. Nang hóa thuốc 5-Fluorouracil (5-FU) lên các loại dendrimer PAMAMPluronic .....................................................................................................................61
2.3.7. Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-FU của PAMAM G4.0-PEG/5-FU in vitro trong
đệm PBS .....................................................................................................................63
2.3.8. Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-FU của PAMAM G4.0-Pluronic/5-FU in
vitro trong đệm PBS ..................................................................................................64
2.3.9. Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-FU in vitro trong đệm PBS ....................65
2.3.10. Phương pháp xác định độc tính tế bào của các chất mang nano ...................65
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................70
3.1. TỔNG HỢP DENDRIMER PAMAM TỪ THẾ HỆ G-0.5 ĐẾN THẾ HỆ G5.0 ...70
3.1.1. Xác định cấu trúc các dendrimer PAMAM dựa vào phổ khối lượng MS ......70
3.1.2. Xác định cấu trúc các dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-NMR ................72
3.2. TỔNG HỢP PAMAM-PEG ...............................................................................78

v

3.2.1. Kết quả phân tích 1H-NMR các sản phẩm trung gian NPC-PEG-NPC, NPCPEG-TA, PAMAM và PAMAM-PEG......................................................................78
3.2.2. Kết quả phân tích FTIR của PAMAM và PAMAM-PEG ..............................83
3.2.3. Kết quả GPC của PAMAM-PEG ....................................................................84
3.2.4. Kết quả TEM của PAMAM và PAMAM-PEG ..............................................89
3.3. TỔNG HỢP PAMAM-PLURONIC ..................................................................89
3.3.1. Kết quả phân tích 1H-NMR của sản phẩm trung gian NPC-Plu-NPC, NPCPlu-TA, PAMAM và PAMAM-Pluronic ..................................................................90
Để tổng hợp PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 với Pluronic cần phải hoạt hóa 2
nhóm -OH đầu và cuối mạch của Pluronic bởi pnitrophenyl chloroformate (NPC)
tạo sản phẩm NPC-Plu-NPC theo phản ứng sau: ......................................................90
3.3.2. Kết quả phân tích FTIR của PAMAM và PAMAM-Pluronic ........................94
3.3.3. Kết quả GPC của PAMAM-Pluronic ..............................................................95
d. Kết quả GPC của PAMAM-F108 .......................................................................100
3.3.4. Kết quả TEM của PAMAM và PAMAM-Pluronic ......................................101
3.4. SO SÁNH KHẢ NĂNG BIẾN TÍNH CỦA DENDRIMER PAMAM G2.0,
G3.0, G4.0, G5.0 BẰNG CÁC BIOPOLYMER (PEG VÀ PLURONIC) .............102
3.4.1. Kết quả biến tính của dendrimer PAMAM với PEG ....................................102
3.4.2. Kết quả biến tính của dendrimer PAMAM với Pluronic ..............................103
3.5. TỔNG HỢP CHẤT MANG NANO PAMAM G4.0-F127 VỚI CÁC TỶ LỆ
MOL KHÁC NHAU ...............................................................................................105
3.6. NANG HÓA THUỐC CHỐNG UNG THƯ 5-FLUOROURACIL TRONG
CÁC CHẤT MANG NANO ...................................................................................106
3.6.1. Nang hóa thuốc trong các chất mang nano dendrimer PAMAM G2.0, G3.0,
G4.0 và G5.0 ...........................................................................................................108
3.6.2. Nang hóa thuốc 5-FU trong polymer PEG và Pluronic ................................110
3.6.3. Nang hóa thuốc 5-FU trong các chất mang dendrimer PAMAM-PEG ........111
3.6.4. Nang hóa thuốc 5-FU trong các chất mang dendrimer PAMAM-Pluronic ..118

vi

3.6.5. So sánh hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU của các chất mang nano dendrimer
PAMAM-PEG .........................................................................................................124
3.6.6. So sánh hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU của các chất mang nano dendrimer
PAMAM-Pluronic ...................................................................................................126
3.7. KHẢO SÁT VÀ SO SÁNH TỐC ĐỘ GIẢI PHÓNG THUỐC 5-FU CỦA
PAMAM G4.0-PEG/5-FU VÀ 5-FU IN VITRO TRONG MÔI TRƯỜNG ĐỆM
PBS (pH=7.4) ..........................................................................................................129
3.8. KHẢO SÁT VÀ SO SÁNH TỐC ĐỘ GIẢI PHÓNG THUỐC 5-FU CỦA
PAMAM G4.0-PLURONIC/5-FU VÀ 5-FU IN VITRO TRONG MÔI TRƯỜNG
ĐỆM PBS (pH=7.4) ................................................................................................129
3.9. KẾT QUẢ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA HỆ CHẤT MANG NANO DẪN
TRUYỀN 5-FU .......................................................................................................130
3.9.1. Kết quả gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 của hệ chất mang nano dẫn truyền
5-FU ........................................................................................................................130
3.9.2. Kết quả gây độc nguyên bào sợi (Fibroblast) của hệ chất mang nano dẫn
truyền 5-FU .............................................................................................................132
KẾT LUẬN .............................................................................................................136
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................138
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ...............................................139
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Phụ lục 1. Xây dựng phương trình đường chuẩn A = 33,101C + 27,857 .............. PL1
Phụ lục 2. Xây dựng phương trình đường chuẩn A = 17346C – 26,26 ................. PL2
Phụ lục 3. Xây dựng phương trình đường chuẩn A = 14732C + 45,44 ................. PL3
Phụ lục 4. Phổ 1H-NMR của các NPC-PEG-NPC ................................................. PL4
Phụ lục 5. Phổ 1H-NMR của các NPC-PEG-TA ................................................... PL5
Phụ lục 6. Phổ 1H-NMR của các PAMAM-PEG ................................................... PL6
Phụ lục 7. Phổ FTIR của PAMAM và PAMAM-PEG .......................................... PL7

Phụ lục 8. Phổ 1H-NMR của các NPC-Plu-NPC ................................................... PL8
Phụ lục 9. Phổ 1H-NMR của các NPC-Plu-TA .................................................... PL10


vii

Phụ lục 10. Phổ 1H-NMR của PAMAM-Pluronic ............................................... PL11
Phụ lục 11. Bảng thống kê kết quả giải phóng thuốc 5-FU mẫu đối chứng ........ PL12
Phụ lục 12. Bảng thống kê kết quả giải phóng thuốc 5-FU mẫu PAMAM G4.0PEG6K/5-FU ........................................................................................................ PL13
Phụ lục 13. Bảng thống kê kết quả giải phóng thuốc 5-FU mẫu PAMAM G4.0P123/5-FU ............................................................................................................ PL14
Phụ lục 14. Bảng thống kê kết quả giải phóng thuốc 5-FU mẫu PAMAM G4.0F127/5-FU ............................................................................................................ PL15


viii

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Thông số đặc trưng của Polyethylene glycol ............................................24
Bảng 1.2. Thông số đặc trưng của Pluronic .............................................................26
Bảng 2.1. Danh mục hóa chất ...................................................................................44
Bảng 2.2. Bảng số liệu dendrimer PAMAM các thế hệ lẻ ........................................47
Bảng 2.3. Bảng số liệu dendrimer PAMAM các thế hệ chẵn ..................................47
Bảng 2.4. Thành phần và khối lượng các chất tham gia phản ứng tổng hợp
PAMAM-PEG ...........................................................................................................53
Bảng 2.5. Thành phần và khối lượng các chất tham gia phản ứng tổng hợp
PAMAM-Pluronic .....................................................................................................57
Bảng 2.6. Thành phần và khối lượng các chất tham gia phản ứng tổng hợp
PAMAM-F127 với tỷ lệ mol khác nhau ...................................................................59
Bảng 3.1. Khối lượng phân tử các dendrimer PAMAM dựa vào phổ MS ...............71
Bảng 3.2. Khối lượng phân tử dựa trên 1H-NMR của PAMAM G-0.5 đến G5.0....77
Bảng 3.3. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM-PEG4K (PAMAM

G2.0-PEG4K, PAMAM G3.0-PEG4K, PAMAM G4.0-PEG4K và PAMAM G5.0PEG4K) .....................................................................................................................85
Bảng 3.4. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM-PEG6K (PAMAM
G2.0-PEG6K, G3.0-PEG6K, G4.0-PEG6K và G5.0-PEG6K) .................................86
Bảng 3.5. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM-PEG10K (PAMAM
G2.0-PEG10K, PAMAM G3.0-PEG10K, PAMAM G4.0-PEG10K và PAMAM
G5.0-PEG10K) ..........................................................................................................87
Bảng 3.6. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM-PEG12K (PAMAM
G2.0-PEG12K, PAMAM G3.0-PEG12K, PAMAM G4.0-PEG12K và PAMAM
G5.0-PEG12K) ..........................................................................................................88
Bảng 3.7. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM-P123 (PAMAM
G2.0-P123, PAMAM G3.0-P123, PAMAM G4.0-P123 và PAMAM G5.0-P123) .96


ix

Bảng 3.8. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM-F68 (PAMAM
G2.0-F68, PAMAM G3.0-F68, PAMAM G4.0-F68 và PAMAM G5.0-F68) .........98
Bảng 3.9. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM-F127 (PAMAM
PAMAM G2.0-F127, PAMAM G3.0-F127, PAMAM G4.0-F127 và PAMAM
G5.0-F127) ................................................................................................................99
Bảng 3.10. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM-F108 (PAMAM
G2.0-F108, PAMAM G3.0-F108, PAMAM G4.0-F108 và PAMAM G5.0-F108)
.................................................................................................................................100
Bảng 3.11. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM G4.0-F127 với các
tỷ lệ mol PAMAM : Pluronic F127 khác nhau .......................................................105
Bảng 3.12. Thống kê hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU trong PAMAM G2.0, G3.0,
G4.0 và G5.0 ...........................................................................................................109
Bảng 3.13. Hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU của PEG6K và Pluronic F127 ............111
Bảng 3.14. Thống kê độ nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-PEG4K...................113
Bảng 3.15. Thống kê độ nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-PEG6K...................115

Bảng 3.16. Thống kê độ nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-PEG10K.................116
Bảng 3.17. Thống kê độ nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-PEG12K.................117
Bảng 3.18. Thống kê độ nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-P123 .......................119
Bảng 3.19. Thống kê độ nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-F68 ........................121
Bảng 3.20. Thống kê độ nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-F127 .......................122
Bảng 3.21. Thống kê độ nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-F108 .......................123
Bảng 3.22. Kết quả gây độc tế bào MCF-7 theo phương pháp nhuộm SRB ..........131


x

DANH MỤC ĐỒ THỊ
Đồ thị 3.1. Tỷ lệ liên hợp của PAMAM-PEG.........................................................102
Đồ thị 3.2. Tỷ lệ liên hợp của PAMAM-Pluronic...................................................104
Đồ thị 3.3. Hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU của các PAMAM-PEG .......................124
Đồ thị 3.4. Hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-Pluronic .......................126
Đồ thị 3.5. Kết quả giải phóng thuốc 5-FU của PAMAM G4.0-PEG6K (Xanh) và 5FU đối chứng (Đỏ) ..................................................................................................129
Đồ thị 3.6. Kết quả giải phóng thuốc 5-FU của PAMAM G4.0-P123 (Xanh nhạt),
PAMAM G4.0-F127 (Xanh đậm) và 5-FU đối chứng (Đỏ) ..................................130
Đồ thị 3.7. Kết quả gây độc tế bào IC50 của các chất mang nano theo phương pháp
nhuộm SRB .............................................................................................................132
Đồ thị 3.8. Kết quả gây độc nguyên bào sợi theo phương pháp nhuộm MTT .......133


xi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc phân tử dendrimer.........................................................................3
Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của dendrgraft, dendron và dendrimer [61] .....................4
Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của dendrimer có ngun tử tạo nhánh khác nhau ..........5

Hình 1.4. Dendrimer cầu nối N và dendrimer cầu nối aryl .........................................5
Hình 1.5. Dendrimer với tâm NH3 (a) và tâm BDA (b) ..............................................6
Hình 1.6. Tổng hợp divergent theo mơ hình tạo nhánh 1→2 .....................................6
Hình 1.7. Tổng hợp divergent theo mơ hình tạo nhánh 1→3 .....................................7
Hình 1.8. G3.0, G4.0, G5.0 của PAMAM có kích thước phù hợp với kích thước của
insulin (30 Å), Cytochrome C (40 Å) và hemoglobin (55 Å)… .................................9
Hình 1.9. Dendrimer “che phủ” bởi các nhóm bề mặt khác nhau dẫn tới sự khác biệt
lớn về đặc tính sinh học.............................................................................................10
Hình 1.10. Sơ đồ dự đoán kết quả của hiện tượng “nếp gấp ngược” khi mật độ phân
tử bên trong dendrimer tăng .....................................................................................11
Hình 1.11. Cấu trúc không gian 3 chiều của dendrimer PAMAM G6.0 ở các điều
kiện pH khác nhau dựa trên động lực học phân tử....................................................12
Hình 1.12. Sự thay đổi hình dạng dendrimer trong dung mơi khác nhau .................12
Hình 1.13. Sự thay đổi hình dạng dendrimer trong nồng độ muối khác nhau .........13
Hình 1.14. Các nồng độ dendrimer khác nhau .........................................................13
Hình 1.15. Sơ đồ tổng hợp dendrimer bằng phương pháp phân kỳ ..........................14
Hình 1.16 Tổng hợp dendrimer bằng phương pháp hội tụ........................................15
Hình 1.17. Tổng hợp dendrimer bằng phương pháp tăng lũy thừa hai .....................15
Hình 1.18. Cơng thức của phân tử dendrimer PAMAM G3.0 tâm EDA..................17
Hình 1.19. Phương trình phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM G -0.5................18
Hình 1.20. Phương trình phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM G 0.0 .................18
Hình 1.21. Cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G0.5 (a); G1.5 (b); G2.5 (c) 19
Hình 1.22. Cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G 1.0 (a) và G 2.0 (b) ..........19
Hình 1.23. Cơ chế nang hóa thuốc của dendrimer ...................................................20


xii

Hình 1.24. Nồng độ thuốc trong máu tương ứng với các phương pháp sử dụng
thuốc: a) Thuốc uống; b) Thuốc được tiêm qua tĩnh mạch và c) Thuốc giải phóng

chậm từ chất mang ....................................................................................................22
Hình 1.25. Cấu trúc của Polyethylene glycol............................................................23
Hình 1.26. Cấu trúc của Pluronic ..............................................................................25
Hình 1.27. Hình dạng của Pluronic. ..........................................................................25
Hình 1.28. Cơ chế thay đổi cấu trúc của Pluronic ....................................................25
Hình 1.29. Vật liệu mao quản SPA-15......................................................................27
Hình 1.30. Mơ hình định hướng thụ động dựa theo cơ chế EPR ..............................28
Hình 1.31. Cấu trúc 5-Fluorouracil ...........................................................................30
Hình 1.32. Ảnh hưởng việc biến tính bề mặt PAMAM lên khả năng gây độc tế bào,
thấm xuyên bào và sự hấp thu của tế bào..................................................................32
Hình 1.33. Sự kết hợp của PEG-PAMAM với adriamycin (a), methotrexate (b) ....34
Hình 1.34. Mơ hình PAMAM-MPEG mang thuốc 5-Fluorouracil ..........................35
Hình 1.35. Cấu trúc hóa học của PEG-Dendrimer gắn với doxorubicin thơng qua
mối nối hydrazone .....................................................................................................37
Hình 1.36. Sơ đồ giải phóng thuốc của PAMAM chưa biến tính và PAMAM đã
biến tính. ....................................................................................................................38
Hình 1.37. Sơ đồ tổng hợp dendrimer PAMAM G5-Pluronic F127 ........................39
Hình 1.38. Sơ đồ tổng hợp P123-g-PAMAM dendrimer .........................................40
Hình 1.39. Cấu trúc của dendrimer PAMAM G5 theo lý thuyết (trái) và thực tế
(phải) do khiếm khuyết của quá trình phản ứng .......................................................41
Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp dendrimer PAMAM các thế hệ........................................46
Hình 2.2. Hình phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM ..........................................48
Hình 2.3. Hình tinh chế sản phẩm dendrimer PAMAM ...........................................48
Hình 2.4. Sơ đồ qui trình tổng hợp các dendrimer PAMAM thế hệ lẻ .....................49
Hình 2.5. Sơ đồ qui trình tổng hợp các dendrimer PAMAM thế hệ chẵn ................50
Hình 2.6. Hình sản phẩm dendrimer PAMAM thế hệ G1.0, G2.0, G3.0, G4.0, G5.0
...................................................................................................................................50


xiii

Hình 2.7. Hình phản ứng PEG với NPC (a), Kết tủa sản phẩm (b), Sản phẩm NPCPEG-NPC (c) .............................................................................................................51
Hình 2.8. Hình phản ứng NPC-PEG-NPC với TA (a), Cơ quay sản phẩm (b), Sản
phẩm NPC-PEG-TA (b) ............................................................................................52
Hình 2.9. Hình cơ quay sản phẩm PAMAM-PEG (a),Sản phẩm PAMAM-PEG (b)
...................................................................................................................................52
Hình 2.10. Sơ đồ tổng hợp 16 hệ PAMAM-PEG .....................................................54
Hình 2.11. Hình phản ứng Pluronic với NPC ...........................................................55
Hình 2.12. Phản ứng NPC-Plu-NPC với TA (a), sản phẩm NPC-Plu-TA (b) ..........56
Hình 2.13. Phản ứng biến tính PAMAM bằng Pluronic (a), Thẩm tách sản phẩm (b),
Sản phẩm PAMAM-Pluronic (c) ..............................................................................56
Hình 2.14. Sơ đồ tổng hợp 16 hệ PAMAM-Pluronic ...............................................58
Kiểm tra cấu trúc các sản phẩm cuối PAMAM G4.0-F127 với 4 tỷ lệ mol phản ứng
(1:8, 1:16, 1:32, 1:64) bằng các phương pháp FTIR, 1H NMR. ...............................59
Hình 2.15. Sơ đồ tổng hợp PAMAM G4.0-F127 với 4 tỷ lệ mol phản ứng (1:8, 1:16,
1:32, 1:64) .................................................................................................................60
Hình 2.16. Hình nang hóa thuốc 5-FU lên PAMAM-PEG (a), Cơ chế mang thuốc
trong cấu trúc các loại chất mang nano PAMAM-PEG (b) ......................................61
Hình 2.17. Sơ đồ quy trình nang hóa thuốc 5-FU của các loại PAMAM-PEG ........61
Hình 2.18. Hình nang hóa thuốc 5-FU lên PAMAM-Pluronic (a), Cơ chế nang hóa
thuốc trong cấu trúc các loại chất mang nano PAMAM-Pluronic (b) ......................62
Hình 2.19. Sơ đồ quy trình nang hóa thuốc 5-FU của các loại PAMAM-Pluronic ..62
Hình 2.20. Sơ đồ quy trình giải phóng thuốc 5-FU của hệ chất mang PAMAM
G4.0-PEG6K .............................................................................................................63
Hình 2.21. Sơ đồ quy trình giải phóng thuốc 5-FU của hệ chất mang PAMAM
G4.0-P123 và PAMAM G4.0-F127 ..........................................................................64
Hình 2.22. Sơ đồ quy trình giải phóng thuốc 5-FU mẫu đối chứng .........................65
Hình 3.1. Cấu trúc dendrimer PAMAM từ EDA đến thế hệ G5.0............................70
Hình 3.2. Phổ MS của dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G2.0 ...............................71

xiv

Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của dendrimer PAMAM thế hệ G-0.5 đến G5.0 ................75
Hình 3.4. Sơ đồ tổng hợp NPC-PEG-NPC ...............................................................78
Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của NPC-PEG4K-NPC.......................................................79
Hình 3.6. Sơ đồ tổng hợp NPC-PEG-TA ..................................................................80
Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của NPC-PEG4K-TA .........................................................80
Hình 3.8. Sơ đồ tổng hợp PAMAM-PEG .................................................................81
Hình 3.9. Phổ 1H-NMR của PAMAM-PEG4K ........................................................82
Hình 3.10. Phổ FTIR của PAMAM G4.0 (a) và PAMAM G4.0-PEG4K(b) ...........83
Hình 3.11. Kết quả GPC của PAMAM G2.0-PEG4K, PAMAM G3.0-PEG4K,
PAMAM G4.0-PEG4K, PAMAM G5.0-PEG4K .....................................................85
Hình 3.12. Kết quả GPC của PAMAM G2.0-PEG6K, PAMAM G3.0-PEG6K,
PAMAM G4.0-PEG6K, PAMAM G5.0-PEG6K .....................................................87
Hình 3.13. Kết quả GPC của PAMAM G2.0-PEG10K, PAMAM G3.0-PEG10K,
PAMAM G4.0-PEG10K, PAMAM G5.0-PEG10K .................................................88
Hình 3.14. Kết quả GPC của PAMAM G2.0-PEG12K, PAMAM G3.0-PEG12K, .89
PAMAM G4.0-PEG12K, PAMAM G5.0-PEG12K .................................................89
Hình 3.15. Hình ảnh TEM của PAMAM G4.0 (a), PAMAM G4.0-PEG4K (b) và
PAMAM G4.0-PEG6K (c)........................................................................................89
Hình 3.16. Sơ đồ tổng hợp NPC-Plu-NPC................................................................90
Hình 3.17. Phổ 1H-NMR của NPC-P123-NPC .........................................................90
Hình 3.18. Sơ đồ tổng hợp NPC-Plu-TA ..................................................................91
Hình 3.19. Phổ 1H-NMR của NPC-P123-TA ...........................................................92
Hình 3.20. Sơ đồ tổng hợp PAMAM-Pluronic .........................................................93
Hình 3.21. Phổ 1H-NMR của PAMAM-Pluronic .....................................................93
Hình 3.22. Phổ FTIR của PAMAM G4.0 (a) và PAMAM G4.0-F127(b) ................95
Hình 3.23. Kết quả GPC của PAMAM G2.0-P123, PAMAM G3.0-P123, PAMAM
G4.0-P123, PAMAM G5.0-P123 ..............................................................................97

Hình 3.24. Kết quả GPC của PAMAM G2.0-F68, PAMAM G3.0-F68, PAMAM
G4.0-F68, PAMAM G5.0-F68 ..................................................................................99


xv

Hình 3.25. Kết quả GPC của PAMAM G2.0-F127, PAMAM G3.0-F127, PAMAM
G4.0-F127, PAMAM G5.0-F127 ............................................................................100
Hình 3.26. Kết quả GPC của PAMAM G2.0-F108, PAMAM G3.0-F108, PAMAM
G4.0-F108, PAMAM G5.0-F108 ............................................................................101
Hình 3.27. Hình ảnh TEM của Pluronic F127 (a), PAMAM G4.0-P123 (b), ........101
PAMAM G4.0-F68 (c), PAMAM G4.0-F127 (d) và PAMAM G4.0-F108 (e)......101
Hình 3.28. Kết quả GPC của PAMAM G4.0-F127 tỷ lệ 1:8 ; 1:16; 1:32; 1:64 .....106
Hình 3.29. Phổ FTIR của PAMAM-PEG (a) và PAMAM-PEG/5-FU (b) .............107
Hình 3.30. Sắc ký đồ của 5-FU khơng được nang hóa trong PAMAM G2.0, G3.0,
G4.0 và G5.0 ...........................................................................................................109
Hình 3.31. Sắc ký đồ của 5-FU khơng được nang hóa trong PEG6K và Pluronic
F127 .........................................................................................................................111
Hình 3.32. Sắc ký đồ của 5-FU khơng được nang hóa trong PAMAM G2.0-PEG4K,
PAMAM G3.0-PEG4K, PAMAM G4.0-PEG4K và PAMAM G5.0-PEG4K .......112
Hình 3.33. Sắc ký đồ của 5-FU khơng được nang hóa trong PAMAM G2.0-PEG6K,
PAMAM G3.0-PEG6K, PAMAM G4.0-PEG6K và PAMAM G5.0-PEG6K .......114
Hình 3.34. Sắc ký đồ của 5-FU khơng được nang hóa trong PAMAM G2.0PEG10K, PAMAM G3.0-PEG10K, PAMAM G4.0-PEG10K và PAMAM G5.0PEG10K ..................................................................................................................116
Hình 3.35. Sắc ký đồ của 5-FU khơng được nang hóa trong PAMAM G2.0PEG12K, PAMAM G3.0-PEG12K, PAMAM G4.0-PEG12K và PAMAM G5.0PEG12K ..................................................................................................................117
Hình 3.36. Sắc ký đồ của 5-FU khơng được nang hóa trong PAMAM G2.0-P123,
PAMAM G3.0-P123, PAMAM G4.0-P123 và PAMAM G5.0-P123 ...................118
Hình 3.37. Sắc ký đồ của 5-FU khơng được nang hóa trong PAMAM G2.0-F68,
PAMAM G3.0-F68, PAMAM G4.0-F68 và PAMAM G5.0-F68 ..........................120
Hình 3.38. Sắc ký đồ của 5-FU khơng được nang hóa trong PAMAM G2.0-F127,
PAMAM G3.0-F127, PAMAM G4.0-F127 và PAMAM G5.0-F127 ....................122

xvi

Hình 3.39. Sắc ký đồ của 5-FU khơng được nang hóa trong PAMAM G2.0-F108,
PAMAM G3.0-F108, PAMAM G4.0-F108 và PAMAM G5.0-F108 ....................123
Hình 3.40. Kết quả gây độc nguyên bào sợi theo phương pháp nhuộm huỳnh quang
FDA/EB ...................................................................................................................134


xvii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A

Độ hấp thu

ACN

Acetonitrile

BDA

Butylenediamine

C

Nồng độ dung dịch

Da

Dalton

DL%

Hàm lượng thuốc được nang hóa trong tổng trọng lượng chất
mang (% drug loading)

DMF

Dimethyl formamide

EDA

Ethylenediamine

EE%

Hàm lượng thuốc được nang hóa so với lượng thuốc tiền sử dụng (
% drug entrapment)

EO

Ethylene oxide

FTIR

Phương pháp quang phổ hồng ngoại (Fourier transform infrared
spectroscopy)

GPC

Phương

pháp

sắc

ký

thẩm

thấu

gel

(Gel Permeation

Chromatography)
HAD

Hexylene diamine

HLB

Hằng số cân bằng ưa nước - kỵ nước (hydrophilic-lipophilic
balance)

HPLC

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)

1

H-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Proton Nuclear Magnetic
Resonance)

5-FU

5-Fuorouracil

MA

Methylacrylate

MPEG

Methoxy Polyethylene glycol

MW

Molecular weight


xviii

MWCO

Molecular weight cut-off

NPC

p-nitrophenyl chloroformate

PAMAM

Polyamidoamine

PAMAM G2.0

Polyamidoamine generation 2.0

PAMAM G3.0

Polyamidoamine generation 3.0

PAMAM G4.0

Polyamidoamine generation 4.0

PAMAM G5.0

Polyamidoamine generation 5.0

PBS

Dung dịch muối đệm photphat (Phosphate Buffered Saline)

PEG

Polyethylene glycol

PEG4K

Polyethylene glycol 4000

PEG6K

Polyethylene glycol 6000

PEG10K

Polyethylene glycol 10000

PEG12K

Polyethylene glycol 12000

PO

Propylene oxide

Plu

Pluronic

P123

Pluronic P123

F68

Pluronic F68

F127

Pluronic F127

F108

Pluronic F108

TA

Tyramine

TEM

Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron
Microscope)

THF

Tetrahydrofurane

1
MỞ ĐẦU
Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, con người đã khơng ngừng
nghiên cứu để tìm ra những vật liệu mới nhằm phục vụ cho nhu cầu của cuộc sống.
Công nghệ nano ra đời đã đáp ứng được nhu cầu cấp thiết này. Trong những năm
gần đây, các nanopolymer được tập trung nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực y
dược. Dendrimer là một trong những nanopolymer được nghiên cứu nhiều nhất bởi
cấu trúc hình cầu có nhiều khoảng trống bên trong có thể được ứng dụng làm chất
mang thuốc, protein và phân phối gen.
Ngày càng có nhiều loại thuốc đang được sử dụng phải đối mặt với các vấn đề
về độ hòa tan, tác dụng sinh học, độ hấp thụ kém và thời gian tồn trữ ngắn. Ngồi
ra, các thuốc đặc trị có rất nhiều tác dụng phụ. Đặc biệt thuốc chống ung thư không
những gây độc với tế bào ung thư mà còn gây độc đối với cả các tế bào lành.
Nhiều báo cáo khoa học chỉ ra rằng việc đóng gói các loại thuốc điều trị ung
thư vào các hệ chất mang polymer hay nanopolymer đã nâng cao đáng kể độ tan
trong nước và độ ổn định lưu trữ thuốc, giúp tăng cường hoạt động chống khối u và
giảm tác dụng phụ của thuốc. Dendrimer PAMAM là một trong những chất mang
nanopolymer có thể làm việc như một cơng cụ hữu ích cho việc phân phối các loại
thuốc, cũng như liệu pháp gen và hóa trị [14, 22, 35, 44, 53, 68, 74-76].
Tuy nhiên, có một nhược điểm của dendrimer PAMAM là gây ra độc tính
trong máu và ly giải tế bào do tương tác mạnh mẽ của các nhóm -NH2 ở trên bề mặt
PAMAM với màng tế bào, dẫn đến sự phá vỡ màng tế bào, đồng nghĩa là diệt tế
bào [44, 53, 79, 88].
Để giải quyết vấn đề này, các nhóm -NH2 trên bề mặt dendrimer PAMAM
được biến tính bằng các polymer tương hợp sinh học, làm triệt tiêu điện tích dương
của các nhóm amine trên hoặc ngăn chặn sự tiếp xúc giữa các nhóm -NH2 với màng
tế bào giúp giảm độc tính, tạo ra khả năng tương tác sinh học cao của chất mang, từ
đó nâng cao hiệu quả mang thuốc và điều trị [14, 35, 80, 83]. Ngồi ra việc biến
tính bề mặt PAMAM cũng có thể làm tăng khả năng mang thuốc của PAMAM.

2
Trên cơ sở đó, chúng tơi đề xuất đề tài “Nghiên cứu biến tính dendrimer
polyamidoamine bằng polymer tương hợp sinh học (PEG và Pluronic) ứng dụng
mang thuốc”.
Mục tiêu của luận án:
Nghiên cứu tổng hợp chất mang thuốc trên cơ sở biến tính dendrimer
PAMAM bằng polymer tương hợp sinh học (Pluronic, Polyethylene glycol), với
mục tiêu làm giảm độc tính của PAMAM (tăng tính tương hợp sinh học) và tăng
khả năng mang thuốc của PAMAM.
Nội dung nghiên cứu luận án bao gồm:
1. Tổng hợp dendrimer PAMAM đến thế hệ G5.0 từ tâm ethylenediamine
(EDA).
2. Nghiên cứu biến tính 4 thế hệ dendrimer PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0
bằng các Polyethylene glycol 4000 (PEG4K), Polyethylene glycol 6000 (PEG6K),
Polyethylene glycol 10000 (PEG10K), Polyethylene glycol 12000 (PEG12K).
3. Nghiên cứu biến tính 4 thế hệ dendrimer PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0
bằng các Pluronic P123, Pluronic F68, Pluronic F127 và Pluronic F108.
4. Nghiên cứu tổng hợp dendrimer PAMAM G4.0-F127 với các tỷ lệ mol
PAMAM/F127 khác nhau.
5. Nghiên cứu hiệu quả nang hóa thuốc chống ung thư 5-Fluorouracil (5-FU)
của các chất mang nano PAMAM-PEG và PAMAM-Pluronic.
6. Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-Fluorouracil của hệ dendrimer PAMAM
G4.0-PEG6K/5-FU trong in vitro với môi trường đệm PBS (pH=7.4).
7. Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-Fluorouracil của hệ dendrimer PAMAM
G4.0-P123/5-FU và PAMAM G4.0-F127/5-FU trong in vitro với môi trường đệm
PBS (pH=7.4).
8. Nghiên cứu độc tính tế bào ung thư vú MCF-7 và nguyên bào sợi
(Fibroblast) đối với các hệ chất mang nano dendrimer PAMAM, PAMAM-PEG,
PAMAM-Pluronic, PAMAM-PEG/5-FU và PAMAM-Pluronic/5FU.

3
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. DENDRIMER
1.1.1. Giới thiệu dendrimer
Hóa học polymer và kỹ thuật sản xuất đã có từ lâu đời trên nền tảng chính là
sản xuất ra polymer mạch thẳng và nhánh, đã thể hiện vai trò là vật liệu quan trọng
trong sản xuất và đời sống. Phân tử polymer có kích thước lớn, cấu tạo mạch thẳng
chỉ chứa một vài nhánh nhỏ hơn hoặc có thể là nhánh lớn được sắp xếp một cách
ngẫu nhiên.
Trong hai thập niên qua người ta nghiên cứu phát triển nhiều loại vật liệu
nanopolymer mới có những tính chất khác biệt so với các polymer cao phân tử
mạch nhánh và thẳng thông thường. Một trong những vật liệu đó là dendrimer và
đây được coi là một loại vật liệu có nhiều ứng dụng tiềm năng.
a. Khái niệm và cấu tạo [2, 106]
Khái niệm dendrimer được Donald A. Tomalia và cộng sự đưa ra đầu tiên vào
năm 1985. Dendrimer được bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “Dendron”, có nghĩa là
nhánh cây. Từ đó đến nay có rất nhiều cơng trình nghiên cứu về cấu trúc, tính chất,
phương pháp tổng hợp và ứng dụng của dendrimer trong nhiều lĩnh vực khác nhau.

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử dendrimer


4
Dendrimer là một nanopolymer có dạng hình cầu, cấu trúc nhánh, có nhiều
tính chất ưu việt hơn so với polymer mạch thẳng.
Cấu tạo phân tử dendrimer gồm ba phần (hình 1.1):
− Tâm phân tử (core, nhân, lõi).
− Các nhánh bên trong: liên kết các nhóm bên ngồi với tâm, giữa các

nhánh có nhiều khoảng khơng gian trống.
− Các nhóm bề mặt: nhóm anion, cation, nhóm trung tính, các nhóm ưa
nước hay kỵ nước.
b. Phân loại [32, 40, 45, 66]
Các dendrimer được phân loại theo các tiêu chí sau:
(1) Theo cấu trúc hình học
Theo cấu trúc hình học, dendrimer được phân chia thành các dạng sau :
dendrgraft; dendron; dendrimer (hình 1.2).

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của dendrgraft, dendron và dendrimer
(2) Theo nguyên tử tạo nhánh khác nhau
Theo nguyên tử tạo nhánh khác nhau thì được phân chia và gọi tên khác nhau
(hình 1.3) : nhánh N ; nhánh aryl ; nhánh C ; nhánh Si ; nhánh saccharide ; nhánh P;
…


5

Dendrimer nhánh N

Dendrimer nhánh aryl

Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của dendrimer có nguyên tử tạo nhánh khác nhau
(3) Theo loại kết nối
Theo loại kết nối (connectivity) sẽ phân chia và gọi tên theo các loại liên kết
hóa học tại vị trí kết nối (hình 1.4): cầu nối aryl; cầu nối amide; cầu nối este; cầu
nối ether; cầu nối N; cầu nối O; cầu nối Si; cầu nối urea; cầu nối alkyl; cầu nối
alken; cầu nối alkyn; …

Hình 1.4. Dendrimer cầu nối N và dendrimer cầu nối aryl

(4) Theo thành phần tâm khác nhau
Dendrimer được phân chia theo thành phần tâm khác nhau: ví dụ tâm là NH3,
ethylenediamine (EDA), butylenediamine (BDA), aryl, … Do các tâm có kích
thước khác nhau nên các phản ứng tạo ra dendrimer sẽ bị ảnh hưởng khơng gian
khác nhau, và do tâm có độ phân cực khác nhau nên phần không gian bên trong