Nghiên cứu biến tính Dendrimer polyamidoamine bằng polymer tương hợp sinh học ứng dụng mang thuốc (TT)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
---------------NGUYỄN THỊ TRÂM CHÂU

NGHIÊN CỨU BIẾN TÍNH CÁC DENDRIMER
POLYAMIDOAMINE BẰNG POLYMER TƯƠNG
HỢP SINH HỌC (PEG VÀ PLURONIC) ỨNG
DỤNG MANG THUỐC

Chuyên ngành: VẬT LIỆU CAO PHÂN TỬ VÀ TỔ HỢP
Mã số : 62.44.01.25

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU

TP. Hồ Chí Minh – 2016


Công trình được hoàn thành tại:
Phòng Vật liệu hóa dược, Viện Khoa học vật liệu ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam

Những người hướng dẫn khoa học:

1.

PGS. TS. NGUYỄN CỬU KHOA

2.

TS. TRẦN NGỌC QUYỂN

Phản biện 1:

Phản biện 2:

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện tổ chức tại Viện Khoa
học vật liệu ứng dụng, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam, Số 1, Mạc
Đĩnh Chi, Q.1, TP. Hồ Chí |Minh
vào hồi

giờ

ngày

tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
Thư viện Quốc gia Việt nam,
Thư viện Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam


GIỚI THIỆU
1. MỞ ĐẦU
Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, con người đã không ngừng nghiên cứu để
tìm ra những vật liệu mới nhằm phục vụ cho nhu cầu của cuộc sống. Công nghệ nano ra đời
đã đáp ứng được nhu cầu cấp thiết này. Trong những năm gần đây, các nanopolymer được
tập trung nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực y dược. Dendrimer là một trong những

nanopolymer được nghiên cứu nhiều nhất bởi cấu trúc hình cầu có nhiều khoảng trống bên
trong có thể được ứng dụng làm chất mang thuốc, protein và phân phối gen.
Ngày càng có nhiều loại thuốc đang được sử dụng phải đối mặt với các vấn đề về độ
hòa tan, tác dụng sinh học, độ hấp thụ kém và thời gian tồn trữ ngắn. Ngoài ra, các thuốc đặc
trị có rất nhiều tác dụng phụ. Đặc biệt thuốc chống ung thư không những gây độc với tế bào
ung thư mà còn gây độc đối với cả các tế bào lành.
Nhiều báo cáo khoa học chỉ ra rằng việc đóng gói các loại thuốc điều trị ung thư vào
các hệ chất mang polymer hay nanopolymer đã nâng cao đáng kể độ tan trong nước và độ ổn
định lưu trữ thuốc, giúp tăng cường hoạt động chống khối u và giảm tác dụng phụ của thuốc.
Dendrimer PAMAM là một trong những chất mang nanopolymer có thể làm việc như một
công cụ hữu ích cho việc phân phối các loại thuốc, cũng như liệu pháp gen và hóa trị [14, 22,
35, 44, 53, 68, 74-76].
Tuy nhiên, có một nhược điểm của dendrimer PAMAM là gây ra độc tính trong máu và
ly giải tế bào do tương tác mạnh mẽ của các nhóm -NH2 ở trên bề mặt PAMAM với màng tế
bào, dẫn đến sự phá vỡ màng tế bào, đồng nghĩa là diệt tế bào [44, 53, 79, 88].
Để giải quyết vấn đề này, các nhóm -NH2 trên bề mặt dendrimer PAMAM được biến
tính bằng các polymer tương hợp sinh học, làm triệt tiêu điện tích dương của các nhóm amine
trên hoặc ngăn chặn sự tiếp xúc giữa các nhóm -NH2 với màng tế bào giúp giảm độc tính, tạo
ra khả năng tương tác sinh học cao của chất mang, từ đó nâng cao hiệu quả mang thuốc và
điều trị [14, 35, 80, 83]. Ngoài ra việc biến tính bề mặt PAMAM cũng có thể làm tăng khả
năng mang thuốc của PAMAM.
Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất đề tài “Nghiên cứu biến tính dendrimer
polyamidoamine bằng polymer tương hợp sinh học (PEG và Pluronic) ứng dụng mang
thuốc”.
2. MỤC TIÊU CỦA LUẬN ÁN
Nghiên cứu tổng hợp chất mang thuốc trên cơ sở biến tính dendrimer PAMAM bằng
polymer tương hợp sinh học (Pluronic, Polyethylene glycol), với mục tiêu làm giảm độc tính
của PAMAM (tăng tính tương hợp sinh học) và tăng khả năng mang thuốc của PAMAM.

Trang 3

3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU LUẬN ÁN
1. Tổng hợp dendrimer PAMAM đến thế hệ G5.0 từ tâm ethylenediamine (EDA).
2. Nghiên cứu biến tính 4 thế hệ dendrimer PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 bằng các
Polyethylene glycol 4000 (PEG4K), Polyethylene glycol 6000 (PEG6K), Polyethylene glycol
10000 (PEG10K), Polyethylene glycol 12000 (PEG12K).
3. Nghiên cứu biến tính 4 thế hệ dendrimer PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 bằng các
Pluronic P123, Pluronic F68, Pluronic F127 và Pluronic F108.
4. Nghiên cứu tổng hợp dendrimer PAMAM G4.0-F127 với các tỷ lệ mol
PAMAM/F127 khác nhau.
5. Nghiên cứu hiệu quả nang hóa thuốc chống ung thư 5-Fluorouracil (5-FU) của các
chất mang nano PAMAM-PEG và PAMAM-Pluronic.
6. Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-Fluorouracil của hệ dendrimer PAMAM G4.0PEG6K/5-FU trong in vitro với môi trường đệm PBS (pH=7.4).
7. Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-Fluorouracil của hệ dendrimer PAMAM G4.0P123/5-FU và PAMAM G4.0-F127/5-FU trong in vitro với môi trường đệm PBS (pH=7.4).
8. Nghiên cứu độc tính tế bào ung thư vú MCF-7 và nguyên bào sợi (Fibroblast) đối với
các hệ chất mang nano dendrimer PAMAM, PAMAM-PEG, PAMAM-Pluronic, PAMAMPEG/5-FU và PAMAM-Pluronic/5FU.
4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN
- Tổng hợp và biến tính các thế hệ dendrimer PAMAM với các polymer tương hợp sinh
học PEG và Pluronic nhằm tạo ra hệ chất mang thuốc có tính tương hợp sinh học và khả năng
mang thuốc cao.
- Việc nghiên cứu biến tính PAMAM bằng các polymer PEG và Pluronic với các khối
lượng phân tử khác nhau làm cơ sở khoa học cho điều kiện phản ứng gắn kết số lượng mạch
PEG hay Pluronic khác nhau lên phân tử PAMAM tạo các hệ PAMAM biến tính có kích
thước nano khác nhau và có khả năng mang thuốc khác nhau, đặc biệt thuốc chống ung thư 5FU.
- Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm chế tạo ra hệ
mang thuốc “thông minh” hướng tới đích trên cơ sở PAMAM.
5. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
(1) Về mặt tổng hợp PAMAM-Pluronic:
- Đã nghiên cứu tổng hợp và biến tính thành công các dendrimer PAMAM thế hệ G2.0;

G3.0; G4.0; G5.0 với các Pluronic có khối lượng phân tử khác nhau (P123; F68; F127; F108).
- Trong đó, Pluronic mạch càng dài càng khó gắn kết với PAMAM hơn.

Trang 4


(2) Về mặt so sánh nang hóa thuốc trong chất mang PAMAM-PEG và PAMAMPluronic thì PAMAM G4.0-PEG và PAMAM G4.0-Pluronic có khả năng nang hóa
thuốc tốt hơn cả. Trong đó, PAMAM-Pluronic nang hóa thuốc kỵ nước 5-FU tốt hơn
PAMAM-PEG tương ứng.
(3) Khả năng mang thuốc của PAMAM-P123> PAMAM-F127> PAMAM-F108 >
PAMAM-F68 chịu ảnh hưởng giá trị HLB hơn là ảnh hưởng của mạch cấu trúc.
6. BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN
Luận án có 169 trang với 30 bảng, 102 hình, 8 đồ thị. Ngoài phần mở đầu (2 trang),
kết luận (3 trang), danh mục các công trình công bố (2 trang) và tài liệu tham khảo (14 trang),
phụ lục(15 trang), luận án được chia thành 3 chương như sau:
Chương 1: Tổng quan 41 trang
Chương 2: Thực nghiệm 26 trang
Chương 3: Kết quả và biện luận 66 trang

Trang 5


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
Giới thiệu về dendrimer và cụ thể dendrimer polyamidoamine (PAMAM), các phương
pháp tổng hợp, các tính chất và ứng dụng của chúng trong lĩnh vực y- dược.
Giới thiệu các phương pháp mang thuốc của PAMAM, ý nghĩa của việc mang thuốc,
đặc biệt mang thuốc chống ung thư (ví dụ 5-Flourouracil) bằng cách thụ động và chủ động.
Các phương pháp biến tính trên bề mặt của PAMAM bằng các tác nhân tương hợp sinh học
như polyethyleneglycol (PEG) hay Pluronic nhằm làm tăng tính tương hợp sinh học, tăng khả
năng mang thuốc của PAMAM.

Tổng quan một số công trình nghiên cứu trong lĩnh vực tổng hợp, biến tính PAMAM
làm hệ mang thuốc chống ung thư.
Nhìn chung trong những năm gần đây, có rất nhiều nghiên cứu về biến tính dendrimer
PAMAM bằng polymer tương hợp sinh học. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng
phương pháp hoạt hóa Pluronic, PEG bằng NPC và khống chế bằng tỷ lệ mol 1:1
(Pluronic/PEG : NPC) và sử dụng xúc tác (pyridine) hay dung môi (benzene) trong quá trình
phản ứng. Nhược điểm của phương pháp này là dễ xảy ra khả năng Pluronic hay PEG bị hoạt
hóa cả hai đầu bằng NPC và kết quả có thể Pluronic hay PEG liên kết cả 2 đầu vào PAMAM,
tạo lớp màng bao phủ bề mặt PAMAM và ngăn cản một phần thuốc không đi vào khoảng
trống trong cấu trúc PAMAM [67, 110, 124]. Mặt khác, chưa thấy công bố nào sử dụng một
hệ Pluronic có khối lượng phân tử khác nhau để biến tính chuỗi các thế hệ PAMAM, nhằm
xây dựng một hệ thống về sự ảnh hưởng cấu trúc dendrimer PAMAM các thế hệ, cấu trúc
Pluronic các loại đến mức độ biến tính, độc tính tế bào và hiệu quả nang hóa thuốc. Vì vậy
trong công trình nghiên cứu của luận án này, chúng tôi tập trung biến tính dendrimer
PAMAM thế hệ G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 bằng 4 loại PEG và 4 loại Pluronic có khối lượng
phân tử khác nhau để xây dựng tính hệ thống về mức độ biến tính và khả năng mang thuốc
của các nanopolymer.

Trang 6


CHƯƠNG 2. NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM
2.1. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ
Hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu của luận án là các hóa chất tinh khiết của các
hãng Sigma–Aldrich, Acros Organics (Mỹ), Merck (Đức), Amresco (Hàn Quốc).
Thiết bị và dụng cụ chính được sử dụng như máy đông khô chân không FDU-2100 Eyela
(Nhật Bản) tại Viện Công nghệ hóa học, Viện HLKH&CN VN; máy JEOL JEM 1400 (Nhật
Bản) chụp hình TEM, tại Trường Đại học Bách Khoa, TP. HCM; máy phân tích quang phổ
hồng ngoại FTIR Equinox 55 Bruker (Đức), tại Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng, Viện
HLKH&CN VN; máy sắc ký gel GPC Agilent 1260 (Hoa Kỳ); sắc ký lỏng HPLC đo bằng

máy Agilent 1260 (Hoa Kỳ); Phân tích dòng chảy tế bào đo tại PTN-SHPT- BM Di truyền tại
Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP. HCM.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Sử dụng phương pháp divergent để tổng hợp nano-dendrimer PAMAM các thế hệ.
Sử dụng phương pháp phổ 1H NMR, FTIR và GPC để xác định thành phần cấu trúc
và khối lượng phân tử của PAMAM các thế hệ và PAMAM biến tính với các polymer tương
hợp sinh học.
Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua TEM để khảo sát hình thái của sản phẩm
PAMAM-PEG và PAMAM-Pluronic.
Sử dụng các phương pháp nhuộm SRB, nhuộm MTT và nhuộm huỳnh quang
FDA/EB để đánh giá độc tính tế bào in vitro.
Sử dụng UV-Vis và HPLC để đánh giá khả năng mang và nhả thuốc của PAMAMPEG/5-FU và PAMAM-Pluronic/5-FU.
Sử dụng các kỹ thuật nuôi cấy tế bào để đánh giá tương hợp sinh học của các loại
hydrogel và hydrogel composite tổng hợp.
2.3. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
2.3.1. Tổng hợp PAMAM dendrimer đến thế hệ G5.0 từ core ethylenediamine (EDA)
Quá trình tổng hợp PAMAM dendrimer thế hệ G5.0 qua 12 giai đoạn, bắt đầu từ giai
đoạn tổng hợp thế hệ G -0.5 xuất phát bởi core ethylenediamine (EDA) lần lượt đến các thế
hệ ké tiếp G0, G0.5, G1.0, G1.5, G2.0, G2.5, G3.0, G3.5, G4.0, G4.5 và G5.0 (hình 2.1).

Trang 7


Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp PAMAM dendrimer các thế hệ
2.3.2. Tổng hợp biến tính dendrimer PAMAM các thế hệ G2.0; G3.0; G4.0; và G5.0 với các
PEG 4000 (PEG4K); PEG 6000 (PEG6K); PEG 10000 (PEG10K) và PEG 12000 (PEG12K).
Để kết nối PEG vào phân tử dendrimer PAMAM với các nhóm NH2 trên bề mặt thông
qua ba giai đoạn, cần thiết phải sử dụng pnitrophenyl chloroformate (NPC) và tyramine
(TA) tạo chất trung gian. Cấu trúc của sản phẩm trung gian NPC-PEG-NPC, NPC-PEG-TA
và của sản phẩm PAMAM-PEG được xác định qua các kết quả phân tích phổ 1H-NMR, FTIR,

GPC và hình ảnh TEM.
2.3.3. Tổng hợp biến tính dendrimer PAMAM các thế hệ G2.0; G3.0; G4.0; và G5.0 với các
Pluronic P123; F68; F127 và F108.
Tương tự PEG và cấu trúc của sản phẩm trung gian NPC-Plu-NPC, NPC-Plu-TA và
của sản phẩm PAMAM-Pluronic được xác định qua các kết quả phân tích phổ 1H-NMR,
FTIR, GPC và hình ảnh TEM.
2.3.4. Tổng hợp chất mang nano PAMAM G4.0-F127 với các tỷ lệ mol PAMAM G4.0: F127
khác nhau
2.3.5. Nang hóa thuốc chống ung thư 5-Fluorouracil (5-FU) lên các loại dendrimer PAMAMPEG và PAMAM-Pluronic

2.3.6. Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-FU của PAMAM-PEG/5-FU, PAMAM-Pluronic/5FU và 5-FU
2.3.7. Xác định độc tính tế bào của các chất mang nano
Độc tính các hệ chất mang nano được xác định lên tế bào ung thư vú MCF-7 và
nguyên bào sợi (Fibroblast).

Trang 8


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. TỔNG HỢP PAMAM TỪ THẾ HỆ G-0.5 ĐẾN THẾ HỆ G5.0
3.1.1. Xác định cấu trúc các dendrimer PAMAM dựa vào phổ khối lượng MS
Phổ khối lượng MS là phương pháp hiệu quả để xác định khối lượng phân tử các
polymer.

Hình 3.1. Phổ MS của dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G2.0
Phổ MS chứng minh sản phẩm từ G-0.5 đến G 2.0 đúng với cấu trúc sản phẩm, phù hợp
với lý thuyết (Hình 3.1 và bảng 3.1).
Bảng 3.1. Khối lượng phân tử các dendrimer PAMAM dựa vào phổ MS
Thế hệ
PAMAM

G-0.5
G0.0
G0.5
G1.0
G1.5
G2.0
G2.5
G3.0
G3.5
G4.0
G5.0

Lý thuyết
MS
MLT
MMS Hiệu số sai lệch (%)
C18H32O8N2
407
405
0,02
C22H48O4N10
517
517
0,00
C54H96O20N10
1212
1206
0,06
C62H128O12N26
1430

1428
0,02
C126H224O44N26
2823
2808
0,15
C142H288O28N58
3256
3259
0,03
C270H480O92N58
6045
*
C302H608O60N122
6909
*
C558H992O188N122
12489
*
C622H1248O124N250
14215
*
C1262H2528O252N506
28826
*
(*: Không xác định được)
CTPT

Trang 9

Tuy MS là phương pháp hiệu quả để xác định khối lượng phân tử, nhưng với các
dendrimer có khối lượng phân tử lớn từ G2.5 (M = 6049) trở đi thì MS không xác định được.

Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của nhóm Schwartz [98] và Hood [46]. Cho
nên 1H-NMR có thể là phương pháp hiệu quả để theo dõi, đánh giá khối lượng phân tử và độ
chuyển hóa của dendrimer và đặc biệt là các dendrimer [25, 29, 49, 58, 73, 112-113] và

đặc biệt là các dendrimer ở thế hệ (G) lớn [47, 69].
3.1.2. Xác định cấu trúc các dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-NMR
Độ dịch chuyển hóa học cho các proton đặc trưng trong dendrimer PAMAM đã được
ghi nhận theo nhiều báo cáo trước [38, 88-89, 98, 102, 106, 119, 124].
Trong kết quả phổ 1H-NMR tương ứng với proton điển hình trong cấu trúc dendrimer: CH2CH2N< (a)

tại

δH =

2.6 ppm; -CH2CH2CO- (b) tại

δH =

2.8-2.9 ppm; -

CH2CH2CONH- (c) tại δH = 2.3-2.4 ppm; -CH2CH2NH2 (d) tại δH = 2.7-2.8 ppm; CONHCH2CH2N- (e) tại δH = 3.2-3.4 ppm; -CH2CH2COOCH3- (g) tại δH = 2.4-2.5 ppm và
-COOCH3 (h) tại δH = 3,7 ppm. Dưới đây là kết quả 1H-NMR của dendrimer PAMAM các
thế hệ (Hình 3.2). [74]
1

H-NMR PAMAM G-0.5: tại δH = 2.497 ppm (a), δH = 2.756-2.784 ppm (b), δH = 2.386-

2.454 ppm (g) và δH = 3.628-3.702 ppm (h).
1

H-NMR PAMAM G0.0: tại δH = 2.561-2.573 ppm (a), δH = 2.771-2.815 ppm (b), δH

= 2.373-2.400 ppm (c), δH = 2.728-2.753 ppm (d) và δH = 3.246-3.336 ppm (e).
1

H-NMR PAMAM G0.5: tại δH = 2.536-2.560 ppm (a), δH = 2.730-2.783 ppm (b), δH

= 2.338-2.394 ppm (c), δH = 3.255-3.312 ppm (e), δH = 2.423-2.496 ppm (g) và δH = 3.6313.674 ppm (h).
1

H-NMR PAMAM G1.0: tại δH = 2.588-2.601 ppm (a), δH = 2.802-2.829 ppm (b), δH

= 2.375-2.402 ppm (c), δH = 2.733-2.758 ppm (d) và δH = 3.258-3.270 ppm (e).
1

H-NMR PAMAM G1.5: tại δH = 2.567-2.654 ppm (a), δH = 2.778-2.848 ppm (b), δH

= 2.391-2.419 ppm (c), δH = 3.266-3.368 ppm (e), δH = 2.472-2.499 ppm (g) và δH = 3.688
ppm (h).
1

H-NMR PAMAM G2.0: tại δH = 2.582-2.608 ppm (a), δH = 2.795-2.822 ppm (b), δH

= 2.368-2.394 ppm (c), δH = 2.699-2.741 ppm (d) và δH = 3.250-3.328 ppm (e).
1

H-NMR PAMAM G2.5: tại δH = 2.536-2.631 ppm (a), δH = 2.748-2.858 ppm (b), δH

= 2.390-2.417 ppm (c), δH = 3.261-3.331 ppm (e), δH = 2.473-2.499 ppm (g) và δH = 3.6833.688 ppm (h).
1

H-NMR PAMAM G3.0: tại δH = 2.605-2.618 ppm (a), δH = 2.804-2.831 ppm (b), δH

= 2.379-2.404 ppm (c), δH = 2.735-2.760 ppm (d) và δH = 3.261-3.334 ppm (e).

Trang 10


1

H-NMR PAMAM G3.5: tại δH = 2.570-2.634 ppm (a), δH = 2.780-2.846 ppm (b), δH

= 2.393-2.419 ppm (c), δH = 3.268-3.369 ppm (e), δH = 2.475-2.501 ppm (g) và δH = 3.6313.689 ppm (h).
1

H-NMR PAMAM G4.0: tại δH = 2.550 ppm (a), δH = 2.770 ppm (b), δH = 2.352 ppm

(c), δH = 2.746-2.758 ppm (d) và δH = 3.225-3.259 ppm (e).
1

H-NMR PAMAM G5.0: tại δH = 2.544 ppm (a), δH = 2.849 ppm (b), δH = 2.340 ppm

(c), δH = 2.761 ppm (d) và δH = 3.239-3.251 ppm (e).

Trang 11

Hình 3.2. Phổ 1H-NMR của dendrimer PAMAM thế hệ G-0.5 đến G5.0
Theo kết quả phổ 1H-NMR, các peak đặc trưng của proton tại vị trí (a) và (e) luôn xuất
hiện rõ ràng và không trùng lặp với bất kỳ peak khác, nên hai peak này được chọn sử dụng để
tính toán đánh giá dendrimer PAMAM theo công thức tính khối lượng phân tử dendrimer
thông qua phổ 1H-NMR như sau:

S

(e)

H(  C H 2  )

S

(e)

S

M ( NMR )

(a )

H(  C H 2  )

H
H

(e)

(  C H2  )
(a )

(  C H2 )

(a )

H(  C H 2  )

: Diện tích

peak của các proton ở vị trí (e) và (a)
xuất hiện trong phổ 1H-NMR.

H(  C H 2  )


 NMR .M (LT) 
 LT

, S

H

.M (LT)

(e)

(  C H2  )

,

H

(a )

(  C H2  )

: Tổng số

proton ở vị trí (e) và (a) tính trong công
thức phân tử dendrimer PAMAM.
MLT: Khối lượng phân tử của
dendrimer PAMAM theo lý thuyết được
tính dựa vào công thức phân tử.

Áp dụng công thức trên, khối lượng phân tử (KLPT) các dendrimer PAMAM được tính
toán dựa vào phổ 1H-NMR không khác nhiều so với KLPT tính dựa vào công thức phân tử
(Bảng 3.1).
Cụ thể:
Tính toán KLPT dendrimer PAMAM G-0.5: sử dụng giá trị diện tích peak của các
proton tại vị trí b và a trong phổ 1H-NMR (peak b và a là 8,000 và 4,000; tương ứng NMR =

Trang 12


8,000/4,000=2); tổng số proton tính trong công thức phân tử dendrimer PAMAM G-0.5 (peak
b và a là 8 và 4, tương ứng LT =8/4=2). MNMR được tính như sau:

Bảng 3.2. Khối lượng phân tử dựa trên 1H-NMR của PAMAM G-0.5 đến G5.0

Thế hệ
PAMAM
G-0.5
G0.0
G0.5
G1.0
G1.5
G2.0
G2.5
G3.0
G3.5
G4.0
G5.0

Lý thuyết
e

 H (CH

2

)

a

 H (CH

8 (H ở vị trí b)
8
8

24
24
56
56
120
120
240
504

4
4
12
12
28
28
60
60
124
120
252

2

)

1H-NMR

LT

MLT

2
2
0.67
2
0.86
2
0.93
2
0.97
2
2

407
517
1212
1430
2823
3256
6045
6909
12489
14215
28826

NMR MNMR
2,00
1,99
0,67
1,88

0,85
1,88
0,88
1,89
0,93
1,91
1,95

407
514
1212
1344
2800
3061
5720
6529
11974
13575
28105

Hiệu số sai
lệch (%)
0,00
0,03
0,00
0,87
0,23
1,95
3,25
3,80

5,15
6,40
7,21

Khối lượng phân tử của PAMAM được tính trên phổ 1H-NMR thường nhỏ hơn từ 0-7%
so với lý thuyết. Điều này cho thấy khối lượng dendrimer PAMAM tính được từ phổ 1HNMR có độ sai lệch không lớn nên có thể dùng để xác định KLPT dendrimer PAMAM có
trọng lượng phân tử lớn hơn trong khi phương pháp đo MS không xác định được.
Phân tử PAMAM các thế hệ ≤ G5.0 đã được tổng hợp thành công và có cấu trúc tương
đối hoàn chỉnh và ổn định nên có thể ứng dụng trong lĩnh vực y-dược.
3.2. TỔNG HỢP PAMAM-PEG
3.2.1. Kết quả phân tích 1H-NMR của sản phẩm trung gian NPC-PEG-NPC, NPC-PEGTA, PAMAM và PAMAM-PEG
Các hệ chất mang PAMAM-PEG (PAMAM G2.0-PEG4K, G2.0-PEG6K, G2.0PEG10K, G2.0-PEG12K, G3.0-PEG4K, G3.0-PEG6K, G3.0-PEG10K, G3.0-PEG12K, G4.0PEG4K, G4.0-PEG6K, G4.0-PEG10K, G4.0-PEG12K, G5.0-PEG4K, G5.0-PEG6K, G5.0PEG10K, G5.0-PEG12K) được tổng hợp thông qua ba giai đoạn theo sơ đồ sau:

Trang 13


Hình 3.3. Sơ đồ tổng hợp NPC-PEG-NPC (a), NPC-PEG-TA (b), PAMAM-PEG (c)
Phản ứng biến tính PAMAM (G2.0, G3.0, G4.0, G5.0) với nhiều PEG độ dài mạch
carbon khác nhau (PEG4K, PEG6K, PEG10K, PEG12K) có các bước phản ứng, các phổ đồ
1

H-NMR tương tự nhau, nên ở đây chúng tôi sử dụng phổ đồ của phản ứng PAMAM với

PEG4K làm ví dụ, còn phổ đồ của các PEG còn lại sẽ có ở phần phụ lục 4, 5, 6.
Kết quả phổ 1H-NMR của NPC-PEG-NPC, NPC-PEG-TA, PAMAM-PEG đo trong
dung môi CDCl3.
Giai đoạn 1: Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc của NPC-PEG-NPC được thể hiện
qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân (hình 3.4 và phụ lục 4). Phổ đồ có các tín hiệu của các proton
có trong PEG như sau: tín hiệu δH = 3,40-3,79 ppm là proton của nhóm methylene (-OCH2CH2O-) trên EO và tín hiệu của proton methylene liên kết trực tiếp với nhóm carbonate ở δH
= 4,44 ppm (-CH2-O-NPC). Sự xuất hiện của hai tín hiệu đôi ở δH = 7,39 ppm và δH = 8,29

ppm là hai tín hiệu đặc trưng của proton nhóm NPC (-CH=CH-). Độ hoạt hóa PEG đạt trên
90% được tính từ tỷ lệ tích phân của proton thơm (NPC) và proton methylene (PEG). Kết quả
này phù hợp với các nghiên cứu Park [64] và Nguyen [26].

Hình 3.4. Phổ 1H-NMR của NPC-PEG4K- NPC
Phổ đồ 1H-NMR của các NPC-PEG-NPC khác được thể hiện ở phụ lục 4 và cũng cho
kết quả tương tự như ở phổ đồ 1H-NMR của NPC-PEG4K-NPC.

Trang 14


Giai đoạn 2: Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc của NPC-PEG-TA được thể hiện qua phổ
cộng hưởng từ hạt nhân (hình 3.5 và phụ lục 5). Phổ đồ có các tín hiệu của các proton có
trong PEG như sau: tín hiệu δH = 3,40-3,79 ppm là proton của nhóm methylene (-OCH2CH2O-) trên EO của PEG. Proton methylene liên kết trực tiếp với nhóm carbonate của NPC ở
δH = 4,44 ppm (-CH2-O-NPC). Ngoài ra, còn xuất hiện thêm proton methylene liên kết trực
tiếp với nhóm carbonate của TA ở δH = 4,2 ppm (-CH2-O-TA). Kết quả này phù hợp với
nghiên cứu của Park [64] và Nguyen [26].

Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của NPC-PEG4K-TA
Sự xuất hiện của hai tín hiệu đôi ở δH=7,40 ppm và δH=8.29 ppm là hai tín hiệu đặc
trưng của proton thơm của NPC (-CH=CH-). Phổ đồ xuất hiện tín hiệu ở δH = 6,78 ppm và
δH = 7,02 ppm là tín hiệu proton liên hợp vòng thơm (-CH=CH-) của nhóm tyramine. Kết
quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyen [26]. Khoảng 50% gốc NPC đã được thay thế
bởi TA. Kết quả này thu được từ phép tính tỷ lệ tích phân của proton trên NPC và proton của
TA.
Phổ đồ 1H-NMR của các NPC-PEG-TA khác được thể hiện ở Phụ lục 5 và cũng cho kết
quả tương tự như ở phổ đồ 1H-NMR của NPC-PEG4K-TA.
Giai đoạn 3: Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc của PAMAM và PAMAM-PEG
được thể hiện qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân (hình 3.2, hình 3.6 và phụ lục 6). Các
PAMAM-PEG sau khi tổng hợp đã thẩm tách bằng màng MWCO 3 ngày. Phổ đồ có tín hiệu

các proton của PAMAM trong PAMAM-PEG (hình 3.6 và phụ lục 6) như: -CH2CH2N< tại
δH = 2.6 ppm; -CH2CH2CO- tại δH = 2.8 ppm; -CONHCH2CH2N- tại δH = 3.3-3.4 ppm.
Các tín hiệu này giống với tín hiệu các proton của PAMAM (hình 3.2). Kết quả này phù hợp
với các nghiên cứu của Xiang Wang [119], Tran [78] và Zhuojun Gu [124].

Trang 15


Hình 3.6. Phổ 1H-NMR của PAMAM G4.0-PEG4K
Ngoài ra, trên phổ đồ hình 3.6 và phụ lục 6, không còn thấy xuất hiện hai tín hiệu đặc
trưng proton thơm của NPC (-CH=CH-) ở δH=7,40 ppm và δH=8.29 ppm; chỉ thấy có sự
xuất hiện của hai tín hiệu đôi tại δH = 6,78 ppm và δH = 7,02 ppm là các tín hiệu đặc trưng
proton liên hợp vòng thơm (-CH=CH-) của nhóm tyramine. Kết quả này phù hợp với nghiên
cứu của Nguyen [26].
Phổ đồ 1H-NMR của các PAMAM-PEG khác được thể hiện ở phụ lục 6 và cũng cho kết
quả tương tự như ở phổ đồ 1H-NMR của PAMAM G4.0-PEG4K.
Điều này cho thấy sự thành công trong tổng hợp PAMAM-PEG. Sự thành công này sẽ
được khẳng định thêm qua các kết quả FTIR, GPC và TEM.
3.2.2. Kết quả phân tích FTIR của PAMAM và PAMAM-PEG
Dendrimer PAMAM và PAMAM-PEG có thể được xác định rõ ràng bởi quang phổ
hồng ngoại FTIR.

Hình 3.7. Phổ FTIR của PAMAM G4.0 (a) và PAMAM G4.0-PEG4K(b)

Trang 16


Kết quả FTIR cho thấy độ chuyển dịch hóa học tại 3287 cm-1 là dao động đặc trưng cho
nhóm amine bậc 1 (-NH2) và amine bậc 2 (-NH-) của PAMAM. Đồng thời tín hiệu này cũng
xuất hiện trong quang phổ hồng ngoại của PAMAM-PEG với độ chuyển dịch hóa học 3423

cm-1, tín hiệu này đã được thay đổi mạnh, điều này phần nào cho thấy số lượng nhóm –NH2
đã giảm đáng kể. Bên cạnh đó, hình 3.7.a và 3.7.b xuất hiện tín hiệu peak 2942 cm-1 (hình
3.19.a) và 2888 cm-1- dao động hóa trị của nhóm methylene (-CH2-), và nhóm amide
(HNC=O) được thấy tại tín hiệu 1644 cm-1 (hình 3.7.a) và 1648 cm-1 (hình 3.7.b). Ngoài ra
còn xuất hiện tín hiệu mới trong phổ FTIR của PAMAM G4.0-PEG4K tại độ chuyển dịch
1113 cm-1 đặc trưng cho nhóm C-O-C của PEG [7].
Kết quả FTIR và 1H-NMR cho thấy NPC-PEG-TA đã được liên hợp với dendrimer
PAMAM.
Phổ FTIR của PAMAM-PEG khác được thể hiện ở phụ lục 7 và cũng cho kết quả tương
tự như ở phổ IR của PAMAM G4.0-PEG4K.
3.2.3. Kết quả GPC của PAMAM-PEG
Sự thành công trong quá trình tổng hợp PAMAM-PEG cũng đã được khẳng định bằng
phép đo GPC. Trong đó, số nhóm liên hợp và tỷ lệ liên hợp được tính toán tương đối theo các
công thức sau:

Tính toán trên cơ sở kết quả GPC của các sản phẩm PAMAM-PEG được thống kê trên
đồ thị 3.1 về mức độ và tỷ lệ biến tính của PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 với 4 loại
polymer có khối lượng phân tử khác nhau PEG 4K, PEG 6K, PEG 10K, PEG 12K.

Đồ thị 3.1. Tỷ lệ liên hợp của PAMAM-PEG

Trang 17


Kết quả đồ thị 3.1 đã cho thấy các dendrimer PAMAM G4.0 có khả năng liên hợp cao
hơn dendrimer PAMAM G2.0, G3.0 và G5.0. Mặt khác, trong cùng một thế hệ dendrimer
PAMAM thì mức độ liên hợp của các PEG với PAMAM giảm dần theo sự tăng chiều dài
mạch phân tử PEG (tăng khối lượng phân tử). Ngoài ra, đối với các PEG có khối lượng phân
tử khác nhau thì các PEG có khối lượng phân tử càng lớn thì cấu trúc mạch phân tử càng dài,
càng cồng kềnh gây cản trở không gian do đó khả năng liên hợp với các PAMAM cũng giảm

theo sự tăng chiều dài mạch carbon trong phân tử PEG.
3.2.4. Kết quả TEM của PAMAM và PAMAM-PEG
Các phân tử PAMAM và PAMAM-PEG có thể được quan sát thấy rõ trong TEM. Kết quả
TEM cho thấy kích thước của PAMAM G4.0 là chỉ khoảng 4,5 nm (Hình 3.8.a), trong khi kích
thước của PAMAM-PEG là 70-100 nm (Hình 3.8.b và hình 3.8.c).

(a)

(b)

(c)

Hình 3.8. Hình ảnh TEM của PAMAM G4.0 (a), PAMAM G4.0-PEG4K (b)
và PAMAM G4.0-PEG6K (c)
3.3. TỔNG HỢP PAMAM-PLURONIC
Trong tổng hợp PAMAM-Pluronic các thành phần cấu trúc của sản phẩm trung gian
NPC-Plu-NPC, NPC-Plu-TA, PAMAM và PAMAM-Pluronic được xác định qua các kết quả
phân tích phổ 1H-NMR, FTIR, GPC và TEM.
3.3.1. Qui trình tổng hợp các sản phẩm trung gian NPC-Plu-NPC, NPC-Plu-TA,
PAMAM và sản phẩm PAMAM-Pluronic
Qui trình tổng hợp PAMAM-Pluronic được thực hiện theo 3 giai đoạn (tương tự như qui
trình tổng hợp PAMAM-PEG):

Hình 3.9. Sơ đồ tổng hợp NPC-Plu-NPC (a), NPC-Plu-TA (b) và PAMAM-Pluronic (c)

Trang 18


Phổ 1H-NMR NPC-Plu-NPC, NPC-Plu-TA, PAMAM và PAMAM-Plu đo trong dung
môi CDCl3. Kết quả phân tích 1H-NMR của sản phẩm trung gian NPC-Plu-NPC, NPC-PluTA, PAMAM và PAMAM-Pluronic (giống tại các sản phẩm PAMAM-PEG trên) cho thấy

sản phẩm đã được tổng hợp và có cấu trúc như dự đoán.
Kết quả này sẽ được khẳng định thêm qua các kết quả FTIR, GPC và TEM.
3.3.2. Tính toán và xác định độ chuyển hóa của các quá trình biến tính gắn các mạch
Pluronic lên PAMAM
Kết quả biến tính của các dendrimer PAMAM-Pluronic cũng cho kết quả tương tự như
PAMAM-PEG. Thống kê kết quả GPC để đánh giá về mức độ và tỷ lệ biến tính của PAMAM
G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 với 4 loại Pluronic có khối lượng phân tử khác nhau Pluronic P123,
Pluronic F68, Pluronic F127 và Pluronic F108 được thể hiện trên đồ thị 3.2
Kết quả đồ thị 3.2 đã cho thấy các dendrimer PAMAM G4.0 có khả năng liên hợp cao
hơn dendrimer PAMAM G2.0, G3.0 và G5.0. Mặt khác, trong cùng một thế hệ dendrimer
PAMAM thì mức độ liên hợp của các Pluronic với PAMAM giảm dần theo sự tăng chiều dài
mạch phân tử Pluronic (tăng khối lượng phân tử). Đối với các Pluronic có khối lượng phân tử
khác nhau thì các Pluronic có khối lượng phân tử càng lớn thì cấu trúc mạch phân tử càng dài,
càng cồng kềnh gây cản trở không gian do đó khả năng liên hợp với các PAMAM cũng giảm
theo sự tăng chiều dài mạch carbon trong phân tử Pluronic.

Đồ thị 3.2. Tỷ lệ liên hợp của PAMAM-Pluronic
3.3.3. Kết quả TEM của PAMAM và PAMAM-Pluronic
Kết quả TEM cho thấy kích thước của PAMAM G4.0 là chỉ khoảng 4,5 nm (Hình
3.8.a), Pluronic F127 15 nm (hình 3.10.a). Trong khi đó, kích thước của PAMAM-Pluronic là
tăng đáng kể từ 60-150 nm (hình 3.10.b, hình 3.10.c, hình 3.10.d và hình 3.10.e), cụ thể:
PAMAM-P123 có kích thước phân tử từ 60-100 nm, PAMAM-F68 90-130 nm, PAMAM-

Trang 19


F127 100-150 nm và PAMAM-F108 120-180 nm. Kích thước này cũng rất phù hợp cho việc
mang thuốc, đặc biệt mang thuốc chống ung thư.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

Hình 3.10. Hình ảnh TEM của Pluronic F127 (a), PAMAM G4.0-P123 (b),
PAMAM G4.0-F68 (c), PAMAM G4.0-F127 (d) và PAMAM G4.0-F108 (e)
3.4. TỔNG HỢP CHẤT MANG NANO PAMAM G4-F127 VỚI CÁC TỶ LỆ MOL
KHÁC NHAU
Quá trình biến tính PAMAM G4.0 bằng Pluronic F127 cũng được khảo sát với các tỷ lệ
mol khác nhau (tỷ lệ mol PAMAM : Pluronic F127 = 1:8 ; 1:16; 1:32; 1:64). Kết quả cho

thấy khả năng liên hợp của PAMAM G4.0 và Pluronic F127 tăng tương ứng với việc
tăng tỷ lệ mol phản ứng: 25% (với tỷ lệ 1:8) < 31,25% (với tỷ lệ 1:16) < 34,38% (với
tỷ lệ 1:32) < 42,19% (với tỷ lệ 1:64).
3.5. KHẢ NĂNG MANG THUỐC CHỐNG UNG THƯ 5-FLUOROURACIL CỦA CÁC
CHẤT MANG NANO PAMAM BIẾN TÍNH
3.5.1. Phương pháp tính toán, xác định khả năng mang thuốc của PAMAM biến tính
Để đánh giá hiệu quả mang thuốc, dựa vào kết quả HPLC nhằm xác định gián tiếp
lượng thuốc 5-FU được mang trong các chất mang nano (PAMAM, PAMAM-PEG,
PAMAM-Pluronic). Lượng 5-FU tự do, không được mang trong vật liệu chất mang nano
được tính toán trực tiếp dựa trên phương trình đường chuẩn Y = 33,101x + 27,857 (R2 =
0,9993) được xây dựng với 5 nồng độ khác nhau, từ 20-100µg.mL-1 (phụ lục 1).
Tỷ lệ hàm lượng 5-FU nang hóa trong các chất mang (EE% và DL%) được xác định
gián tiếp thông qua kết quả đo HPLC và công thức sau, trong đó Wtotal 5-FU là lượng thuốc 5FU ban đầu và lượng 5-FU không được tải trong chất mang là Wfree-5-FU [9, 68].

Trang 20


Các dendrimer PAMAM G2.0, G3.0, G4.0 và G5.0 sau khi được biến tính bởi các PEG
có khối lượng phân tử khác nhau (PEG 4K, PEG 6K, PEG 10K, PEG 12K) được sử dụng để
nang hóa thuốc kỵ nước 5-FU. Tuy nhiên, với sự ảnh hưởng cấu trúc của các thế hệ dendrimer
PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 và các loại PEG có mạch phân tử dài ngắn khác nhau đã tác
động lên hiệu quả mang thuốc.
3.5.2. Khảo sát khả năng mang thuốc của PAMAM-PEG
Thống kê kết quả HPLC thu được trong đồ thị 3.3 về hiệu quả mang thuốc kỵ nước 5FU của các hệ chất mang PAMAM-PEG:

Đồ thị 3.3. Hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU của các PAMAM-PEG
Các PAMAM G4.0-PEG có hiệu quả mang thuốc cao nhất. Tuy nhiên, trong cùng một thế
hệ dendrimer PAMAM thì chiều dài của mạch PEG ảnh hưởng không nhiều tới khả năng mang
thuốc 5-FU và các PEG có khối lượng phân tử càng lớn thì càng cồng kềnh gây cản trở không
gian làm các thuốc 5-FU khó đi vào các khoảng trống bên trong cấu trúc dendrimer PAMAM
nên hiệu quả mang thuốc giảm theo sự tăng chiều dài mạch carbon trong phân tử PEG.
3.5.3. Khảo sát khả năng mang thuốc của PAMAM-Pluronic
Thống kê kết quả HPLC thu được trong đồ thị 3.4 về hiệu quả mang thuốc của các chất
mang nano PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 sau khi được biến tính với 4 loại Pluronic có
khối lượng phân tử khác nhau Pluronic P123 (5800 Da), Pluronic F68 (8400 Da), Pluronic
F127 (12600 Da) và Pluronic F108 (14600 Da).

Trang 21


Đồ thị 3.4. Hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-Pluronic
Đồ thị 3.4 cho thấy PAMAM-Pluronic thế hệ G4.0 có khả năng mang thuốc 5-FU cao
nhất. Các Pluronic có cấu trúc mạch phân tử càng dài, càng cồng kềnh gây cản trở không gian
làm cản trở khả năng mang thuốc của các PAMAM-Pluronic. Ngoài ra, các loại Pluronic có giá

trị HLB (là tỉ lệ giữa nhóm ái nước và nhóm ái dầu trên một phân tử) khác nhau thì hiệu quả
mang thuốc cũng khác nhau. Pluronic nào có nhóm kị nước nhiều hơn (tức giá trị HLB cao hơn)
thì sẽ có khả năng mang thuốc kỵ nước 5-FU tốt hơn.
Và cũng chính vì cấu trúc phân tử các Pluronic ngoài nhóm EO (ưa nước) còn có nhóm
PO (kỵ nước), trong khi đó các phân tử PEG chỉ gồm các nhóm EO ưa nước nên các PAMAMPluronic mang thuốc kỵ nước 5-FU tốt hơn các PAMAM-PEG.
3.6. KHẢO SÁT TỐC ĐỘ GIẢI PHÓNG THUỐC 5-FU CỦA PAMAM-PEG/5-FU,
PAMAM-PLURONIC/5-FU VÀ 5-FU
Trong môi trường PSB (pH=7.4), PAMAM-PEG và PAMAM-Pluronic có tốc độ giải
phóng thuốc từ từ, có sự kiểm soát hơn so với 5-FU đối chứng. Kết quả khảo sát tốc độ giải
phóng thuốc 5-FU (thực hiện 3 lần) của PAMAM-PEG/5-FU và PAMAM-Pluronic/5-FU chỉ
khoảng 22% sau 96 giờ so với mẫu 5-FU đối chứng giải phóng trên 90% trong giờ đầu.
3.7. KẾT QUẢ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA HỆ CHẤT NANO DẪN TRUYỀN 5-FU
Tính tương hợp sinh học của hệ chất mang nano được đánh giá trên cơ sở thử nghiệm
hoạt tính gây độc lên tế bào ung thư vú MCF-7 và dòng nguyên bào sợi (Fibroblast).
3.7.1. Kết quả độc tính tế bào ung thư vú MCF-7 của hệ chất nano dẫn truyền 5-FU
Kết quả độc tính tế bào ung thư vú MCF-7 của hệ chất mang nano được thực hiện bằng
phương pháp nhuộm SRB. Kết quả sau 48 giờ chỉ ra trong bảng 3.3 cho thấy tại nồng độ 100
μg/ml: PAMAM khi chưa biến tính (PAMAM G4.0) gây độc tế bào, các PAMAM sau khi
biến tính bằng PEG hay Pluronic (PAMAM G4.0-PEG và PAMAM G4.0-Pluronic) làm giảm
đáng kể khả năng gây độc tế bào của PAMAM.

Trang 22


Bảng 3.3. Kết quả độc tính tế bào MCF-7 theo phương pháp nhuộm SRB
Mẫu
Nồng độ (μg/ ml) Hoạt động kháng sinh (Tăng trưởng tế bào %)
PAMAM G4.0
100
Inhibited 35,49 ± 3.93%

G4.0-PEG4K
100
Inhibited -1,10 ± 4,32%
G4.0-PEG6K
100
Inhibited -2,00 ± 2,05%
G4.0-PEG10K
100
Inhibited -4,09 ± 8,13%
G4.0-PEG12K
100
Inhibited -12,75 ± 3,54%
G4.0-P123
100
Inhibited -1,27 ± 4,55%
G4.0-F68
100
Inhibited 2,41 ± 2,99%
G4.0-F127
100
Inhibited 4,20 ± 4,15%
G4.0-F108
100
Inhibited 1,54 ± 3,97%
Ngoài ra, các PAMAM sau khi biến tính bằng PEG hay Pluronic được nang hóa thuốc
5-FU (PAMAM G4.0-PEG6K/5-FU, PAMAM G4.0-P123/5-FU và PAMAM G4.0-F127/5FU) có khả năng gây độc tế bào mạnh với nồng độ gây độc tế bào IC50 cao gấp 2-3 lần so với
5-FU đối chứng.

Đồ thị 3.5. Kết quả gây độc tế bào IC50 của các chất mang nano
3.7.2. Kết quả gây độc nguyên bào sợi (Fibroblast) của hệ chất nano dẫn truyền 5-FU

a. Kết quả theo phương pháp nhuộm MTT
Kết quả gây độc nguyên bào sợi (Fibroblast) bằng phương pháp nhuộm MTT được thể
hiện trên đồ thị 3.6.

Đồ thị 3.6. Kết quả gây độc nguyên bào sợi theo phương pháp nhuộm MTT

Trang 23


b. Kết quả theo phương pháp nhuộm huỳnh quang FDA/EB
Kết quả gây độc nguyên bào sợi (Fibroblast) của hệ chất mang nano (PAMAM G4.0,
G4.0-PEG6K, G4.0-P123 và G4.0-F68) cũng được khẳng định thêm bằng phương pháp
nhuộm huỳnh quang FDA/EB được thể hiện trên hình 3.11. Trong đó, hình nhuộm FDA (màu
xanh lá) đặc trưng tế bào sống và hình nhuộm EB (màu đỏ).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(l)

(m)

Hình 3.11. Kết quả gây độc nguyên bào sợi theo phương pháp nhuộm huỳnh quang FDA/EB
Kết quả trên đồ thị 3.6 và hình 3.11 đánh giá về khả năng tăng trưởng nguyên bào sợi
cũng cho thấy sau 24 giờ và 48 giờ. Mẫu đối chứng (control) sống và phát triển ổn định trong
môi trường nuôi cấy. Các mẫu G4.0-PEG6K (hình 3.11.e-f), G4.0-P123 (hình 3.11.g-h) và
G4.0-F68 (hình 3.11.l-m) vẫn thể hiện sự tăng trưởng mạnh về số lượng tế bào, với tỷ lệ tế
bào chết và hình thái tương đương so với mẫu đối chứng.
Từ kết quả thử hoạt tính gây độc của các hệ chất mang nano lên tế bào ung thư MCF-7
(bảng 3.3, đồ thị 3.5) và nguyên bào sợi (đồ thị 3.6, hình 3.11) cho thấy rằng PAMAM khi
chưa biến tính (PAMAM G4.0) gây độc tế bào, các PAMAM sau khi biến tính bằng PEG hay
Pluronic (G4.0-PEG, G4.0-Pluronic) không gây độc tế bào (có tính tương hợp sinh học).

Trang 24


KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu hoàn thành nội dung luận án, đã rút ra những kết luận sau:
(1)

Đã tổng hợp thành công dendrimer PAMAM đến thế hệ G5.0. Sản phẩm

dendrimer PAMAM các thế hệ từ G-0.5 đến G5.0 được xác định cấu trúc bằng phương pháp
MS và 1H-NMR và công thức tính toán trên cơ sở dữ liệu của phổ 1H NMR.
(2)

Đã biến tính thành công dendrimer PAMAM thế hệ G2.0, G3.0, G4.0 và G5.0

với polymer tương hợp sinh học PEG có chiều dài mạch khác nhau (PEG4K, PEG6K,
PEG10K và PEG12K). Khối lượng phân tử của sản phẩm dendrimer PAMAM-PEG và số
lượng nhánh polymer PEG gắn trên PAMAM được xác định và tính toán bằng 1H-NMR và
GPC.
(3)

Đã biến tính thành công dendrimer PAMAM thế hệ G2.0, G3.0, G4.0 và G5.0

với polymer tương hợp sinh học Pluronic có cấu trúc mạch khác nhau (P123, F68, F108 và
F127). Khối lượng phân tử của các sản phẩm dendrimer PAMAM-Pluronic và số lượng nhánh
polymer Pluronic gắn trên PAMAM được xác định và tính toán bằng 1H-NMR và GPC.
(4)

Trong dendrimer PAMAM các thế hệ G2.0, G3.0, G4.0 và G5.0 thì PAMAM

G4.0 biến tính tốt nhất (có số lượng nhánh polymer gắn lên PAMAM nhiều nhất) cả khi biến
tính với các PEG hay các Pluronic. Ngoài ra, mạch của polymer (cả PEG lẫn Pluronic) càng
dài thì càng khó biến tính (số lượng nhánh polymer gắn lên PAMAM đều giảm).
(5)

Dendrimer PAMAM với các nhóm amine trên bề mặt có khả năng gây độc tế

bào, tuy nhiên tất cả các sản phẩm biến tính PAMAM-PEG và PAMAM-Pluronic đều không
gây độc tế bào (tế bào bệnh và tế bào lành), trong đó PAMAM-PEG có tính tương hợp sinh
học tốt hơn PAMAM-Pluronic.
(6)

PEG không có khả năng nang hóa thuốc 5-FU (chỉ nang hóa 0,15%), Pluronic

nang hóa rất ít (18,75%), còn dendrimer các thế hệ G2.0, G3.0, G4.0 và G5.0 nang hóa được
từ 21,90% đến 42,35%, trong đó PAMAM thế hệ G4.0 nang hóa được nhiều nhất. Tuy nhiên,
hệ chất mang PAMAM-PEG nang hóa được nhiều thuốc 5-FU hơn hẳn (từ 31,05% đến
66,35%) trong đó PAMAM-PEG thế hệ G4.0 nang hóa được nhiều hơn cả, còn PAMAMPluronic thì nang hóa được nhiều hơn nữa (từ 38,05% đến 76,25%) trong đó PAMAMPluronic thế hệ G4.0 cũng nang hóa được nhiều nhất.
Ngoài ra, so sánh giữa các PAMAM-PEG và PAMAM-Pluronic tương ứng thì
PAMAM-Pluronic đều nang hóa thuốc kỵ nước 5-FU tốt hơn.
(7)

Dendrimer PAMAM-PEG hay PAMAM-Pluronic sau khi nang hóa thuốc 5-

FU thì có tốc độ giải phóng thuốc chậm hơn rất nhiều so với mẫu 5-FU đối chứng.

Trang 25