Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn trong dạ cỏ để ứng dụng chăn nuôi gia súc nhai lại và cung cấp cho quá trình lên men cồn từ bã mía

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

VÕ VĂN SONG TOÀN

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN
TRONG DẠ CỎ ĐỂ ỨNG DỤNG CHĂN NUÔI
GIA SÖC NHAI LẠI VÀ CUNG CẤP CHO
QUÁ TRÌNH LÊN MEN CỒN TỪ BÃ MÍA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NGÀNH VI SINH VẬT HỌC
MÃ NGÀNH: 62 42 01 07

Cần Thơ, 2015


BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

VÕ VĂN SONG TOÀN

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN
TRONG DẠ CỎ ĐỂ ỨNG DỤNG CHĂN NUÔI
GIA SÚC NHAI LẠI VÀ CUNG CẤP CHO
QUÁ TRÌNH LÊN MEN CỒN TỪ BÃ MÍA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NGÀNH VI SINH VẬT HỌC
MÃ CHUYÊN NGÀNH: 62 42 01 07

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
PGS. TS. TRẦN NHÂN DŨNG
PGS. TS. HỒ QUẢNG ĐỒ

Cần Thơ, 2015


TRANG XÁC NHẬN CỦA NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
Luận án “phân lập, tuyển chọn vi khuẩn trong dạ cỏ để ứng dụng
chăn nuôi gia súc nhai lại và cung cấp cho quá trình lên men cồn từ bã
mía” do nghiên cứu sinh Võ Văn Song Toàn thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của
PGS. TS. Trần Nhân Dũng và PGS. TS. Hồ Quảng Đồ. Luận án đã đƣợc
nghiên cứu sinh nghiêm túc sửa chữa theo góp ý của hai (02) phản biện độc
lập.
Tác giả luận án

Võ Văn Song Toàn

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học chính

PGS. TS TRẦN NHÂN DŨNG

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học phụ

PGS. TS. HỒ QUẢNG ĐỒ


LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn thầy PGS. TS. Trần Nhân Dũng và thầy PGS.
TS. Hồ Quảng Đồ, ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn khoa học, tƣ vấn thiết kế các

thí nghiệm, hƣớng dẫn cách tiếp cận các kiến thức khoa học trong lĩnh vực
nghiên cứu từ đó giúp tôi hoàn thành luận án nghiên cứu sinh. Xin chân thành
cảm ơn và tri ân sâu sắc đến hai thầy.
Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Cần Thơ, Ban
Lãnh Đạo Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Khoa Nông
nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Khoa Sau Đại Học, Phòng Quản Lý Khoa Học
và các phòng ban chức năng khác của Trƣờng, Viện đã tạo điều kiện thuận lợi
trong thực hiện các thủ tục, hỗ trợ kinh phí, trang thiết bị, … cho các nghiên
cứu của Luận án.
Chân thành cảm ơn quý thầy cô, các anh chị, các bạn đồng nghiệp thuộc
Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học đã giúp đỡ, động viên và
tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Xin cảm ơn thầy Nguyễn Văn Biện, anh Nguyễn Văn Hùng, anh Nguyễn
Văn Việt và em Võ Phƣơng Ghil đã hỗ trợ kỹ thuật, chuyên môn trong việc
chăm sóc, nuôi dƣỡng bò để triển khai các thí nghiệm in vitro và in vivo. Đồng
thời, tôi cũng chân thành gửi lời cảm ơn đến các em sinh viên đã cộng tác
trong suốt thời gian thực hiện luận án.
Sau cùng tôi xin đƣợc cảm ơn cha, mẹ, vợ, con và những ngƣời thân
trong gia đình đã luôn động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Xin chân thành cảm ơn.
VÕ VĂN SONG TOÀN


TÓM TẮT
Đề tài luận án “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn trong dạ cỏ để ứng dụng
chăn nuôi gia súc nhai lại và cung cấp cho quá trình lên men cồn từ bã mía” đã
đƣợc thực hiện trong thời gian 3 năm 9 tháng (11/2010 - 8/2014), nhằm mục
tiêu i) Tuyển chọn tổ hợp vi khuẩn dạ cỏ (VKDC) ứng dụng trong chăn nuôi
gia súc nhai lại và ii) Tuyển chọn tổ hợp VKDC-nấm men để lên men ethanol

từ nguyên liệu bã mía.
Kết quả đã phân lập đƣợc 121 dòng VKDC trong đó tế bào vi khuẩn có
dạng que ngắn chiếm ƣu thế bên cạnh tế bào que dài và hình cầu. Qua quá
trình tuyển chọn, tổ hợp VKDC bò bao gồm 4 dòng VKDC trong đó dòng
VKDC bò BM13, đƣợc xác định đồng hình với Achromobacter xylosoxidans
BL6 (China) ở mức 91% cùng với đặc điểm dạng que ngắn, Gram âm, dƣơng
tính catalase. Trong khi đó dòng VKDC bò BM21, BM49 và VKDC dê DD9
tƣơng đồng với Bacillus subtilis strain S2O (Cameroon), Uncultured Bacillus
sp. Filt.171 và Bacillus subtilis RC24 ở mức 94% và đều có dạng que ngắn,
Gram dƣơng, catalase dƣơng tính; Đồng thời enzym endoglucanse của 4 dòng
vi khuẩn này đƣợc phát hiện có khối lƣợng phân tử trong khoảng 72,8 - 34
kDa trong khi enzym exoglucanase của B. subtilis ẩn BM21 có khối lƣợng phân
tử trong khoảng 81,28 - 71,69 kDa. Việc phối hợp VKDC bò (BM13, BM21,
BM49) với VKDC dê (DD9) theo tỷ lệ 1:3, kết quả bƣớc đầu đã cho thấy tổ
hợp VKDC phân giải tốt bã mía trong điều kiện in vitro cũng nhƣ hỗ trợ tích
cực cho bò thí nghiệm trong điều kiện in vivo với hàm lƣợng NH3, vật chất
khô (VCK), cellulose, hemicellulose, lignin, protein tổng (CP) đƣợc tiêu hóa
tăng lên cũng nhƣ thức ăn dạng lớn giảm dần trong khi thức ăn dạng vừa và
nhỏ tăng dần sau 4 đến 6 giờ cho ăn và kết quả là bò đã tăng trọng trung bình
đạt 0,517 kg/ngày.
Bên cạnh đó, phân tích vùng gen ITS 1-4 dòng nấm men D11 cho kết
quả định danh tƣơng đồng với Candida inconspicua ở mức 96%. Dòng nấm
men D11 bƣớc đầu cũng đã cho thấy khả năng lên men ethanol từ sản phẩm
đƣờng hóa bã mía của tổ hợp VKDC bò (BM13, BM21, BM49) ở pH 6, nhiệt
độ 30oC và thời gian lên men 7 ngày.
Từ khóa: Bã mía, in vitro, in vivo, gia súc nhai lại, lên men ethanol, vi
khuẩn dạ cỏ.

i

ABSTRACT
The thesis “Isolation and selection of rumen bacteria for applications in
raising ruminants and alcohol fermentation from bagasse” was carried out in 3
years and 9 months (11/2010 – 8/2014), with the aims of i) Isolating bacterial
consortium from rumen fluid for application in raising ruminants and ii)
Selecting of yeast and the rumen bacteria for alcoholic fermentation from
sugarcane bagasse.
In total of 121 bacterial strains were isolated from rumen fluid (RB); the
majority was short rod-shape bacteria, whereas the minority was dominated by
long rod-shape and cocci bacteria. After the selection, the bacterial consortium
included three strain of cow RB (BM13, BM21, BM49) and one strain of goat
RB (DD9). These strains were sequenced and the strain BM13 was determined
to be isomophic with Achromobacter xylosoxidans BL6 (China) at 91% and
included of characteristics: Short rod-shape, Gram negative and catalase
positive. While, The other strains including of BM21, BM49 and DD9 were
homologous with Bacillus subtilis strain S2O (Cameroon), Uncultured
Bacillus sp. Filt.171, and Bacillus subtilis RC24 respectively at 94% with
short rod-shape, Gram positive and catalase positive characteristics.
Simultaneously, endoglucanase purified from four these strain showed range
of molecular weight 72.8 – 34 kDa. While molecular weight of exoglucanase
purified from bacterium strain BM21 illustrated in a range from 81,28 – 71.69
kDa. Mixture of cow RB (BM13, BM21, BM49) and goat RB with ratio of
1:3, the results initially showed the consortium of RB was the potential for
effectively hydrolysis of sugarcane bagasse in vitro as well as positive
supporting for feed digestion of experimental cows in vivo, it was illustrated
by the rising of NH3 concentration, digested amount of dry matter (DM),
cellulose, hemicellulose, lignin, total protein; it also caused reducing of large
type feed and increasing of medium and small type feed after eating 4 to 6
hours and as a result, cows‟ weight increased 0.517 kg /day.

Besides, the genetic analysis of ITS 1-4 of yeast strain D11 revealed that
it was homologous with Candida inconspicua at 96%. This strain initially
showed the ability of alcoholic fermentation from saccharification products of
the RB consortium (BM13, BM21, BM49) at pH 6, 30oC and 6 days.
Key words: Ethanol fermentation, in vitro and in vivo rumen bacteria,
ruminants, sugarcane baggasse.

ii


CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

CAM KẾT KẾT QUẢ
Tôi xin cam kết luận án “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn trong dạ cỏ để ứng
dụng chăn nuôi gia súc nhai lại và cung cấp cho quá trình lên men cồn từ
bã mía” này đƣợc hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi dƣới sự
hƣớng dẫn khoa học của PGS. TS. Trần Nhân Dũng và PGS. TS. Hồ Quảng
Đồ. Các kết quả của công trình nghiên cứu này chƣa đƣợc dùng cho bất cứ
luận án cùng cấp nào khác.
Tác giả luận án

Võ Văn Song Toàn

iii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................
TÓM TẮT

..................................................................................................
ABSTRACT
................................................................................................ ii
CAM KẾT KẾT QUẢ .................................................................................... iii
MỤC LỤC
............................................................................................... iv
DANH SÁCH BẢNG ..................................................................................... vii
DANH SÁCH HÌNH ....................................................................................... ix
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................ xii
CHƢƠNG I: GIỚI THIỆU ............................................................................ 1
1.1 Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................... 1
1.2 Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu ............................................................... 3
1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................................3
1.2.2 Nhiệm vụ nghiên cứu ...............................................................................................3
1.3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ............................................................... 3
1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................... 3
1.5 Những đóng góp của luận án ....................................................................... 4
1.6 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án ..................................... 4
CHƢƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................... 5
2.1 Tiêu hóa ở gia súc nhai lại ........................................................................... 5
2.1.1 Cấu tạo bộ máy tiêu hóa ..........................................................................................5
2.1.2 Tiêu hóa ở dạ cỏ ........................................................................................................6
2.1.3 Tiêu hóa ở dạ tổ ong, dạ lá sách và dạ múi khế ..............................................13
2.1.4. Tiêu hóa ở ruột của gia súc nhai lai ..................................................................13
2.1.5 Thành phần dƣỡng chất trong dạ cỏ ...................................................................14
2.1.6 Phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng thức ăn .......................................................15
2.2 Bã mía và enzym cellulase ........................................................................ 18
2.2.1 Bã mía ........................................................................................................................18
2.2.2 Enzym cellulase .......................................................................................................20
2.2.3. Một số phƣơng pháp phân tích cellulase .........................................................22

2.3 Ethanol sinh học......................................................................................... 28
2.3.1 Lên men ethanol sinh học .....................................................................................28
2.3.2 Cơ chế lên men ethanol .........................................................................................28
2.3.3 Lên men lignocellulose ..........................................................................................29
2.3.4. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men ...........................................30
2.4 Tình hình nghiên cứu ................................................................................. 32
2.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc .......................................................................32
iv


2.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc .......................................................................33
CHƢƠNG III:
NỘI DUNG, PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 36
3.1 Nội dung nghiên cứu.................................................................................. 36
3.2 Phƣơng tiện nghiên cứu ............................................................................. 36
3.2.1 Vật liệu .......................................................................................................................36
3.2.2 Thiết bị thí nghiệm..................................................................................................37
3.2.3. Hóa chất ....................................................................................................................38
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................... 38
3.3.1 Nội dung 1: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải xơ bã mía mạnh
từ dịch dạ cỏ trâu, bò, cừu và dê ....................................................................................38
3.3.2 Nội dung 2: Tuyển chọn tổ hợp VKDC để phân giải bã mía trong điều
kiện in vitro và in vivo ......................................................................................................41
3.3.3 Nội dung 3: Khảo sát ảnh hƣởng của nấm men và VKDC trong quá trình
lên men ethanol từ bã mía ...............................................................................................46
3.4 Xử lý số liệu ............................................................................................... 50
CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................. 51
4.1 Thành phần hóa học bã mía ....................................................................... 51
4.2 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải xơ bã mía mạnh từ dịch dạ cỏ
bò, trâu, cừu và dê ............................................................................................ 52

4.2.1 Vi khuẩn dạ cỏ bò ...................................................................................................52
4.2.2 Vi khuẩn dạ cỏ trâu .................................................................................................68
4.2.3 Vi khuẩn dạ cỏ cừu .................................................................................................77
4.2.4 Vi khuẩn dạ cỏ dê....................................................................................................87
4.2.5 Phân tích quan hệ di truyền của VKDC ............................................................96
4.3 Tuyển chọn tổ hợp dịch VKDC phân giải xơ trong điều kiện in vitro và in
vivo 98
4.3.1 Ảnh hƣởng của các tổ hợp VKDC giữa các loài đến sự phân giải bã mía
trong điều kiện in vitro .....................................................................................................98
4.3.2 Ảnh hƣởng của VKDC bò và dê lên các chỉ tiêu khảo sát trong điều kiện
in vivo ..................................................................................................................................122
4.4 Tuyển chọn nấm men và VKDC để lên men ethanol từ bã mía .............. 134
4.4.1 Tổ hợp các dòng nấm men và các dòng VKDC đƣợc tuyển chọn ở bò .134
4.4.2 Tổ hợp dòng nấm men D11 với các dòng VKDC đƣợc tuyển chọn ở bò137
CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................ 147
5.1 KẾT LUẬN.............................................................................................. 147
5.2 ĐỀ XUẤT ................................................................................................ 147
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 148
v


PHỤ LỤC
............................................................................................ 167
PHỤ LỤC 1: PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ............................................... 167
PHỤ LỤC 2: SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM ......................................................... 184
PHỤ LỤC 3: SỐ LIỆU THỐNG KÊ ............................................................. 210
PHỤ LỤC 4: HÓA CHẤT VÀ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM ........................ 261

vi

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần hóa học của bã mía ...................................................... 18
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của tổ hợp VKDC mỗi loài gia súc đến phân giải bã mía
.......................................................................................................................... 40
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của sự phối hợp VKDC trong điều kiện in vitro .......... 42
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của tổ hợp VKDC bò, cừu và dê trong điều kiện in vitro
.......................................................................................................................... 43
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của VKDC bò và nấm men trong lên men ethanol ..... 47
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của VKDC và nấm men và điều kiện khử trùng nhiệt
ƣớt trong lên men ethanol bã mía .................................................................... 48
Bảng 4.1. Thành phần hóa học bã mía............................................................. 51
Bảng 4.2. Danh sách vi khuẩn dạ cỏ bò ........................................................... 52
Bảng 4.3. Đặc điểm khuẩn lạc VKDC bò ........................................................ 53
Bảng 4.4. Đặc điểm khuẩn lạc VKDC bò (tt) .................................................. 54
Bảng 4.5. Đặc điểm tế bào VKDC bò ............................................................. 55
Bảng 4.6. Đặc điểm VKDC bò (tt) .................................................................. 56
Bảng 4.7. Danh sách VKDC trâu..................................................................... 68
Bảng 4.8. Đặc điểm khuẩn lạc VKDC trâu ..................................................... 69
Bảng 4.9. Đặc điểm tế bào VKDC trâu ........................................................... 70
Bảng 4.10. Danh sách VKDC cừu ................................................................... 77
Bảng 4.11. Đặc điểm khuẩn lạc VKDC cừu .................................................... 78
Bảng 4.12. Đặc điểm tế bào VKDC cừu ......................................................... 79
Bảng 4.13. Đặc điểm khuẩn lạc VKDC dê ...................................................... 87
Bảng 4.14. Đặc điểm tế bào VKDC dê ............................................................ 88
Bảng 4.15. Thành phần hóa học bã mía đƣợc phân giải bởi VKDC bò và trâu
.......................................................................................................................... 98
Bảng 4.16. Thành phần hóa học bã mía đƣợc phân giải bởi VKDC bò và cừu
........................................................................................................................ 101
Bảng 4.17. Thành phần hóa học bã mía đƣợc phân giải bởi VKDC bò và dê

........................................................................................................................ 105
Bảng 4.18. Kết quả tủa phân đoạn endoglucanase bằng AS ......................... 110
Bảng 4.19. Kết quả phân tích phân đoạn của sắc ký đồ ................................ 113
Bảng 4.20. Tóm tắt quy trình tinh sạch ......................................................... 119
Bảng 4.21. Kết quả tủa phân đoạn endoglucanase của B. subtilis BM21 bằng
AS .................................................................................................................. 119
Bảng 4.22. Thành phần hóa học thực liệu sử dụng nuôi bò .......................... 124
Bảng 4.23. Trung bình lƣợng thực liệu ăn vào của bò thí nghiệm/ngày ....... 125
Bảng 4.24. Giá trị pH dịch dạ cỏ bò ở sau cho ăn ......................................... 125
vii


Bảng 4.25. Hàm lƣợng NH3 trong dịch dạ cỏ bò sau cho ăn ......................... 126
Bảng 4.26. Kích thƣớc thức ăn trong dạ cỏ bò (% VCK) .............................. 128
Bảng 4.27. Hàm lƣợng protein thô đƣợc tiêu hóa ......................................... 133
Bảng 4.28. Trung bình tăng trọng của bò/ngày ............................................. 133
Bảng 4.29. Ảnh hƣởng của một số yếu tố đến thể tích khí sinh ra ................ 141
Bảng 4.30. Hàm lƣợng ethanol ...................................................................... 144

viii


DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1. Cấu tạo ống tiêu hóa của gia súc nhai lại........................................... 5
Hình 2.2. Đƣờng tiêu hóa thức ăn ở bò ............................................................. 6
Hình 2.3. Sơ đồ chuyển hóa glucid trong dạ cỏ ................................................. 8
Hình 2.4. Sơ đồ quá trình tiêu hóa và phân giải protein ở bò .......................... 11
Hình 2.5. Sơ đồ chuyển hóa NO3- thành NH3 .................................................. 11
Hình 2.6. Tƣơng quan về nồng độ của nitrate, nitrite và ammonia sau khi chích
NaNO3(25g) trên cừu sau 16 giờ sau khi cho ăn cỏ ........................................ 12

Hình 2.7. Sơ đồ chuyển hóa lipid ở bò ............................................................ 13
Hình 2.8. Cấu trúc hóa học của cellulose ........................................................ 18
Hình 2.9. Cấu trúc hóa học của hemicellulose ................................................ 19
Hình 2.10. Hoạt động phân giải cellulose........................................................ 20
Hình 2.11. Sự đồng bộ endo-exo và exo-exo cellulase đóng vai trò quan trọng
cả nấm và vi khuẩn. Nói chung, các endoglucanases tạo ra đầu ngoài cùng tự
do và là mục tiêu của exoglucanases (* Nguồn: Abelson and Simon, 2012) .. 22
Hình 2.12. Công thức phân tử Coomassie Brilliant Blue G-250 ..................... 23
Hình 2.13. Ảnh hƣởng của nồng độ muối đối với tính tan của protein ........... 24
Hình 2.14. Sắc ký trao đổi ion ......................................................................... 26
Hình 2.15. Biểu đồ hấp thụ điện tích protein trong sắc ký trao đổi ion........... 26
Hình 3.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu luận án ................................................. 36
Hình 3.2. Thiết bị sử dụng cho thí nghiệm ...................................................... 38
Hình 3.3. Thu dịch dạ cỏ bò ............................................................................ 42
Hình 4.1. Vi khuẩn nhuộm gram chụp ở vật kính 100X ................................. 57
Hình 4.2. Đƣờng kính vòng halo phân giải CMC của VKDC bò ................... 58
Hình 4.3. Đƣờng kính vòng halo phân giải bã mía của VKDC bò .................. 59
Hình 4.4. Đƣờng kính vòng halo phân giải bã mía của vi khuẩn BM13 ......... 59
Hình 4.5. Đƣờng kính vòng halo phân giải bã mía của 21 dòng VKDC bò.... 60
Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi 8F và 1492R .............. 61
Hình 4.7. Trình tự DNA vùng 16S rDNA của vi khuẩn BM13 ...................... 62
Hình 4.8. Mức độ đồng hình của vi khuẩn BM13 ........................................... 62
Hình 4.9. Trình tự DNA vùng 16S rDNA của vi khuẩn BM21 ...................... 63
Hình 4.10. Mức độ đồng hình của vi khuẩn BM21 ......................................... 63
Hình 4.11. Trình tự DNA vùng 16S rDNA của vi khuẩn BM49..................... 64
Hình 4.12. Mức độ đồng hình của vi khuẩn BM49 ......................................... 64
Hình 4.13. Trình tự DNA vùng 16S rDNA của vi khuẩn BM97..................... 65
Hình 4.14. Mức độ đồng hình của vi khuẩn BM97 ......................................... 65
Hình 4.15. Đƣờng kính vòng halo phân giải bã mía của tổ hợp VKDC bò .... 67
ix

Hình 4.16. Đƣờng kính vòng halo phân giải CMC và bã mía của VKDC trâu
.......................................................................................................................... 70
Hình 4.17. Trình tự DNA vùng 16S rDNA của vi khuẩn TM11 ..................... 72
Hình 4.18. Mức độ đồng hình của vi khuẩn TM11 ......................................... 72
Hình 4.19. Trình tự DNA vùng 16S rDNA của vi khuẩn TM17 ..................... 73
Hình 4.20. Mức độ đồng hình của vi khuẩn TM17 ......................................... 73
Hình 4.21. Trình tự DNA vùng 16S rDNA của vi khuẩn TM27 ..................... 74
Hình 4.22. Mức độ đồng hình của vi khuẩn TM27 ......................................... 74
Hình 4.23. Đƣờng kính vòng halo phân giải bã mía của tổ hợp VKDC trâu .. 76
Hình 4.24. Đƣờng kính vòng halo phân giải CMC và bã mía của VKDC cừu80
Hình 4.25. Đƣờng kính vòng halo phân giải CMC và bã mía của VKDC cừu81
Hình 4.26. Trình tự DNA vùng 16S rDNA của vi khuẩn CD11 ..................... 81
Hình 4.27. Mức độ đồng hình của vi khuẩn CD11 .......................................... 81
Hình 4.28. Trình tự DNA vùng 16S rDNA của vi khuẩn CD15 ..................... 82
Hình 4.29. Mức độ đồng hình của vi khuẩn CD15 .......................................... 82
Hình 4.30. Trình tự DNA vùng 16S rDNA của vi khuẩn CD21 ..................... 83
Hình 4.31. Mức độ đồng hình của vi khuẩn CD21 .......................................... 83
Hình 4.32. Trình tự DNA vùng 16S rDNA của vi khuẩn CD43 ..................... 84
Hình 4.33. Mức độ đồng hình của vi khuẩn CD43 .......................................... 84
Hình 4.34. Đƣờng kính vòng halo phân giải bã mía của tổ hợp VKDC cừu .. 86
Hình 4.35. Đƣờng kính vòng halo phân giải CMC và bã mía của VKDC dê . 89
Hình 4.36. Trình tự DNA vùng 16S rDNA của vi khuẩn DD5 ....................... 90
Hình 4.37. Mức độ đồng hình của vi khuẩn DD5 ........................................... 91
Hình 4.38. Trình tự DNA vùng 16S rDNA của vi khuẩn DD7 ....................... 91
Hình 4.39. Mức độ đồng hình của vi khuẩn DD7 ........................................... 92
Hình 4.40. Trình tự DNA vùng 16S rDNA của vi khuẩn DD9 ....................... 92
Hình 4.41. Mức độ đồng hình của vi khuẩn DD9 ........................................... 93
Hình 4.42. Đƣờng kính vòng halo phân giải bã mía của tổ hợp VKDC dê..... 95

Hình 4.43. Cây phả hệ mô tả tƣơng quan di truyền giữa các dòng vi khuẩn . 96
Hình 4.44. VCK, cellulose, hemicellulose và lignin BM đƣợc phân giải ..... 107
Hình 4.45. Hoạt tính endoglucanase từ dịch enzym thô của B. subtilis BM21
........................................................................................................................ 111
Hình 4.46. Sắc ký đồ tinh sạch endoglucanase của Achromobacter
xylosoxidans BM13 bằng gel Uno Sphere Q ................................................. 114
Hình 4.47. Điện di đồ endoglucanase tinh sạch của Achromobacter
xylosoxidans BM13........................................................................................ 115
Hình 4.48. Sắc ký đồ tinh sạch endoglucanase của B. subtilis BM21 bằng gel
Uno Sphere Q................................................................................................. 115
x


Hình 4.49. Điện di đồ enzym endoglucanase của B. subtilis BM21 ............. 116
Hình 4.50. Sắc ký đồ tinh sạch endoglucanase của Bacillus sp. BM49 bằng gel
Uno Sphere Q................................................................................................. 117
Hình 4.51. Điện di đồ Hình 4.52. Hoạt tính endoglucanase của Bacillus sp.
BM49 endoglucanase F1 của Bacillus sp. BM49 .......................................... 117
Hình 4.53. Sắc ký đồ tinh sạch endoglucanase của B. subtilis DD9 bằng gel
Uno Sphere Q................................................................................................. 118
Hình 4.54. Điện di đồ endoglucanase của B. subtilis DD9 ........................... 118
Hình 4.55. Hoạt tính exoglucanase phân giải bã mía của phân đoạn protein AS
70% ................................................................................................................ 120
Hình 4.56. Sắc ký đồ tinh sạch endoglucanase của B. subtilis BM21 bằng gel
Uno Sphere Q................................................................................................. 120
Hình 4.57. Điện di đồ enzym exoglucanase của B. subtilis BM21 ............... 121
Hình 4.58. Đƣờng tăng trƣởng của vi khuẩn dạ cỏ bò và dê ......................... 122
Hình 4.59. Hàm lƣợng VCK, cellulose, hemicellulose và lignin thức ăn ..... 127
Hình 4.60. Sự phân giải các dạng thức ăn trong dạ cỏ bò ............................. 130
Hình 4.61. Hàm lƣợng VCK, cellulose, hemicellulose và lignin .................. 131

Hình 4.62. Hàm lƣợng VCK và xơ thô đƣợc phân giải sau 7 ngày lên men . 135
Hình 4.63. Thể tích khí sinh ra sau lên men .................................................. 136
Hình 4.64. Hàm lƣợng ethanol tạo ra sau 7 ngày lên men ........................... 136
Hình 4.65. Sản phẩm PCR khuếch đại bằng cặp mồi ITS 1-4 ...................... 137
Hình 4.66. Mức độ đồng hình của vi khuẩn D11 .......................................... 138
Hình 4.67. Hàm lƣợng VCK và xơ thô đƣợc phân giải sau lên men ............. 139
Hình 4.68. Thể tích khí đƣợc tạo ra của quá trình lên men ........................... 140
Hình 4.69. Hàm lƣợng ethanol tạo ra sau 7 ngày lên men ............................ 141
Hình 4.70. Đồ thị mặt đáp ứng thể hiện sự tƣơng quan giữa pH và nhiệt độ đến
thể tích khí sinh ra .......................................................................................... 142
Hình 4.71. Đồ thị đƣờng mức thể hiện sự tƣơng quan giữa pH và nhiệt độ đến
thể tích khí sinh ra .......................................................................................... 143
Hình 4.72. Đồ thị mặt đáp ứng thể hiện sự tƣơng quan giữa pH và nhiệt độ đến
lƣợng ethanol ................................................................................................. 145
Hình 4.73. Đồ thị đƣờng mức thể hiện sự tƣơng quan giữa nhiệt độ và pH đến
lƣợng ethanol ................................................................................................. 145

xi


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
µm:
16rDNA:
ABBH:
ADF:
ADL:
ATP:
B:
BDBV:
BLAST:

BVK:
CF:
CFU:
CMC:
CP:
ĐBSCL:
DDC:
Đkvt:
DM:
DNA:
Egl:
g/L:
g:
GVS:
ITS:
LA:
MDF:
mL:
mm:
NCBI:
NDF:
NT:
OD:
PCR:
PG:
pI:
PTN:

Micrometer
16S-ribosomal deoxyribose nucleotide acid

Acid béo bay hơi
Acid detergent fiber (Chỉ số xơ acid)
Acid detergent lignin
Adenosine triphosphate
Bò
Bánh dầu bông vải
Basic Local Alignment Search Tool
Bò có chủng bổ sung vi khuẩn
Crude fiber
Colony forming unit
Carboxy methyl cellulose
Protein thô (crude protein)
Đồng bằng sông Cửu Long
Dịch dạ cỏ
Đƣờng kính vòng tròn
Dry matter
Deoxyribonucleic Acid
Eendoglucanase
Gram/Lít
Ggram
Goering và Van Soest
Iinternal transcribed spacer
Linoleic acid
Microbials Direct Fed
Milliliter
Millimeter
National Center for Biotechnology Information
Xơ trung tính (Neutral detergent fiber)
Nghiệm thức
Optical density

Polymerase chain reaction
Potato glucose
Isoelectric point
Phòng thí nghiệm
xii


Tm:
VCK:
VCK:
VKDC:
VSV:
VSVP:

Melting temperature
Vật chất khô
Vật chất khô
Vi khuẩn dạ cỏ
Vi sinh vật
Phƣơng pháp xác định tỷ lệ tiêu hóa in vitro với vi sinh vật từ phân

xiii


Chapter 1 :

CHƢƠNG I: GIỚI THIỆU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài
Thế kỷ 21 và trong tƣơng lai, lĩnh vực Công nghệ sinh học tiếp tục đóng

vai trò rất quan trọng đối với nhiều nền kinh tế (Hernandez-Cuevas and
Valenzuela, 2004; Hermann et al. 2007; Wohlgemuth, 2009) khi dân số thế
giới đang tiến gần đến mốc 9,3 tỷ ngƣời vào năm 2050 (UN, Population
Division Statistics, 2011). Thật vậy, giá trị thƣơng mại của Công nghệ sinh
học tại các nƣớc phát triển chiếm hơn 17% hàng năm, và khoảng 36% đối với
những nƣớc đang phát triển ở khu vực Châu Á (Tüsiad, 2006). Công nghệ sinh
học cung cấp cho những nền kinh tế đang phát triển những giải pháp về nhiều
vấn đề đã và đang phải đối mặt thƣờng xuyên trong sản xuất nông nghiệp,
lƣơng thực, dƣợc phẩm, năng lƣợng cũng nhƣ năng suất thấp và ô nhiễm môi
trƣờng.
Một trong những sản phẩm của công nghệ sinh học là dạng thức ăn bổ
sung probiotic. Ngày nay, mặc dù xu thế sử dụng dạng thức ăn này đã và đang
tăng lên qua đó cải thiện sức khỏe vật nuôi nhƣng những thông tin cần thiết về
sự ảnh hƣởng của thức ăn bổ sung probiotic cần đƣợc cập nhật và hoàn chỉnh
(Gaggìa et al. 2010). Bào tử của một số loài B. cereus, B. licheniformis, và B.
subtilis thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ thức ăn bổ sung probiotic để đƣa vào đƣờng
tiêu hóa (Sanders et al., 2003). Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra
rằng, nhiều loài Bacillus có khả năng sinh tổng hợp cellulase và đƣợc phân lập
từ dạ cỏ gia súc nhai lại khi đƣợc cho ăn bằng cỏ khô (Williams and Wither,
1983). Bacillus cùng với một số dòng vi sinh vật khác nhƣ P. eruginosa,
Streptococcus, Penicillin, Aspergillus, Mucor, Fusarium cũng đã đƣợc phân
lập đƣợc từ dạ cỏ động vật nhai lại bò, cừu, dê (Oyeleke and Okusanmi, 2008).
Việc cho ăn trực tiếp vi sinh vật (Microbials Direct-Fed, DFM) đã tác động tốt
đến môi trƣờng dạ cỏ nhƣ giảm khả năng nhiễm acid dạ cỏ, tiêu thụ thức ăn
hiệu quả với lƣợng ăn vào hàng ngày khoảng 2,5%, và tăng sản lƣợng sữa bò
hằng ngày 0,75-2,0 kg/ngày, đồng thời cải thiện sức khỏe và sự phát triển của
bê non (Krehbiel et al., 2003).
Bên cạnh đó, nguồn thức ăn xanh có nhiều xơ dùng cho gia súc chỉ có
nhiều vào mùa mƣa nhƣng thiếu trầm trọng vào mùa khô trong khi rơm và bã
mía là nguồn thức ăn thay thế dồi dào, nhƣng vật nuôi tăng trƣởng thấp do

rơm, bã mía nghèo dinh dƣỡng (Nguyễn Nhựt Xuân Dung và ctv., 2006).
Ngoài ra, nấm men S. cerevisiae, S. boulardii cũng đã đƣợc sử dụng nhƣ dạng
thức ăn bổ sung probiotic đặc biệt cho đàn gia súc nhai lại và heo (van der Aa
Kühle and Jespersen, 2003). Điều này đã cho thấy việc sử dụng những vi sinh
1


vật sở hữu hệ cellulase và có thể đƣợc dùng nhƣ nguồn thức ăn bổ sung
probiotic cần thiết để cải thiện khả năng tiêu hóa của gia súc nhai lại, góp phần
cải thiện sức khỏe của vật nuôi.
Ngày nay sức ép từ khủng hoảng dầu mỏ và nhu cầu năng lƣợng luôn là
vấn đề đặt ra cho bất cứ quốc gia nào trên thế giới. Tuy nhiên, việc sản xuất
ethanol thế hệ thứ nhất (sản phẩm nông nghiệp) đe dọa nền an ninh lƣơng thực
toàn cầu. Điều này đã khuyến khích các nƣớc khác đầu tƣ nghiên cứu vào lĩnh
vực nhiên liệu sinh học thế hệ thứ hai: Lignocellulose (Rubin, 2008). Bã mía
đã đƣợc sử dụng để lên men ethanol bằng Candida shehatae NCIM 3501
(Anuj, 2007). Cũng với bã mía, nhƣng Nasim (2011) đã sử dụng tổ hợp hai
loại nấm sợi là Aspergillus niger và Trichoderma longibrachiatum để lên men
rắn trong khi enzym thƣơng mại Cellulast của Novozymes đƣợc sử dụng trong
giai đoạn phân giải; Dịch phân giải sau đó đƣợc lên men bằng Sacchaomyces
cerevisiae. Ngoài ra, Pichia stipitis tái tổ hợp đã đƣợc sử dụng để lên men thân
cây bắp sau khi nổ hơi nƣớc và đƣợc phân giải trực tiếp với enzym (Xiushan,
2011). Trichoderma viride kết hợp với Saccharomyces cerevisiae cũng đã
đƣợc sử dụng để sản xuất ethanol (Firoz et al., 2012).
Với mong muốn phát triển chế phẩm vi sinh vật trong hỗ trợ gia súc nhai
lại tiêu hóa xơ thực vật và phát triển nguồn nhiên liệu sinh học thế hệ thứ 2,
chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “phân lập, tuyển chọn vi khuẩn trong dạ
cỏ để ứng dụng chăn nuôi gia súc nhai lại và cung cấp cho quá trình lên men
cồn từ bã mía” với hai (02) mục tiêu:
- Tuyển chọn tổ hợp VKDC ứng dụng trong chăn nuôi gia súc nhai lại.

- Tuyển chọn tổ hợp VKDC-nấm men để lên men ethanol từ bã mía.

2


1.2 Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu
1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu
- Tuyển chọn tổ hợp VKDC ứng dụng trong chăn nuôi gia súc nhai lại.
- Tuyển chọn tổ hợp VKDC-nấm men để lên men ethanol từ bã mía.
1.2.2 Nhiệm vụ nghiên cứu
- Nghiên cứu chế phẩm vi sinh phân giải xơ để hỗ trợ phát triển nghề
nuôi gia súc nhai lại vùng đồng bằng sông Cửu Long.
- Tận dụng nguồn bã mía để lên men ethanol bằng tổ hợp VKDC-nấm
men.
1.3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu
- Vi khuẩn phân giải xơ có nguồn gốc từ dịch dạ cỏ bò, trâu, cừu dê.
- Các dòng nấm men bao gồm D3, D7, D9, D11, D16, H6, H13, ST1
và CM4 đƣợc lƣu trữ tại Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử, Viện NC & PT
CNSH, Trƣờng Đại học Cần Thơ.
Phạm vi nghiên cứu
Vi khuẩn và nấm men có hệ enzym endoglucanase và exoglucanase
phân giải xơ bã mía để ứng dụng trong chăn nuôi và lên men ethanol.
1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu thực tế từ tháng 11/2010 đến tháng 8/2014 kèm
theo các quyết định:
- Quyết định số 2891/QĐ-ĐHCT ngày 23/11/2010 về việc cử cán bộ
làm nghiên cứu sinh Tiến sĩ tại Trƣờng Đại Học Cần Thơ.
- Thời gian đào tạo hệ không tập trung là 4 năm (11/2010 đến
11/2014) theo quyết định số 3193/QĐ-ĐHCT ngày 06/12/2010 công nhận và

giao ngƣời hƣớng dẫn Nghiên cứu sinh và quyết định số 4885/QĐ-ĐHCT
ngày 28/12/2012 giao đề tài và ngƣời hƣớng dẫn nghiên cứu sinh của Hiệu
Trƣởng trƣờng Đại học Cần Thơ.
- Báo cáo luận án cấp cơ sở ngày 26/12/2014 theo quyết định số
6067/QĐ-ĐHCT cấp ngày 18/11/2014 của Trƣờng Đại học Cần Thơ về việc
thành lập Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp cơ sở chuyên ngành Vi Sinh Vật
Học.
Địa điểm nghiên cứu
- Phòng thí nghiệm (PTN) Công nghệ Protein-Enzym, PTN Sinh Hóa,
PTN Hóa sinh Thực phẩm, PTN Vi sinh vật, PTN Công nghệ Sinh học Thực
phẩm, PTN Công nghệ Sinh học Phân tử - Viện NC & PT Công nghệ Sinh
3


học, PTN Chăn nuôi Tiên tiến - Khoa Nông nghiệp & SHƢD, Trƣờng Đại học
Cần Thơ.
- Lò giết mổ gia súc Sơn Quỳnh, xã Minh Đức, huyện Mỏ Cày Nam,
Tỉnh Bến Tre. Lò giết mổ chợ Cầu Đình, xã Tân Bình, huyện Phụng Hiệp,
Tỉnh Hậu Giang. Lò giết mổ dê tại Thành phố Long Xuyên, Tỉnh An Giang.
Trại nuôi bò hộ gia đình ông Nguyễn Văn Việt tại ấp Phú Long, Xã Phú
Thành, Huyện Trà Ôn, Tỉnh Vĩnh Long.
1.5 Những đóng góp của luận án
- Đề tài đã tuyển chọn đƣợc tổ hợp VKDC có 4 dòng vi khuẩn trong đó
có tổ hợp VKDC bò bao gồm BM13, BM21, BM49 và một dòng VKDC dê
DD9 từ 121 dòng VKDC phân lập đƣợc bằng nguồn carbon là bã mía ở 38oC.
- Bƣớc đầu đã xác định đƣợc 4 dòng VKDC BM13, BM21, BM49, DD9
và dòng nấm men D11 lần lƣợt tƣơng đồng với Achromobacter xylosoxidans
BL6 (China), Bacillus subtilis strain S2O (Cameroon), Uncultured Bacillus
sp. Filt.171, Bacillus subtilis RC24 và Candida inconspicua ở mức 91%, 94%,
94%, 94% và 96%.

- Tổ hợp VKDC bò (BM13, BM21 và BM49) có thể phối trộn với
VKDC dê (DD9) theo tỷ lệ 1:3 cho thấy phân giải bã mía hiệu quả trong điều
kiện in vitro và hỗ trợ tích cực bò thí nghiệm tiêu hóa thực liệu giàu xơ trong
điều kiện in vivo; cũng nhƣ có thể phối hợp với nấm men D11 để lên men
ethanol từ nguồn nguyên liệu bã mía.
1.6 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án
* Ý nghĩa khoa học
- Tổ hợp 04 dòng VKDC bao gồm BM13, BM21, BM49 và DD9 thích
hợp để để hỗ trợ bò tiêu hóa bã trong điều kiện in vitro và in vivo.
- Dòng nấm men D11 kết hợp với tổ hợp 3 dòng VKDC bò BM13,
BM21 và BM49 để lên men ethanol bằng nguồn nguyên liệu bã mía.
- Kết quả của đề tài mở ra hƣớng nghiên cứu chế phẩm vi sinh dùng
cho chăn nuôi gia súc nhai lai và lên men ehanol sinh học trong tƣơng lai và
bổ sung vào giáo trình giảng dạy.
* Ý nghĩa thực tiễn
- Cung cấp nguồn nguyên liệu ban đầu (4 dòng VKDC có khả năng
phân giải xơ bã mía) cho các nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh dùng trong chăn
nuôi gia súc nhai lại.
- Đề tài đã cung cấp nguyên liệu ban đầu (3 dòng VKDC bò và 1 dòng
nấm men) cho các nghiên cứu sử dụng nguyên liệu lignocellulose để sản xuất
ethanol sinh học; đồng thời lƣu trữ nguồn gen quí của những vi sinh vật này
cho các nghiên cứu tạo giống vi sinh vật biến đổi gen trong tƣơng lai.
4


Chapter 2 :

CHƢƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tiêu hóa ở gia súc nhai lại

2.1.1 Cấu tạo bộ máy tiêu hóa
Cấu trúc bộ máy tiêu hóa (hình 2.1) của gia súc nhai lại có đặc điểm
đặc trƣng và khác so với những động vật có dạ dày đơn. Động vật nhai lại có
dạ dày kép gồm có 4 túi (dạ): Dạ cỏ, dạ tổ ong, dạ lá sách còn gọi là dạ dày
trƣớc (không có ở động vật có dạ dày đơn), dạ múi khế có chức năng tƣơng tự
dạ dày đơn (Nguyễn Xuân Trạch, 2007).

Hình 2.1. Cấu tạo ống tiêu hóa của gia súc nhai lại
(*Nguồn: Nguyễn Xuân Trạch, 2007)

Miệng có vai trò lấy thức ăn, tiết nƣớc bọt, nhai và nhai lại. Nƣớc bọt
có pH trung tính nên có hiệu quả đệm cho dạ cỏ (Trần Cừ, 1979). Thực quản
có tác dụng nuốt thức ăn và ợ các miếng thức ăn lên miệng để nhai lại; đồng
thời còn có vai trò ợ hơi để thải các khí thừa sinh ra trong quá trình lên men dạ
cỏ đƣa lên miệng để thải ra ngoài. Thức ăn sau khi đƣợc nuốt xuống dạ cỏ và
lên men ở đó (hình 2.2). Phần thức ăn chƣa đƣợc nhai kỹ nằm trong dạ cỏ và
dạ tổ ong sẽ đƣợc ợ lên và nhai lại ở trong xoang miệng. Thức ăn đƣợc nhai kỹ
và thấm nƣớc bọt lại đƣợc nuốt trở lại dạ cỏ. Sự nhai lại diễn ra 5 - 6 lần trong
ngày, mỗi lần kéo dài khoảng 50 phút. Thời gian nhai lại phụ thuộc vào bản
chất vật lý của thức ăn, trạng thái sinh lý của con vật, cơ cấu khẩu phần …
Thức ăn thô trong khẩu phần càng ít thì sự nhai lại càng ngắn. Cƣờng độ nhai
lại mạnh nhất vào buổi sáng, buổi chiều (Nguyễn Xuân Trạch, 2007). Nhờ vào
quá trình nhai lại mà giúp gia súc nghiền mịn thức ăn để cho vi sinh vật dạ cỏ
thâm nhập vào các mảnh thức ăn thô và tiến hành lên men và tiêu hóa thức ăn
(Ulyatt et al., 1984).
5


Hình 2.2. Đƣờng tiêu hóa thức ăn ở bò
2.1.2 Tiêu hóa ở dạ cỏ

Dạ cỏ là túi lớn nhất, chiếm hầu hết nửa trái của xoang bụng, từ cơ
hoành đến xƣơng chậu. Dạ cỏ chiếm 85 - 90% dung tích dạ dày, 75% dung
tích đƣờng tiêu hóa (Nguyễn Xuân Trạch và ctv., 2004), có tác dụng tích trữ,
nhào trộn và lên men phân giải thức ăn, pH dạ cỏ khoảng 6,5, nhiệt độ dạ cỏ
38oC - 42oC (Trần Cừ, 1979).
Hệ vi sinh vật dạ cỏ rất phức tạp và phụ thuộc nhiều vào khẩu phần
thức ăn. Hệ vi sinh vật dạ cỏ gồm có 3 nhóm chính: Vi khuẩn (Bacteria) với số
lƣợng 1010 - 1011 tế bào/mL, động vật nguyên sinh (Protozoa) là 105 - 106 tế
bào/mL và nấm (Fungi) 103 - 104 tế bào/mL (Jouany and Ushida, 1999). Vi
khuẩn xuất hiện trong dạ cỏ gia súc nhai lại trong lứa tuổi còn non, mặc dù
chúng đƣợc nuôi cách biệt hoặc cùng với mẹ chúng và là tác nhân chính trong
quá trình tiêu hóa xơ. Có khoảng 60 loài vi khuẩn đã đƣợc xác định với mật số
khoảng 109 - 1010 tế bào/g chất chứa dạ cỏ (Hungate, 1957); trong đó khoảng
30% vi khuẩn ở thể tự do, số còn lại bám vào các mẫu thức ăn, trú ngụ ở các
nếp gấp biểu mô và bám vào protozoa.
2.1.2.1 Tiêu hóa carbohydrate
Trong suốt 6 giờ đầu sau khi ăn, phần lớn những thành phần glucide dễ
hòa tan, protit và khoảng 28% chất xơ đƣợc lên men. Trong sáu giờ tiếp theo,
chất xơ đƣợc tiêu hóa mạnh nhất (30,8%) và chỉ có khoảng 3,6% chất xơ đƣợc
tiêu hóa trong 12 giờ tiếp theo (Hale et al., 1947). Bên cạnh đó, Lischenko
(1965) đã cho thấy hoạt tính hệ vi sinh vật và nồng độ H+ của chất chứa dạ cỏ
trong một ngày đêm biến động nhiều. Trong những giờ đầu sau khi cho ăn độ
acide của chất chứa tăng lên, mức độ sử dụng cellulose giảm đi. Qua 6-8 giờ
sau khi cho ăn, pH đƣợc trung hòa dần và sử dụng cellulose tăng lên. Khuynh
hƣớng tăng sử dụng cellulose đƣợc duy trì ở cừu cả sau bữa ăn cỏ khô buổi
chiều. Vào lúc động vật nghỉ (ban đêm), sự nhai lại thức ăn tăng lên và lúc này

6

không còn những chất dinh dƣỡng dễ lên men đi vào dạ cỏ nên mức độ sử
dụng xơ tăng lên rõ rệt và đạt mức tối đa trƣớc bữa ăn buổi sáng.
Sự tiêu hóa xơ và việc sử sản phẩm chuyển hóa của nó là một trong
những chức năng quan trọng nhất của vi sinh vật dạ cỏ. Sự lên men cellulose
của quần thể vi khuẩn dẫn đến sự tạo thành các sản phẩm chuyển hóa quan
trọng đối với cơ thể động vật nhai lại. Điều này cho thấy, sự tiêu hóa chất xơ
không thể xem nhƣ biệt lập với các quá trình phân giải các chất dinh dƣỡng
khác. Tuy nhiên, chất xơ trong đƣờng tiêu hóa của gia súc nhai lại vẫn chỉ đạt
khoảng 30-80% do bị ảnh hƣởng của một số yếu tố nhƣ lignin, mức độ glucide
dễ tiêu, protein trong khẩu phần, … (Trần Cừ, 1979).
a) Tiêu hóa tinh bột, glucide
Tinh bột và đƣờng đƣợc vi khuẩn và protozoa tiêu thụ rất nhanh.
Protozoa đồng hóa tinh bột biến thành poly-dextin dự trữ trong cơ thể của
chúng. Khi protozoa bị chuyển xuống dạ múi khế và ruột non, poly-dextin
đƣợc tiêu hóa dễ dàng bởi men tiêu hóa của vật chủ. Ngƣợc lại vi khuẩn phân
giải tinh bột và đƣờng thành các đƣờng đơn sau đó lên men tiếp tục thành các
acid béo bay hơi, CO2, CH4 và ATP. ATP là nguồn cung cấp năng lƣợng chính
cho tế bào vi sinh vật. Những nghiên cứu gần đây cho thấy không phải tất cả
tinh bột đều đƣợc tiêu hóa ở dạ cỏ mà một phần đƣợc chuyển xuống phần dƣới
của dạ dày bốn túi, những thức ăn không bị lên men ở dạ cỏ gọi là “thức ăn
thoát tiêu”. Tinh bột, đƣờng “thoát tiêu” khỏi dạ cỏ sẽ tiêu hóa ở dạ múi khế
(Bùi Đức Lũng và ctv., 1995).

7


Sự chuyển hóa glucid

Hình 2.3. Sơ đồ chuyển hóa glucid trong dạ cỏ
(*Nguồn: Haresign and Cole, 1981)

Dựa theo phƣơng trình tóm tắt mô tả sự lên men glucose, sản phẩm trung
gian của quá trình phân giải các glucid phức tạp, để tạo các acid béo bay hơi
(ABBH) nhƣ sau:
Acid axetic
C6 H12O6 + 2 H2O ----> 2CH3COOH + 2CO2 + 4 H2
Acid propionic
C6 H12O6 + 2 H2 ------ > 2CH3CH2COOH + 2 H2O
Acid butyric
C6 H12O6 -------> CH3CH2CH2COOH + 2CO2 + 2 H2
Khí mê tan
4 H2 + CO2 -------> CH4 + 2 H2O
Nhƣ vậy, sản phẩm cuối cùng của sự lên men carbohydrat thức ăn bởi vi
sinh vật dạ cỏ gồm: Các acid béo bay hơi, chủ yếu là acid acetic (C2), acid
propyonic (C3), acid butyric (C4) và một lƣợng nhỏ các acid khác (isobytyric,
valeric, isovaleric). Các ABBH có vai trò to lớn trong việc trao đổi năng lƣợng
của cơ thể và sự chuyển hóa, trao đổi chất của các loài nhai lai. Các ABBH
đƣợc tạo thành trong một ngày và đêm ở dạ cỏ bò là 8140-17.980 kcal (Balch,
1958) và đƣợc hấp thu qua vách dạ cỏ vào máu và là nguồn năng lƣợng chính
cho vật chủ. Các ABBH cung cấp khoảng 70 - 80% tổng số năng lƣợng đƣợc
gia súc nhai lại hấp thu (Hungate, 1966). Trong khi đó gia súc dạ dày đơn lấy
năng lƣợng chủ yếu từ glucose và lipit hấp thu ở ruột. Tỷ lệ giữa các ABBH
phụ thuộc vào bản chất của các loại glucid có trong khẩu phần.
8