Tạp chất gây độc gen và không gây độc gen trong dược thành phẩm

Tạp chất gây độc gen và không gây độc gen
trong dược thành phẩm
I.

Tạp chất trong quá trình phát triển thuốc

Sơ đồ 1: Tạp chất trong quá trình phát triển dược phẩm.

Khâu phát triển dược chất và phát triển dược phẩm là hai khâu quan trọng trong sự phát
triển dược thành phẩm. Tạp chất có thể được theo dõi hoặc không trong qúa trình sản
xuất và chúng có thể là tạp chất hữu cơ thông thường, các tạp chất hữu cơ dễ bay hơi (thí
dụ các dung môi còn thừa lại), tạp chất vô cơ (thí dụ các kim loại sử dụng chủ yếu trong
quá trình phát triển dược chất).
Trong suốt khâu phát triển dược chất, tạp chất có thể sản sinh từ các quá trình tổng hợp
hoặc như là kết quả của sự thoái hóa. Còn trong khâu phát triển dược thành phẩm , tạp
chất có thể sản sinh từ sự thoái hóa sản phẩm thuốc hoặc là kết quả của sự tiếp xúc tá
dược với sự nhiễm bẩn bên ngoài hay từ các thành phần đóng gói.

II.

Các quy định về tạp chất

-1-


Việc mô tả các tạp chất trong cả quá trình phát triển dược thành phẩm được quản lý chủ
yếu thông qua sử chỉ đạo của ICH và FDA. Quy định về chất lượng được ban hành bởi
ICH trình bày một trong những sổ tay hướng dẫn được viết nghiêm ngặt và xuyên suốt
nhất cho việc phát triển dược phẩm. Trước khi thảo luận về các phương pháp phân tích
được sử dụng để xác định các tạp chất, việc hiểu rõ các quy định được ban hành bởi
FDA và ICH đề cập tạp chất là quan trọng. Để thuận lợi cho việc thảo luận thông suốt,

tạp chất được chia thành hai nhóm lớn: tạp chất gây độc gen và không gây độc gen.
Mọi hướng dẫn của FDA và ICH thảo luận bên dưới chủ yếu áp dụng cho các tạp chất
không gây độc gen. Vì thế trong hầu hết các hướng dẫn về tạp chất, nếu từ “genotoxic”
không được nói đến nghĩa là hướng dẫn đó chỉ được áp dụng cho tạp chất không gây độc
gen.

Sơ đồ 2: Các hướng dẫn của FDA và ICH và mối liên quan giữa chúng với dược chất và thuốc thành
phẩm

Các quy định của FDA về tạp chất
-2-


Cục quản lý dược và thực phẩm Hoa Kỳ FDA ban hành nhiều hướng dẫn có liên quan
mật thiết đến việc xác định tạp chất trong quá trình phát triển thuốc đối với NDA và
ANDA.
Có hai quy định quan trọng sau:
a. Nguyên tắc trong công nghiệp, NDA: Tạp chất trong Dược chất (2 /2000): tài

liệu này ban hành quy định về việc áp dụng NDA và các hồ sơ thuốc gốc loại II
nhằm hỗ trợ cho việc áp dụng NDA. Đặc biệt lưu ý là hướng dẫn này không áp
dụng cho các chế phẩm thuốc có nguồn gốc sinh học và dược thảo.
b. Hướng dẫn trong công nghiệp, ANDA: tạp chất trong dược chất (2/2005): tài
liệu này dành cho việc sử dụng thuốc gốc và phác họa thông tin được xem xét
trong CMC, v.v. thông báo, cách nhận biết và định tính các tạp chất trong dược
chất và các sản phẩm phân hủy trong các chế phẩm dược.
Cả hai hướng dẫn này của FDA liên quan đến các hướng dẫn Q3A, Q3B và Q3C của
ICH.
Các hướng dẫn của ICH về tạp chất
Hướng dẫn về tạp chất có thể tìm thấy dưới bảng hướng dẫn chất lượng. Có 3 hướng dẫn

chính được cho bên dưới:
a. Tạp chất trong các dược chất mới Q 3A: trọng tâm của hướng dẫn này nhằm

khuyến cáo hàm lượng tạp chất có thể chấp nhận được trong một dược chất vì sự
an toàn cho bệnh nhân.
Trong lần tái bản mới nhất ( tái bản lần 2) đã được thông qua vào tháng 10 năm
2006. Tái bản lần 2 chia tạp chất trong dược chất thành ba nhóm riêng biệt là tạp
chất hữu cơ, tạp chất vô cơ và các dung môi.
Theo tài liệu này, tạp chất hữu cơ có thể là các nguyên liệu ban đầu, sản phẩm
trung gian, sản phẩm phụ, sản phẩm phân hủy, các tác chất, các phối tử và chất
xúc tác.
Các tạp chất có hàm lượng ít hơn một phần trăm phải được báo cáo với hai số có nghĩa
sau dấu phẩy.

-3-


Liều tối đa hàng
ngày
≤ 2g/ngày

Ngưỡng
báo cáo
0,05 %

Ngưỡng phát hiện

Ngưỡng định tính

0,10 % hay liều 0,1

mg/ngày (bất cứ giá trị
nào thấp hơn)

> 2g/ngày

0,03 %

0,05 %

0,15 % hay liều
1,0mg/ngày
(bất cứ giá trị nào
thấp hơn)
0,05 %

Bảng 1: Các ngưỡng thông báo, phát hiện và định tính dành cho tạp chất của dược chất.

Bảng 1 thể hiện các hướng dẫn hiện hành về mức độ tạp chất trong các dược chất: các
tạp chất vô cơ có thể là tác chất, phối tử, xúc tác, kim loại nặng hoặc kim loại dư, các
muối vô cơ hoặc các nguyên liệu khác (thí dụ: chất trợ lọc, than hoạt tính). Không có sự
hướng dẫn rõ ràng về tạp chất vô cơ trong bản hướng dẫn này. Các chỉ tiêu chấp nhận
được nên dựa theo các tiêu chuẩn của dược điển hoặc dữ liệu an toàn đã biết.
Tuy vậy, có một đề suất từ châu Âu của Ủy ban các sản phẩm y khoa sử dụng trên con
người (CHMP) quy định tiêu chuẩn các tạp chất vô cơ có hiệu lực từ tháng 9 năm 2008.
Mục đích của các quy định này nhằm khuyến cáo nồng độ hạn chế tối đa cho phép đối
với lượng thừa của xúc tác kim loại hoặc các tác chất kim loại có mặt trong dược chất
hoặc dược phẩm. Dung môi được định nghĩa trong hướng dẫn này là các chất lỏng vô cơ
hoặc hữu cơ sử dụng như tá dược lỏng để điều chế các dung dịch hay các huyền phù
trong tổng hợp một dược chất mới. Hướng dẫn dành cho dung môi hữu cơ được thảo luận
trong mục Q 3C.

b. Tạp chất trong các sản phẩm tân dược Q 3B (R2): quy định này khuyến cáo

hàm lượng tạp chất cho phép trong dược phẩm. Trong lần tái bản mới nhất (lần
thứ 2) được thông qua vào tháng 6 năm 2006. Tài liệu này chỉ áp dụng cho các tạp
chất trong các sản phẩm tân dược được sản xuất từ tổng hợp hóa học. Quy định chỉ
rõ chỉ những tạp chất trong các sản phẩm tân dược đã được phân loại thành các
sản phẩm phân hủy của dược chất hay các sản phẩm từ phản ứng của dược chất
với tá dược và(hoặc) bao bì trực tiếp. Tạp chất có mặt trong dược chất không cần
phải được theo dõi tiếp trong dược phẩm trừ khi chúng là các sản phẩm phân hủy.
Bất kỳ sản phẩm phân hủy nào trong các nghiên cứu độ ổn định tiến hành tại điệu
kiện bảo quản phải được xác định rõ khi mức độ hiện diện lớn hơn (>) ngưỡng xác
định cho bên dưới.

-4-


Ngưỡng báo cáo
Liều tối đa hàng ngày

Ngưỡng

≤1g

0,1 %

>1g

0.05 %

Ngưỡng phát hiện

Liều tối đa hàng ngày

Ngưỡng

< 1 mg

1,0 % hay 5 µg TDI, (cái nào cũng thấp hơn)

1 mg – 10 mg
> 10 mg – 2 g

0,5 % hay 20 µg TDI, (cái nào cũng thấp
hơn)
0,2 % hay 2 mg TDI, (cái nào cũng thấp hơn)

> 2g

0,10 %

Ngưỡng định tính
Liều tối đa hàng ngày

Ngưỡng

< 10 mg
11
> 100 mg – 2 g

1,0 % hay 50 µg TDI, (cái nào cũng thấp
hơn)

0,5 % hay 200 µg TDI, (cái nào cũng thấp
hơn)
0,2 % hay 3 mg TDI, (cái nào cũng thấp hơn)

>2g

0,15 %

10 mg – 100 mg

Bảng 2: Các ngưỡng báo cáo, phát hiện và định tính cho tạp chất của thuốc thành phẩm theo tổng số
liều TDI hàng ngày

c. Tạp chất: quy định đối với dung môi tồn dư Q 3C (R3): lần tái bản mới nhất

(lần thứ 3) 11/2005. Quy định khuyến cáo hàm lượng dung môi tồn dư cho phép
-5-


trong dược phẩm. Dung môi tồn dư trong dược phẩm là các hóa chất hữu cơ dễ
bay hơi, được sử dụng hay sản xuất trong bào chế dược chất hay tá dược, hoặc
trong điều chế thuốc. Dung môi được chia thành ba loại: loại I, loại II, loại III.
Dung môi loại I có độc tính cao, nên tránh sử dụng trong sản xuất dược chất, tá
dược hoặc thuốc trừ khi việc sử dụng chúng đã được cân nhắc kĩ lưỡng trong việc
đánh giá lợi-hại. Dung môi loại II nên được hạn chế vì các tác động bất lợi tiềm
tàng. Dung môi loại III ít độc nên được sử dụng nhiều trong thực tế. Danh sách
các dung môi được cho trong hướng dẫn này là các ví dụ đã được tính toán kĩ
lưỡng.

III.

Các tạp chất độc gen

Tạp chất gây độc gen là các hóa chất gây hại cho cơ thể bằng cách làm hư hại các vật
liệu di truyền (DNA), những vật liệu này có thể gây ra đột biến soma hay ung thư.
Theo tác giả, ICH đã không cung cấp bất cứ hướng dẫn chi tiết nào về ngưỡng hay
mức độ hạn chế cho các nguyên liệu gây độc gen. Tuy nhiên hiện có một tài liệu an
toàn diều chỉnh quy định S2của ICH (3/ 2008): “Hướng dẫn chi tiết các hướng điều
tiết thử nghiệm tính gây độc gen của dược phẩm” (S2A) và “Tính gây độc gen: bộ
dụng cụ tiêu chuẩn cho việc kiểm tra tính độc gen trong dược phẩm”. Những hướng
dẫn này chủ yếu kiểm tra độc tố di truyền đối với dược phẩm. Mục đích của bản điều
chỉnh ICH S2 A và B nhằm thu được các mục tiêu sau:
1. Giảm số lượng con vật sử dụng trong các thử nghiệm bằng cách cải thiện quy trình

hiện hành (hạn chế số con vật sử dụng làm đối chứng dương) và chọn lọc kiểm tra
lần nửa trong trường hợp phát hiện dương tính.
2. Tránh hoặc giải thích các phát hiện không liên quan một cách thỏa đáng nhằm
giảm thiểu những rào cản trong quá trình phát triển thuốc ban đầu bằng cách cải
thiện khâu đánh giá rủi ro đối với các tác động gây ung thư do thay đổi vật liệu di
truyền.
3. Cập nhật và cải thiện sự đồng thuận quốc tế dựa trên các tiêu chuẩn cho việc kiểm
tra lần nữa và giải thích các kết quả dương tính, đặc biệt từ các xét nghiệm in vitro
nhờ vào bộ dụng cụ tiêu chuẩn thử độc tố gen.
IV.
Phân loại
Có một vài tài liệu sẵn có khác từ các nguồn có thể kể đến sau:
1. Đề xuất của châu Âu từ Ủy ban dược thành phẩm sử dụng cho con người

(CHMP).
-6-

2. Hiệp hội các nhà sản xuất và nghiên cứu dược thành phẩm Hoa Kỳ.
3. Hướng dẫn(chỉ đạo) từ FDA. (Bản thảo 12/ 2008).

Theo như CHMP, tạp chất gây độc gen có thể phân biệt thành hai loại:
a. Hợp chất gây độc gen với những số liệu thực nghiệm đầy đủ về ngưỡng có cơ chế

tương ứng: đối với những hợp chất này, mức độ phơi nhiễm có thể tính toán theo
phương pháp áp dụng cho dung môi loại II trong hướng dẫn ICH Q 3C.
b. Hợp chất gây độc gen mà không có đủ số liệu thực nghiệm đầy đủ về ngưỡng có
chế tương ứng: đối với những hợp chất này, mức độ đạt ngưỡng được quy định
theo nguyên tắc ALARP ( miễn thấp đủ khả thi vừa phải). Về mặt này, ngưỡng
gây độc (TTC) cho phép liều lấy vào tối đa 1,5 µg/ngày đối với một tạp chất gây
độc gen trong suốt cuộc đời của bệnh nhân. Nồng độ giới hạn (ppm) của một tạp
chất gây độc gen trong một dược chất dựa vào TTC có thể được tính toán dựa trên
liều ước tính sử dụng hàng ngày đối với bệnh nhân thông qua phương trình sau:
Nồng độ giới hạn (ppm) = TTC [µg/ day]/liều sự dụng (g/ngày)
Khái niệm TTC không áp dụng cho chất gây ung thư bởi vì dữ liệu độc tính thích
hợp (nghiên cứu lâu dài) có sẵn và tính đến thẩm định độ rủi ro một thuốc đặc
hiệu.
Có sự tương quan cao (khoảng 90%) giữa hoạt tính của cấu trúc cảnh báo với
DNA. Hóa chất gây độc gen có thể hoạt động như một chất thân điện tử liên kết
cộng hóa trị với nguyên tử nitrogen và oxygen trong DNA. Các ví dụ cụ thể của
cấu trúc cảnh báothân điện tử bao gồm ion carbonium, ion nitrenium, epoxide, ion
oxonium, andehyde, các acceptor Micheal ( các xeton chưa bão hòa alpha-beta,
các peroxide, các gốc tự do và tác nhân acyl hóa. Việc áp dụng dự đoán cho mỗi
cấu trúc cảnh báo ở các mức độ khác nhau, thí dụ độc tính của xeton không bão
hòa alpha-beta phụ thuộc nhiều vào cấu trúc chính xác. Trong bài này, theo
PhRMA, tạp chất được phân thành năm nhóm tương ứng với khả năng gây độc

gen tiềm tàng:
Nhóm I: “ Tạp chất gây độc gen và ung thư”, chúng là tác nhân gây ung thư cho
động vật và con người với cơ chế gây độc gen rõ ràng.
Nhóm II: “Tạp chất gây độc gen ( đột biến gen) nhưng khả năng gây ung thư chưa
biết rõ”, chúng đã được chứng minh là gây đột biến gen trong các xét nghiệm
thông thường, nhưng khả năng gây ung thư chưa được biết rõ.
Nhóm III: “Cấu trúc cảnh báo không có liên hệ với cấu trúc của hoạt chất và khả
năng gây độc gen chưa biết rõ”, chúng dựa trên quy tắc chung là những nhóm
chức có cấu trúc có thể gây độc gen, tuy vậy chúng vẫn chưa được cô lập thử
nghiệm.

-7-


Nhóm IV: “Cấu trúc cảnh báo có liên hệ với hoạt chất”, chúng là các tạp chất có
chung nhóm chức cảnh báo với cấu trúc các chất ban đầu.
Nhóm V: “ Không có cấu trúc cảnh báo hoặc không đủ bằng chứng cho thấy chất
có khả năng gây độc gen” chúng đã được nói đến ở các hướng dẫn Q 3A, B và C
của ICH.
V.
Phương pháp tiếp cận
Trước khi có bản hướng dẫn chính thức 12/ 2008, McGovern và cộng sự đã đề
xuất phương pháp làm việc với các tạp chất gây độc gen của FDA. Theo tài liệu
này, cần ngăn ngừa sự hình thành tạp chất gây độc gen trong quá trình tổng hợp
dược chất hay bào chế dược phẩm và giảm thiểu tạp chất thông qua các bước tinh
chế. Khi các mức độ được xác định là thấp hơn giới hạn định tính của ICH, khả
năng gây độc gen của tạp chất có thể được đánh giá bởi mối liên hệ hoạt tính cấu
trúc (SAR) . Sự đánh giá khả năng gây độc gen dựa trên các tài liệu đã được xuất
bản và áp dụng các phần mềm thích hợp, thí dụ phần mềm MCASE ( đánh giá cấu
trúc tự động đa máy tính), DEREK ( Suy luận ước đoán rủi ro từ kiến thức đã

biết). Các tạp chất đã xác định cấu trúc cảnh báo, cần trải qua bước thử độc tính.
Bản thảo hướng dẫn chính thức của FDA có tên là “Genotoxic and Carcinogenic
Impurities in Drug Substances and Products: Recommended Approaches” 12 /
2008. Tài liệu là trở thành bản bổ sung cho các bản hướng dẫn Q3 A, B, C của
ICH. Những quy định của CHMP về tạp chất gây độc gen được đề cập trong tài
liệu này của FDA. Ngưỡng giới hạn phơi nhiễm trong việc triển khai lâm sàng và
lưu hành ngoài thị trường dựa theo tài liệu của CHMP. FDA đề xuất những
phương pháp thẩm định ban đầu về khả năng gây độc gen tiềm tàng giống với
những gì đã đề cập đến trong tài liệu trên. Phương pháp cho việc xử lý các tạp chất
gây hại di truyền và gây ung thư là ngăn ngừa và giảm thiểu tạp chất. Đối với sản
phẩm thương mại, bất kì tạp chất có hàm lượng thấp hơn 1,5 µg/ ngày thì không
cần phải xét nghiệm tiếp nửa. Tạp chất có ngưỡng 0.15 µg/ngày được xếp vào các
nhóm chất đã được phân loại ở trên.
Tài liệu này cũng cung cấp hướng dẫn quy trình triển khai lâm sàng cho các tạp
chất gâyđộc gen. Ngưỡng tạp chất được khuyến cáo cho nghiên cứu lâm sàng kéo
dài 12 tháng là 0,15 µg/ ngày vì lí do an toàn sức khỏe. Đối với các thử nghiệm
kéo dài nhiều hơn 1 năm, khuyến cáo nên dùng liều lượng 1,5 µg/ ngày sẽ đạt
nhiều tác dụng hơn. Các phương pháp khuyến cáo dựa trên các giai đoạn triển khai
được cho bên dưới:

-8-


Giai đoạn
phát triển
lâm sàng
IND

Phương pháp đề xuất

Đánh giá nguy cơ gây độc gen và ung thư của các tạp
chất thông qua thử nghiệm SAR .
• Thực hiện xét nghiệm sự có mặt tạp chất gây độc gen và
ung thư đã được tiên liệu.
• Nếu tạp chất đã được nhận diện là có khả năng gây độc
gen và ung thư tiềm tàng:
- Tìm cách thay đổi hướng tổng hợp để loại tạp chất nếu có
thể.
Hoặc:
- Thực hiện xét nghiệm độc tính gen nếu chưa biết rõ.
Và/Hoặc:
- Thiết lập tiêu chuẩn để liên kết khả năng phơi nhiễm tạp
chất tiềm tàng bằng cách thẩm định mức độ rủi ro của
thuốc đặc hiệu hay ngưỡng định tính phù hợp.
Lưu hành sản
• Đánh giá nguy cơ gây độc gen và ung thư của các tạp
phẩm (NDA,
chất thông qua thử nghiệm SAR .
BLA, ALDA)
• Nếu tạp chất đã được nhận diện là có khả năng gây độc
gen và ung thư tiềm tàng:
- Thực hiện xét nghiệm độc tính gen nếu chưa biết rõ.
Và/Hoặc:
- Thiết lập tiêu chuẩn để liên kết khả năng phơi nhiễm tạp
chất tiềm tàng bằng cách thẩm định mức độ rủi ro của
thuốc đặc hiệu hay ngưỡng 1,5 µg /ngày.
•

-9-

Bảng 5: phương pháp khuyến cáo cho tạp chất gây độc gen dựa trên giai đoạn phát triển

Các phương pháp phân tích tạp chất
Như thảo luận ở trên, các tạp chất được tìm thấy trong dược chất hoặc dược phẩm
được chia thành từng nhóm ở hình 3.
IV.

Sơ đồ 3: Các công nghệ phân tích thông thường sử dụng để phân tích các chất bẩn dựa theo nguồn gốc
của chúng.

Các phương pháp phân tích ICP và ICP-MS, AAS, AES và IC dùng để phân tích
tạp chất vô cơ. Đối với tạp chất hữu cơ dễ bay hơi thì sử dụng kỹ thuật GC. Các kỹ
-10-


thuật phân tích tạp chất hữu cơ thì khó khăn nhất. Nếu một nguyên liệu gây độc
gen có trong dược chất hoặc dược phẩm thì cần phải phân tích định lượng. Trong
mục này, chúng ta sẽ tập trung vào phân tích sơ bộ về nguyên liệu gây độc gen,
trước đây có nhiều tài liệu tham khảo về phân tích định tính và định lượng của tạp
chất không gây độc gen. Nhiều tạp chí có giá trị cao về chủ đề phân tích tạp chất.
Các kỹ thuật phân tích định lượng như LC-UV và LC-MS (hoặc MS/MS) được sử
dụng rộng rãi. Đối với tạp chất có nhóm mang màu thì không xuất hiện khi soi UV
nhưng dẫn xuất của nó thì có hoạt tính với UV. Phân tích định tính là sự giải thích
cấu trúc với các kỹ thuật phân tích như LC-MS với MS(n) hoặc LC-NMR. Phổ
MS thường được dùng để nhận biết sơ bộ, với các thiết bị đo khối dễ dàng cho giá
trị phân giải cao hoặc chính xác. Các phương pháp trao đổi deuterium được dùng
để phân biệt giữa những cấu trúc tương tự nhau với khối đẳng áp (isobaric
masses). Sử dụng sắc ký phi thủ tính để tách đối phân của tạp chất. Việc tổng hợp
hoặc cô lập ở mức bán điều chế để phát hiện một tạp chất chưa biết thì thực hiện

mô hình trực giao. Chiết pha rắn, cột sắc ký và dung môi chiết có thể dùng được
trong nhiều trường hợp. Tuy nhiên, giới hạn để phát hiện tạp chất gây độc gen thì
thấp. Trong hầu hết các trường hợp, vùng phát hiện các tạp chất là 1-20 ppm. Đối
với tạp chất không gây độc gen, nếu giới hạn phát hiện là 0.1% thì tương đương
với 1000 ppm. Nghĩa là ở mức 1 ppm (thường để phát hiện tạp chất gây độc gen)
thì đòi hỏi độ nhạy phải tăng 1000 lần ứng với các phương pháp phân tích tạp chất
không đổi. Vì vậy các kỹ thuật khác, nhất là LC-MS, GC-FID, GC-MS và LCFluorescence có hiệu quả cao trong phân tích hợp chất gây độc gen. Dùng phương
pháp LCMS để phân tích vết alkyl sulfonate trong tạp chất gây độc gen. Độ nhạy
của phương pháp này thì được xác định ở mức ppm thấp (1-2 ppm). Elder và cộng
sự đã trình bày một bài báo tương tự về phân tích tác nhân alkyl hóa dẫn xuất
halogen. Vết alkyl halogen được phân tích bằng các phương pháp GC khác nhau.
Raman và cộng sự dùng phương pháp isocratic RP-HPCL để phân tích alkyl
benzene sulfonate. Tuy nhiên, khả năng sử dụng phương pháp này còn nhiều e
ngại nếu có một lượng nhỏ tạp chất trong dược chất. Yuabova và cộng sự đưa ra
nhận định rằng sự định lượng gần như khác nhau, tùy vào từng trường hợp mà sử
dụng các kỹ thuật khác nhau như UV, ELSD, CAD và MS.

-11-


Sơ đồ 4: Sơ đồ cây miêu tả phân tích định lượng của các hợp chất gây độc gen với những kỹ thuật phân
tích khác nhau. Sens ở đây là độ nhậy.(sensitivity).

-12-