NHỮNG QUY TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT

NHỮNG QUY TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
VI SINH VẬT
Thao tác an toàn là yêu cầu cực kỳ quan trọng đối với thí nghiệm vi sinh vật. Vi sinh
vật có kích thước nhỏ bé mà mắt thường không nhìn thấy được. Trong quá trình làm thí
nghiệm, chúng ta thường thao tác với số lượng rất lớn và đậm đặc tế bào vi sinh vật. Bên cạnh
những giống, loài vi sinh vật có ích là những giống, loài có khả năng gây bệnh và có hại đối
với sức khỏe con người. Mặt khác, trong quá trình thí nghiệm chúng ta cũng phải sử dụng
nhiều loại hóa chất, trong đó có những hóa chất có độc tính. Chính vì thế, người làm thí
nghiệm trong phòng thí nghiệm vi sinh vật cần tuân thủ các qui tắc cơ bản sau đây:
1. Những qui định chung:
- Những người không có nhiệm vụ không được vào phòng thí nghiệm.
- Khi vào phòng thí nghiệm phải mặc áo Blouse (cài khuy kín), cột tóc gọn gàng.
- Không nói chuyện ồn ào, giữ gìn trật tự. Không ăn uống, hút thuốc trong phòng kiểm
nghiệm.
- Mang khẩu trang, găng tay khi thao tác với vi sinh vật và hóa chất.
- Trên bàn thí nghiệm chỉ để vật dụng thí nghiệm, số ghi chép, giấy ghi chép. Tất cả
các vật dụng cá nhân, áo khoác, túi xách, sách vở,… phải để đúng nơi qui định.
- Trước và sau khi kết thúc thí nghiệm, phải sát trùng mặt bàn bằng các hóa chất sát
trùng cồn 70% hoặc dung dịch diệt khuẩn khác (lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%) đã
chuẩn bị sẵn và lau khô bằng giấy vệ sinh.
- Cần ghi chú tên chủng, ngày tháng thí nghiệm, người là thí nghiệm lên tất cả các hộp
petri, ống nghiệm,…
- Tuyệt đối không để canh trường hay vật phẩm có vi sinh vật dấy lên quần áo, sách
vở và dụng cụ cá nhân. Đồng thời cũng phải chú ý bảo vệ da và quần áo khỏi bị dính hóa chất
và thuốc nhuộm.
- Cẩn thận khi thao tác với đèn cồn hoặc đèn Bunsen. Tắt ngọn lửa khi chưa có nhu
cầu sử dụng hoặc ngay sau khi thực hiện xong mỗi thao tác. Tuyệt đối không dùng đèn cồn để
mồi lửa đèn cồn.
- Sử dụng quả bóp cao su khi thao tác ống hút định lượng (pipette), Tuyệt đối không
hút bằng miệng.
- Không tự ý sử dụng trang thiết bị, dụng cụ trong phòng thí nghiệm khi chưa được

hướng dẫn cụ thể. Sử dụng theo hướng dẫn, hết sức thận trọng, tránh làm đổ vỡ và hư hỏng.
- Tất cả các vật liệu bị nhiễm bẩn, môi trường chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần phải
được khử trùng trước khi vứt bỏ hoặc sử dụng lại. Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật
cần được ngâm vào dung dịch diệt khuẩn (nước javel) trước khi rửa và tái sử dụng.
- Kết thúc thí nghiệm phải vệ sinh các thiết bị, dụng cụ đã sử dụng theo đúng qui trình
và sắp xếp vào đúng nơi qui định.
- Rửa tay sạch sẽ trước khi rời phòng thí nghiệm.
- Tất cả các trường hợp tai nạn phải báo cáo cho cán bộ hướng dẫn thí nghiệm để kịp
thời và xử lý.
2. Một số lưu ý với sinh viên nhằm đạt kết quả tốt trong thực hành vi sinh vật
a. Trước khi thực hành
- Cần đọc bài trước nội dung toàn bài để hình dung được khối lượng công việc sẽ làm.
- Hiểu rõ nguyên tắc, mục đích của các thí nghiệm.
- Đọc cẩn thận cách tiến hành thí nghiệm
b. Trong giờ thực hành:
- Ghi chú cẩn thận những căn dặn của giảng viên về các thao tác và qui trình thực
hành.
- Thực hiện thí nghiệm theo đúng hướng dẫn của giảng viên.
- Trong quá trình thí nghiệm có những thao tác, công đoạn không rõ cần hỏi lại giảng
viên hướng dẫn.
Trang 1


- Ghi chép cẩn thận các chú ý quan trọng của thí nghiệm và kết quả của mỗi thí
nghiệm.
c. Kết thúc thực hành:
- Làm báo cáo thực hành theo các yêu cầu trong mục 5 của từng bài thí nghiệm và
theo yêu cầu của giảng viên.

Trang 2

BÀI 1
THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT
VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG VI SINH VẬT
1. Thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh vật học
1.1.Tủ sấy (vacuum oven): to từ 60oC – 200oC, dùng để sấy khô, khử trùng các loại
dụng cụ chịu được sức nóng khô, chủ yếu là dụng cụ thủy tinh, kim loại. Tùy vào đối tượng
cần khử khuẩn mà sấy ở chế độ to và thời gian khác nhau, thường sấy ở 160oC/2 giờ, hoặc
180oC/30 phút.

Hình. Tủ sấy
1.2.Tủ ấm (incubator or etuve): to từ 20oC – 60oC, có chế độ ổn định nhiệt độ, được
sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật tại nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của
chúng. Tùy vào đối tượng nuôi cấy mà ủ ở t o khác nhau để vi sinh vật có thể phát triển tốt. Ví
dụ: Coliform 30oC/24h – 48h, E. coli thích hợp ở 44oC/24h – 48h.
1.3. Tủ lạnh hay tủ mát (freezer): dùng bảo quản môi trường đã pha chế, giống vi
khuẩn, các chế phẩm sinh học (vaccin, huyết thanh, đĩa giấy kháng sinh,…), hóa chất, thuốc
thử dễ phân hủy ở nhiệt độ thường.
1.4. Nồi hấp ướt (Autoclave): Thiết bị này cấp nhiệt bằng hơi nước ở áp suất cao (hơi
nước bão hòa ở áp suất cao), được sử dụng để hấp khủ trùng môi trường, một số nguyên liệu
và dụng cụ thí nghiệm. Tùy đối tượng mà sử dụng ở chế độ nhiệt độ và áp suất thích hợp,
thường dùng ở 121oC/1 atm/ 15 phút. Hay 127oC/1.5 atm/30 phút với môi trường đất, 117 oC/
0.8 atm/15 phút với môi trường chứa nhiều đường, môi trường sữa……
Thể tích môi trường nuôi
cấy (ml)
25
50
100
250

500
1000
2000
4000

Thời gian hấp tiệt trùng
tối thiểu (phút)
20
25
28
31
35
40
48
63

Trang 3


Chỉ số áp kế của 0,0
nồi áp suất (atm)
To sôi nước (oC)
100
o

o

T sôi nước ( F)

212

0,2

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,5

2,0

105

110

112

114

116

117

119

121

127

134

221

230

234

237

241

243

246

250

261

273

Hình. Nồi hấp cao áp (Autoclave)
1.5. Cân phân tích điện tử (analytical balance): cân trọng lượng từ 100µg – 200g.
Độ chính xác 10-4 g. Cân kỹ thuật (technical balance): độ chính xác 10 -2g. Dùng cân hóa chất,
môi trường.

A

B

Hình. Cân phân tích (A) và cân kỹ thuật (B)
1.6. Tủ cấy vô khuẩn có đèn cực tím (UV) (flux laminar ): Có không gian vô trùng
được sử dụng để thao tác với vi sinh vật nhờ hệ thống đèn tử ngoại và bộ phận thổi khí vô
trùng.

Hình. Tủ cấy vô trùng

1.7. Máy ly tâm (centrifuge): Dùng tách các chất ở các pha rắn-lỏng ra khỏi nhau như
Trang 4


tách sinh khối tế bào ra khỏi môi trường nuôi cấy, tách hồng cầu, enzyme,…

Hình. Máy ly tâm
1.8. Máy lắc (shaker): Thiết bị dùng để nuôi cấy, nhân giống vi sinh vật bằng cách
lắc các bình nuôi cấy theo các chiều khác nhau (lắc vòng và lắc ngang) một cách đều đặn để
tăng lượng oxy hòa tan trong môi trường.

Hình. Máy lắc
1.9. Kính hiển vi (microscope): có vai trò rất quan trọng nghiên cứu vi sinh vật.

Dùng nghiên cứu, quan sát tế bào vi sinh vật về đặc điểm hình thái, sinh lý nhờ vào khả năng
phóng đại của kính (sẽ giới thiệu chi tiết ở bài sử dụng kính hiển vi).

Hình. Kính hiển vi quang học
1.10. Máy đo pH (pH meter): đo pH dung dịch, môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Trang 5


A

B

Hình. Máy đo pH để bàn (A), máy đo pH cầm tay (B)
1.11. Máy cất nước (single/ double water stills): dùng để cất nước.

Hình. Máy cất nước
1.12. Bể ổn nhiệt (water bath): chứa nước và được cài đặt ở nhiệt độ nhất định để ổn
định nhiệt độ cho những thí nghiệm cần sự ổn định về nhiệt độ.

Hình. Bể ổn nhiệt
1.13. Nồi lên men (fermenter/Bioreactor): thiết bị lên men nuôi cấy vi sinh vật trong
điều kiện tối ưu hóa và điều chỉnh được các thông số môi trường nuôi cấy

Trang 6


Hình. Nồi lên men
1.14. Các thiết bị khác như: máy đếm vi sinh vật, máy quang phổ, sấy đông khô,…
2. Dụng cụ

- Dụng cụ thủy tinh: có nhiều loại với nhiều kích cỡ khác nhau như bình tam giác, ống
nghiệm, đĩa petri, lam kính, đũa thủy tinh, que trang, ống đong, cốc đong, bình định mức,…
yêu cầu phải sạch, trong, trung tính. Trước khi dùng đựng môi trường phải được sấy khô, làm
nút bông và khử trùng trong tủ sấy khô.
- Đối với dụng cụ mới: cần ngâm nước hoặc dung dịch H 2SO4 loãng trong 24 giờ. Sau
đó mới rửa lại bằng nước hoặc xà phòng nhiều lần cho đến khi pH trung tính.
- Đối với dụng cụ đã qua sử dụng còn chứa môi trường và vi sinh vật, cần khử trùng
rồi mới rửa sạch bằng xà phòng, phơi và sấy khô.
- Đối với dụng cụ bị bám bẩn, cần ngâm thêm với dung dịch sulfocromic vài giờ, sau
đó rửa lại bằng nước sạch.
- Dụng cụ sạch khi đưa lên ánh sáng không có vết mờ và vết bợn.
- Các dụng cụ khác: như đèn cồn, giá ống nghiệm, que cấy, kẹp, kéo, bơm tiêm nhựa,
đầu típ, bếp điện,…
3. Các phương pháp khử trùng vi sinh vật
* Nguyên tắc
Diệt trùng hay khử trùng là phương pháp nhằm ức chế hoặc loại bỏ, cuối cùng là giết
chết các vi sinh vật không mong muốn.
Người ta thường khử trùng bằng 2 phương pháp chính:
3.1. Phương pháp lý học
* Nhiệt khô.
- Đối với dụng cụ cấy kim loại, đôi khi cả thủy tinh, phương pháp thường dùng là đốt:
đốt trực tiếp trên ngọn lửa hoặc nhúng cồn đốt.
- Đối với dụng cụ thủy tinh có thể gói giấy và sấy ở 160 oC/ 1 giờ. Dụng cụ đưa vào
sấy phải chịu được nhiệt độ cao và không buộc dây nhựa hoặc thun.
* Nhiệt ẩm.
- Phương pháp luộc: cho vật khử trùng vào nước sôi, nhiệt sẽ thấm nhanh vào mẫu vật
làm cho protein đông kết, dẫn đến giết chết vi sinh vật. Tuy nhiên, chỉ diệt tế bào sinh dưỡng,
bào tử vẫn còn.
- Phương pháp Pasteur: Chỉ diệt vi khuẩn gây bệnh ( ký sinh ), không diệt bào tử và vi
khuẩn hoại sinh. Phương pháp này không diệt hoàn toàn mầm bệnh mà chỉ chọn một vài vi

sinh vật đối kháng mạnh nhất. Vì vậy, phải biết nhiệt độ và thời gian diệt trùng cho từng loại
vi sinh vật.
- Phương pháp Tyndall: đun cách thủy nhiều lần ở nhiệt độ 70- 80 oC, mỗi lần 30-60
phút và liên tiếp trong 3 ngày liền.
- Phương pháp hơi nước bảo hòa ở áp suất cao: dùng autoclave.
* Diệt trùng bức xạ.
- Tia tử ngoại hay UV: chỉ sát trùng bề mặt, không xuyên sâu vào mẫu vật.
- Tia âm cực: dùng trong diệt trùng dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm. Vật khử
Trang 7


trùng phải bao gói kín.
* Diệt trùng bằng sóng.
Sóng ngắn khi tác động với cường độ và thời gian thích hợp có thể phá vỡ tế bào vi
sinh vật, làm chết các tế bào sống.
* Diệt trùng bằng cách lọc.
- Dụng cụ lọc thường là những màng xốp bằng sứ, aminate, cellulose,… thường là
những vật phẩm lỏng không khử trùng bằng nhiệt được.
- Đối với khử trùng không khí thì thiết bị khử trùng là một máy lọc khí có trang bị
màng lọc hay hấp phụ vi khuẩn.
3.2. Phương pháp hóa học.
- Chất sát khuẩn ngoài da: xà phòng, cồn, iode, phẩm màu (phần lớn phẩm màu có tác
dụng sát khuẩn như: xanh methylene).
- Chất diệt khuẩn và tẩy uế: phenol, formol, hợp chất Clor,…
4. Những điểm cần lưu ý
- Không làm vụn bông không thấm khi làm nút đậy cho các dụng cụ như ống nghiệm,
bình tam giác.
- Khi nút bông gòn vào đuôi pipette, độ chặt phải vừa đủ, phải kiểm tra khả năng hút
dung dịch của pipette sau khi nút xong.
- Kích thước nút đậy của ống nghiệm, bình tam giác phải phù hợp, tiện dụng.

5. Báo cáo thực tập
- Trình bày yêu cầu của việc bao gói dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật?
- Công dụng và cách sử dụng các dụng cụ, thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh vật?
- Trình bày phương pháp tiệt trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy vi sinh vật?

Trang 8


BÀI 2
PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
VI SINH VẬT
1. Nguyên tắc
Các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào.
Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì
thế oxi hoá khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môi trường.
Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng: có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết; có độ pH
thích hợp; có độ nhớt nhất định; không chứa các yếu tố độc hại; hoàn toàn vô trùng đảm bảo
sự phát triển ổn định của vi sinh vật.
Phân loại môi trường dinh dưỡng: người ta dựa trên các cơ sở khác nhau để phân loại
môi trường
- Phân loại theo nguồn gốc
+ Môi trường tự nhiên: dịch nước chiết thịt, nước chiết khoai tây, máu động
vật...
+ Môi trường nhân tạo: Czapeck, Hansen, EMB...
+ Môi trường bán tự nhiên: Potatoe glucose agar (PGA), giá đậu đường...
- Phân loại theo trạng thái vật lý:
+ Môi trường lỏng: dạng lỏng, không có agar hay các chất làm giá thể khác
trong thành phần môi trường
+ Môi trường rắn: mỗi 1000ml môi trường có 15-20g agar hay các chất làm giá
thể

+ Môi trường bán lỏng (bán rắn): mỗi 1000ml môi trường có 3-5g agar hay các
chất làm giá thể khác.
- Phân loại theo công dụng:
+ Môi trường phân lập
+ Môi trường tăng sinh
+ Môi trường lưu giữ giống
+ Môi trường thử nghiệm sinh hóa
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật được pha chế theo nguyên tắc:
- Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hoá các chất dinh
dưỡng của từng loại sinh vật.
- Để đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vât
nên cần điều chỉnh tỷ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trường.
- Đảm bảo các điều kiện hoá lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh
vật.
2. Dụng cụ, môi trường và hóa chất
2.1. Dụng cụ
STT

Tên dụng cụ, thiết bị mỗi
nhóm (3 sinh viên)

Đơn vị tính

Số lượng

1

Giá ống nghiệm

Cái

1

2

Ống nghiệm Ф18

Cái

5

3

Bình tam giác

Cái

1

4

Phễu thủy tinh

Cái

1

5

Đũa khuấy thủy tinh

Cái

1

Ghi chú

Trang 9


STT

Tên dụng cụ, thiết bị mỗi
nhóm (3 sinh viên)

Đơn vị tính

Số lượng

6

Cốc 100ml

Cái

3

7

Cốc 500ml

Cái

1

8

Đĩa cân nhựa

Cái

3

9

Bình tia

Cái

1

10

Bếp điện

Cái

1

Đơn vị tính

Số lượng

STT

Dụng cụ dùng chung

1

Máy đo pH

Cái

1

2

Cân kỹ thuật

Cái

1

3

Cân phân tích

Cái

1

4

Nồi hấp cao áp

Cái

1

5

Tủ sấy

Cái

1

Ghi chú

Ghi chú

2.2. Môi trường và hoá chất
* Môi trường nuôi cấy vi khuẩn:
Môi trường cao thịt - peptone
- Cao thịt: 3g
- Peptone: 10g
- NaCl : 5g
- Agar: 20g
- Thêm nước cất cho đủ 1000ml.
Lắc đều, điều chỉnh pH=7,0±0,2

Nấu sôi nhẹ để tan agar, phân phối môi trường vào các dụng cụ để khử trùng ở 121 oC
trong 30 phút
* Môi trường nuôi cấy nấm men:
Môi trường Hansen
- Glucose, maltose (hoặc đường kính ): 50g
- Peptone:10g
- K2HPO4: 3g
- MgSO4.7H2O : 2 - 5g
- Agar: 20g
- Thêm nước cất đủ: 1000ml
Lắc đều, điều chỉnh pH=6,0±0,2
Trang 10


Nấu sôi nhẹ để tan agar, phân phối môi trường vào các dụng cụ để khử trùng ở 121 oC
trong 30 phút
* Môi trường nuôi cấy nấm mốc:
Môi trường Czapek
- Saccarose: 30g
- NaNO3: 30g
- K2HPO4:1 g
- MgSO4: 0,5g
- FeSO4: 0,01g
- Thạch (agar): 20g;
- Thêm nước cất đủ: 1000ml
pH = 6,0±0,2 khử trùng 1atm / 30 phút.
* Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn:
Môi trường Gauze 1
- Tinh bộ tan: 20g
- K2HPO4: 0,5g

- MgSO4.7H2O: 0,5g
- KNO3: 1,0g
- NaCl : 0,5g
- FeSO4 : 0,1g
- Agar: 20g
- Nước cất đủ: 1000 ml
pH = 7,2 ÷ 7,4 khử trùng 1atm/30 phút
* Môi trường nuôi cấy tảo
Môi trường Tamiya
- KNO3: 5,000
- MgSO4: 2,500
- KH2PO4: 1,250
- FeSO4.7H2O: 0,003 - EDTA: 0,037
- Vi lượng A5: 1 ml
- Agar: 20g
- Nước cất đủ 1.000 ml
Thành phần vi lượng A5
- H3BO3: 2,860
- MnCl2.4H2O: 1,810
- ZnSO4.7H2O: 0,222
- MoO3: 176,4
Trang 11


- NH4VO3: 229,6
- Nước cất đủ 1.000 ml
2.3. Nguyên liệu khác
- Giấy lọc
- Bông không thấm
- Bông thấm nước

3. Tiến hành thí nghiệm
Làm môi trường để thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồng
thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng.
Các bước chế tạo môi trường dinh dưỡng:
3.1. Chuẩn bị dụng cụ
tất cả các dụng cụ cần sử dụng trong suốt quá trình pha chế môi trường phải được
chuẩn bị đầy đủ. Các dụng cụ được rửa sạch, tráng bằng nước cất, sấy khô trước khi sử dụng.
3.2. Cân đong hóa chất pha chế môi trường
Cân, đong thật chính xác từng thành phần môi trường và pha chế theo đúng trình tự
hướng dẫn trong tài liệu. Dùng đĩa cân nhựa hoặc cốc thủy tinh để cân đong các loại hóa chất
dễ hút ẩm
3.3. Phối chế tạo môi trường nuôi cấy
- Các thành phần của môi trường được hòa tan riêng rẽ trong nước cất trước khi phối
trộn.
- Phối trộn các thành phần theo trình tự nhất định tránh sự tương tác trực tiếp của các
thành phần có thể phản ứng tạo kết tủa với nhau. Phối trộn dựa trên nguyên tắc thể tích tăng
dần.
- Sau khi phối chế các thành phần, cần tiến hành lọc môi trường qua giấy lọc, bông
thấm nước (đối với môi trường lỏng) hoặc vải màn (đối với môi trường đặc) để làm trong môi
trường, đảm bảo việc quan sát vi sinh vật được dễ dàng.
- Đối với môi trường rắn, sau khi phối trộn các thành phần, phải tiến hành nấu sôi môi
trường để làm tan hoàn toàn agar trước khi phân phối vào dụng cụ chứa.
3.4. Điều chỉnh độ pH của môi trường
- Muốn điều chỉnh độ pH của môi trường có thể dùng HCl 10 % hay NaCl 10 %. Ngoài
ra có thể dùng một số hoá chất khác như: H3PO4, H2SO4, KOH, NaHCO3, Na2CO3 ...
- Muốn kiểm tra độ pH của môi trường nên dùng máy đo pH (pH-metre). Phương pháp
này nhanh nhạy và cho độ chính xác cao. Trong phòng thí nghiệm có thể dùng chỉ thị màu
xanh bromotomol hay giấy quỳ để đo pH. Phương pháp này tiện lợi, nhanh nhưng không cho
độ chính xác cao.
3.5. Phân phối môi trường vào dụng cụ chứa

- Môi trường sau khi pha chế xong thường được phân phối môi trường vào ống
nghiệm, bình tam giác. Trình tự phân phối gồm các bước sau:
+ Môi trường cần được đun cho hoá chất lỏng rồi đổ qua phễu thuỷ tinh vào các dụng
cụ.
+ Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường, tay phải kẹp nút bông và kéo ra.
+ Nhanh tay rót môi trường vào dụng cụ và đậy nút bông lại.
- Đối với ống nghiệm: Nếu dùng môi trường làm thạch nghiêng thì lượng môi trường
cần được phân phối chiếm 1/4 thể tích của ống nghiệm. Nếu làm thạch đứng thì lượng môi
trường cần được phân phối từ 1/2 - 1/3 thể tích ống nghiệm.
- Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng môi trường được phân phối chiếm 1/2 1/3 thể tích của bình.
- Đối với đĩa petri, môi trường chỉ được phân phối vào đĩa sau khi đã hấp tiệt trùng.
Thể tích môi trường khoảng 12-15ml mỗi đĩa, lớp môi trường thạch dầy khoảng 2mm.
- Viết nhãn môi trường trên dụng cụ chứa, bao gồm các thông tin:
Trang 12


+ Tên môi trường
+ Ngày khử trùng
+ Người pha chế
3.6. Khử trùng môi trường
- Tuỳ theo tính chất và điều kiện cụ thể của từng loại môi trường mà có chế độ và
phương pháp khử trùng khác nhau. Môi trường thường được hấp tiệt trùng bằng nồi ấp cao áp.
Thời gian hấp tiệt trùng môi trường ở nhiệt độ 121 oC phụ thuộc vào lượng môi trường được
phân phối vào dụng cụ chứa (xem bài 1).
- Đối với môi trường có các thành phần dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao (vitamin, chất
kháng sinh, chất kích thích sinh trưởng...), cần hấp tiệt trùng môi trường trước, sau đó bổ sung
các thành phần này sau khi hấp xong.
- Một số loại môi trường không được hấp tiệt trùng theo quy định của nhà sản xuất (ví
dụ: môi trường Selenit cystine broth, Xylose lysin deoxycholate agar, Chromocult coliform
agar...), cần chuẩn bị nước cất vô trùng trước, sau đó pha chế và sử dụng ngay.

3.7. Làm thạch nghiêng, thạch đứng, đổ thạch vào đĩa petri
- Làm thạch nghiêng: cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường vừa kết thúc và
môi trường chưa đông đặc. Ống nghiệm được đặt nghiêng cố định trên giá đỡ. Phần đỉnh
nghiêng phải cách nút đậy 3-5cm. Phần đáy phải có một phần thạch đứng 0,5-1cm.
- Làm thạch đứng: đặt các ống nghiệm đã có môi trường làm thạch đứng vào giá ,để
yên cho đến khi môi trường nguội và đông đặc.
- Đổ thạch vào đĩa petri: môi trường vô trùng chứa trong ống nghiệm hoặc bình tam
giác được rót vào phần đáy của đĩa petri. Toàn bộ quy trình đổ thạch vào đĩa petri đều thực
hiện trong tủ cấy vô trùng hoặc trong phạm vi vô trùng của ngọn lửa đèn cồn.
3.8 Kiểm tra độ vô trùng và bảo quản
- Môi trường sau khi pha chế xong, được đặt ở điều kiện nhiệt độ phòng 24 giờ. Sau
thời gian này kiểm tra độ vô trùng của môi trường bằng cách quan sát trạng thái môi trường.
- Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ mát, hạn chế tác dụng của ánh sáng,
nhiệt độ từ 0 - 50C và không để môi trường bị khô. Thời gian lưu trữ tối đa là 15 ngày.
- Trước khi sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường, người ta thường đặt
chúng vào tủ ấm 370C, trong 48 - 72h. Sau đó lấy ra quan sát, loại bỏ các ống có vi sinh vật
phát triển và chỉ sử dụng những ống nghiệm, những đĩa petri có môi trường đạt yêu cầu.

Thạch
đứng

Đĩa thạch

Canh
trường

Thạch
nghiêng

Trang 13

Hình. Một số dạng môi trường trong ống nghiệm và hộp petri
4. Những điểm cần lưu ý
- Khi pha chế môi trường rắn hoặc bán rắn, thành phần agar trong môi trường có thể bổ
sung sau khi điều chỉnh pH của môi trường.
- Đối với môi trường rắn hoặc bán rắn, cần phải nấu sôi để làm tan agar hoàn toàn trước
khi phân phối vào dụng cụ chứa.
- Khi điều chỉnh pH, cần dùng từng lượng nhỏ các dung dịch điều chỉnh (dung dịch
NaOH, HCl) để tránh vượt quá pH cần. pH môi trường cần được kiểm tra trước và sau khi
hấp tiệt trùng.
- Các thao tác phân phối môi trường vào dụng cụ phải nhanh, gọn, khéo léo để môi
trường không dính lên miệng dụng cụ hoặc nút bông và việc phân phối cần thực hiện xong
trước khi môi trường bị đông đặc.
5. Báo các thực tập
- Trình bày khái niệm môi trường và phân loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật?
- Trình bày quy trình pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật?
- Yêu cầu của môi trường trong đĩa petri, ống nghiệm thạch nghiêng và thạch đứng?
- Giải thích tạo sao không phân phối môi trường vào đĩa petri trước khi khử trùng?
- Đĩa petri chứa môi trường trước khi cấy vi sinh vật nên đặt úp hay ngửa? Tại sao?

Trang 14


BÀI 3
PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT
1. Nguyên tắc
Quá trình nuôi cấy vi sinh vật gồm 2 khâu: cấy và nuôi. Cấy là những thao tác chuyển
vi sinh vật từ môi trường đang sống sang môi trường thuận lợi hơn cho sự phát triển của
chúng. Nuôi là quá trình đảm bảo và duy trì những điều kiện thuận lợi nhất cho sự hoạt động

và phát triển của vi sinh vật. Hai khâu này luôn gắn bó với nhau trong quá trình nghiên cứu
và ứng dụng vi sinh vật.
* Mục đích của việc nuôi cấy
- Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các nguyên liệu và vật phẩm cần nghiên
cứu.
- Tiến hành việc nhân giống các vi sinh vật một cách nhanh chóng.
- Bảo tồn các giống vi sinh vật thuần khiết.
- Nghiên cứu các đặc tính sinh học và sự phát triển của từng loại vi sinh vật.
* Nguyên tắc nuôi cấy vi sinh vật
- Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp nhiễm
các vi sinh vật không mong muốn từ môi trường ngoài.
- Môi trường và dụng cụ nuôi cấy đều phải được khử trùng triệt để.
- Duy trì tốt các điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, oxy...) để vi sinh vật
phát triển thuận lợi.
2. Dụng cụ, môi trường và hóa chất
2.1. Dụng cụ
STT

Tên dụng cụ, thiết bị mỗi
nhóm (3 sinh viên)

Đơn vị tính

Số lượng

1

Giá ống nghiệm

Cái

1

2

Ống nghiệm Ф18

Cái

1

3

Cốc 100ml

Cái

3

4

Cốc 500ml

Cái

1

5

Đèn cồn

Cái

1

6

Que cấy

Cái

1

7

Bình tia

Cái

1

Đơn vị tính

Số lượng

STT

Dụng cụ dùng chung

1

Tủ ấm

Cái

1

2

Tủ cấy vô trùng

Cái

1

Ghi chú

Ghi chú

2.2. Môi trường, hóa chất
- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: đã được chuẩn bị ở bài 2, bao gồm các loại
+ Môi trường cao thịt – pepton: nuôi cấy vi khuẩn
+ Môi trường Hansen: nuôi cấy nấm men
+ Môi trường Czapeck: nuôi cấy nấm mốc
- Cồn 96o
Trang 15


2.3. Chủng giống vi sinh vật
- Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzea

- Nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces vini
- Vi khuẩn: Escherichia coli, Bacillus subtilis
2.4. Nguyên liệu khác
- Giấy lọc
- Bông không thấm
- Bông thấm nước
3. Tiến hành thí nghiệm
3.1. Cấy truyền vi sinh vật trên môi trường lỏng
Cấy truyền là phương pháp lấy vi sinh vật từ ống nghiệm này sang một ống nghiệm
khác. Trước khi cấy, tiến hành dán nhãn ghi: tên loại vi sinh vật, ngày cấy vào thành ống
nghiệm bên dưới nút ống nghiệm.
a. Cấy truyền bằng pipet Pasteur
- Khử trùng pipet pasteur qua ngọn lửa đèn cồn
- Tay trái cầm ống giống gốc, dùng ngón tay út phải mở nút bông của ống giống, hơ
và xoay miệng ống giống qua ngọn lửa đèn cồn để sát khuẩn.
- Cho pipet pasteur vào ống giống lỏng để lấy dịch vi khuẩn (dịch dâng lên trong pipet
từ từ theo lực mao dẫn), nhanh chóng đặt ngón tay trỏ phải lên đầu pipet, rút pipet ra khỏi
ống, đậy nút bông lại rồi đặt ống giống vào giá.
- Cầm ống môi trường mới bằng tay trái, mở nút bằng ngón tay út phải, khử khuẩn
miệng ống, cho pipet vào tới khi đầu pipet chạm vào môi trường và để chảy ra vài giọt dịch
chứa vi khuẩn. Rút pipet ra, khử trùng miệng ống, đậy nút.
- Đặt pipet vào bình đựng thuốc sát khuẩn.
b. Cấy truyền bằng que cấy vòng
- Tay trái cầm hai ống nghiệm: 1 ống giống; 1 ống môi trường.
- Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây
cấy.
- Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút ống nghiệm vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút
ống nghiệm ra.
- Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng 2 ống nghiệm.
- Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống

giống.
- Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa vào ống môi
trường. Khi đầu que cấy chạm vào môi trường thì lắc khẽ que cấy cho vi khuẩn tan trong môi
trường.
- Khử trùng lại phần không khí nơi miệng 2 ống nghiệm rồi đậy nút lại
- Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong.
* Chú ý
- Nếu ống giống là canh trường lỏng có vi sinh vật thì dùng pipet hút canh trường thay
que cấy.
- Thao tác khử trùng ống hút bắt đầu thực hiện ở đầu nhỏ của ống hút sau khi đã tháo
giấy bao gói.
- Sử dụng xong cắm ống hút vào dung dịch sunfocromic để khử trùng.

Trang 16


Hình. Thao tác cấy truyền vi sinh vật trên môi trường lỏng
3.2. Phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch
a. Cấy truyền trên ống nghiệm thạch nghiêng
Phương pháp này dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí. Gồm các thao tác như
sau:
- Dán nhãn ghi: tên loại vi sinh vật, ngày cấy vào thành ống nghiệm.
- Sử dụng que cấy đầu tròn thực hiện các thao tác cấy
- Tay trái cầm hai ống nghiệm: 1 ống giống; 1 ống môi trường.
- Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây
cấy.
- Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút đậy ống nghiệm vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo
nút đậy ra.
- Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng 2 ống nghiệm.
- Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống

giống.
- Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa vào ống môi
trường để thực hiện thao táo cấy:
- Hòa giống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm.
- Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu:
+ Hình chữ chi.
+ Hình vòng xoắn.
+ Hình vạch ngang song song.
- Khử trùng lại phần không khí nơi miệng 2 ống nghiệm rồi đậy nút bông.
- Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong
Trang 17


* Đối với nấm mốc hoặc các vi sinh vật đa bào sinh bào tử khác, khi cấy trên ống
nghiệm thạch nghiêng, dùng que cấy móc vô trùng lấy bào tử từ ống giống. Cấy truyền bào tử
sang ống nghiệm môi trường mới theo 2 cách:
- Cấy điểm: cách cắm ngập đầu que cấy thành 3 điểm cách đều nhau trên bề mặt thạch
- Cấy gõ: đưa que cấy có mang bào tử vào ống nghiệm môi trường, gõ nhẹ lưng que
cấy vào thành ống nghiệm đối diện với mặt thạch để rải bào tử xuống.

Hình. Cấy truyền trên ống nghiệm thạch nghiêng
b. Cấy trên ống nghiệm thạch đứng
- Phương pháp này dùng để cấy các vi sinh vật kỵ khí.
- Sử dụng que cấy đầu nhọn.
- Sau khi lấy giống vi sinh vật, dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch hình
trụ.
- Đâm sát đáy ống nghiệm và đâm thành 3 đường: 1 đường chính giữa, 2 đường sát
thành ống tùy yêu cầu.
- Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường.

Trang 18


Hình. Phương pháp cấy trên thạch đứng
c. Cấy truyền trên thạch đĩa
- Dùng que cấy đầu tròn, hoặc que trải thủy tinh.
- Dùng que cấy đầu tròn lấy vi sinh vật bằng tay phải theo đúng quy cách đã hướng
dẫn ở trên.
- Tay trái cầm hộp petri khẽ hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn. Sau đó để cách đèn cồn
chừng 1 - 2cm, khẽ mở mở nghiêng một bên hộp (phần hơ lửa), sao cho vừa đủ để cho que
cấy vào.
- Nhẹ nhàng, nhanh chóng lướt que cấy trên mặt thạch theo một trong các kiểu sau:
+ Theo hình zig zac trên toàn bộ mặt thạch
+ Theo những đường song song
+ Theo hình zig zac 3 hoặc 4 góc.
- Khi dùng que trải, hút sẵn một lượng khoảng 0,1 dịch vi sinh vật nhỏ lên trên bề mặt
thạch đĩa. Khử trùng que trải thủy tinh bằng cách nhúng vào cồn và đốt trên ngọn lửa. Làm
nguội que trải và trải đều giọt dung dịch vi sinh vật lên khắp bề mặt môi trường thạch đĩa.

(d)

Hình. Các kiểu cấy truyền bằng que cấy trên thạch đĩa

Trang 19


Hình. Cấy truyền bằng que trải trên thạch đĩa
3.3. Các điều kiện nuôi cấy của vi sinh vật
- Nhiệt độ: Phụ thuộc vào từng loại vi sinh vật. Duy trì sự ổn định của nhiệt độ đó
bằng tủ ủ vi sinh vật.

- Độ ẩm: để duy trì độ ẩm, trong quá trình nuôi cần đảm bảo đủ lượng nước khi làm
môi trường. Trong điều kiện cần thiết có thể phun nước vô khuẩn vào phòng nuôi hoặc để
nước bốc hơi trong tủ ấm.
- Oxy: đối với vi sinh vật hiếu khí, cung cấp thường xuyên và đầy đủ oxy. Lớp môi
trường nuôi cấy có độ dầy vừa phải. Các bình chứa môi trường được lắc thường xuyên trong
quá trình nuôi để cung cấp thêm oxy cho vi sinh vật. Nếu nuôi cấy trong môi trường có khối
lượng lớn phải tiến hành sục khí thường xuyên hay định kỳ. Đối với vi sinh vật kỵ khí: hạn
chế sự tiếp xúc với oxy bằng cách đổ lên bề mặt môi trường parafin, dầu vaselin hoặc cấy
trích sâu vào môi trường đặc, nuôi cấy trong bình hút chân không, nuôi trong ống nghiệm đặc
biệt, sau khi rút hết không khí và hàn kín lại, đun sôi môi trường trong một thời gian để loại
hết O2 . Để nguội 450C. Dùng pipet cấy vi sinh vật vào đáy ống nghệm. Làm nguội nhanh rồi
đổ vaselin lên bề mặt để hạn chế sự tiếp xúc với oxy.
3.4. Quan sát vi sinh vật sau khi nuôi cấy
Sau khi nuôi ở thời gian và nhiệt độ thích hợp cho mỗi loại vi sinh vật ta thấy:
- Trong môi trường lỏng: Vi khuẩn phát triển sẽ làm đục môi trường
- Trong môi trường đặc ở thạch nghiêng: Nấm men, vi khuẩn phát triển sẽ tạo nên vệt
nổi trên mặt thạch trong hay trắng đục. Nấm mốc sẽ tạo nên những sợi mảnh từ vết cấy.
- Trong môi trường thạch đứng: Các vi khuẩn kỵ khí phát triển ở đáy của cột môi
trường..
4. Những điểm cần lưu ý
- Môi trường thạch phải có bề mặt khô, phẳng. Nếu ống môi trường còn đọng nước
cần dựng ống mới cấy vào giá ống nghiệm, tránh nước làm hoen vết cấy.
- Khi tiến hành cấy truyền tránh chạm đầu que cấy dùng để lấy vi khuẩn vào bất cứ vật
gì.
- Nếu dịch vi khuẩn cấy truyền rơi xuống mặt bàn cần lau ngay bằng panh kẹp bông
thấm cồn hoặc nước sát trùng.
- Khi cấy truyền vi khuẩn, dùng tay trái cầm hai ống nghiệm; ống có vi sinh vật ở xa
và ống môi trường ở gần người thao tác. Trước và sau khi cấy truyền xong phải hơ que cấy
trên ngọn lửa đèn cồn để vô trùng que cấy.
5. Báo cáo thực tập

- Trình bày phương pháp cấy truyền vi khuẩn, nấm men, nấm mốc?
- Nêu các điều kiện nuôi ủ nấm men và vi khuẩn sau khi gieo cấy?
- Đĩa petri sau khi cấy vi sinh vật nên đặt úp hay ngửa mặt thạch? Giải thích?
- Khi cấy truyền vi sinh vật trên ống thạch nghiêng, giải thích tại sao phải ria que cấy
ngược từ đáy ống nghiệm lên phía trên?

Trang 20


BÀI 4
PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT VI SINH VẬT BẰNG KÍNH HIỂN
VI QUANG HỌC
1. Nguyên tắc
1.1. Giới thiệu về các loại kính hiển vi
a. Kính hiển vi nền đen
Ánh sáng thường chiếu từ dưới lên, qua rìa của tụ quang nền đen, chiếu hắt vào xung
quanh tiêu bản, những tia sáng này bị tiêu bản làm khúc xạ rồi đưa vào vật kính. Tiêu bản
được soi sáng rực trên nền đen, giống như trong phòng tối có một tia sáng mạnh chiếu vào,
giúp thấy rõ từng hạt bụi trong không khí bị tia sáng chiếu vào. Chức năng: quan sát hình thái
và đặc tính của một số vi khuẩn mà kính hiển vi thường khó quan sát.
b. Kính hiển vi đổi pha
Ánh sáng thường bị đổi pha và biên độ dao động bởi cấu trúc đặc biệt của tụ quang
kính, vật kính và thị kính. Chức năng: dùng quan sát rõ nét các cấu trúc nhỏ như tiên mao, các
lớp màng.
c. Kính hiển vi huỳnh quang
Chùm tia tử ngoại chiếu vào tiêu bản đã nhuộm màu bằng các chất huỳnh quang.
Trong tế bào, các cấu trúc khác nhau sẽ phát quang với màu sắc khác nhau. Chức năng: quan
sát và phân biệt được các cấu trúc khác nhau trong tế bào vi sinh vật.
d. Kính hiển vi điện tử
Chùm tia điện tử bước sóng rất ngắn, năng suất phân li rất lớn nên độ phân giải cao,

giúp phân biệt 2 điểm rất gần nhau. Chức năng: dùng quan sát virus, cấu trúc phân tử của tế
bào.
e. Kính hiển vi quang học
Dùng ánh sáng có bước sóng từ 500nm – 560 nm trong chùm ánh sáng thường để tạo
năng suất phân ly lớn giúp phân biệt 2 điểm cách nhau khoảng 0.2 µm trở lên. Hệ thống
phóng to của kính hiển vi quang học gồm hai bộ phận:
Vật kính (quay về phía vật quan sát) và thị kính (quay về phía mắt nhìn). Mỗi bộ phận
này là một hệ thống thấu kính hội tụ phức tạp, mẫu vật cần quan sát AB được đặt trước vật
kính một khoảng cách lớn hơn tiêu cự của vật kính một chút. Ảnh thật đảo ngược A’B’ của
vật sẽ thu được ở bên kia vật kính, nằm trong khoảng tiêu cự của thị kính. Thị kính hoạt động
như một kính lúp. Qua thị kính, người ta sẽ thấy ảnh ảo A’’B’’ được phóng to lên của ảnh
thật A’B’.

Hình. Nguyên tắc quang học của kính hiển vi
Chức năng của kính hiển vi quang học dùng để quan sát tế bào vi sinh vật, ký sinh
trùng, tế bào động vật, thực vật.
1.2. Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của kính hiển vi quang học
Kính hiển vi quang học được cấu tạo gồm 2 phần:
- Hệ thống cơ học: giá kính gồm chân kính, thân kính, trụ đỡ và xoay thị kính, ổ gắn
Trang 21


và xoay vật kính, bàn kính, thanh trượt di chuyển tiêu bản, ốc di chuyển thanh trượt, kẹp giữ
tiêu bản, ốc di chuyển tụ quang kính, ốc điều chỉnh sơ thô cấp, ốc điều chỉnh thứ cấp (vi
cấp).
- Hệ thống quang học gồm: thị kính, vật kính, tụ quang kính, màn chắn sáng, nguồn
chiếu sáng (đèn điện chiếu sáng và/ hoặc kính chiếu sáng). Ngoài ra, ở kính dùng nguồn
chiếu sáng là đèn điện thì có thêm bộ phận cung cấp điện như phích cắm, dây điện, cầu chì,
mạch điện (trong chân kính) và nút điều chỉnh cường độ chiếu sáng.

Thị kính
Ống kính
Thân kính
Tụ quang vật kính

Vật kính

Ốc chỉnh tinh

Bàn mang mẫu vật

Ốc chỉnh thô

Tụ quang
Đèn
Đế kính

Hình. Cấu tạo kính hiển vi quang học
* Nguyên tắc hoạt động của kính hiển vi quang học
- Vật kính là hệ thống quang học phức tạp gồm một số thấu kính, trực tiếp phóng đại
mẫu vật. Các thấu kính sắp xếp theo thứ tự, thấu kính nhỏ ngoài cùng hướng vào tiêu bản có
độ phóng đại lớn nhất. Độ phóng đại của kính phụ thuộc tiêu cự, tức bán kính cong của thấu
kính. Thấu kính càng cong, tiêu cự càng ngắn thì khả năng phóng đại càng lớn.
Có 2 loại vật kính:
+ Vật kính khô độ phóng đại nhỏ như x4, x10, x15, x40,.
+ Vật kính dầu có độ phóng đại lớn như x90, x100.
- Thị kính cũng có cấu tạo phức tạp, gồm 2 thấu kính, một hướng về mắt người xem,
một hướng về vật kính. Thị kính phóng đại một lần nữa ảnh do vật kính thu vào, làm ảnh to
lên, xem rõ hơn.
Độ phóng đại của kính = độ phóng đại của vật kính x độ phóng đại của thị kính.

Ví dụ: Độ phóng đại của vật kính: x100 , độ phóng đại của thị kính: x10
Như vậy: độ phóng đại của kính: 100 x 10 = 1.000 lần.
Năng suất phân ly của kính quan trọng hơn độ phóng đại, và là tiêu chuẩn chính để
chọn kính hiển vi. Năng suất phân ly (độ phân giải) của kính hiển vi là đại lượng cho biết khả
năng phân biệt hai điểm của vật quan sát nằm sát nhau. Nếu khoảng cách giữa 2 điểm nằm
càng sát nhau mà vẫn có thể phân biệt được thì năng suất phân ly của kính càng cao.
Khoảng cách này phụ thuộc chiều dài sóng ánh sáng sử dụng và số lượng tia sáng đi
vào vật kính, được biểu hiện bằng công thức:

Trang 22


Trong đó:
λ: Độ dài bước sóng phát ra từ mẫu vật.
n: Chỉ số chiết quang của môi trường giữa mẫu vật và vật kính.
α: Nửa góc mở của vật kính.
2nsinα: Trị số mở của vật kính.
- Qua đó, ta thấy muốn có độ phân ly cao phải dùng ánh sáng có bước sóng thật ngắn,
hoặc dùng vật kính có trị số mở lớn. Nếu dùng vật kính có trị số mở 0,65 và soi với ánh sáng
trắng (có bước sóng trung bình α= 0,55 μm) thì khoảng cách nhỏ nhất có thể nhìn thấy rõ
được là:

Bảng. Thông số của vật kính và thị kính

Ký hiệu ghi

Độ phóng đại

Độ mở

Khoảng cách từ vật

Đường kính vi trường

trên vật kính

của vật kính

(A)

kính đên tiêu bản (mm)

khi quan sát bằng thị
kính x10 (mm)

Vật kính khô
8 x 0,20

8

0,20

8,91

1,75

10 x 0,25

10

0,25

6,80

40 x 0,65

40

0,65

0,60

0,35

90 x 1,25

90

1,25

0,15

0,15

100 x 1,25

100

1,25

0,12

Vật kính dầu

Chiết suất ánh sáng của không khí nhỏ hơn thủy tinh, nên tia sáng khi đi qua tiêu bản
thủy tinh sẽ bị khúc xạ một phần. Phần phía ngoài của tia sáng do bị khúc xạ nên không đi
vào được vật kính. Vật kính có độ phóng đại lớn thì đường kính của thấu kính càng nhỏ,
lượng tia sáng đi vào được vật kính rất ít, nên không thấy rõ ảnh. Để hạn chế nhược điểm này
ta dùng dầu soi có chiết suất ánh sáng gần bằng thủy tinh, thủy tinh và dầu soi được xem như
một môi trường đồng nhất. Ánh sáng đi qua không bị khúc xạ, nên tập trung đầy đủ vào vật
kính, giúp xem rõ ảnh.

Độ phóng đại
Độ mở
Khoảng cách làm việc

Hình. Tương quan giữa độ phóng đại của vật kính với khoảng cách làm việc từ vật kính đến
tiêu bản vi sinh vật

Trang 23


Ánh sáng không bị khúc xạ
Thấu kính của vật
kính dầu

Ánh sáng bị khúc xạ nếu
kkông có dầu soi kính

Dầu soi kính

Tiểu bản

Đèn tụ quang

Con ngươi diaphragm
Nguồn sáng

Hình. Nguyên lý của vật kính dầu
2. Dụng cụ, môi trường và hóa chất
2.1. Dụng cụ
STT

Tên dụng cụ, thiết bị mỗi
nhóm (3 sinh viên)

Đơn vị tính

Số lượng

1

Giá ống nghiệm

Cái

1

2

Ống nghiệm Ф18

Cái

1

3

Cốc 100ml

Cái

3

4

Đèn cồn

Cái

1

5

Que cấy

Cái

1

6

Bình tia

Cái

1

7

Lame (phiến kính)

Tấm

5

8

Lamelle (lá kính)

Tấm

5

9

Phiến kính lõm

Tấm

1

10

Kính hiển vi

Cái

1

Đơn vị tính

Số lượng

STT

Dụng cụ dùng chung

1

Nồi hấp cao áp

Cái

1

2

Tủ cấy vô trùng

Cái

1

Ghi chú

Ghi chú

2.2. Hóa chất
- Cồn 96o
- Dịch xà phòng loãng
- Dung dịch Xylen
2.3. Chủng giống vi sinh vật dùng quan sát
- Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzea
- Nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces vini
Trang 24


- Vi khuẩn: Escherichia coli, Bacillus subtilis
2.4. Nguyên liệu khác
- Giấy lọc
- Bông không thấm
- Bông thấm nước
3. Tiến hành thí nghiệm
3.1. Làm tiêu bản vi sinh vật sống
a. Làm tiêu bản giọt ép
- Dùng que cấy hoặc ống hút chuyển giống vi sinh vật từ ống nghiệm nuôi cấy lên tấm
phiến kính. Nếu vi sinh vật được nuôi trên môi trườn thạch, khi làm tiêu bản, nhỏ sẵn một giọt
nước muối sinh lý lên phiến kính, sau đó hòa sinh khối vi sinh vật vào giọt nước muối này.
- Đặt lá kính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không tạo thành bọt khí giữa
hai tấm kinh. Muốn vậy để một mép lá kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lá kính xuống.

- Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi ở vật kính x10 rồi x40.
- Chú ý:
+ Nếu giọt dịch nhiều quá, tràn ra phần ngoài tiếp xúc của phiến kính và lá
kính ta dùng giấy thấm bớt nước đi.
+ Nếu cần quan sát tiêu bản lâu thì dùng vazơlin bôi quanh mép lá kính để giọt
dịch khỏi bị khô.
b. Làm tiêu bản giọt treo
Loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di
động và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các loại kích thích.
- Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa.
- Bôi vazơlin quanh phần lõm của phiến kính.
- Cho 1 giọt canh trường lên giữa lá kính
- Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh trường xuống phía dưới rồi dặt lên
phần lõm của phiến kính.
- Chú ý không để giọt canh trường lan rộng hay chạm vào phần đáy của phần lõm trên
phiến kính.
- Đặt tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi ở vật kính x10 rồi x40.
Ưu điểm của loại tiêu bản này so với tiêu bản giọt ép là giúp ta quan sát tế bào vi sinh
vật sống dễ dàng hơn và lâu hơn.

Hình. Tiêu bản giọt ép và tiêu bản giọt treo
3.2. Sử dụng kính hiển vi quan sát tiêu bản vi sinh vật sống
Trước khi sử dụng phải kiểm tra tất cả các bộ phận của kính, dùng khăn mềm để lau
các bộ phận của kính (Chú ý: chỉ lau bên ngoài, không tháo rời các bộ phận của kính), để kính
ngay ngắn vừa với tầm ngồi, sau đó tiến hành tuần tự các bước tiếp theo để soi tiêu bản.
* Bước 1: Chuẩn bị kính.
Trang 25